KR101603456B1 - 형광 표지 항체 가변 영역 함유 폴리펩티드 복합체를 이용한 형광 면역 측정 방법 - Google Patents

형광 표지 항체 가변 영역 함유 폴리펩티드 복합체를 이용한 형광 면역 측정 방법 Download PDF

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Abstract

고상화 공정과 세정 공정을 필요로 하지 않는, 액상에 있어서 신속하고 또한 간편하게 목적 물질의 정량적인 측정을 가능하게 하며, 또한, 항원을 가시화하는 것이 가능하고, 검출 감도가 높은 면역 측정법을 제공하는 것을 과제로 했다. 이러한 과제를, (a) 액상 중에서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정; (b) 상기 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 강도를 측정하는 공정; (c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정;을 순차로 행하고, 피검 물질 중에 존재하는 목적으로 하는 항원의 농도를 측정함으로써 해결했다.

Description

형광 표지 항체 가변 영역 함유 폴리펩티드 복합체를 이용한 형광 면역 측정 방법{FLUOROIMMUNOASSAY METHOD USING POLYPEPTIDE COMPLEX CONTAINING FLUOROLABELED ANTIBODY-VARIABLE REGION}
본 발명은 고상화 공정 및 세정 공정을 필요로 하지 않고 고감도로 저분자 화합물의 검출이 가능한 항원 농도 측정·검출용 키트나, 항원 농도 측정·검출 방법에 관한 것이다.
항체와 항원의 결합을 이용한 면역 측정법은, 시료 중의 물질의 검출이나 농도 측정에 널리 이용되고 있다. 이들 항원이나 항체의 농도를 측정하는 방법 중, 임상 진단, 기초 연구나 환경 조사 등에 가장 널리 이용되고 있는 측정 방법은, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로날 항체, 혹은 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체를 사용하는, 샌드위치 ELISA법(혹은 샌드위치 RIA법)이라고 불리는 면역 측정법이다. 샌드위치법의 상세한 것은 이하에 서술하는 바와 같다. 제1 단계로서 1차 항체라고 불리는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 측정용 플레이트에 고정화시키고, 그곳에 항원을 포함하는 검체를 붓고, 일정 시간 반응시켜 항체와 항원을 결합시킨다. 다음으로, 제2 단계로서, 항체에 결합한 협잡물이나, 플레이트에 비특이적으로 결합한 항원을 세정액으로 세정하여 제거한다. 제3 단계로서, 미리 효소, 형광 색소 혹은 라디오아이소토프 등의 리포터 분자를 결합시킨 표지 2차 항체 용액을 붓고, 일정 시간 반응시켜, 1차 항체에 의해 보충된 항원에 더욱 표지 2차 항체를 결합시킨다. 반응 후에, 세정액으로 여분의 표지 항체를 제거하고, 측정용 플레이트에 결합한 리포터 분자의 양을 효소 활성, 형광 혹은 라디오아이소토프 등으로 측정함으로써 검체 중의 항원량을 측정한다.
상술한 바와 같이, 통상의 샌드위치 ELISA법에서는, 에피토프가 상이한 2종류의 항체가 필요하지만, 예컨대, 저분자 화합물 등을 항원으로 하는 경우에는, 상이한 에피토프를 인식하는 복수의 항체를 제조하는 것이 곤란하다. 이 때문에, 우에다 등은, 1종류의 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 가변 영역(VH)을 이용한, 오픈 샌드위치법이라고 불리는, 정밀도가 높은 저분자 화합물의 면역 측정법을 확립했다(특허문헌 1 및 2, 비특허문헌 1 및 2). 이 방법은, 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 VH 영역 폴리펩티드 및 VL 영역 폴리펩티드를 조제하고, 한쪽의 폴리펩티드를 리포터 분자로 표지하여 표지화 폴리펩티드로 하고, 다른쪽의 폴리펩티드를 고상에 고정하여 고정화 폴리펩티드로 하고, 항원 함유 시료 및 표지화 폴리펩티드를 고정화 폴리펩티드에 접촉시켜, 고정화 폴리펩티드에 결합한 표지화 폴리펩티드의 리포터 분자의 양을 측정하는 항원 농도 측정 방법이다. 또한, 저분자 화합물을 측정하기 위한 측정법으로는, 면역 측정법 외에도 액체 크로마토그래프법 등이 있지만, 고정밀도의 측정 기기가 필요한 데다가, 피검체의 필요량도 많고, 측정 시간도 걸리고, 게다가 범용성이 낮다는 문제가 있었다.
또한, 형광 색소 표지한 항체를 이용하여 항원의 농도를 측정하는 면역 측정 방법으로는, 항체와 항원을 각각 상이한 형광 색소에 의해 표지하고, 형광 색소 사이에서 발생하는 형광 공명 에너지 전이(FRET)의 효율의 변화를 지표로 한 면역 측정 방법이나(비특허문헌 3 및 4), 형광 표지한 항체에 미리 소광 물질을 혼합함으로써 소광되어 있던 항체의 형광이, 목적 검출 물질의 도입에 의해 증대되는 현상을 이용하는 켄칭에 의한 효율의 변화를 지표로 한 면역 측정 방법이나, 형광 색소로 표지한 항체를 이용하여, 표지 항체와 측정 대상물이 응집함으로써 발생하는 형광 강도의 감소를 측정하는 면역 측정 방법(특허문헌 3)이 알려져 있다.
그러나, 면역 측정 방법의 대다수는, 항체 또는 항원을 고상화(고정화)하는 공정과, 비특이적인 표지 화합물의 흡착을 제거하기 위한 세정 공정을 필요로 하는 것이었다. 이들 공정은 작업이 번잡하고 시간이 걸리는 데다가, 측정 결과 변동의 원인이 되는 점에서, 고상화 공정이나 세정 공정을 필요로 하지 않는 액상계 면역 측정 방법의 개발이 요구되고 있었다. 그래서, 본 발명자들은, 고상화 공정과 세정 공정을 필요로 하지 않는 액상계로서, 신속하고 또한 간편하게 목적 물질의 정량적인 측정을 가능하게 하며, 또한, 항원을 가시화하는 것이 가능한 면역 측정법인 「균일계 형광 면역 측정법(「균일계 형광 면역 아세이법」이나 「켄치바디(Quenchbody) 측정법」이나 「Q-바디(Q-body) 측정법」이라고도 함)」을 개발했다(특허문헌 4, 비특허문헌 5, 도 1∼3).
상기 「균일계 형광 면역 아세이법」의 면역 측정법은, 소광(켄칭) 현상을 이용한 기술을 사용한 측정 방법으로, (1) 항체 경쇄 가변 영역(VL이라고 칭해지는 영역) 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역(VH라고 칭해지는 영역) 폴리펩티드를 구비하고, 상기 항체 경쇄 가변 영역 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 형광 색소에 의해 표지된 키트로서, 액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하는 항원 농도 측정·검출용 키트나, (2) VL 폴리펩티드와 VH 폴리펩티드가 결합한 단일쇄 항체인 상기 (1)에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트에 관한 것이다. 즉, VL 폴리펩티드와 VH 폴리펩티드 중 어느 한쪽을 형광 표지한 2개의 항체 단편, 또는 형광 표지한 VL 폴리펩티드와 VH 폴리펩티드가 결합한 단일쇄 항체(scFv)(이들 (1) 및 (2)를 「켄치바디」 또는 「Q-바디」라고도 하며, (1)을 VH+VL형 Q-바디, (2)를 scFv형 Q-바디라고도 함)를, 항원이 포함되어 있는지의 여부를 검사하는 피검 시료 용액에 혼합하고, 상기 형광 색소의 형광 강도와 항원 농도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하는 형광 면역 측정 방법이다(도 1∼3). 이러한 측정 방법의 원리는, 항체 분자 내의 보존성이 높은 트립토판 잔기와 형광 색소가 상호 작용하여 형광 색소를 소광하고, 항원이 가해짐으로써 항원 의존적으로 이러한 소광이 해소되는 것에 있다.
상기 Q-바디를 이용한 「균일계 형광 면역 측정법」의 수법의 이점은, 1) 세정 공정이 불필요하고, 소량의 샘플과 혼합하여 형광 강도를 측정하는 것만으로 측정이 완료되는 매우 간편한 측정 기술인 점, 2) 항체 중에 존재하는 보존성이 높은 트립토판을 소광에 이용하기 때문에, 항체의 종류를 바꾸더라도 소광 효과가 얻어져, 여러가지 항체를 이용하여 여러가지 물질의 검출에도 널리 적용이 가능한 점에서 범용성이 우수한 점, 3) 항원 부위가 1개소이면 되기 때문에, 원리적으로 저분자 화합물에 대해서도 적용 가능한 점 등을 들 수 있다(특허문헌 4 참조, 도 1). 그리고, 세정 공정이 없고, 간편한 측정 방법인 점에서, 측정 디바이스를 매우 콤팩트하게 설계하여, 휴대 가능한 손바닥 사이즈까지 소형화하는 것이 가능하고, 전문 교육을 받지 않은 일반 사람이 현장에서 측정하는 것도 가능한 것으로 상정된다. 그러나, 상술한 바와 같이 매우 유용한 형광 면역 측정 방법이지만, 항원이 존재하지 않을 때의 형광 강도와 항원이 포화에 도달했을 때의 형광 강도의 비는, 큰 것에서 6배, 작은 것에서는 1.2배 정도였기 때문에, 측정 결과의 다이나믹 레인지를 보다 넓히고 감도를 높여, 성능을 더욱 향상시키는 것이 기대되고 있었다.
특허문헌 1 : 일본 특허 공개 평10-78436호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 제3784111호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 평10-282098호 공보 특허문헌 4 : WO2011/061944호 공보
비특허문헌 1 : 우에다 히로시, 약학 잡지 27 : 71-80(2007) 비특허문헌 2 : Lim SL, et al., Anal Chem. 79(16) : 6193-200(2007) 비특허문헌 3 : Iijima I. and Hohsaka T., Chembiochem. 17 ; 10(6) : 999-1006(2009) 비특허문헌 4 : Kajihara D, et al., Nat Methods. 3(11) : 923(2006) 비특허문헌 5 : Abe R, et al., J. Am. Chem. Soc. 133(43) : 17386-17394(2011)
본원발명의 과제는, 고상화 공정과 세정 공정을 필요로 하지 않는, 액상에 있어서 신속하고 또한 간편하게 목적 물질의 검출 및/또는 정량적인 측정을 가능하게 하며, 또한, 항원을 가시화하는 것이 가능한 면역 측정법으로서, 이러한 측정 결과의 다이나믹 레인지가 더욱 넓고, 감도가 높은 형광 면역 측정 방법을 제공하는 것에 있다.
항원이 존재하지 않는 용액 중에서 소광되어 있는 형광 표지 단일쇄 항체(scFv)를 구아니딘 염산으로 변성시킨 항체의 형광 강도와, 항원이 포화에 도달했을 때의 형광 강도는, 거의 동일한 정도였던 점에서, 항원 비존재시의 소광 효율을 높이는 것이 다이나믹 레인지를 넓히는 유효한 수단이라고 생각하고, 이하의 검토를 행했다.
즉, 소광의 주된 요인은, VL 폴리펩티드나 VH 폴리펩티드에 고도로 보존된 트립토판 잔기와, 표지한 형광 색소가 접촉하는 것에 의한 것이고, 항원 결합에 따르는 가변 영역의 구조 안정화에 의해 형광 색소가 항원 결합 포켓으로부터 추방됨으로써, 소광 상태가 해소되고, 형광 강도가 증가하는 것으로 추측했다. 그리고, VL 폴리펩티드나 VH 폴리펩티드가 2종류의 단백질로서 존재하는 경우에는, VL 폴리펩티드나 VH 폴리펩티드가 해리되어 있어 상호 작용이 약하기 때문에, 형광 색소와 트립토판 잔기의 접촉 효율이 낮고 그에 따라 소광 상태도 낮은 것이었을 것으로 예상했다. 또한, 단일쇄 항체(scFv)에 있어서는, VL 폴리펩티드와 VH 폴리펩티드를 인공적인 펩티드 링커에 의해 단일쇄 항체로서 결합시킨 것에 의해, VL 폴리펩티드와 VH 폴리펩티드의 상호 작용을 높일 수 있지만, 인공적인 펩티드 링커의 부가에 의해 본래 갖는 항원과의 결합 활성이나 안정성 등의 항체의 기능을 저하시키고 있을 가능성을 생각할 수 있었다. 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 경쇄 불변 영역으로 이루어지는 폴리펩티드와, 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 중쇄 불변 영역으로 이루어지는 폴리펩티드가, 디술피드 결합으로 결합한 1분자의 헤테로 다이머 단백질로 이루어지는 Fab 항체(단편, 항원 결합)이면, 본래 갖는 항체의 기능을 유지하고 있을 것으로 추측하고, Fab 항체의 VH 함유 폴리펩티드 또는 VL 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽을 형광 표지한 바, 항원 비존재하에서 이러한 형광 색소는 보다 강하게 소광되고, 백그라운드를 낮출 수 있는 것을 알아냈다. 또한, Fab 항체의 VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드의 각각에 동색의 형광 색소를 표지한 바, 형광 색소와 트립토판 잔기의 접촉에 의한 소광에 덧붙여, 색소 사이의 소광 효과(H-다이머(dimer))가 부가되어 더욱 높은 검출 감도를 얻을 수 있는 것을 알아냈다. 또한, Fab 항체의 VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드의 각각에 이색의 형광 색소를 표지한 바, 형광 색소와 트립토판 잔기의 접촉에 의한 소광과 색소 사이의 소광 효과에 덧붙여 FRET 효과에 의한 소광 효과도 얻어져, 더욱 높은 검출 감도를 얻을 수 있는 것을 알아냈다. 또한, Fab 항체의 VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드의 각각에 형광 색소와 상기 형광 색소를 소광하는 켄처를 표지한 바, 형광 색소와 트립토판 잔기의 접촉에 의한 소광과 형광 색소와 켄처 사이의 소광 효과도 얻어져, 높은 검출 감도를 얻을 수 있는 것을 알아냈다.
종래의 형광 표지 단일쇄 항체(scFv)와 본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체의 열 안정성을 측정한 바, 형광 표지 단일쇄 항체(scFv)가 변성하는 온도는 61℃였지만, 형광 표지 Fab형 복합체가 변성하는 온도는 73℃로 내열성이 우수하고, 보존성도 우수한 것을 알아냈다. 본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성하기에 이른 것이다(도 4).
즉 본 발명은,
[1] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구비한 키트로서, 액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정·검출용 키트;
[2] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 동일한 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[3] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 상이한 종류의 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[4] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 한쪽이 형광 색소, 다른쪽이 상기 형광 색소를 소광하는 켄처에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[5] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽이, 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[6] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체가, Fab 항체(단편, 항원 결합)인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[7] 형광 색소가, 로다민계 형광 색소 및 옥사진계 형광 색소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[8] 형광 색소가, 카르복시로다민 110, 카르복시테트라메틸로다민 및 ATTO655(상표명)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 [7]에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;
[9] 켄처가, 7-니트로벤조푸라잔(NBD)인 것을 특징으로 하는 상기 [4]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출용 키트;에 관한 것이다.
또한 본 발명은,
[10] 이하의 공정 (a)∼(c),
(a) 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정;
(b) 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 색소의 형광 강도를 측정하는 공정;
(c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정;
을 순차로 구비하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정·검출 방법;
[11] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 동일한 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [10]에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[12] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 상이한 종류의 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [10]에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[13] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 한쪽이 형광 색소, 다른쪽이 상기 형광 색소를 소광하는 켄처에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [10]에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[14] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽이, 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 상기 [10]에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[15] 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체가, Fab 항체(단편, 항원 결합)인 것을 특징으로 하는 상기 [10]∼[14] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[16] 항원이 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는 상기 [10]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;
[17] 항원이, 인간 오스테오칼신, 비스페놀 A, 혈청 알부민, 클렌부테롤, 락토파민, 코티닌, 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌, 모르핀류, 메탐페타민류, 코카인, 테트라히드로칸나비놀, 케타민인 것을 특징으로 하는 상기 [10]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 항원 농도 측정·검출 방법;에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 액상계에서 신속하고 또한 간편하게 목적 물질의 검출 및/또는 정량적인 측정이 가능하고, 저분자 화합물도 측정할 수 있는 고감도의 면역 측정 방법이나, 상기 측정 방법에 의한 항원의 측정을 행하기 위한 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 측정 방법은, 어느 한쪽 또는 각각 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드(이하, 「VL 함유 폴리펩티드」라고도 함)와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드(이하, 「VH 함유 폴리펩티드」라고도 함)를 포함하는 복합체(이하, 「본 발명의 형광 표지 복합체」라고도 함)와, 항원의 결합을, 상기 형광 색소의 형광 강도를 지표로 하여 검출 및/또는 측정할 수 있다. 본 발명의 형광 표지 복합체는 항원과 결합하고 있지 않을 때에는, 상기 형광 색소가 효과적으로 소광(켄치)된 상태에 있기 때문에, 항원을 양호한 감도로 검출 및/또는 측정할 수 있다.
도 1은, Q-바디 측정법의 특징을 도시한 도면이다. 항체 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 항체 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 중 어느 한쪽에 형광 표지한 2종류의 폴리펩티드(VH+VL), 또는, 항체 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 항체 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 결합한 형광 표지 단일쇄 항체(scFv)는, 항원과 섞는 것만으로, 신속, 고감도로 항원 농도를 측정할 수 있다(WO2011/061944호 공보 참조).
도 2는, Q-바디의 원리를 도시한 도면이다. 형광 색소와, 항체 가변 영역에 널리 보존되어 있는 아미노산, 즉 항체 중쇄 가변 영역의 Trp33, Trp47, Trp36, Trp106이나 항체 경쇄 가변 영역의 Trp40과의 상호 작용에 의해, 항원 비존재하에서는 형광이 소광되어 있지만, 항원 농도 의존적으로 소광이 해제되고 형광이 증가한다. 형광 표지 (VH+VL) 및 형광 표지 scFv를 켄치바디(Q-바디)라고 부른다.
도 3은, Q-바디를 이용하여 항원 농도를 측정한, 균일계 형광 면역 아세이법의 실시의 일례를 도시한 도면이다. Q-바디인 TAMRA 표지 항BGP 단일쇄 항체(scFv)에 항원 농도를 변화시키고, 형광 분광 광도계(FluoroMax-4)를 이용하여 형광 스펙트럼 및 형광 이미지 애널라이저(FM-BIOIII)를 이용하여 형광 강도를 측정한 결과를 도시했다.
도 4는, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 모식적으로 도시한 도면이다. 즉 본 발명의 형광 라벨 복합체를 모식적으로 도시했다(상측 도면). 또한, 실시예에 이용한 Q-바디, 및 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체, 동색 더블 라벨 Fab형 복합체, 이색 더블 라벨 Fab형 복합체를 모식적으로 도시한 도면이다(하측 도면).
도 5는, 본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체의 제조 방법을 모식적으로 도시한 도면이다. 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체를 제조하는 경우에는, ProX 태그(TAG), VH, CH1, C 말단에 링커 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를 포함하는 플라스미드와, ProX 태그(TTT), VL, Cκ, C 말단에 링커 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를 포함하는 플라스미드와, TAMRA-AF-tRNA앰버(amber)(Clover Direct)를 대장균 무세포 합성 키트(RYTS)에 가하고, 20℃에서 2시간 반응시켜 TAMRA 표지 VH 함유 폴리펩티드와 VL 함유 폴리펩티드를 공발현으로 합성했다. 그 후, 4℃ 16시간 정치하여 복합체를 형성했다. C 말단에 부여한 FLAG와 His 태그를 이용하여 단백질을 정제했다. 동색 더블 라벨로 하는 경우에는, VH 함유 유전자 및 VL 함유 유전자의 N 말단측에 ProX 태그(TAG)를 부여한 플라스미드를 이용하여, 싱글 라벨 Fab형 복합체와 동일한 방법으로 합성, 정제했다. 또한 이색 더블 라벨로 하는 경우에는, ProX 태그(TAG)와 ProX 태그(CGGG)를, 각각 어느 유전자의 N 말단측에 부여한 플라스미드를 이용하여, 색소 A-AF-tRNA앰버, 색소 B-AF-tRNACGGG(Clover Direct)를 첨가한 상기한 방법에 의해 합성, 정제했다. 프레임란에 4염기 코돈에 의한 형광 표지 아미노산 도입의 모식도를 도시했다.
도 6은, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체가, VH+VL형 Q-바디나 scFv형 Q-바디보다 높은 형광 강도비로 BGP나 비스페놀 A를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 7은, 본 발명의 동색 더블 라벨 Fab형 복합체가, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 BGP를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 8은, 본 발명의 동색 더블 라벨 Fab형 복합체가, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 HSA를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 9는, 본 발명의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체가, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 BGP를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 10은, 본 발명의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체가, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 HSA를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 11은, CR110으로 표지한 항SA 항체의 중쇄 가변 영역(VH)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지한 항SA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 항SA 항체의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체가, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 HSA를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다.
도 12는, 본 발명의 한쪽이 형광 색소, 다른쪽이 상기 형광 색소를 소광하는 켄처에 의해 표지된 Fab형 복합체가 높은 형광 강도비로 BGP를 측정할 수 있었던 것을 도시한 도면이다. 어느것이나, Ex/Em = 530/580으로 측정했다.
도 13은, 본 발명의 형광 라벨 Fab형 복합체의 열 변성을 일으키는 온도는, 형광 라벨 scFv의 열 변성을 일으키는 온도보다 12℃ 높아, 온도 안정성이 우수한 것을 도시한 도면이다.
본 발명의 항원 농도 측정·검출용 키트로는, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드(VL 함유 폴리펩티드)와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드(VH 함유 폴리펩티드)를 포함하는 복합체를 구비하고, 상기 VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지되어 있는, 상기 복합체를 구비한 키트로서, 액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정·검출용 키트이면 특별히 제한되지 않지만, 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지되어 있는, VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구성 요소로서 포함하는 것 외에, 표준 물질로서 사용할 수 있는 항원이나, 통상 이러한 종류의 면역 측정 키트에 이용되는 시약 등, 기구, 취급 설명서 등을 구비하고 있어도 좋다.
상기 항원으로는, 상기 VH 함유 폴리펩티드나 상기 VL 함유 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드를 포함하는 복합체에 의해 특이적으로 인식되는 항원이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 단백질, 펩티드, 당질, 지질, 당지질, 저분자 화합물 외에, 인산화, 메틸화 등의 단백질 수식 등이나 이들 수식을 받은 단백질 등을 들 수 있고, 본 발명의 항원 농도 측정·검출용 키트는 검출 감도가 우수한 점에서, 저분자 화합물의 검출에 있어서 특히 유용하다.
본 발명의 항원 농도 측정·검출용 키트에서의, VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구성하는, VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드는, 그 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지되어 있으면 되고, (i) 어느 한쪽이 형광 색소에 의해 표지된 복합체, (ii) 각각이 동일한 형광 색소에 의해 표지된 복합체, (iii) 각각이 상이한 종류의 형광 색소에 의해 표지된 복합체, 또는 (iv) 어느 한쪽이 형광 색소, 다른쪽이 상기 형광 색소를 소광하는 켄처에 의해 표지된 복합체로 할 수 있다. VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽에 부가되는 경우, 형광 색소는 어느 폴리펩티드에 부가되어도 좋지만, 높은 검출 감도를 얻을 수 있는 쪽에 부가하는 것이 바람직하다. 각각이 상이한 2종의 형광 색소가 VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드에 부가되는 경우에는, 어느 형광 색소가 어느쪽의 폴리펩티드에 부가되어도 좋고, 높은 검출 감도를 얻을 수 있는 형광 색소와 폴리펩티드의 조합으로 하는 것이 바람직하다. VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드는, 어느 것이나 상기 형광 색소의 발광이나 검출, 켄칭이 저해되지 않는 한은, 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이나, ProX 태그(서열번호 1), FLAG 태그, His 태그, HA 태그, Ni 태그 등의 펩티드 태그, 임의의 아미노산 서열을 포함하는 링커, 안정 방사성 동위체, 효소, 상기 형광 색소와 상이한 종류의 형광 색소 등에 의해 표지되는 것 외에, 당쇄 부가나 인산화, 메틸화 등의 수식을 받고 있어도 좋다.
항체 경쇄 가변 영역(VL)은, 항체 경쇄 유전자의 V 영역 및 J 영역의 엑손에 의해 코드되는 항체 경쇄 가변 영역(VL)에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 상기 VL 함유 폴리펩티드, 또는 본 발명의 형광 표지 복합체와 항원의 친화성이 손상되지 않는 한은, 상기 항체 경쇄 가변 영역에 특이적인 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단측에, 임의의 아미노산 서열이 부가된 것이어도 좋고, 1 또는 2 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입되어 있어도 좋다. 이러한 항원과의 친화성은, ELISA법이나 FACS 등의 통상법에 의해 적절히 조사할 수 있다. 또한, 상기 항체 경쇄 가변 영역에 특이적인 아미노산 서열로는, 카바트(Kabat)의 번호 부여계에서 제35번째의 아미노산이 트립토판인 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
항체 중쇄 가변 영역(VH)은, 항체 중쇄 유전자의 V 영역, D 영역, 및 J 영역의 엑손에 의해 코드되는 항체 중쇄 가변 영역(VH)에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 상기 VH 함유 폴리펩티드 또는 본 발명의 형광 표지 복합체와, 항원의 친화성이 손상되지 않는 한은, 상기 항체 중쇄 가변 영역에 특이적인 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단측에, 임의의 아미노산 서열이 부가된 것이어도 좋고, 1 또는 2 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입되어 있어도 좋다. 이러한 항원과의 친화성은, ELISA법이나 FACS 등의 통상법에 의해 적절히 조사할 수 있다. 또한, 상기 항체 중쇄 가변 영역에 특이적인 아미노산 서열로는, 카바트(Kabat)의 번호 부여계에서 제36번째, 제47번째, 또는 제103번째의 아미노산이 트립토판인 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
VL 함유 폴리펩티드로는, 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 함유하고 있으면 되고, 항체 경쇄나, 항체 경쇄에 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 예컨대, 항체 경쇄 가변 영역(VL)에, 항체 경쇄 불변 영역(Cκ)이나, 또한 힌지 부분을 부여한 폴리펩티드로 할 수 있고, 그 중에서도 VL에 Cκ를 부여한 폴리펩티드 등이 바람직하다. 상기 VL 함유 폴리펩티드로서 구체적으로는, 서열번호 5에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 7에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 10에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 15에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 17에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 19에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 21에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 23에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 25에 서열번호 4를 부가한 것, 서열번호 27에 서열번호 4를 부가한 것, 및 서열번호 29에 서열번호 4를 부가한 것으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 적합하게 예시할 수 있는 것 외에, 측정 대상의 항원에 따라, 항원을 인식할 수 있는 VL 함유 폴리펩티드를 적절히 제조할 수 있다.
VH 함유 폴리펩티드로는, 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 함유하고 있으면 되고, 항체 중쇄나, 항체 중쇄에 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고, 예컨대, 항체 중쇄 가변 영역(VH)에, 항체 중쇄 불변 영역(CH1)이나, 또한 힌지 부분이나 Fc 영역을 부여한 폴리펩티드로 할 수 있고, 그 중에서도 VH에 CH1을 부여한 폴리펩티드 등이 바람직하다. 상기 VH 함유 폴리펩티드로서 구체적으로는, 서열번호 3에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 9에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 12에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 16에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 18에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 20에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 22에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 24에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 26에 서열번호 6을 부가한 것, 서열번호 28에 서열번호 6을 부가한 것, 및 서열번호 30에 서열번호 6을 부가한 것으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 적합하게 예시할 수 있는 것 외에, 측정 대상의 항원에 따라, 항원을 인식할 수 있는 VH 함유 폴리펩티드를 적절히 제조할 수 있다.
VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드는, 복합체를 형성하는 것이 바람직하고, 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)에, 각각 복합체를 형성하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 결합된 것이면 특별히 제한되지 않는다. 복합체를 형성하는 펩티드로는, 상기 항체 불변 영역(CH1이나 Cκ 등) 외에, 2량체를 형성하는 한쪽을 VL에 다른쪽을 VH에 부여할 수도 있다. 또한, 상호 작용하여 이들의 복합체 형성에 기여하는 2종류의 단백질을 선택할 수도 있다.
본 발명의 형광 표지 복합체에서의 「복합체」로는, VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드를 구성 요소로서 포함하여, 복합체를 형성하는 것이면 되고, 본 발명의 형광 표지 복합체의 기능을 손상시키지 않는 한은, 상기 VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드에 추가하여, 더욱 펩티드나 단백질, 지질, 금속, 기타 화합물 등을 구성 요소로서 포함해도 좋다.
또한, 본 발명의 복합체는, 상기 폴리펩티드끼리가 조합되어 일체로서 기능할 수 있는 구조체이면 되고, 상기 폴리펩티드 사이의 화학 결합의 유무는 특별히 문제가 되지 않는다. 상기 결합으로는, 상기 폴리펩티드끼리에 의한, 디술피드 결합이나, 가교제를 이용하여 형성된 결합 등을 들 수 있고, 이들 결합은 하나의 복합체에 있어서 복수 조합하여 사용되어도 좋다. 이들 중에서도 디술피드 결합을 적합하게 예시할 수 있다. 본 발명의 복합체는 상기 폴리펩티드끼리가 서로 가까운 거리가 되는 복합체를 형성하는 것이 바람직하고, 이러한 기능을 갖는 펩티드를 포함하는, VL 함유 폴리펩티드나 VH 함유 폴리펩티드를 포함하는 복합체가 바람직하다. 항체 분자에 있어서 항체 경쇄 불변 영역과 항체 중쇄 불변 영역은 그 상호 작용에 의해 항체 경쇄 가변 영역과 항체 중쇄 가변 영역을 보다 가까운 거리로 하여, 강고한 항원 결합 포켓을 형성하는 보조적 역할을 수행하고 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 복합체로는, 항체 경쇄 가변 영역과 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드와, 항체 중쇄 가변 영역과 항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 디술피드 결합으로 결합한 1분자의 항체 단백질인 Fab 항체나, Fab 항체 2개가 힌지를 통해 디술피드 결합으로 결합한 F(ab')2 항체나, 완전체의 항체가 바람직하고, 그 중에서도 Fab 항체가 가장 바람직하다. 이러한 VL 함유 폴리펩티드 및 VH 함유 폴리펩티드를 포함하는, Fab 항체를 형성하는 본 발명의 형광 표지 복합체는, 「본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체」라고 하는 경우도 있다. 그 중에서도 VL 함유 폴리펩티드 또는 VH 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 형광 표지된 본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체는, 「본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체」라고 하는 경우도 있다. 또한, VL 함유 폴리펩티드 및 VH 함유 폴리펩티드가 모두 형광 표지된 본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체는, 그 2종의 형광 색소가 동일한 경우에는 「본 발명의 동색 더블 라벨 Fab형 복합체」, 2종의 형광 색소가 상이한 경우에는 「본 발명의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체」라고 하는 경우도 있다.
본 발명에 있어서, VL 함유 폴리펩티드나, VH 함유 폴리펩티드나, 이들 폴리펩티드를 포함하는 복합체나 그 구성 요소 등은, 공지된 화학 합성법, 유전자 재조합 기술, 항체 분자의 단백질 분해 효소에 의한 분해 방법 등을 이용하여 조제할 수 있지만, 그 중에서도, 비교적 용이한 조작으로 또한 대량으로 조제하는 것이 가능한 유전자 재조합 기술에 의해 조제하는 것이 바람직하다. 유전자 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 조제하는 경우에는, 이러한 폴리펩티드를 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 적합한 발현 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하고, 박테리아, 효모, 곤충, 동식물 세포 등을 숙주로서 이용한 발현계나, 무세포 번역계에 의해 원하는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다(도 5). 무세포 번역계에서 원하는 폴리펩티드의 발현을 행하는 경우에는, 예컨대, 대장균, 밀 배아, 토끼 망상 적혈구 등의 무세포 추출액에, 뉴클레오티드 3인산이나 각종 아미노산을 첨가한 반응액 중에서, 원하는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 이 때, VL 함유 폴리펩티드나, VH 함유 폴리펩티드는 ProX 태그나 FLAG 태그, His 태그 등의 태그가 부가되어 있어도 좋고, 이들 태그는 형광 색소의 부가나, 폴리펩티드의 정제 등에 이용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻은 VL 함유 폴리펩티드나, VH 함유 폴리펩티드끼리는, 형광 색소에 의한 표지중 또는 표지 전후에, 적당한 용매 중에서 복합체를 형성시킬 수 있고, 디술피드 결합 또는 가교제에 의해 결합시켜, 복합체를 형성시키는 예를 들 수 있다. 예컨대, 상기 VL 함유 폴리펩티드 및 VH 함유 폴리펩티드를 코드하는 유전자를, 대장균 무세포 합성계에서 공발현 후, 4℃에서 16시간 인큐베이션함으로써 디술피드 결합을 형성시켜 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 대장균 무세포 합성 반응계에 단백질 디술피드 아이소메라아제나 프롤린 시스트랜스 아이소메라아제 등의 분자 샤페론을 첨가함으로써 디술피드 결합을 촉진할 수 있다. 또한, 상기 가교제로는, 폴리펩티드끼리를 가교하여 결합시킬 수 있는 화합물이면 되고, 예컨대, 알데히드류(예컨대, 글루타르알데히드), 카르보디이미드류, 이미드에스테르류 등을 들 수 있고, 적절히 시판품을 입수하여 통상법에 의해 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는, 항체를 효소 등으로 절단하여 제조할 수도 있고, 예컨대 파파인이나, 펩신을 이용하여 항체를 처리함으로써, 각각 Fab 항체나, F(ab')2 항체를 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 형광 색소에 의해, VL 함유 폴리펩티드나 VH 함유 폴리펩티드를 표지하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 폴리펩티드의 양단 또는 측쇄의 관능기를 이용하여 직접 또는 가교제 등을 통해 간접적으로 표지하는 방법이나, 무세포 번역계를 이용하여 폴리펩티드를 합성하면서 부위 특이적으로 표지하는 수법 등을 이용할 수 있다. 무세포 번역계를 이용하여 표지하는 방법으로는, 앰버 서프레션법(Ellman J et al.(1991) Methods Enzymol.202 : 301-36), 4염기 코돈법(Hohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 9778-9779, 1996), C 말단 표지법(일본 특허 공개 제2000-139468호 공보), N 말단 표지법(미국 특허 제5,643,722호 공보, Olejnik et al.(2005) Methods 36 : 252-260) 등이 알려져 있고, 앰버 서프레션법에서는, 표지의 타깃 부위의 아미노산을 코드하는 코돈을 종지 코돈의 하나인 앰버 코돈으로 치환한 DNA 또는 mRNA를 제조하고, 무세포 번역계를 이용하여 상기 DNA 또는 mRNA로부터 단백질을 합성한다. 그 때, 단백질 합성 반응액에 표지된 비천연 아미노산을 결합시킨 서프레서 tRNA를 첨가함으로써, 앰버 코돈으로 치환한 부위에 표지 아미노산이 도입된 단백질을 합성할 수 있다. 4염기 코돈법에서는 코돈을 주로 CGGG로 확장하고, 아미노산을 코드하는 코돈을 CGGG로 치환한 DNA 또는 mRNA를 제조하고, 무세포 번역계를 이용하여 상기 DNA 또는 mRNA로부터 단백질을 합성한다. 그 때, 단백질 합성 반응액에 표지된 비천연 아미노산을 결합시킨 tRNACGGG를 첨가함으로써, 4염기 코돈으로 치환한 부위에 표지 아미노산이 도입된 단백질을 합성할 수 있다. 본 발명에서의 이색 더블 라벨에는, 무세포 번역계를 이용하여, 앰버 서프레션법과 4염기 코돈법을 조합하여 공발현시킴으로써, VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드에 상이한 형광 색소로 표지를 행하고, 복합체를 형성할 수 있다. 또한, C 말단 표지법에서는, 표지한 퓨로마이신을 최적 농도로 첨가한 무세포 번역계에서, DNA 또는 mRNA로부터 단백질로의 번역을 행함으로써, C 말단 특이적으로 표지가 도입된 단백질을 합성할 수 있다.
또한, 대장균이나 동물 세포를 숙주로 하는 유전자 재조합 기술에 의해 부위 특이적으로 형광 색소를 도입하는 수법을 이용할 수도 있다. 아지드 티로신을 인식하는 아미노아실 tRNA 합성 효소와, 서프레서 아지드 티로실 tRNA를 도입한 대장균을 숙주로 하여, 부위 특이적으로 폴리펩티드에 아지드 티로신을 도입하고, 도입한 아지드기에 형광 색소를 결합할 수 있다. 또한, 고세균 유래 피롤리딜 tRNA 합성 효소와, 서프레서 피롤리딜-tRNA를 도입한 동물 세포를 숙주로 하여, 부위 특이적으로 폴리펩티드에 아지드 Z리신을 도입하고, 도입한 아지드기에 형광 색소를 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 형광 표지에 이용하는 형광 색소로는, VH 함유 폴리펩티드 및/또는 VL 함유 폴리펩티드를 표지한 경우, 본 발명의 형광 표지 복합체를 형성한 상태에서, 항원의 비존재하에서 켄치(소광)되는 형광 색소로서, 이러한 복합체와 항원이 결합했을 때에는 소광 기능이 해제되고 형광이 발하여지는 형광 색소이면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 동일 또는 상이한 종류의 형광 색소를, VH 함유 폴리펩티드와 VL 함유 폴리펩티드의 각각에 부가하는 경우에는, 상기한 켄칭에 덧붙여, 항원의 비존재하에서 색소 사이의 켄칭이나 FRET 효과에 의한 켄칭이 효과적으로 발생하는 조합을 선택하는 것이 바람직하다. 형광 표지에 이용하는 형광 색소로는, 로다민, 쿠마린, Cy, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌, 카바졸 등을 기본 골격으로서 갖는 형광 색소나 그 형광 색소의 유도체를 예시할 수 있고, 구체적으로는, CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, ATTO655(상표명), BODIPY FL(상표명) : 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPY R6G(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, Cy3(상표명), Cy3B(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 390(상표명), ATTO 425(상표명), ATTO 465(상표명), ATTO 488(상표명), ATTO 495(상표명), ATTO 520(상표명), ATTO 532(상표명), ATTO Rho6G(상표명), ATTO 550(상표명), ATTO 565(상표명), ATTO Rho3B(상표명), ATTO Rho11(상표명), ATTO Rho12(상표명), ATTO Thio12(상표명), ATTO 610(상표명), ATTO 611X(상표명), ATTO 620(상표명), ATTO Rho14(상표명), ATTO 633(상표명), ATTO 647(상표명), ATTO 647N(상표명), ATTO 655(상표명), ATTO Oxa12(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO 725(상표명), ATTO 740(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 647(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), SFX(상표명)를 들 수 있지만, 그 중에서도, 로다민계 형광 색소인 CR110이나 TAMRA, 및 옥사진계 형광 색소인 ATTO 655를 특히 적합하게 예시할 수 있다.
본 발명에서의 켄처로는, 항원 비존재하의 본 발명의 형광 표지 복합체에 있어서, 그 구성 요소인 VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽에 표지된 형광 색소의 형광을, 다른 한쪽의 펩티드에 부가된 켄처가 소광할 수 있는 켄처로서, 이러한 복합체와 항원이 결합한 경우에는 이러한 소광 기능이 해제되고 형광이 발하여지는 켄처이면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 켄처는, NBD : 7-니트로벤조푸라잔, DABCYL, BHQ, ATTO, QXL, QSY, Cy, 로바 블랙(Lowa Black), IRDYE 등을 기본 골격으로 하는 소광 색소나 그 소광 색소의 유도체를 예시할 수 있고, 구체적으로는, NBD, DABCYL, BHQ-1(상표명), BHQ-2(상표명), BHQ-3(상표명), ATTO540Q(상표명), ATTO580Q(상표명), ATTO612Q(상표명), QXL490(상표명), QXL520(상표명), QXL570(상표명), QXL610(상표명), QXL670(상표명), QXL680(상표명), QSY-35(상표명), QSY-7(상표명), QSY-9(상표명), QSY-21(상표명), Cy5Q(상표명), Cy7Q(상표명), 로바 블랙 FQ(상표명), 로바 블랙 RQ(상표명), IRDYE QC-1(상표명)을 들 수 있지만, 그 중에서도, NBD가 바람직하다. 또한, 본 발명의 복합체에서의 형광 색소와 켄처의 조합은, 항원 비존재하에서 켄처가 형광 색소를 효과적으로 소광하고, 항원 존재하에서는 형광 색소의 발광을 저해하지 않는 조합을 적절히 선택할 수 있고, 형광 색소 TAMRA와 NBD의 조합을 예시할 수 있다.
본 발명의 형광 표지 복합체, 즉 VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드를 포함하는 복합체로서, 상기 VL 함유 폴리펩티드와 VH 함유 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지되어 있는 복합체는, 항원의 비존재하에서는, 상술한 형광 색소와 항체 가변 영역에서 보존된 트립토판 잔기의 상호 작용에 의한 형광 색소의 소광이 발생한다. 그것에 덧붙여, 동색의 형광 색소가 상기폴리펩티드 각각에 표지된 본 발명의 형광 표지 복합체에서는, 형광 색소 사이의 켄칭 효과가 얻어진다. 또한, 이색의 형광 색소가 상기 폴리펩티드 각각에 표지된 본 발명의 형광 표지 복합체에서는, 상기 트립토판 잔기에 의한 켄칭, 형광 색소 사이의 켄칭에 덧붙여, 형광 공명 에너지 전이(FRET) 효과에 의한 켄칭의 효과가 얻어진다. 또한, 형광 색소와 그 색소를 소광하는 켄처가 상기 폴리펩티드 각각에 표지된 본 발명의 형광 표지 복합체에서는, 형광 색소와 켄처 사이의 켄칭 효과에 의해, 다이나믹 레인지를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 항원 농도 측정·검출 방법으로는,
(a) 액상에서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정;
(b) 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 색소의 형광 강도를 측정하는 공정;
(c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정;
의 공정 (a)∼(c)를 순차로 구비하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및/또는 검출 방법이면 되고, 상기 복합체는 본 발명의 형광 표지 복합체이면 되고, 그 중에서도 본 발명의 형광 표지 Fab형 복합체, 보다 바람직하게는 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체, 본 발명의 동색 더블 라벨 Fab형 복합체, 본 발명의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체를 예시할 수 있다. 또한 본 발명의 항원 농도 측정·검출 방법은, 본 발명의 형광 표지 복합체나 본 발명의 항원 농도 측정 및/또는 검출용 키트를 이용하여 행할 수 있다.
본 발명의 항원 농도 측정·검출용 키트의 사용, 및 본 발명의 항원 농도 측정·검출 방법은, 액상 중에서 본 발명의 형광 표지 복합체와 항원의 접촉을 행하는 것이 바람직하고, 그 때문에 측정 대상 시료인 검체는, 적절히 액체 혹은 액체를 포함하거나, 또는 액체에 침지된 측정용 시료로서 조제하여 상기 공정 (a)나 본 발명의 항원 농도 측정·검출 방법에 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항원 농도 측정 및/또는 검출용 키트의 사용, 및 본 발명의 항원 농도 측정 및/또는 검출 방법에서의 검체의 유래 등은 특별히 제한되지 않고, 적절히 전처리 등을 실시하여 상기 측정용 시료로 할 수 있다. 액체의 검체는, 그대로 측정용 시료로서 측정에 제공하는 경우도, 혹은 항원을 손상시키는 경우나 항원 농도 측정·검출을 저해하는 경우도 없는 한, 완충액이나 생리 식염수 등으로 희석, 혹은 농축, 또는 pH나 염 농도 등을 적절히 조정하여 측정용 시료로 할 수도 있다. 이러한 액체의 검체로는, 예컨대 측정 대상이 되는 타깃 항원을 포함할 가능성이 있는 혈청, 혈장, 타액, 수액, 뇨 등의 체액, 배양 상청, 세포 추출액, 균체 추출액, 공업 폐수 등을 들 수 있다.
고체 등의 액체 이외의 검체는, 그대로, 혹은 항원을 손상시키는 경우나 항원 농도 측정·검출을 저해하는 경우가 없는 한, 적절히 분할, 세단, 분쇄, 갈아 으깨고, 조직 세그먼트를 제조하고, 혹은 검체의 특정 성분만을 제거 혹은 추출하는, 등의 처리를 실시한 후에, 완충액이나 생리 식염수 등의 액체에 용해, 현탁, 또는 액침함으로써, 본 발명의 형광 표지 복합체가 항원에 접촉할 수 있는 상태로 하여, 측정용 시료로 할 수 있다. 상기 조직 세그먼트의 제조에 있어서는, 항원을 손상시키지 않는 범위에서 파라포름알데히드나 글루타르알데히드 등을 이용하여 고정 처리를 실시할 수 있고, 또한 BSA(소혈청 알부민)나 스킴 밀크 등에 의해 블로킹 처리를 행할 수도 있다. 이러한 고체 등의 검체로는, 예컨대 생체로부터 채취된 조직, 세포, 단백질이나 당 등의 성분이 블롯된 니트로셀룰로오스막이나 PVDF막, 식품, 토양 등을 들 수 있다. 또한, 측정용 시료는, 항원을 손상시키는 경우도 항원 농도 측정·검출을 저해하는 경우도 없는 한, 적절히 방부제, 곰팡이 방지제, pH 조정제, 계면 활성제, 응고 방지제, 킬레이트제 등을 포함해도 좋다.
본 발명에 있어서는, 또한, 생체 내의 혈액이나 수액 등의 체액, 조직 등도 측정용 시료로 할 수 있다. 즉, 실험 동물 등의 비인간 동물에게 본 발명의 형광 표지 복합체를 투여함으로써, 본 발명의 형광 표지 복합체와 생체 내의 항원을 접촉시킬 수 있다. 이러한 비인간 동물로는, 인간 이외의 동물이면 되고, 예컨대, 척추 동물, 그 중에서도 포유류, 어류, 조류, 파충류, 양서류 등의 비인간 동물을 들 수 있고, 그 중에서도 포유류가 바람직하고, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 돼지 등이 보다 바람직하다. 또한, 상기 투여 방법도 특별히 제한되지 않고, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 매립, 도포 등의 비경구적인 국소 투여 방법이나, 경구적인 투여 방법 중에서 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 형광 표지 복합체 투여와 동시, 혹은 그 전후에 다른 약제 등을 투여해도 좋다. 비인간 동물에게 본 발명의 형광 표지 복합체를 투여함으로써, 생체 내에서의 항원의 위치나 그 이동, 항원량이나 그 변화를 관찰하는 것도 가능하다. 이러한 관찰에 있어서는, 시간 경과적으로 체액이나 조직 등의 검체를 채취하여 측정용 시료를 조제하고, 형광 강도 측정이나 형광의 국재 관찰을 행할 수도 있고, 혹은 생체 중의 형광 강도나 그 변화, 형광의 국재나 그 이동을 리얼 타임으로 검출하여 관찰할 수도 있다.
본 발명의 형광 표지 복합체와 측정용 시료 중의 항원을 접촉시키는 반응 조건으로는, 측정용 시료에 본 발명의 형광 표지 복합체를 첨가하고, 항원 항체 반응에 일반적으로 이용할 수 있는 조건에서 인큐베이트하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 온도 조건은, 예컨대 1∼30℃, 바람직하게는 18∼25℃, 반응 시간은, 예컨대 순간∼180분, 바람직하게는 1∼90분으로 할 수 있다. 또한, 비인간 동물의 체내에서 반응을 행하는 경우에는, 투여 후 예컨대 5∼180분, 바람직하게는 60∼120분 인큐베이트하고, 필요에 따라, 조직, 혈액, 세포 등을 적출, 또는 관찰 대상 부위를 노출시키는 등의 처리를 적절히 행할 수 있다. 인큐베이트 종료 후의 시료에 있어서는, 항원을 인식한 본 발명의 형광 표지 복합체에서의 켄칭이 해소되고, 여기광의 조사에 의해 형광이 발하여지지만, 항원을 인식하지 않은 본 발명의 형광 표지 복합체는, 켄칭된 채로, 여기광의 조사에 의해서도 형광을 발하지 않는다. 따라서 상기 형광 표지 복합체를 첨가한 측정용 시료는, 세정 등의 공정을 거치지 않고, 그대로 항원 농도 측정 및/또는 검출에 제공할 수 있고, 이것이 본 발명의 항원 농도 측정·검출용 키트 및 본 발명의 항원 농도 측정·검출 방법의 큰 특징 중 하나이다.
본 발명에서의 측정용 시료 중의 형광의 검출 방법은, 형광 색소로부터 발하여지는 형광을 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 상기 반응 후의 측정용 시료에 여기광을 조사하여 형광 색소의 형광 강도를 측정 및/또는 검출하는 것이면 된다. 조사하는 여기광 및, 측정 및/또는 검출하는 형광의 파장은, 사용하는 형광 색소의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 형광 색소에 CR110을 이용한 경우에는 여기광 파장 480 nm와 형광 파장 530 nm, TAMRA를 이용한 경우에는 여기광 파장 530 nm와 형광 파장 580 nm, ATTO655를 이용한 경우에는 여기광 파장 630 nm와 형광 파장 680 nm의 조합으로 할 수 있다. 또한, 2종류의 상이한 형광 색소를 이용하는 경우에도, 항원 농도를 측정 및/또는 항원을 검출할 수 있는, 여기광 파장 및 형광 파장의 조합을 적절히 선택하여 사용하면 된다. 예컨대, 본 발명의 형광 표지 복합체와 반응시킨 측정용 시료에, 상기 형광 표지 복합체에 포함되는 형광 색소 중 어느 하나에 알맞은 여기 파장의 광을 조사하고, 형광 스펙트럼을 취득하는 것을 2종 양쪽의 형광 색소에 관해 행함으로써, 항원 농도 측정·검출에 최적인 여기광 파장 및 형광 파장의 조합을 특정할 수 있다. 예컨대, 여기광 파장과 형광 파장의 조합으로서, 어느 한쪽의 형광 색소에 알맞은 여기광 파장 및 형광 파장의 조합을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 여기광 파장 및 형광 파장이 짧은 쪽의 형광 색소에 알맞은, 여기광 파장 및 형광 파장의 조합을 들 수 있다. 또 형광은, 형광 스펙트럼으로서 검출해도 좋고, 특정한 파장에서의 광 강도로서 검출해도 좋고, 예컨대, CR110과 TAMRA의 조합을 사용하는 경우에는, 여기광 파장을 480 nm로 하고, 파장 530 nm의 형광을 검출할 수도 있고, 파장 515 nm∼650 nm의 형광 스펙트럼으로서 검출할 수도 있다. 2종류의 상이한 형광 색소 중 어느 한쪽에 알맞은 여기광 파장 및 형광 파장의 조합은, 항원 비존재시의 FRET(형광 공명 에너지 이동 : 형광 공명 에너지 전이) 효과에 의한 백그라운드의 저감을 효율적으로 검출할 수 있고, 보다 고감도로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서 형광 검출에 이용하는 광원이나 측정 장치는 적절히 선택할 수 있고, 광원은 여기광 파장을 조사할 수 있는 것이면 되고, 광원으로는 수은 램프, 크세논 램프, LED, 레이저광 등을 들 수 있고, 적당한 필터를 이용하여 특정한 파장의 여기광을 얻을 수 있다. 형광 측정 장치는, 형광 관찰에 통상 이용되는 디바이스를 이용할 수 있고, 여기광의 광원 및 그 조사 시스템, 형광 화상 취득 시스템을 구비한 현미경 등을 적절히 이용할 수 있고, MF20/FluoroPoint-Light(올림푸스사 제조)나 FMBIO-III(히타치 소프트웨어 엔지니어링사 제조) 등을 예시할 수 있다. 형광 강도와 항원의 농도는 양의 상관 관계에 있기 때문에, 농도가 이미 알려진 항원을 포함하는 피검 물질을 이용했을 때의 형광 강도를 측정하여 항원 농도와 형광 강도의 관계를 나타내는 표준 곡선을 작성하고, 이 표준 곡선으로부터, 농도가 알려지지 않은 항원 농도를 산출할 수 있다. 이러한 항원 농도의 산출은, 미리 작성된 표준 곡선에 기초하여 설정된 변환식 등에 의해 자동적으로 항원량을 산출할 수도 있다. 또 형광의 검출은, 형광 스펙트럼의 검출이어도 좋고, 특정 파장의 형광 강도의 검출이어도 좋다.
또한, 본 발명의 형광 표지 복합체를 비인간 동물에게 투여한 경우에는, 그 체액이나 조직 등을 채취하는 것 외에, 비인간 동물의 검출 대상 영역에 여기광을 조사하여, 형광 색소의 형광을 2차원 또는 3차원적으로 측정 및/또는 검출할 수도 있고, 이 경우, 형광 현미경이나 형광 이미지 애널라이저, 광원을 구비한 내시경 등을 사용하는 예를 들 수 있다. 또한, 검출시에는, 내시경, X선, CT, MRI, 초음파, 현미경 등을 이용하여, 비인간 동물의 개체, 조직, 또는 세포의 구조를 나타내는 화상도 아울러 취득하는 것이 바람직하다. 측정 및/또는 검출된 형광 강도와 항원량은 양의 상관 관계에 있기 때문에, 검출된 형광의 2차원 또는 3차원적 화상에 기초하여, 항원의 국재(위치) 및/또는 양을 알 수 있고, 이 때 상기 구조를 나타내는 화상과 비교할 수도 있다. 이들 형광의 검출시에는, 본 발명의 형광 표지 복합체를 포함하지 않거나, 또는 검체를 포함하지 않는 측정용 시료 등을 네거티브 컨트롤로서 조제하고, 함께 측정 및/또는 검출하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 네거티브 컨트롤에서의 형광 측정치로, 측정용 시료에서의 형광 측정치를 나눈, 형광 강도비를 이용하여, 항원량의 측정 등을 행할 수도 있다. 혹은, 본 발명에 있어서 형광 강도와 항원량은 양의 상관 관계에 있기 때문에, 적절히 설정한 임계치를 초과하는 형광 강도가 얻어진 경우에, 측정 시료 중에 항원이 존재하는 것으로 판정할 수도 있다.
이상과 같이, 본 발명에 의하면, ELISA법, 면역 확산법, 라텍스 응집법, 이뮤노 크로마토법, 표면 플라즈몬 공명법 등의 면역 측정법으로 측정할 수 있는 모든 항원류를 검출할 수 있다. 예컨대, 저분자 물질에 대한 면역 측정법은, 일반적으로는 경합 ELISA법이 이용되고 있지만, 본 발명에 의한 저분자 물질의 검출 측정은, 수법의 간편함, 측정 감도나 SN 비 등에서 경합 ELISA법보다 우수하고, 가장 그 능력을 발할 수 있다. 예컨대, 암페타민, 메탐페타민, 모르핀, 헤로인, 코데인 등의 각성제나 마약류, 아플라톡신, 스테리그마토시스틴, 네오솔라니올, 니발레놀, 푸모니신, 오크라톡신, 엔도파이트 산생 독소 등의 곰팡이독, 테스토스테론이나 에스트라디올 등의 성호르몬, 클렌부테롤이나 락토파민 등의 사료에 부정하게 이용되는 첨가물, PCB, 고시폴, 히스타민, 벤즈피렌, 멜라민, 아크릴아미드, 다이옥신 등의 유해 물질, 아세타미프리드, 이미다클로프리드, 클로르페나피르, 말라티온, 카르바릴, 클로티아니딘, 트리플루미졸, 클로로탈로닐, 스피노사드, 란네이트, 메타미도포스, 클로르피리포스 등의 잔류 농약, 비스페놀 A 등의 환경 호르몬 등을 들 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 측정 결과가 순간에 얻어지는 데다가, 검출 방법이 단순하기 때문에 검출 기기를 소형화 또한 저가격화하는 것이 가능해진다. 이러한 이점들은, 저분자 물질에 한정되지 않고, 현장에 나가 측정하는 온 사이트 분석에 위력을 발휘할 수 있다. 더구나, 측정이 용이하기 때문에, 전문가가 아니더라도 측정할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자, 전염병이나 감염증 등의 원인 바이러스나 세균, 약물 혈중 농도나 POCT를 포함하는 임상 진단 분야나 직장, 학교, 보육원이나 가정에서의 간이 건강 측정 분야, 탄저균, 보툴리누스 독소, 사린이나 VX 가스 등 테러 대책 등의 안심 안전 분야, 현장 사이드에서 측정이 필요해지는 환경 오염 물질이나 하우스 더스트 등의 환경 분야, 면역 측정을 필요로 하는 연구 개발 분야 등에서, 그 능력을 유감없이 발휘할 수 있다.
이하에 나타내는 실시예에 있어서, 본 발명을 구체적 또한 더욱 상세히 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 본 발명의 형광 표지 복합체를 이용한 균일계 형광 면역 측정법의 확립
(발현 벡터의 구축)
1) 싱글 라벨 Fab형 복합체
인간 오스테오칼신(인간 골 Gla 단백질; BGP)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 ProX(상표명) 태그(9번째의 아미노산에 대응하는 염기 서열은 TTT이고, 번역되면 MSKQIEVNFSNET ; 서열번호 1)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다. 또한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(9번째의 아미노산에 대응하는 염기 서열은 TAG이고, 번역되면 MSKQIEVNXSNET(X는 형광 표지 아미노산) ; 서열번호 2)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다(도 5). 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그(번역되면 VH는 표지되고, VL은 비표지)가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
비스페놀 A(bisphenol A)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 7)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 ProX 태그(서열번호 1) 및 GGGS5 스페이서(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS ; 서열번호 8)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다. 또한 비스페놀 A에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 9)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(서열번호 2) 및 GGGS5 스페이서(서열번호 8)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다(도 5). 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그(번역되면 VH는 표지되고, VL은 비표지)가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
혈청 알부민(SA)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 ProX 태그(서열번호 1) 및 GGGS2 스페이서(GGGSGGGS ; 서열번호 11)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다. 또한 혈청 알부민(SA)에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(서열번호 2) 및 GGGS5 스페이서(서열번호 8)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다(도 5). 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그(번역되면 VH는 표지되고, VL은 비표지)가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
2) 동색 더블 라벨 Fab형 복합체
BGP에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다. 또한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다. 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그(앰버)가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
혈청 알부민(SA)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2) 및 GGGS2 스페이서(서열번호 11)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다. 또한 SA에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2) 및 GGGS2 스페이서(서열번호 11)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다. 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그(앰버)가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
3) 이색 더블 라벨 Fab형 복합체
BGP에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 CGGG4 염기 코돈을 포함하는 ProX 태그(9번째의 아미노산에 대응하는 염기 서열은 CGGG이고, 번역되면 서열번호 2)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다. 또한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다(도 5). 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
혈청 알부민(SA)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 CGGG4 염기 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2) 및 GGGS2 스페이서(서열번호 11)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 FLAG 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터(로슈·다이아그노스틱스사 제조)에 삽입했다. 또한 SA에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열에, N 말단에 앰버 코돈을 포함하는 ProX 태그(번역되면 서열번호 2) 및 GGGS2 스페이서(서열번호 11)의 DNA 서열을, C 말단에 링커(서열번호 14) 및 His 태그의 DNA 서열을 부여한 유전자를, pIVEX2.3d 벡터에 삽입했다. 이들의 구축한 발현 벡터는, 삽입한 VL 또는 VH의 N 말단에 ProX 태그가, C 말단에 His 태그 또는 FLAG 태그가, 각각 부가되도록 설계되어 있다.
(형광 표지 Fab형 복합체의 합성)
RYTS(상품명) 대장균 무세포 합성 키트(프로테인·익스프레스사 제조)를 이용하여, 무세포 번역계에 의한 항체 가변 영역 함유 펩티드 및/또는 항체 가변 영역 함유 펩티드의 N 말단 영역에 형광 표지 아미노산을 도입했다.
1) 싱글 라벨 또는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체
반응액(60 μL)은, 3 μL의 효소 믹스, 0.6 μL의 메티오닌, 30 μL의 2×반응 믹스, 20 μL의 이-콜라이 용해물, 2 μL의 2종류의 플라스미드 DNA(각 200 ng), 3 μL의 형광 표지 아미노아실-tRNA앰버(480 pmol), 1.4 μL의 뉴클레아제 비포함 물(Nuclease Free Water)을 첨가했다. 형광 표지 단백질을 제조하기 위한 형광 표지 아미노아실-tRNA(TAMRA-X-AF-tRNA앰버, CR110-X-AF-tRNA앰버, 및 ATTO655-X-AF-tRNA앰버)는, CloverDirect(상표명) 부위 지정 단백질 작용화를 위한 tRNA 시약(tRNA Reagents for Site-Directed Protein Functionalization)(프로테인·익스프레스사 제조)을 이용했다. 반응액은, 20℃, 2시간으로 정치하여 반응시켜 단백질 합성을 행한 후, 또한, 4℃, 16시간의 반응에 의해 복합화 형성을 완성시켰다. 반응 종료 후, 반응액 0.5 μL를 이용하여 SDS-PAGE(15%)를 행하고, 형광 이미지 애널라이저(FMBIO-III ; 히타치 소프트웨어 엔지니어링사 제조)로 단백질 발현을 관찰했다. 또한, 항His 태그 항체 또는 항FLAG 태그 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 행하여, 원하는 형광 표지 항체 가변 영역 함유 펩티드가 합성되어 있는 것을 확인했다.
2) 이색 더블 라벨 Fab형 복합체
반응액(60 μL)은, 3 μL의 효소 믹스, 0.6 μL의 메티오닌, 30 μL의 2×반응 믹스, 20 μL의 이-콜라이 용해물, 2 μL의 2종류의 플라스미드 DNA(각 200 ng), 1.5 μL의 2종류의 형광 표지 아미노아실-tRNA앰버 및 CGGG(각각 480 nmol), 1.4 μL의 뉴클레아제 비포함 물을 첨가했다. 형광 표지 단백질을 제조하기 위한 형광 표지 아미노아실-tRNA(TAMRA-X-AF-tRNA앰버 또는 CGGG, CR110-X-AF-tRNA앰버 또는 CGGG, 및 ATTO655-X-AF-tRNA앰버 또는 CGGG)는, CloverDirect(상표명) 부위 지정 단백질 작용화를 위한 tRNA 시약(프로테인·익스프레스사 제조)을 이용했다. VH 영역 함유 폴리펩티드나 VL 영역 함유 폴리펩티드의 표지에는, 각각 tRNAamber, tRNACGGG가 사용된다. 반응액은, 20℃, 2시간으로 정치하여 반응시켜 단백질 합성을 행한 후, 또한, 4℃, 16시간의 반응에 의해 복합화 형성을 완성시켰다. 반응 종료 후, 반응액 0.5 μL를 이용하여 SDS-PAGE(15%)를 행하고, 형광 이미지 애널라이저(FMBIO-III ; 히타치 소프트웨어 엔지니어링사 제조)로 단백질 발현을 관찰했다. 또한, 항His 태그 항체 또는 항FLAG 태그 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 행하여, 원하는 형광 표지 항체 가변 영역 함유 펩티드가 합성되어 있는 것을 확인했다.
3) 한쪽이 형광 색소, 다른쪽이 상기 형광 색소를 소광하는 켄처에 의해 표지된 Fab형 복합체
형광 색소로서 TAMRA, 켄처로서 NBD-X, SE(Anspec사)를 사용했다. NBD-X-AF-tRNACGGG는 아베 등의 방법(Abe R, et al., J. Biosci. Bioeng. 110(1) : 32-38(2010))의 TAMRA-X, SE를 각각 NBD-X, SE(Anspec사)로 바꾸어 합성했다. 반응액(60 μL)은, 3 μL의 효소 믹스, 0.6 μL의 메티오닌, 30 μL의 2×반응 믹스, 20 μL의 이-콜라이 용해물, 2 μL의 2종류의 플라스미드 DNA(각 200 ng), 1.5 μL의 TAMRA-X-AF-tRNA앰버 및 NBD-X-AF-tRNACGGG(각각 480 nmol), 1.4 μL의 뉴클레아제 비포함 물을 첨가했다. VH 영역 함유 폴리펩티드나 VL 영역 함유 폴리펩티드의 표지에는, 각각 tRNAamber, tRNACGGG가 사용된다. 반응액은, 20℃, 2시간으로 정치하여 반응시켜 단백질 합성을 행한 후, 또한, 4℃, 16시간의 반응에 의해 복합화 형성을 완성시켰다. 반응 종료 후, 반응액 0.5 μL를 이용하여 SDS-PAGE(15%)를 행하고, 형광 이미지 애널라이저(FMBIO-III ; 히타치 소프트웨어 엔지니어링사 제조)로 단백질 발현을 관찰했다. 또한, 항His 태그 항체 또는 항FLAG 태그 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 행하여, 원하는 형광 표지 항체 가변 영역 함유 펩티드가 합성되어 있는 것을 확인했다.
(형광 표지 Fab형 복합체의 정제)
합성한 형광 표지 Fab형 복합체는, 항FLAG M2 어피니티겔(시그마 알도리치사 제조)이나 His-스핀 트랩 컬럼(GE 헬스케어사 제조)에 의해 정제를 행했다. 상기 반응액(60 μL)을, 항FLAG M2 어피니티겔을 넣은 컬럼에 어플라이하고, 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에 세척 버퍼(20 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)/0.5 M NaCl/0.1% 폴리옥시에틸렌(23)라우릴 에테르)로 3회 세정을 행했다. 다음으로 200 μL의 용출 버퍼(20 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)/0.5 M NaCl/100 μg FLAG 펩티드/0.1% 폴리옥시에틸렌(23)라우릴 에테르)로 3회 용출시켰다. 다음으로 용출액은, His-스핀 트랩 컬럼에 어플라이했다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에 세척 버퍼(20 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)/0.5 M NaCl/60 mM 이미다졸/0.1% 폴리옥시에틸렌(23)라우릴 에테르)로 3회 세정을 행했다. 다음으로 200 μL의 용출 버퍼(20 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)/0.5 M NaCl/0.5 M 이미다졸/0.1% 폴리옥시에틸렌(23)라우릴 에테르)로 3회 용출시켰다. 또한 용출액은, 아미콘울트라 0.5 원심식 필터 10 kDa(밀리포어사 제조)을 사용하고, PBS(+0.05% Tween20)로 버퍼 교환, 농축을 행했다. 정제 후의 샘플의 농도는, 형광 이미지 애널라이저(FMBIO-III ; 히타치 소프트웨어 엔지니어링사 제조)를 이용하여 측정했다.
(Q-바디의 제조)
TAMRA로 표지한 항BGP 항체의 VH와 VL(VH를 표지하고 VL은 미표지), 및 TAMRA로 표지한 항BGP 항체와 항비스페놀 A 항체의 VH와 VL을 링커(GGGGSGGGGSGGGGS)에 의해 결합시킨 단일쇄 항체(scFv)의 제조는, 국제 공개 공보 WO2011/061944에 기재된 방법에 의했다.
실시예 2
2. 본 발명의 형광 표지 복합체를 이용한 균일계 형광 면역 측정법에 의한 측정
(싱글 라벨 Fab형 복합체를 이용한 형광 스펙트럼 측정)
실시예 1에서 제조한, BGP(인간 오스테오칼신)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA 형광으로 표지한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, TAMRA 싱글 라벨 항BGP 항체 Fab형 복합체, 또는 TAMRA 표지 항BGP 항체 scFv, 또는 TAMRA 표지 항BGP 항체 VH+항BGP 항체 VL을 이용하여, BGP 농도를 측정했다. TAMRA 싱글 라벨 항BGP 항체 Fab형 복합체, 또는 TAMRA 표지 항BGP scFv(70 nM, 6.25 μL), 또는 TAMRA 표지 항BGP 항체 VH+항BGP 항체 VL(70 nM/mL, 6.25 μL)과, 항원인 BGP-C7(서열번호 13)(0, 1, 3, 10, 25, 100, 또는 1,000 nM)을, 1% BSA를 포함하는 PBS(+0.05% Tween20)로 합계 50 μL가 되도록 조제했다. 이 용액을 25℃, 70분간 방치한 후에, 형광 분광 광도계(FluoroMax-4 ; 호리바·조반이본사 제조)를 이용하여 형광 스펙트럼 측정을 행했다. 543 nm의 He-Ne 레이저를 이용하여, 여기 파장은 530 nm에 세트하고 580 nm에서의 형광 강도를 측정했다. 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 도 6 좌측 위의 그래프에, BGP-C7이 1,000 nM인 경우의 형광 강도의 비를 도 6 좌측 아래의 표에 나타낸다. 동일하게 하여, TAMRA 형광으로 표지한 비스페놀 A에 대한 항체의 VL(서열번호 7)과 Cκ(서열번호 4)를 포함하는 폴리펩티드와, 비스페놀 A에 대한 항체의 VH(서열번호 9)와 CH1(서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, TAMRA 싱글 라벨 항비스페놀 A 항체 Fab형 복합체 또는, TAMRA 표지 항비스페놀 A 항체 scFv와, 비스페놀 A(0, 1, 3, 10, 30, 100, 또는 1,000 nM)를 반응시키고, 형광 강도를 측정했다. 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 도 6 우측 위의 그래프에, 비스페놀 A가 1,000 nM인 경우의 형광 강도의 비를 도 6 우측 아래의 표에 나타낸다. 형광 색소의 종류나 항원 농도에 상관없이, 본 발명의 싱글 라벨 Fab형 복합체는, 종래의 scFv형 Q-바디나 VH+VL형 Q-바디와 비교하여 높은 형광 강도비를 얻을 수 있고, 고감도로 저분자 화합물 및 단백질을 검출 및 정량할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 Fab형 복합체는, scFv형 Q-바디나 VH+VL형 Q-바디와 비교하여 그 구성 요소인 폴리펩티드끼리가 서로 가까운 거리가 되는 복합체를 형성하기 때문에, 항체의 가변 영역의 트립토판에 의한 형광 색소의 켄칭 효과가 효과적으로 발생하는 것으로 생각된다.
실시예 3
(동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 이용한 형광 스펙트럼 측정)
실시예 1에서 제조한, CR110, TAMRA, 또는 ATTO655의 형광 색소로 표지한 BGP에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, 동일한 색소로 표지된 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 동색 더블 라벨 Fab형 복합체(70 nM, 6.25 μL)와, 항원인 BGP-C7(0∼10,000 nM)을, 1% BSA를 포함하는 PBS(+0.05% Tween20)로 합계 50 μL가 되도록 조제했다. 컨트롤로서, BGP에 대한 항체 VL(서열번호 5)과 Cκ(서열번호 4)를 포함하는 폴리펩티드 또는 BGP에 대한 항체 VH(서열번호 3)와 CH1(서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 형광 표지된 싱글 라벨 Fab형 복합체의 샘플을 준비했다. 이들 용액을 25℃, 70분간 방치한 후에, 형광 분광 광도계(FluoroMax-4 ; 호리바·조반이본사 제조)를 이용하여 형광 스펙트럼 측정을 행했다. CR110 형광 색소 표지 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 사용한 경우에는, 여기 파장(Ex)은 480 nm에 세트하고, 형광 파장(Em) 530 nm에서의 형광 강도를 측정했다. TAMRA 형광 색소 표지 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 사용한 경우에는, 여기 파장은 530 nm에 세트하고, 형광 파장 580 nm에서의 형광 강도를 측정했다. ATTO655 형광 색소 표지 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 사용한 경우에는, 여기 파장은 630 nm에 세트하고, 형광 파장 680 nm에서의 형광 강도를 측정했다. 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 형광 강도비로 하여, 도 7의 그래프에 나타낸다. BGP-C7이 1,000 nM, 또는 10,000 nM인 경우의 형광 강도의 비를 도 7의 표에 나타낸다.
또한 동일하게 하여, 혈청 알부민(SA)에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, 동일한 색소로 표지된 SA에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체와, 항원인 HSA(0∼100 μM)를 반응시키고, 형광 강도를 측정했다. 형광 강도비를 도 8의 그래프에, HSA가 100 μM인 경우의 형광 강도의 비를 도 8의 표에 나타낸다. 이상의 결과로부터, 형광 색소나 항원의 종류에 상관없이, 본 발명의 동색 더블 라벨 Fab형 복합체는, 싱글 라벨 Fab형 복합체보다 높은 형광 강도비로 항원량을 측정할 수 있는 것으로 확인할 수 있었다. 동색 더블 라벨 Fab형 복합체에서는, 항체의 가변 영역의 트립토판에 의한 형광 색소의 켄칭 효과에 덧붙여, 형광 색소 사이에서의 켄칭 효과(H-다이머)가 부가됨으로써, 백그라운드를 저감시킬 수 있고, 다이나믹 레인지가 증강되는 것으로 생각된다.
실시예 4
(이색 더블 라벨 Fab형 복합체를 이용한 형광 스펙트럼 측정)
실시예 1에서 제조한, CR110, TAMRA, 또는 ATTO655의 형광 색소로 표지한 BGP에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, 상기와 상이한 색소로 표지한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, BGP 항체의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체(70 nM, 6.25 μL)와, 항원인 BGP-C7(0∼1,000 nM)을, 1% BSA를 포함하는 PBS(+0.05% Tween20)로 합계 50 μL가 되도록 조제했다. 컨트롤로서, 동색 더블 라벨 Fab형 복합체의 샘플을 준비했다. 실시예 3과 동일하게 형광 강도를 상정하고, 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 얻었다. 또, CR110 및 TAMRA를 이용한 경우에는, 여기 파장은 480 nm에 세트하고, 형광 파장 530 nm에서의 형광 강도를 측정했다(도 9 좌측 그래프). CR110, TAMRA, 및 ATTO655를 이용한 경우에는, 여기 파장은 530 nm에 세트하고, 형광 파장 580 nm에서의 형광 강도를 측정했다(도 9 중앙 그래프). TAMRA 및 ATTO655를 이용한 경우에는, 여기 파장은 630 nm에 세트하고, 형광 파장 680 nm에서의 형광 강도를 측정했다(도 9 우측 그래프). BGP-C7이 1,000 nM인 경우의 형광 강도의 비를 도 9의 각 표에 나타낸다.
또한 동일하게 하여, 실시예 1에서 제조한, CR110, TAMRA, 또는 ATTO655의 형광 색소로 표지한 SA에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드와, 상기와 상이한 색소로 표지된 SA에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, SA 항체의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체와, 항원인 HSA(0∼100 μM)를 반응시키고, 형광 강도를 측정했다. 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 형광 강도비로 하여, 도 10의 그래프에 나타낸다. HSA가 100 μM에서의 형광 강도비를 도 10의 표에 나타낸다.
또한, CR110으로 표지한 항SA 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 12)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지한 항SA 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 10)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 항SA 항체의 이색 더블 라벨 Fab형 복합체(CR110_TAMRA라고도 표기함)와, 항원인 HSA(1×10-4, 1×10-5, 1×10-6, 1×10-7 M)를 반응시키고, 파장 480 nm(도 11 좌측 위 그래프) 또는 파장 530 nm(도 11 우측 위 그래프)의 여기광을 조사하고, 형광 스펙트럼을 측정했다. 또한, CR110으로 표지한 항SA 항체 VH(서열번호 12)와 CH1(서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드와, 항SA 항체 VL(서열번호 10)과 Cκ(서열번호 4)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 항SA 항체의 CR110 싱글 라벨 Fab형 복합체(CR110_no)와, 항원인 HSA(1×10-4, 1×10-5, 1×10-6, 1×10-7 M)를 반응시키고, 파장 480 nm의 여기광을 조사하고, 형광 스펙트럼을 측정했다(도 11 좌측 아래 그래프). 항SA 항체 VH(서열번호 12)와 CH1(서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지한 항SA 항체 VL(서열번호 10)과 Cκ(서열번호 4)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, SA 항체의 TAMRA 싱글 라벨 Fab형 복합체(no_TAMRA)와, 항원인 HSA(1×10-4, 1×10-5, 1×10-6, 1×10-7 M)를 반응시키고, 파장 530 nm의 여기광을 조사하고, 형광 분광 광도계(FluoroMax-4)를 이용하여 형광 스펙트럼을 측정했다(도 11 우측 아래 그래프). 그래프에서의 곡선은, 상측으로부터 HSA 농도가 1×10-4 M, 1×10-5 M, 1×10-6 M, 1×10-7 M, 0 M의 샘플 데이터이다.
이 결과로부터, 이색 더블 라벨 Fab형 복합체 CR110_TAMRA에서는, 파장 480 nm의 여기광을 조사한 경우에 항원 비존재하에서의 약 530 nm의 파장의 형광이 FRET 효과에 의해 억제되어 있고, 그 때문에 약 530 nm의 파장에 있어서 높은 형광 강도의 비를 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 파장 530 nm의 여기광을 조사한 경우에도, 형광 색소 사이에서의 켄칭 효과에 의해, 형광 파장 약 530 nm에서, CR110_TAMRA는 no_TAMRA와 비교하여 높은 형광 강도의 비를 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 항체의 가변 영역의 트립토판에 의한 형광 색소의 켄칭 효과에 덧붙여, 형광 색소 사이에서의 켄칭 효과, 또한 FRET 효과가 부가됨으로써 백그라운드를 저감시킬 수 있고, 다이나믹 레인지가 증강되는 것으로 생각된다. 본 실험계에서 CR110_TAMRA는 최대 75배나 되는 형광 증가에 의해 항원을 검출할 수 있어, 본 발명의 유용성이 밝혀졌다.
실시예 5
(형광 표지와 켄처 표지를 포함하는 Fab형 복합체를 이용한 형광 스펙트럼 측정)
실시예 1에서 제조한, TAMRA 표지한 BGP에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 3)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)과 NBD로 표지한 BGP에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 5)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드로 이루어지는 Fab형 복합체(70 nM, 6.25 μL)와, 항원인 BGP-C7(0∼10,000 nM)을, 1% BSA를 포함하는 PBS(+0.05% Tween20)로 합계 50 μL가 되도록 조제했다. 이 용액을 25℃, 70분간 방치한 후에, 형광 분광 광도계(FluoroMax-4 ; 호리바·조반이본사 제조)를 이용하여 형광 스펙트럼 측정을 행했다. 여기 파장은 530 nm에 세트하고, 형광 파장 580 nm에서의 형광 강도를 측정했다. 항원이 없는 경우의 형광 강도에 대한, 각 항원 농도에서의 형광 강도의 비를 형광 강도비로 하여, 도 12의 그래프에 나타낸다. BGP-C7이 1,000 nM인 경우의 형광 강도의 비를 도 12의 표에 나타낸다.
이 결과로부터, Fab형 복합체 TAMRA_NBD는, 싱글 라벨 Fab형 복합체(TAMRA_No)(도 7)와 동일한 정도의 1 nM의 농도로 BGP를 검출할 수 있으며, 또한 더블 라벨(TAMRA_TAMRA)(도 7)보다 높은 27배의 형광 증가에 의해 항원을 검출할 수 있어, 본 발명의 유용성이 밝혀졌다.
실시예 6
(온도 안정성의 측정)
실시예 1에서 제조한 항BGP_TAMRA 싱글 라벨 Fab 복합체와 항BGP_TAMRA 라벨 scFv의 열 안정성을 측정하기 위해, 서멀 시프트 아세이를 행했다. 스텝원(StepOne) 리얼 타임 PCR 시스템(어플라이드 바이오 시스템즈사)을 이용하여 1분간에 1℃씩 온도를 상승시켜, 각 온도에서의 형광 강도를 측정했다. 각각의 항체가 열 변성을 일으키면, 그 구조가 붕괴되어 소광 상태가 해소되고 형광 강도가 증가하는 원리에 기초하여, 열 안정성을 측정했다. 도 13에 도시한 바와 같이, TAMRA 라벨 scFv의 Tm치(열 변성을 일으키는 온도)는 61℃였지만, 본 발명인 TAMRA 싱글 라벨 Fab 복합체의 Tm치는 73℃로 12℃ 상승했다. 이 열 안정성은, 시약의 장기 보존이 가능해지고 유통 온도, 보존 온도, 보존 기간 등 산업상의 메리트에 크게 공헌할 수 있다.
실시예 7
(형광 라벨 Fab형 복합체에 의한 클렌부테롤의 측정)
실시예 1에 나타낸 방법으로 합성한 클렌부테롤에 대한 항체의 CR110으로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 15)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 클렌부테롤에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 16)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 이색 더블 라벨 Fab형 복합체와, 항원인 클렌부테롤(0∼16 μg/mL)을 반응시키고, 실시예 4의 방법으로 형광 강도를 측정했다. 클렌부테롤이 16 μg/mL인 경우의 형광 강도의 비를 표 1에 나타낸다. 이 결과, 16 μg/mL의 클렌부테롤을 측정할 수 있었다.
Figure 112014048712900-pct00001
실시예 8
(형광 라벨 Fab형 복합체에 의한 락토파민, 코티닌의 측정)
실시예 1에 나타낸 방법으로, 락토파민에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 17)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 락토파민에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 18)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 또한, 코티닌에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 19)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 코티닌에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 20)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 계속해서, 각각 항원인 락토파민 3.4 μg/mL 또는 코티닌 3.5 μg/mL를 반응시키고, 실시예 4의 방법으로 형광 강도를 측정했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 형광 증가비 형광 강도비를 2.3 및 1.9로 측정할 수 있었다.
Figure 112014048712900-pct00002
실시예 9
(형광 라벨 Fab형 복합체에 의한 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌(HA)의 측정)
실시예 1에 나타낸 방법으로 합성한 인플루엔자 A형 H5N1, H1N1의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체의 CR110으로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 21)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 인플루엔자 A형 H5N1, H1N1의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 22)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 이색 더블 라벨 Fab형 복합체와, 각각의 항원 30 μg/mL를 반응시키고, 실시예 4의 방법으로 형광 강도를 측정했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, H5N1 HA, 및 H1N1 HA 각각의 항원에 대하여, 형광 증가비는 각각 6.1 및 7.1로 측정할 수 있었다.
Figure 112014048712900-pct00003
실시예 10
(형광 라벨 Fab형 복합체에 의한 모르핀류, 메탐페타민류, 코카인의 측정)
실시예 1에 나타낸 방법으로 합성한 모르핀에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 23)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 모르핀에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 24)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 마찬가지로, 메탐페타민에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 25)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 메탐페타민에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 26)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체, 코카인에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 27)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 코카인에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 28)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 또한, 실시예 1에 따라, TAMRA로 표지한 항모르핀 항체의 VL과 VH를 링커(GGGGSGGGGSGGGGS)에 의해 결합시킨 단일쇄 항체(scFv)와, 항메탐페타민 항체의 VH와 VL을 링커(GGGGSGGGGSGGGGS)에 의해 결합시킨 단일쇄 항체(scFv)를 제조했다. 구축한 TAMRA 더블 라벨 Fab 복합체 및 TAMRA 라벨 scFv와 여러가지 모르핀류, 메탐페타민류, 코카인, 케타민을 반응시키고, 실시예 3 또는 실시예 1의 방법으로 형광 강도를 측정했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 3종류의 형광 표지 Fab 복합체는 특이적으로 각각의 항원을 인식하며, 또한 형광 표지 모르핀 Fab 복합체와 scFv의 비교, 형광 표지 메탐페타민 Fab 복합체와 scFv의 형광 증가비는, 모두 Fab 복합체가 높고, 다이나믹 레인지가 크게 증대되었다.
Figure 112014048712900-pct00004
실시예 11
(형광 라벨 Fab형 복합체에 의한 대마 성분 THC와 케타민의 측정)
실시예 1에 나타낸 방법으로, 대마 성분 THC에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 29)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 대마 성분 THC에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 30)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 마찬가지로, 케타민에 대한 항체의 TAMRA로 표지된 경쇄 가변 영역(VL ; 서열번호 31)과 항체 경쇄 불변 영역(Cκ ; 서열번호 4)을 포함하는 폴리펩티드와, TAMRA로 표지된 케타민에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(VH ; 서열번호 32)과 항체 중쇄 불변 영역(CH1 ; 서열번호 6)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 동색 더블 라벨 Fab형 복합체를 합성했다. 계속해서, 각각 항원인 THC(100 μg/mL) 또는 케타민(1.0 mg/mL)을 반응시키고, 실시예 4의 방법으로 형광 강도를 측정했다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 형광 증가비 형광 강도비를 1.3 및 2.0으로 측정할 수 있었다.
Figure 112014048712900-pct00005
산업상 이용 가능성
본 발명은, 시료 분석이나 약물 검사의 분야나, 휴대형 시료 분석 키트의 분야 등에 있어서 유용하게 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Ushio Denki Kabushiki Kaisha <120> Fluoroimmunoassay using fluorescence labeled complex composed of VH and VL containing polypeptides <130> 08227 <150> JP 2011-241402 <151> 2011-11-02 <160> 32 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventor: Ueda, Hiroshi; Abe, Ryoji; Takagi, Hiroaki <220> <223> ProX tag <400> 1 Met Ser Lys Gln Ile Glu Val Asn Phe Ser Asn Glu Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ProX tag containing a fluorescent amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is a fluorescent amino acid. <400> 2 Met Ser Lys Gln Ile Glu Val Asn Xaa Ser Asn Glu Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-BGP antibody VH <400> 3 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Ala Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide Ck <400> 4 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-BGP antibody VL <400> 5 Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Lys Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Ser Thr Ser Val Gly Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide CH1 <400> 6 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys 100 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-bisphenol A antibody VL <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Ile Lys Tyr Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu 85 90 95 Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> spacer GGGS5 <400> 8 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-bisphenol A antibody VH <400> 9 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-SA antibody VL <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Asp Arg Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> spacer GGGS2 <400> 11 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-SA antibody VH <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser His Ile Ser Pro Tyr Gly Ala Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide BGP-C7 <400> 13 Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker GGGS <400> 14 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Clen-VL-15 <400> 15 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Arg Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Lys Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Clen-VH-16 <400> 16 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Asp Gly Asn Asp Glu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ract-VL-17 <400> 17 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 18 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ract-VH-18 <400> 18 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ala Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Coti-VL-19 <400> 19 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Ala 20 25 30 Lys Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Gly Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Gly Pro 85 90 95 Asp Trp Tyr Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg 100 105 110 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Coti-VH-20 <400> 20 Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile His Gly Asn Arg Gly Phe Asn Tyr His Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg 65 70 75 80 Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Ala Asp Asp Ser Gly Ser His Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Infl-VL-21 <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Phe Asn 20 25 30 Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 85 90 95 Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 22 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Infl-VH-22 <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Ala Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser 100 105 110 Gln Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 23 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Morp-VL-23 <400> 23 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Morp-VH-24 <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Gln Val His Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Meth-VL-25 <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Phe Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Meth-VH-26 <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Ser Thr Arg Phe 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Phe His Tyr Ser Gly Gln Leu Asp Thr Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Lys Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Coca-VL-27 <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Phe 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Coca-VH-28 <400> 28 Asp Val Thr Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Val Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Lys Tyr Thr Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Val Pro Gln Leu Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> THC-VL-29 <400> 29 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> THC-VH-30 <400> 30 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Val Met Val Trp Leu Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Gly Thr Thr Ile Val Ala Gly Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Keta-VL-31 <400> 31 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ser Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Keta-VH-32 <400> 32 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ala Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Gly Tyr Phe Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (19)

  1. 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 둘 다가 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구비한 키트로서,
    액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것인 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  3. 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구비한 키트로서,
    액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하고,
    복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  4. 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 하나가 형광 색소에 의해 표지되고, 다른 하나가 형광 색소를 켄칭하는 켄처에 의해 표지되고, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 구비한 키트로서,
    액상 중의 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 항원 농도의 측정 또는 항원의 가시화를 가능하게 하고,
    형광 색소는 항원의 부재 하에서 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 내의 트립토판 잔기 및 켄처에 의해 소광되는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것인 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  6. 제1항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 동일한 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  7. 제1항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 상이한 종류의 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 색소가, 로다민계 형광 색소 및 옥사진계 형광 색소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 형광 색소가, 카르복시로다민 110, 카르복시테트라메틸로다민 및 ATTO655(상표명)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  10. 제4항에 있어서, 켄처가, 7-니트로벤조푸라잔(NBD)인 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출용 키트.
  11. 이하의 공정 (a)∼(c)를 순차로 구비하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법:
    (a) 액상에서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 둘 다가 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정;
    (b) 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 색소의 형광 강도를 측정하는 공정;
    (c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정.
  12. 제11항에 있어서, 복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것인 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
  13. 이하의 공정 (a)∼(c)를 순차로 구비하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법:
    (a) 액상에서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가 형광 색소에 의해 표지된, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정으로서,
    복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것인 공정;
    (b) 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 색소의 형광 강도를 측정하는 공정;
    (c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정.
  14. 이하의 공정 (a)∼(c)를 순차로 구비하는 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법:
    (a) 액상에서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 하나가 형광 색소에 의해 표지되고, 다른 하나가 형광 색소를 켄칭하는 켄처에 의해 표지되고, 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 복합체를, 측정용 시료 중의 항원에 접촉시키는 공정으로서,
    형광 색소는 항원의 부재 하에서 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 내의 트립토판 잔기 및 켄처에 의해 소광되는 공정;
    (b) 형광 색소의 형광을 검출, 또는 형광 색소의 형광 강도를 측정하는 공정;
    (c) 항원 농도와 상기 형광 색소의 형광 강도가, 양의 상관 관계에 있는 것을 지표로 하여, 검체에 포함되는 항원량을 산출, 또는 항원을 가시화하는 공정.
  15. 제14항에 있어서, 복합체는 Fab(단편, 항원 결합), F(ab')2 단편 또는 전장 항체이고, 2개의 Fab 단편은 힌지에 의해 이황화 결합된 것인 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
  16. 제11항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 동일한 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
  17. 제11항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드와 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가, 각각이 상이한 종류의 형광 색소에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이, 인간 오스테오칼신, 비스페놀 A, 혈청 알부민, 클렌부테롤, 락토파민, 코티닌, 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌, 모르핀류, 메탐페타민류, 코카인, 테트라히드로칸나비놀, 또는 케타민인 것을 특징으로 하는 항원 농도 측정 및 검출, 또는 측정 또는 검출 방법.
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