WO2015122484A1 - 大麻成分の抽出方法、大麻成分の検査用デバイス及び大麻成分の検査方法 - Google Patents

大麻成分の抽出方法、大麻成分の検査用デバイス及び大麻成分の検査方法 Download PDF

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cannabis
antibody
container
antigen
chain variable
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PCT/JP2015/053918
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富士男 斎木
亮二 阿部
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ウシオ電機株式会社
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    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
    • G01N2001/4061—Solvent extraction

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting cannabis components for inspection of cannabis, which is an illegal drug, an inspection device for use in inspection of cannabis components, and a method for inspecting cannabis components.
  • a reagent having a characteristic of showing a specific reaction color for a specific drug is used as a reagent.
  • the most widely used is called Duchenoa reagent, and the reagent reacts with THC (tetrahydrocannabinol), which is a component of cannabis, to show a color reaction (Non-patent Document 1).
  • THC tetrahydrocannabinol
  • the liquid is divided into two upper and lower layers, and the upper layer exhibits a transparent light purple color and the lower layer exhibits an opaque blue purple color.
  • the point of determination is that the liquid to which the reagent is added is divided into two layers, upper and lower, and the lower layer is blue-purple, and in reality it is difficult to determine and accurate determination is not easy.
  • Patent Document 1 the cannabis component was extracted using a 100% organic solvent
  • Patent Document 2 there has been a report that it is necessary to separate and purify hallucinatory components in cannabis by repeating operations such as liquid-liquid extraction after extraction using an organic solvent such as methanol
  • the object of the present invention is to provide a method for extracting cannabis components from cannabis plant pieces using a low alcohol concentration extraction solution.
  • an immunological measurement method using an antibody against cannabis components and utilizing an antigen-antibody reaction is desirable. Thought.
  • an organic solvent such as alcohol is essential for the extraction of cannabis components, and 100% of the organic solvent has been used for the extraction.
  • the antibody has low resistance to the organic solvent required for extraction of the cannabis component, and the cannabis component extracted with the organic solvent could not be measured using the antigen-antibody reaction.
  • the present inventors need to measure cannabis components (THC-A, THC and CBN) by immunoassay using antigen-antibody reaction in order to enable measurement of cannabis components using antigen-antibody reaction.
  • concentration of the cannabis component was examined. According to Figure 4 of Marja H.Niemi et al,, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, (2010), VOL400 (4), pages 803-814, the presence of 3 ng / mL cannabis component when using antibodies against cannabis components Can be detected.
  • the fluorescence intensity when reacted with a cannabis component having a concentration of 1 ⁇ g / mL or more is required. Therefore, the concentration of the cannabis component necessary for carrying out the antigen-antibody reaction was set to 1 ⁇ g / mL (4 ⁇ g / mL was diluted 4-fold), and subsequent studies were conducted.
  • the concentration of the cannabis component required for the antigen-antibody reaction is 1 ⁇ g / mL or more
  • the concentration of the cannabis component required for extraction is assumed to be 4 ⁇ g / mL or more when it is assumed that the specimen is diluted 4-fold during the antigen-antibody reaction. It is.
  • the present inventors prepared an extraction solution in which the content ratio of methanol used for extraction was changed, and measured the extraction amount of the cannabis component. Surprisingly, it became clear for the first time that a solution containing 30% by weight or less of methanol can be extracted in an amount exceeding the lower limit of analysis of cannabis components.
  • the present invention is as follows.
  • a method for extracting cannabis components comprising placing a target plant test piece suspected of being cannabis in a solution having an alcohol concentration of 30 wt% or less and extracting the components of the test piece into the solution.
  • the solution is a phosphate buffered saline (PBS-T) containing a surfactant, a phosphate buffered saline (PBS) containing no surfactant, or a pure water solution, [1] or [2] Cannabis component extraction method.
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • [4] The method for extracting a cannabis component according to any one of [1] to [3], wherein the alcohol is selected from the group consisting of methanol, ethanol and propanol.
  • [5] The method for extracting a cannabis component according to any one of [1] to [4], wherein the cannabis component is tetrahydrocannabinol (THC), tetrahydrocannabinolic acid (THC-A), or cannabinol (CBN).
  • THC tetrahydrocannabinol
  • THC-A tetrahydrocannabinolic acid
  • CBN cannabinol
  • a testing device used to detect cannabis components A first container and a second container;
  • the first container contains a solution having an alcohol concentration of 30 wt% or less
  • the second container contains an antibody against the cannabis component, Put the target plant test piece suspected of being cannabis in the first container, extract the components of the test piece into a solution having an alcohol concentration of 30 wt% or less
  • a test device for detecting a cannabis component that causes an antigen-antibody reaction in a second container by adding a predetermined amount of the extract in the first container to the second container.
  • the solution is a phosphate buffered saline (PBS-T) containing a surfactant, a phosphate buffered saline (PBS) containing no surfactant, or a pure water solution, [7] or [8]
  • An inspection device for detecting the cannabis component [10] The test device for detecting the cannabis component according to any one of [7] to [9], wherein the alcohol is selected from the group consisting of methanol, ethanol and propanol.
  • An antibody against a cannabis component comprises an antibody light chain variable region polypeptide and an antibody heavy chain variable region polypeptide, and one or both of the antibody light chain variable region polypeptide and the antibody heavy chain variable region polypeptide Are labeled with a fluorescent dye that is quenched in a state where the antibody heavy chain variable region polypeptide or the antibody light chain variable region polypeptide is labeled, and the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide are antigens.
  • An antibody against the cannabis component comprises an antibody light chain variable region polypeptide and an antibody heavy chain variable region polypeptide, and one or both of the antibody light chain variable region polypeptide and the antibody heavy chain variable region polypeptide Is labeled with a fluorescent dye, and when the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide bind to a cannabis component as an antigen to form a complex, the antigen and the antigen binding protein The complex becomes a quencher of the fluorescent dye, and the antigen concentration and the fluorescence intensity of the fluorescent dye are negatively correlated, and the antigen and the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide
  • the cannabis according to any one of [7] to [12], which is an antibody whose fluorescence intensity decreases when the fluorescent dye is more strongly quenched when a complex is formed Inspection device for detecting components.
  • the antibody against the cannabis component is an antibody produced by a hybridoma that produces an antibody that binds to tetrahydrocannabinol (THC) or a derivative thereof deposited internationally under accession number NITE BP-01970.
  • [17] The method for testing a cannabis component according to [16], wherein the final alcohol concentration during the antigen-antibody reaction is 7.5 wt% or less.
  • the solution is a phosphate buffered saline (PBS-T) containing a surfactant, a phosphate buffered saline (PBS) containing no surfactant, or a pure water solution, [16] or [17] The method for testing cannabis components.
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • the method for testing cannabis components [19] The method for inspecting a cannabis component according to any one of [16] to [18], wherein the alcohol is selected from the group consisting of methanol, ethanol, and propanol.
  • [20] The method for testing a cannabis component according to any one of [16] to [19], wherein the cannabis component is tetrahydrocannabinol (THC), tetrahydrocannabinolic acid (THC-A), or cannabinol (CBN).
  • THC tetrahydrocannabinol
  • THC-A tetrahydrocannabinolic acid
  • CBN cannabinol
  • the target plant test piece includes any part selected from the group consisting of leaves, stems, roots, seeds, and petals.
  • the method of the present invention is a method of extracting cannabis components from cannabis plant pieces with a solution having an alcohol concentration of 30 wt% or less, and the cannabis components extracted by the method use an antigen-antibody reaction using an extract containing alcohol as a specimen. It can be detected by an immunological assay.
  • the cannabis component can be detected by the cannabis component extraction method and the inspection method of the present invention.
  • cannabis components can be extracted and detected without using deleterious substances such as hydrochloric acid. According to the present invention, the cannabis component can be detected on-site simply and safely.
  • the present invention is a method for extracting a cannabis component for inspecting whether or not a test object which is a target plant test piece suspected of being cannabis is cannabis.
  • Cannabis is also referred to as marijuana, and it means that the corolla and leaves of Asa belonging to the Asa genus (Cannabis genus) are dried or resinized and liquefied.
  • a plant part of Asa such as a leaf, stem, root, seed and petal or a plant fragment thereof is used as a specimen.
  • these plant parts or plant pieces are used as dry cannabis in a dry state.
  • preferred test objects are these dry cannabis.
  • dried cannabis plant pieces are preferred.
  • Cannabis contains a chemical substance called cannabinoid as a cannabis component, and cannabinoid has various pharmacological actions such as euphoria, analgesic action and hallucination action.
  • cannabinoids include tetrahydrocannabinol (THC), tetrahydrocannabinolic acid (THC-A), cannabinol (CBN), and cannabidiol (CBD).
  • THC tetrahydrocannabinol
  • THC-A tetrahydrocannabinolic acid
  • CBN cannabinol
  • CBD cannabidiol
  • THC has double bond positional isomers, ⁇ 8 -THC and ⁇ 9 -THC.
  • Reference to THC includes ⁇ 8 -THC and ⁇ 9 -THC.
  • the chemical structural formulas of THC, THC-A and CBN are shown in FIG.
  • the cannabis components of THC, THC-A, and CBN have been extracted from cannabis plant pieces using an organic solvent such as methanol.
  • an organic solvent such as methanol.
  • organic solvents inhibit antigen-antibody reactions, it was not possible to directly measure cannabis components extracted with high-concentration organic solvents using antigen-antibody reactions. Therefore, it was recognized that cannabis components in cannabis plant pieces could not be extracted and the cannabis components could be measured directly using an antigen-antibody reaction using the extract.
  • a cannabis component is extracted from a cannabis plant piece using a low-concentration organic solvent, which has been conventionally recognized as being unable to extract the cannabis component, and the cannabis component extract is directly used as a sample as it is.
  • the component is measured and detected by an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction. That is, according to the present invention, it is possible to limit the use of the alcohol component when extracting the cannabis component.
  • an alcohol having a small carbon number is used, preferably methanol, ethanol, or propanol. Among these, methanol is preferable.
  • the alcohol may be diluted with water, but is preferably diluted with a buffer or physiological saline. Further, it may be used preferably diluted with phosphate buffered saline (PBS-T) containing a surfactant or phosphate buffered saline (PBS) containing no surfactant.
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • the aqueous alcohol solution for cannabis component extraction preferably contains a surfactant, but an aqueous alcohol solution that does not contain a surfactant can also be used.
  • the surfactant is not limited, but Tween-20, Tween-80 and the like are preferably used.
  • THC, THC-A or CBN is extracted at a concentration of several ⁇ g / mL or more, for example, 3 to 4 ⁇ g / mL or more. I can do it. Accordingly, it is possible to extract THC, THC-A, or CBN at a concentration that can be measured by antigen-antibody reaction even if extraction is performed with a solution containing a low concentration of alcohol or an extraction solution that does not contain alcohol. If the alcohol concentration when extracting the cannabis component is low, the cannabis component extract containing alcohol can be used as a specimen sample for immunological measurement using an antigen-antibody reaction directly.
  • Extraction is performed by placing cannabis plant pieces in an extraction solution containing alcohol and stirring, shaking, or standing. Stirring can be performed using a stirrer such as a vortex mixer. Moreover, you may extract by irradiating an ultrasonic wave. Agitation or vibration may be performed, for example, for 10 seconds to 60 minutes. Moreover, when extracting by standing, a cannabis plant piece is put into the solution for cannabis component extraction, and it should just stand for 10 seconds or more. Although the size of the cannabis plant piece is not limited, for example, it may be extracted as a 1 to 10 mm square piece. Moreover, you may extract after grind
  • the container used for extraction is not limited, and for example, a glass vial or a resin vial such as polypropylene may be used. Moreover, you may use the device which can extract a cannabis component and can also perform subsequent antigen antibody reaction.
  • the antibody is a specific antibody against the cannabis component, preferably an anti-THC antibody, an anti-THC-A antibody or an anti-CBN antibody. Since THC, THC-A and CBN have similar structures and immunologically cross-react, using either anti-THC antibody, anti-THC-A antibody or anti-CBN antibody, THC, THC -A and CBN can be measured.
  • the antibody may be a complete antibody or a functional fragment of an antibody. Examples of the functional fragment include Fab antibody, F (ab ′) 2 antibody, Fab / c antibody having one Fab and complete Fc, and the like.
  • an antibody fragment or an artificial antibody that has a region to which Protein A binds and a region to which Protein G binds and has a structure capable of binding to an antigen.
  • examples thereof include antibody fragments and artificial antibodies having a VH region to which Protein A binds and a CH1 region to which Protein G binds.
  • the term “antibody” includes functional fragments of such antibodies and artificial antibodies.
  • the antibody may be a monoclonal antibody produced by an antibody-producing hybridoma or a fragment thereof, or an antibody prepared by genetic recombination technology based on the DNA information of the monoclonal antibody produced by the hybridoma.
  • hybridoma A-04 which is dated November 20, 2014, and is a NITE Patent Microorganisms Depositary (NITE).
  • NITE NITE Patent Microorganisms Depositary
  • Fab antibody Fab antibody having one heavy chain variable region and one heavy chain CH1 region and one light chain variable region and one light chain CL region is preferable.
  • the animal from which the antibody is derived is not limited, and humans, mice, rats, rabbits, goats, horses, musk rats, sheep and the like can be used.
  • the antibody may be a labeled antibody.
  • labeled antibodies include antibodies labeled with fluorescent dyes, enzymes, chemiluminescent substances, and the like.
  • Fluorescently labeled antibodies designed to change the presence or absence of fluorescence and change in fluorescence intensity when the antibody binds to the antigen and when the antibody does not bind to the antigen.
  • the fluorescent substance used for the labeling is quenched (quenched) so that it does not emit fluorescence or is in a state of generating fluorescence of a specific wavelength.
  • the fluorescence generation state of the fluorescent dye can be changed.
  • the fluorescent dye that has been used causes the wavelength of the fluorescence generated by the binding of the antibody and the antigen to shift.
  • examples of such an antibody include an antibody in which the fluorescence intensity is changed by a quenching dye (quencher), and an antibody in which the emission state of the fluorescent dye is changed by fluorescence resonance energy transfer (FRET). That is, in the present invention, an antibody that can change the fluorescence intensity when a cannabis component and an antibody against the cannabis component form a complex is used.
  • the concentration of the antigen to be measured and the fluorescence intensity of the fluorescent dye are positively correlated, and the concentration of the antigen to be measured and the fluorescence intensity of the fluorescent dye are positively correlated. It is called an antibody.
  • the antigen concentration to be measured and the fluorescence intensity of the fluorescent dye have a negative correlation, and the antigen concentration to be measured and the fluorescence intensity of the fluorescent dye have a negative correlation. It is called an antibody.
  • an antibody light chain variable region polypeptide and an antibody heavy chain variable region polypeptide wherein one or both of the antibody light chain variable region polypeptide and the antibody heavy chain variable region polypeptide are antibody heavy chain variable regions
  • the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide form a complex through the antigen by being labeled with a fluorescent dye that is quenched while being labeled to the polypeptide or antibody light chain variable region polypeptide. Then, an antibody whose quenching is eliminated and the fluorescence intensity is increased can be suitably used.
  • an antibody light chain variable region polypeptide and an antibody heavy chain variable region polypeptide wherein one or both of the antibody light chain variable region polypeptide and the antibody heavy chain variable region polypeptide are labeled with a fluorescent dye.
  • the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide are combined with a cannabis component that is an antigen to form a complex, the complex of the antigen and the antigen binding protein Use an antibody that becomes a quencher, and whose fluorescence intensity decreases when the complex of the antigen, the antibody heavy chain variable region polypeptide and the antibody light chain variable region polypeptide is formed, and the fluorescent dye is more strongly quenched be able to.
  • Q-body (trademark)
  • Q-body (trademark) in which the concentration of the antigen to be measured and the fluorescence intensity of the fluorescent dye are positively correlated with the concentration of the antigen to be measured
  • Q-body (trademark) in which the fluorescence intensity of the fluorescent dye has a negative correlation
  • Q-body (trademark) is also referred to as a Fab-type complex or Fab-type antibody.
  • fluorescently labeled antibodies that use a tryptophan residue present in the VH region of the antibody as a quenching dye (quencher) can be mentioned.
  • tryptophan (W) residues at the 36th, 47th, and 103rd positions of the antibody VH region (according to the Kabat numbering system), and these tryptophan residues act as quenchers ( WO2011 / 061944). It is designed such that when bound to an antibody antigen labeled with a fluorescent dye, the fluorescent dye is located in the vicinity of the tryptophan residue and interacts with the tryptophan residue to quench the fluorescent dye.
  • the fluorescently labeled antibody when it is not bound to the antigen, it is quenched and does not emit fluorescence.
  • an antibody with a positive correlation between the antigen concentration and the fluorescence intensity of the fluorescent dye when the antigen binds to the antibody, the three-dimensional structure of the antibody changes, and the fluorescent dye located near tryptophan moves away from tryptophan. , No longer interacts with tryptophan, the quench is released and fluorescence is emitted.
  • the antigen is present, the antibody and the antigen are bound, the three-dimensional structure of the antibody is changed, the quenching of the fluorescent dye is released, and fluorescence is emitted.
  • the presence of the antigen can be detected, and the antigen can also be quantified by the fluorescence intensity.
  • the complex of the antigen and antibody acts as a quencher on the fluorescent dye, and the fluorescent dye is further quenched to generate a fluorescent dye.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence to be weakened.
  • the fluorescent dye used for labeling the antibody light chain variable region polypeptide and / or antibody heavy chain variable region polypeptide of the antibody is located in the antigen-binding pocket of the antibody and is combined with tryptophan of the heavy chain variable region.
  • both the antibody light chain variable region polypeptide and the antibody heavy chain variable region polypeptide are labeled with a fluorescent dye, both fluorescent dyes enter the antigen-binding pocket of the antibody and there is interaction between the two fluorescent dyes. And quenching effect (H-dimer) between fluorescent dyes is obtained.
  • the fluorescent dye used for labeling the antibody light chain variable region polypeptide is different from the fluorescent dye used for labeling the antibody heavy chain variable region polypeptide, and is an energy donor (donor) for fluorescence resonance energy transfer.
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • a quenching effect by a fluorescence resonance energy transfer (FRET) effect is obtained, resulting in a large quench.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the fluorescent dye interacts with the antigen-antibody complex by hydrophobic interaction, electrostatic interaction, or the like, and the degree of quenching is increased.
  • An antibody having a negative correlation between the antigen concentration and the fluorescence intensity of the fluorescent dye includes an antibody produced by hybridoma A-04 (Accession No. NITE BP-01970).
  • the antibody light chain variable region polypeptide of the antibody and the anti-antibody A Q-body (trademark) in which the antigen concentration and the fluorescence intensity of the fluorescent dye have a negative correlation can be prepared by using the weight chain variable region polypeptide.
  • the Q-body antibody heavy chain variable region polypeptide includes an amino acid sequence specific to the antibody heavy chain variable region encoded by exons of the V region, D region, and J region of the antibody heavy chain gene. Any amino acid sequence may be added to the N-terminal and / or C-terminal side of the amino acid sequence specific to the antibody heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence specific to the antibody heavy chain variable region is an amino acid sequence in which the 36th, 47th, or 103rd amino acid is tryptophan in the Kabat numbering system. preferable.
  • the Q-body antibody light chain variable region polypeptide is not particularly limited as long as it contains an amino acid sequence specific to the antibody light chain variable region encoded by exons of the V region and J region of the antibody light chain gene.
  • an arbitrary amino acid sequence may be further added to the N-terminal and / or C-terminal side of the amino acid sequence specific to the antibody light chain variable region.
  • the amino acid sequence specific to the antibody light chain variable region is preferably an amino acid sequence in which the 35th amino acid is tryptophan in the Kabat numbering system.
  • Antibody light chain variable region polypeptides, antibody light chain variable region polypeptides, and single chain antibody polypeptides comprising both antibody light chain variable regions and antibody light chain variable regions are known chemical synthesis methods, genetic recombination Although it can be prepared using a technique, a method for degrading antibody molecules with a proteolytic enzyme, etc., among them, it is preferable to prepare by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation.
  • the fluorescent dye for labeling Q-body is not particularly limited as long as it is quenched (quenched) in a state labeled with antibody heavy chain variable region polypeptide or antibody light chain variable region polypeptide.
  • Rhodamine, coumarin , Cy, EvoBlue, oxazine, Carbopyronin, naphthalene, biphenyl, anthracene, phenenthrene, pyrene, carbazole and the like, and a fluorescent dye and derivatives of the fluorescent dye can be exemplified.
  • CR110 carboxyrhodamine 110 : Rhodamine Green (trade name), TAMRA: carbocytetremethlrhodamine: TMR, ATTO655 (trade name), BODIPY FL (trade name): 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s -indancene-3-propionic acid, BODIPY 493/503 (trade name): 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid , BODIPY R6G (trade name): 4,4-difluoro-5- (4-phenyl-1,3-butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid, BODIPY 558 / 568 ( Trade name): 4,4-diflu
  • the immunological measurement method using an antigen-antibody reaction is not limited, and can be measured by a known ELISA, immunochromatography or the like.
  • a cannabis component extracted from a cannabis plant piece and a specific antibody against the cannabis component may be mixed to detect an antigen-antibody complex.
  • the fluorescence generated when the antibody and the cannabis component are combined may be measured.
  • the antigen-antibody reaction system for immunological measurement may be a liquid system or a solid phase system.
  • the solid phase system uses a dried antibody.
  • As the dry antibody a freeze-dried antibody or an antibody immobilized on a carrier such as a microtiter plate can be used.
  • An antibody solution or a dry antibody may be placed in a container in which an antigen-antibody reaction is performed, and a cannabis component extract extracted from a cannabis plant piece may be added to the container.
  • a cannabis component extract containing or not containing an alcohol component during the antigen-antibody reaction is used as a sample sample. However, if the reaction system contains a high concentration of alcohol when the antigen-antibody reaction occurs, the antigen-antibody reaction is inhibited.
  • the alcohol final concentration during the antigen-antibody reaction is 30 wt% or less, preferably 25 wt% or less, more preferably 20 wt% or less, more preferably 15 wt% or less, more preferably 10 wt% or less, more preferably 7.5 wt% or less, Preferably it is 5 wt% or less, and particularly preferably 0 wt%.
  • the cannabis component extract when a cannabis component is extracted from a cannabis plant piece using an extraction solution that may contain alcohol, and a solution containing alcohol is used as the extraction solution, the cannabis component extract contains alcohol. Therefore, the final alcohol concentration when the cannabis component extract and the antibody are added is 30 wt% or less, preferably 25 wt% or less, more preferably 20 wt% or less, more preferably 15 wt% or less. It is necessary to adjust the alcohol concentration of the cannabis component extraction solution so that it is more preferably 10 wt% or less, more preferably 7.5 wt% or less, more preferably 5 wt% or less, and particularly preferably 0 wt%.
  • the alcohol concentration in the cannabis component extraction solution is 30 wt% or less, preferably 25 wt% or less, more preferably 20 wt% or less, more preferably 15 wt% or less, More preferably, it may be 7.5 wt% or less.
  • the alcohol concentration of the cannabis component extraction solution is 30 wt% or less, more preferably 20 wt% or less, more preferably Is 15 wt% or less, more preferably 10 wt% or less, particularly preferably 0 wt%, and when an antigen-antibody reaction is carried out by mixing the cannabis component extract and the antibody solution at a volume ratio of 1: 2,
  • the alcohol concentration of the mixture is 30 wt% or less, preferably 22.5 wt% or less, more preferably 15 wt% or less, and even more preferably 0 wt%, and the cannabis component extract and the antibody solution are mixed at a volume ratio of 1: 3 for antigen-antibody reaction.
  • the alcohol concentration of the cannabis component extraction liquid may be 30 wt% or less, preferably 20 wt% or less, more preferably 0 wt%.
  • the cannabis component extract and the antibody solution are mixed at a volume ratio of 1: 1 to 1: 3. Therefore, the alcohol concentration in the cannabis component extraction liquid in consideration of both the cannabis component extraction efficiency and the antigen-antibody reaction is 30 wt% or less, preferably 22.5 wt% or less, more preferably 20 wt% or less, more preferably It is 15 wt% or less, more preferably 10 wt% or less, and particularly preferably 0 wt%.
  • cannabis components can be extracted from cannabis plant pieces and mixed with antibodies against cannabis components to cause an antigen-antibody reaction.
  • Test devices that extract cannabis components and cause an antigen-antibody reaction May be used. Examples of such a device include a device having a container part for extracting a cannabis component from a cannabis plant piece, and a container part for mixing a cannabis component and an antibody against the cannabis component to cause an antigen-antibody reaction.
  • the device may be referred to as a cannabis component testing device.
  • test device for extracting a cannabis component and performing an antigen-antibody reaction
  • method for extracting a cannabis component using the device and a method for performing an antigen-antibody reaction by mixing a cannabis component extract and an antibody against the cannabis component are described. To do.
  • the device includes a first container and a second container.
  • the device may be an integrated device in which a first container and a second container are continuous through a partition wall, and a predetermined amount of liquid can be moved and added from the first container to the second container.
  • the first container and the second container may be separate devices that are not continuous.
  • the first container contains a solution having an alcohol concentration of 30 wt% or less
  • the second container contains an antibody against the cannabis component for detecting an antigen by an antigen-antibody reaction using the cannabis component as an antigen.
  • the antibody may be liquid or dried. Examples of the dried product include freeze-dried antibody, antibody immobilized on a second container, and the like.
  • the cannabis component is extracted from the cannabis plant piece, and the extract containing the cannabis component is added to the second container by moving a constant volume, and an antigen-antibody reaction occurs in the second container.
  • the capacity of the first container is about 1.2 to 4.8 mL
  • the capacity of the second container is about 50 to 200 ⁇ L
  • the overall size of the device is about 54 to 216 mm in length and about 7 to 26 mm in outer diameter. .
  • the device includes a constant-volume transfer mechanism having a mechanism for extracting a cannabis component into a second container after extracting the cannabis component using an extraction solution containing alcohol in the first container. It may be.
  • a target plant test piece suspected of being a cannabis plant piece is placed in a first container containing an extraction solution, and extracted by stirring, shaking or standing still.
  • the first container and the second container of the device have a cylindrical shape, and the second container is mounted below the first container.
  • a measuring member is fitted on the inner peripheral side of the first container, and the measuring member is movable in a direction in which the measuring member comes into contact with and separates from the first container.
  • a cap member is inserted into the upper opening of the first container, and the cap member moves in a direction of contacting and separating from the measuring member by rotating 90 degrees and pushing in or removing 9 mm. Is possible.
  • a liquid flow opening through which liquid flows is formed at the bottom of the measuring member, and a measuring rod provided with a measuring groove for measuring the liquid projects from the bottom of the measuring member.
  • the cannabis component extract containing the cannabis component is accommodated in the measuring groove through the liquid flow opening of the measuring member and approaches the cap member
  • the cap member comes into contact with the measuring member, and further, the measuring member is moved in the direction approaching the second container by moving the cap member in the direction approaching the measuring member.
  • a predetermined amount of cannabis component extract contained in the measuring groove of the measuring member is added to the second container and mixed with the antibody against the cannabis component contained in the second container, and the antigen antibody A reaction occurs.
  • the cannabis component extract extracted in the first container is accommodated in the measuring groove through the liquid flow opening of the measuring member. Thereafter, by moving the cap member in a direction approaching the measuring member, the cap member abuts on the measuring member, and further, moving the cap member in a direction approaching the measuring member, A predetermined amount of the cannabis component extract that moves in the direction approaching the second container and is accommodated in the measuring groove of the measuring member can be added to the antibody against the cannabis component contained in the second container.
  • the measuring member includes a measuring rod, and the measuring rod is configured to slide in a liquid-tight state along a measuring side wall formed inside the first container.
  • the measuring rod of the measuring member slides in a liquid-tight state along the measuring side wall formed on the inner periphery of the first container, so that it is once accommodated in the measuring groove.
  • a predetermined amount of cannabis component extract can always be mixed with an antibody against the cannabis component contained in the second container without leakage of the predetermined amount of cannabis component extract.
  • FIG. 2 shows a longitudinal sectional view of a testing device for extracting the cannabis component and performing an antigen-antibody reaction.
  • the test device 10 includes a first container 12 that contains an extraction solution L1 for extracting a cannabis component, and a second container that contains an antibody L2 against the cannabis component below the first container.
  • a container 14 is mounted.
  • a measuring member 16 that can move in the direction in which the second container 14 is brought into and out of contact with the second container 14 is fitted on the inner peripheral side of the first container 12.
  • the first container 12 includes a substantially cylindrical container main body 20, and a measuring side wall 22 having a smaller diameter than the diameter of the container main body 20 is formed at the bottom of the container main body 20. Yes. Further, an engaging portion 24 whose diameter is increased again extends from the lower end of the measuring side wall 22, and an engaging protrusion 24 a is formed on the outer periphery of the engaging portion 24.
  • a positioning projecting portion 26 for positioning the measuring member 16 when the measuring member 16 is fitted to the inner peripheral side of the first container 12 is formed on the inner wall 20a of the container body 20. ing.
  • the inner wall 20a near the upper opening 12a of the first container 12 has a locking projection 28 for locking the cap member 18 when the cap member 18 is attached to the upper opening 12a. Is formed.
  • a guide groove 30 that guides the cap member 18 when the cap member 18 is moved in a direction approaching the measuring member 16 is formed in the inner wall 20a in the vicinity of the upper opening 12a of the first container 12. Yes.
  • the second container 14 includes a second container body 14a having a substantially cylindrical shape, and the antibody L2 against the cannabis component is accommodated inside the second container body 14a.
  • the bottomed cylindrical antibody accommodating part 34 is formed.
  • the upper portion of the main body 14a of the second container 14 is engaged with an engaging protrusion 24a formed on the outer periphery of the container main body portion 20 of the first container 12 when mounted below the first container 12.
  • An engagement slit 14b is formed.
  • two opposing slit openings 36 are formed in the lower portion of the main body 14a of the second container 14, and, for example, light is irradiated through these slit openings 36 to form the second It is comprised so that the test
  • the measuring member 16 includes a substantially cylindrical measuring member main body 38, and a liquid circulation opening 40 through which liquid flows is formed at the bottom of the measuring member main body 38. ing.
  • a measuring rod 44 is provided at the lower end of the measuring member main body 38 of the measuring member 16, and the measuring rod 44 is disposed along the measuring side wall 22 formed on the inner periphery of the first container 12. It is configured to slide in a dense state.
  • the outer diameter of the measuring member main body 38 of the measuring member 16 is formed to be substantially the same as or slightly smaller than the inner diameter of the container main body portion 20 of the first container 12, and the measuring member 16 is the container of the first container 12. It slides along the inner wall 20a of the main body 20 and can move in the direction of contact with and away from the second container 14.
  • the cap member 18 is spaced apart from the substantially cylindrical cap member main body 52, the upper surface 54, and the cap member main body 52, and extends downward from the outer peripheral end of the upper surface 54. And an operating member 56 provided.
  • the outer diameter of the cap member main body 52 is formed to be substantially the same as or slightly smaller than the inner diameter of the container main body portion 20 of the first container 12, and is in contact with the measuring member 16 as will be described later. It can move in the direction of separation.
  • the cap member main body 52 prevents the extraction liquid L1 accommodated in the container main body portion 20 of the first container 12 from leaking to the outside. It is desirable that the outer diameter of the first container 12 is dimensioned so as to be liquid-tightly sealed with respect to the inner diameter of the container body 20 of the first container 12.
  • the inner diameter of the operation member 56 is substantially the same as or slightly larger than the outer diameter of the container body 20 of the first container 12 so as to be able to move in the direction of contact with and separating from the measuring member 16. It is formed as follows.
  • the upper end 12b of the first container 12 abuts on the lower surface 54a of the upper surface 54 located between the cap member main body 52 and the operation member 56 and functions as a stopper, so that the measuring member 16 is further removed.
  • the second container 14 is configured not to move in the approaching direction.
  • the cap member main body 52 of the cap member 18 is formed with a guide projecting portion that fits and slides in the guide groove 30 formed on the inner wall of the first container 12. .
  • the cannabis component testing device 10 of the present invention configured as described above is used as follows, for example.
  • the cannabis component testing device 10 of the present invention is in a pre-assembled state before use.
  • the second container 14 is attached to the engaging portion 24 below the first container 12.
  • the antibody L2 is stored in advance in the antibody storage portion 34 of the second container 14.
  • a measuring member 16 that can move in the direction of contact with and away from the second container 14 is fitted on the inner peripheral side of the container main body 20 of the first container 12. Has been.
  • the measuring member 16 when the measuring member 16 is fitted to the inner peripheral side of the first container 12, the lower end 38 a of the measuring member main body 38 of the measuring member 16 is positioned on the inner wall 20 a of the container main body 20.
  • the measuring member 16 is positioned at the initial position by contacting the portion 26 and functioning as a stopper.
  • the lower seal portion 48 of the measuring rod 44 of the measuring member 16 is in a state of being fitted to the measuring side wall 22 formed on the inner periphery of the first container 12 so as to be sealed in a liquid-tight manner. It has become.
  • the cannabis component extract L1 to be mixed accommodated in the main body part 20 of the first container 12 is the liquid flow opening 40 formed in the bottom part of the measuring member main body 38, and the measuring side wall of the container main body 20 22 is configured so as not to be mixed with the antibody L2 accommodated in the antibody accommodating part 34 of the second container 14 through the opening surrounded by the numeral 22.
  • the measuring member 16 is fitted into the upper opening 12a of the first container 12. And it forms in the latching protrusion part 28 formed in the inner wall 20a of the vicinity of the upper opening part 12a of the 1st container 12 so that it may protrude outside in the approximate middle of the cap member main body 52 of the cap member 18.
  • the locking projection 52a comes into contact with each other and functions as a stopper, and the cap member 18 is locked at the initial position.
  • the cap member 18 is fitted into the upper opening 12 a of the first container 12 again.
  • the cap member 18 is held on the second container 14 by grasping the operation member 56 of the cap member main body 52 with a finger or the like and pressing it downward, or by pressing the upper surface 54 of the cap member main body 52 downward. Move in the direction.
  • the lower end 52b of the cap member main body 52 of the cap member 18 abuts on the upper end of the measuring member main body 38 of the measuring member 16, and the lower end 38a of the measuring member main body 38 of the measuring member 16 and the inner wall of the container main body portion 20.
  • the contact state with the positioning protrusion 26 formed on 20a is released, and the measuring member 16 is moved in the direction of the second container 14, that is, downward.
  • the cannabis component extract L1 to be mixed accommodated in the container body 20 of the first container 12 passes through the liquid circulation opening 40 formed at the bottom of the measuring member body 38 of the measuring member 16.
  • the metering member 16 enters the metering groove 50 formed between the upper seal portion 46 and the lower seal portion 48 of the metering rod 44 of the metering member 16.
  • the cap member 18 by further moving the cap member 18 in the direction of the second container 14, the upper sealing portion 46 of the measuring rod 44 of the measuring member 16 is formed on the inner side wall 22 of the first container 12. And is sealed in a liquid-tight manner.
  • the measuring member 16 is moved further downward in the direction of the second container 14.
  • the lower seal portion 48 of the measuring rod 44 of the measuring member 16 is separated from the lower end of the measuring side wall 22 formed on the inner periphery of the first container 12, and an opening is formed. .
  • the cannabis component extract L1 accommodated and weighed in the space enters the antibody accommodating part 34 of the second container 14 through this opening, and the antibody accommodating part 34 of the second container 14 Mixing with the antibody L2 contained in is started.
  • the measuring member 16 is further moved downward in the direction of the second container 14 to the final position (mixing completion position).
  • the upper seal portion 46 of the measuring rod 44 of the measuring member 16 acts as a piston.
  • the measuring groove portion 50 formed between the upper seal portion 46 and the lower seal portion 48 of the measuring rod 44 of the measuring member 16, that is, the cannabis component extract L1 accommodated and measured in the space It enters the antibody container 34 of the second container 14 and is mixed with the antibody L2 stored in the antibody container 34 of the second container 14.
  • the upper end 12b of the first container 12 abuts on the lower surface 54a of the upper surface 54 located between the cap member main body 52 and the operation member 56, and functions as a stopper. No more 16 moves relative to the second container 14 in the approaching direction.
  • the upper seal portion 46 of the measuring rod 44 of the measuring member 16 is fitted to the measuring side wall 22 formed on the inner periphery of the first container 12, and is liquid-tight. Is sealed.
  • the cannabis component extract L1 accommodated in the container main body 20 of the first container 12 enters the antibody accommodating part 34 of the second container 14 further, and the antibody accommodating part of the second container 14 34 is configured not to be mixed with the antibody L2 accommodated in 34.
  • the measuring groove portion 50 of the measuring member 16 that is, the predetermined amount of liquid stored in the space is transferred to the antibody storing portion of the second container 14. It can be mixed with the antibody L2 accommodated in 34.
  • the materials of the first container 12, the second container 14, the measuring member 16, and the cap member 18 are not particularly limited, and examples thereof include metals such as glass and aluminum. It can be made of resin or the like. In this case, it is desirable to use a resin from the standpoint of metering and operability, and the resin that can be used is not particularly limited. For example, polyethylene resin (PE), polypropylene resin (PP), polyethylene terephthalate resin (PET) Etc. can be used.
  • PE polyethylene resin
  • PP polypropylene resin
  • PET polyethylene terephthalate resin
  • PS polystyrene resin
  • PMMA acrylic resin
  • first container 12, the second container 14, the measuring member 16, and the cap member 18 can be opaque, translucent, and transparent.
  • the cannabis component extract and the antibody against the cannabis component are mixed to cause an antigen-antibody reaction.
  • the target plant test piece suspected of being cannabis is placed in the first container containing the cannabis component extraction solution containing alcohol of the cannabis component testing device, and the cannabis component is extracted.
  • the extract containing the cannabis component in the first container is transferred and added to the second container containing the antibody against the cannabis component using the mechanism of the device to cause the antigen-antibody reaction.
  • the antibody in the second container may be contained as a dry product such as a lyophilized product or may be contained as an antibody solution.
  • the mixing ratio (volume ratio) of the cannabis component extract containing alcohol and the antibody solution is 1: 1 to 1: 5, preferably 1: 2 to 1: 4, more preferably 1: 3. is there.
  • 1 to 5 mL, preferably 2 to 3 mL, more preferably 2.4 mL of cannabis component extract is stored in a first container, and plant pieces suspected of containing cannabis are placed and extracted. Transfer 10-100 ⁇ L, preferably 20-50 ⁇ L, more preferably 25 ⁇ L to the second container.
  • the cannabis component may be contained in the extract at a concentration of 4 ⁇ g / mL or more, preferably 4 to 400 ⁇ g / mL.
  • 25 to 100 ⁇ L, preferably 50 to 100 ⁇ L, more preferably 75 ⁇ L of an antibody solution containing an antibody against the cannabis component may be placed in the second container (FIG. 7).
  • the cannabis component concentration in the cannabis component extract in the first container is 4 to 400 ⁇ g / mL
  • the cannabis component concentration when the antigen-antibody reaction is performed in the second container is 1 to 100 ⁇ g / mL.
  • the antigen-antibody reaction is performed at 4 to 44 ° C., preferably 25 to 35 ° C., immediately after the reaction for 3 minutes, preferably 3 minutes or more.
  • the antigen-antibody complex formed in the reaction solution is detected.
  • the fluorescence generated from the complex of the antigen and antibody may be measured.
  • Q-body the measurement can be performed by measuring the reaction solution after the antigen-antibody reaction in the second container with a fluorescence tester.
  • Fluorescence tester can be any device as long as it can detect fluorescence of a specific wavelength.
  • the portable fluorescence tester shown in FIG. 3 can be used. After extracting a cannabis component from a cannabis plant piece using the above cannabis component testing device and causing an antigen-antibody reaction, fluorescence may be measured with a fluorescence tester using the reaction solution as a sample. At this time, the second container portion containing the antigen-antibody reaction solution of the cannabis component test device can be inserted into the tester for measurement.
  • the inspection device includes at least a light source that emits excitation light that can excite a fluorescent substance in a liquid phase object in the container to emit fluorescence, and a detector that detects the fluorescence emitted by the fluorescent substance. And a portable fluorometer equipped with an optical system that guides excitation light from the light source to the liquid phase object in the container and guides fluorescence from the liquid phase object to the detector.
  • the inspection device includes a housing that integrally holds a container, a light source, a detector, and an optical system.
  • FIG. 6 shows a measurement system of the fluorescence tester.
  • Fig. 3 shows a schematic perspective view of the portable fluorescence tester
  • Fig. 4 shows the internal configuration.
  • the fluorescence tester has a flat, substantially rectangular parallelepiped box shape as a whole. Since it is portable, its size is about the size of a person's palm or slightly larger.
  • a display unit 63 for displaying the operation state of the photometer and measurement results and several operation buttons 64 to 69 are provided on the front surface of the housing 62 of the fluorescence tester.
  • a part of the upper surface of the housing 62 of the fluorescence tester is an open / close lid 61.
  • a reagent cell mounting portion 60 is formed in the housing 62.
  • the reagent cell mounting portion 60 is a frame-shaped portion that matches the size and shape of the reagent cell 70.
  • the reagent cell 70 is formed of a material that sufficiently transmits excitation light and fluorescence. Specifically, a material made of glass such as borosilicate glass, quartz, or sapphire, or a resin such as PMMA (acrylic resin), polystyrene, or COC (cyclic olefin copolymer) is used as the material of the reagent cell 70. . What is necessary is just to add the reaction liquid after making antigen-antibody reaction to the reagent cell 70, and to measure fluorescence.
  • the open / close lid 61 is opened and the sample cell 70 is inserted into the insertion hole of the reagent cell attachment portion 60.
  • the reagent cell 70 is mounted on the reagent cell mounting portion and is held at a predetermined position. Thereafter, the opening / closing lid 61 is closed.
  • the light source 72 emits light (excitation light) that can excite the fluorescent substance in the liquid phase object to emit fluorescence.
  • the light source laser light, LED light, or the like can be used.
  • an LED lamp is used.
  • an LED that emits green light having a wavelength of 525 nm may be used. A thing can be used suitably.
  • the optical system of the fluorescence tester guides excitation light from the light source 72 to the cell portion of the reagent cell 70 and guides fluorescence from the liquid phase object of the cell to the detector 76.
  • the detector 76 is appropriately selected from those using a photodiode or a phototube, and a photodiode is preferably used.
  • the optical system includes a lens 71 that collects light from the light source 72, a dichroic mirror 75 for bending the optical path and selecting light, and a filter disposed on the optical path. (Excitation filter 73 and fluorescent filter 74) and the like.
  • a detector 76 is disposed at a position opposite to the reagent cell mounting portion 60 with the dichroic mirror 75 interposed therebetween.
  • the fluorescence tester further includes a battery 77 for supplying power and an arithmetic unit 78.
  • the computing device can calculate the cannabis component concentration in the sample from the detected fluorescence intensity and display it on the display unit 63.
  • the arithmetic device may be provided with a storage device, and an equation in which the fluorescence intensity and the cannabis component concentration are stored in advance in the storage device, and the cannabis component concentration is calculated based on the equation.
  • the general expression is, for example, an expression representing a calibration curve created in advance.
  • the present invention further includes a cannabis component test kit including the above-described test device, or a cannabis component test kit including the above-described test device and a fluorescence tester.
  • the cannabis component is detected as follows using the test device for extracting the cannabis component and performing an antigen-antibody reaction and the fluorescence tester.
  • the cannabis component inspection device containing the cannabis component extraction solution containing alcohol at a concentration of 30 wt% or less, and stir, vibrate, or stand still Extract cannabis ingredients.
  • the cannabis component extract in the first container is moved and added to the second container of the cannabis component testing device in which antibodies against the cannabis component are accommodated. Thereafter, the antigen-antibody reaction proceeds in the second container.
  • the reaction solution is transferred to the reagent cell of the fluorescence tester and measured.
  • the second container of the cannabis component testing device can also be used as a reagent cell.
  • Q-body When Q-body is used as an antibody, when cannabis plant pieces are contained in the plant pieces, the antibody binds to the cannabis component, which is an antigen, so that fluorescence is emitted and the presence of cannabis plant pieces is detected. can do.
  • Example 1 Examination of extraction efficiency from cannabis leaves using THC and THC-A alcohol (1) Examination of methanol concentration during extraction In the antigen-antibody reaction, the reaction can be confirmed if cannabis components of 4 ⁇ g / mL or more can be extracted. it can. The concentration of methanol used for extraction was changed, and it was confirmed whether cannabis components of 4 ⁇ g / mL or more could be extracted.
  • PBS-T solution phosphate buffered saline + interface
  • Activating agent Tween 20% 0.05% + preservative sodium azide 0.05%) was used.
  • Sodium azide in PBS-T is a preservative for long-term storage and does not participate in antigen-antibody reaction.
  • the above solution was placed in a polypropylene resin container. Twenty cannabis leaves were prepared, the leaves were made into 5 mm square sections, about 20 mg in weight were put into the container and immersed in the solution, and the container was covered and vibrated up and down. Immersion is performed for 3 minutes, and 50 ⁇ L of the extract is quantified by HPLC (high performance liquid chromatography). The immersion time of 3 minutes was set as an allowable time for on-site inspection.
  • Fig. 8 shows the outline of the cannabis component extraction method.
  • HPLC (high performance liquid chromatography) measurement conditions were as follows.
  • Buffer D Acetonitrile
  • Elution conditions for running buffer solution for elution
  • the buffer A is flowed from the beginning, and the ratio of the buffer D is gradually changed.
  • the average extraction amount of cannabis components was 8.7 ⁇ g / mL, 9.3 ⁇ g / mL, and 7.6 ⁇ g / mL in the PSB-T solutions with methanol concentrations of 0wt%, 10wt%, and 30wt%, respectively. Also exceeded the minimum extraction of 4 ⁇ g / mL. It was also found that cannabis components can be extracted even at a methanol concentration of 0 wt%, and that there is no difference compared to when methanol concentrations are 10 wt% and 30 wt%.
  • Example 2 From the results of Example 2 described later, it was found that when the methanol concentration reached 40 wt%, the antibody was denatured and hindered measurement. When the methanol concentration is 0 wt%, the antibody activity is maintained higher than when the methanol concentrations are 10 wt% and 30 wt%, and the cannabis component can be measured without denaturing the antibody.
  • the average extraction amount of the cannabis component was 3.4 ⁇ g / mL with pure water and 7.4 ⁇ g / mL with PBS-T solution, and the extraction concentration of pure water was slightly more than twice that with PBS-T solution.
  • a PBS-T solution containing no methanol is preferable rather than pure water containing no methanol.
  • pure water is used as the extract, the amount of cannabis used for the antigen-antibody reaction can be extracted although the extraction amount is inferior to that of the PBS-T solution.
  • Example 1 As a result of Example 1, it was found that cannabis leaf was introduced as a test piece into a solution having an alcohol component of 30 wt% or less, and the components of the test piece could be extracted into the solution.
  • Example 2 Effect of methanol on measurement of cannabis components using antigen-antibody reaction Q-body (T-3 antibody), an antibody obtained by labeling antibodies against cannabis components THC and THC-A with a fluorescent dye, is used as an antibody. It was.
  • double-label Fab type of the same color comprising a polypeptide comprising a heavy chain variable region (VH; SEQ ID NO: 3) and a heavy chain constant region (CH1; SEQ ID NO: 4) for cannabis component THC labeled with TAMRA
  • VH heavy chain variable region
  • CH1 heavy chain constant region
  • the fluorescence of the reaction solution was measured using a fluorescence plate reader (Moleculardevices, SpectraMax® Paradigm® S / N: 32 770-02-2092).
  • the excitation wavelength and fluorescence wavelength during measurement were 530 nm and 580 nm, respectively.
  • the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis of the graph of FIG. 9 indicates the relative fluorescence intensity, 1.00 or higher indicates that the antigen can be detected, and BR> 5, and less than 1.00 indicates that it cannot be detected.
  • the final methanol concentration during the antigen-antibody reaction was 15 WT% or less, the antigen-antibody reaction occurred and THC could be measured.
  • Fig. 10 shows the results of THC measurement
  • Fig. 11 shows the results of THC-A measurement. Both THC and THC-A could be measured at a final methanol concentration of 25 wt% to 30 wt%.
  • Example 3 Measurement of Cannabis Component Using Antigen-Antibody Reaction
  • Hybridoma A mouse strain (BALB / c) is immunized with BSA-conjugated THC antigen (Genway Biotech) together with adjuvant, and the spleen is removed after increasing the serum titer. Then, cell fusion by myeloma cell NS-1 strain (P3.NS-1 / 1.Ag4.1) by PEG method (40%) was performed.
  • the obtained antibody showed affinity for THCA, THC and CBN.
  • Fab type antibody Construction of expression vector
  • NITE BP-01970 (“Identification” is “A-04”)) 5
  • a DNA sequence encoding a polypeptide comprising 5) is given a DNA sequence of ProX tag (the base sequence corresponding to the 9th amino acid is TTT at the N-terminus, and MSKQIEVNFSNET; SEQ ID NO: 6) when translated;
  • a gene having a linker (SEQ ID NO: 7) and a FLAG tag DNA sequence at the C-terminus was incorporated into a pIVEX2.3d vector (Roche Diagnostics).
  • a ProX tag (VH is labeled when translated and VL is unlabeled) is added to the N-terminus of the inserted VL or VH, and a His tag or FLAG tag is added to the C-terminus. It is designed as follows.
  • the reaction solution (60 ⁇ L) consists of 3 ⁇ L Enzyme Mix, 0.6 ⁇ L Methionine, 30 ⁇ L 2 ⁇ Reaction Mix, 20 ⁇ L E-coli Lysate, 2 ⁇ L of two types of plasmid DNA (200 ng each), 3 ⁇ L of fluorescently labeled aminoacyl-tRNAamber (480 pmol), 1.4 ⁇ L of Nuclease Free Water was added.
  • CloverDirect (trade name) tRNA Reagents for Site-Directed Protein Functionalization (manufactured by Protein Express) was used as a fluorescently labeled aminoacyl-tRNA (TAMRA-X-AF-tRNAamber) for producing a fluorescently labeled protein.
  • the reaction solution was allowed to stand at 20 ° C. for 2 hours for reaction to synthesize the protein, and then complex formation was completed by further reaction at 4 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, SDS-PAGE (15%) was performed using 0.5 ⁇ L of the reaction solution, and protein expression was observed with a fluorescence image analyzer (FMBIO-III; manufactured by Hitachi Software Engineering). Furthermore, Western blotting was performed using an anti-His tag antibody or an anti-FLAG tag antibody, and it was confirmed that the target fluorescently labeled antibody variable region-containing peptide was synthesized.
  • FMBIO-III fluorescence image analyzer
  • the synthesized fluorescently labeled Fab type antibody was purified by anti-FLAG M2 affinity gel (Sigma Aldrich) or His-Spin Trap Column (GE Healthcare). The above reaction solution (60 ⁇ L) was applied to a column containing anti-FLAG M2 affinity gel, incubated for 15 minutes at room temperature, and then washed with a wash buffer (20 mM Phosphate buffer (pH 7.4) /0.5 M NaCl / 0.1% Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether) was washed 3 times.
  • a wash buffer (20 mM Phosphate buffer (pH 7.4) /0.5 M NaCl / 0.1% Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether
  • the resulting fluorescently labeled Fab antibody was as follows. The first four alphabets are abbreviations for each.
  • a dilution buffer having an alcohol concentration of 0 was added as an extract.
  • PBS-T solution phosphate buffered saline + surfactant Tween 20 0.05% + preservative sodium azide 0.05%) was used. Thereafter, the cannabis leaf was dried and finely crushed, and about 30 mg was weighed with a weighing jig and put into a first container to extract cannabis components.
  • the Fab antibody (10.7 nM, 75 ⁇ L) was put, and 25 ⁇ l of the cannabis component extracted in the first container was mixed in the second container.
  • the reaction was performed at 25 ° C.
  • the voltage value which is an index of the amount of fluorescence received by the light receiver of the fluorescence tester, was examined to confirm a decrease in the amount of fluorescence. Changes in the voltage values of samples A, B and C (fluorescence change) are shown.
  • inspection device 12 which extracts cannabis component and performs antigen-antibody reaction 1st container 12a Upper opening part 12b Upper end 14 Second container 14a Second container main body 14b Engagement slit 16 Measuring member 18
  • Cap member 20 First Container main body portion 20a inner wall 20b outer peripheral side wall 22 measuring side wall 24 engaging portion 24a engaging protrusion 26 positioning protruding portion 28 locking protruding portion 30 guide groove 32 indicator member 34 antibody accommodating portion 36 slit opening portion 38 measuring member Main body 38a Lower end 40 Liquid flow opening 44 Measuring rod 46 Upper seal 48 Lower seal 50 Measuring groove 52 Cap member main body 52a Locking projection 52b Lower end 54 Upper surface 54a Lower surface 56 Operation member 60 Reagent cell mounting portion 61 Opening / closing lid 62 Housing 63 Display 64 to 69 Operation Button 70 Reagent Cell 71 Lens 72 Light Source 73 Excitation Filter 74 Fluorescent Fill 75 dichroic mirror 76 detector 77 battery 78 arithmetic unit

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Abstract

　本発明はアルコール成分の使用を制限した大麻の抽出方法と大麻成分の検査用デバイス及び大麻成分検査方法を提供することを目的とする。　アルコール濃度が30wt％以下の溶液に大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分を溶液中へ抽出させることを含む大麻成分の抽出方法。

Description

大麻成分の抽出方法、大麻成分の検査用デバイス及び大麻成分の検査方法
　本発明は、不法薬物である大麻の検査のための大麻成分の抽出方法、大麻成分の検査に使用するための検査用デバイス及び大麻成分の検査方法に関する。
　従来より、大麻の検査には大麻の葉や花冠をアルコール等の有機溶媒に浸し成分を抽出して呈色試薬をつかった簡易検査が行われている。試薬等を用いて、発見された物が大麻であることを一次的に認定する。その際には、キットになっている試薬を使用する。
　簡易検査には、特定の薬物に対して特有の反応色を示す性質のあるものが試薬として使われる。大麻の場合、もっとも広く使われるのがデュケノア試薬と呼ばれるもので、試薬が大麻の成分であるTHC（テトラヒドロカンナビノール）と反応して、呈色反応を示す（非特許文献１）。具体的には、大麻に3種の液を順に加えて反応させた後、しばらくすると、液体が上下２層に分かれ、上層は透明な薄い紫色、下層は不透明な青紫色を呈する。
　しかし、判定のポイントは、試薬を加えた液体が、上下２層に分かれ、その下層が青紫色を呈していることであり、現実的には見極めが難しく、正確な判定は容易ではなかった。
　このように大麻の簡易検査の呈色反応の判定は容易ではなく、例えば、薄暗い車両の中などでは誤判定が生じるおそれがあった。さらに、このキットに入っている3種の液体のなかには劇薬の塩酸もあり、取り扱いによっては非常に危険で注意が必要となっている。
　また、従来の方法では、大麻成分は100％の有機溶媒を用いて抽出していた（特許文献１）。さらに、メタノール等の有機溶媒を用いて抽出した後、液―液抽出などの操作を繰り返して、大麻中の幻覚成分を分離精製する必要があるという報告もあった（特許文献２）。
特許第4358993号公報 特開2012-69516号公報
Marja H.Niemi et al, ,JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,(2010), VOL400(4), pages 803-814
　本発明は、低いアルコール濃度の抽出用溶液を用いて大麻植物片から大麻成分を抽出する方法の提供を目的とする。
　大麻取り締まりの現場では、オンサイトで大麻を検出する必要があり、誤判定が少なく、劇物も使用しない安全な判定キットや判定方法が望まれていた。
　本発明者らは、簡便に実施でき、誤判定が少なく、劇物も使用しない安全な大麻成分の測定方法として、大麻成分に対する抗体を用い抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法が望ましいと考えた。
　しかし、従来は大麻成分の抽出のためにはアルコールなどの有機溶媒が必須であるとされ、100％の有機溶媒が抽出に用いられていた。抗体は大麻成分の抽出に必要とされていた有機溶媒に対して耐性が低く、有機溶媒で抽出した大麻成分を抗原抗体反応を利用して測定することはできなかった。
　本発明者らは、抗原抗体反応を用いた大麻成分の測定を可能にすべく、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法による大麻成分（THC-A、THC及びCBN）の測定に必要となる大麻成分の濃度について検討を行った。Marja H.Niemi et al, ,JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,(2010), VOL400(4), pages 803-814の図４によれば、大麻成分に対する抗体を用いたとき、３ng/mLの大麻成分の存在を検知できる。しかし、蛍光標識した抗体を用いて、抗原抗体反応後の抗体から発せられる蛍光強度を光学検知する為には、1μg/mL以上の濃度の大麻成分と反応したときの蛍光強度が必要となる。そこで、抗原抗体反応を行うときに必要な大麻成分の濃度を１μg/mL（4μg/mLが4倍希釈された濃度）として、その後の検討を行った。抗原抗体反応時に必要とする大麻成分の濃度が１μg/mL以上であるので、抗原抗体反応時に検体が４倍希釈されると仮定した場合に必要とする抽出時の大麻成分濃度は４μg/mL以上である。
　次いで、本発明者らは、抽出に用いるメタノールの含有割合を変えた抽出用溶液を用意し、大麻成分の抽出量を測定した。すると驚いたことに、メタノールが30重量(wt)％以下の溶液で大麻成分の分析必要下限値を超える量の抽出ができることが初めて明らかになった。
　さらに、30重量（wt）％以下のメタノールを含む抽出液を検体として、直接抗原抗体反応を行わせた場合もメタノールにより抗原抗体反応が阻害されることなく、大麻成分を免疫学的測定法により測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　アルコール濃度が30wt％以下の溶液に、大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分を溶液中へ抽出させることを含む大麻成分の抽出方法。
[２]　アルコールを含まない溶液を用いる、[１]の大麻成分の抽出方法。
[３]　溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、[１]又は[２]の大麻成分の抽出方法。
[４]　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、[１]～[３]のいずれかの大麻成分の抽出方法。
[５]　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)である、[１]～[４]のいずれかの大麻成分の抽出方法。
[６]　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、[１]～[５]のいずれかの大麻成分の抽出方法。
[７]　大麻成分を検出するために用いる検査用デバイスであって、
第一の容器と第二の容器とを備え、
前記第一の容器にはアルコール濃度が30wt％以下の溶液が収容され、
前記第二の容器には大麻成分に対する抗体が収容され、
前記第一の容器内に大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分をアルコール濃度30wt％以下の溶液中へ抽出し、
前記第二の容器内に前記第一の容器内の抽出液を所定量添加することにより第二の容器内で抗原抗体反応を生じさせる、大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[８]第二の容器内で生じる抗原抗体反応時のアルコール終濃度が7.5wt％以下である、[７]の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[９]　溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、[７]又は[８]の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１０]　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、[７]～[９]のいずれかの大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１１]　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)である、[７]～[１０]のいずれかの大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１２]　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、[７]～[１１]のいずれかの大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１３]　大麻成分に対する抗体が、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が、抗体重鎖可変領域ポリペプチド又は抗体軽鎖可変領域ポリペプチドに標識された状態でクエンチされる蛍光色素により標識され、前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原を介して複合体を形成したときにクエンチが解消されて蛍光強度が増加する抗体である、[７]～[１２]のいずれかの大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１４]　大麻成分に対する抗体が、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されており、前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原である大麻成分と結合して複合体を形成したときに、該抗原と抗原結合タンパク質の複合体が前記蛍光色素のクエンチャーとなり、該抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが負の相関関係にあり、該抗原と前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの複合体が形成したときに前記蛍光色素がより強くクエンチされることにより蛍光強度が減少する抗体である[７]～[１２]のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１５]　大麻成分に対する抗体が、受託番号NITE BP-01970で国際寄託されている、テトラヒドロカンナビノール（THC)又はその誘導体に結合する抗体を産生するハイブリドーマが産生する抗体である、[7]～[１２]のいずれかの大麻成分を検出するための検査用デバイス。
[１６]　アルコール濃度が30wt％以下の溶液に、大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分を前記溶液中へ溶出させ、該抽出液を大麻成分に対する抗体に添加し、抗原抗体反応を生じさせることを含む、大麻成分の検査方法。
[１７]　前記抗原抗体反応時のアルコール終濃度が7.5wt％以下である、[１６]の大麻成分の検査方法。
[１８]　溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、[１６]又は[１７]の大麻成分の検査方法。
[１９]　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、[１６]～[１８]のいずれかの大麻成分の検査方法。
[２０]　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)である、[１６]～[１９]のいずれかの大麻成分の検査方法。
[２１]　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、[１６]～[２０]のいずれかの大麻成分の検査方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-025914号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の方法は、アルコール濃度が30wt％以下の溶液で大麻植物片より大麻成分を抽出する方法であり、該方法で抽出した大麻成分はアルコールを含む抽出液を検体として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により、検出することができる。本発明の大麻成分抽出法及び検査法により、大麻成分を検出することができる。また、塩酸等の劇物を使用することなく、大麻成分を抽出、検出することができる。本発明により、大麻成分をオンサイトで簡易にかつ安全に検出することができる。
THC、THC-A及びCBNの構造を示す図である。 大麻成分の抽出及び抗原抗体反応を行わせる検査用デバイスの縦断面図である。 蛍光検査器の外観を示す図である。 蛍光検査器の内部構成を示す図である。 励起光照射による抗原抗体反応による抗原同定の原理を示す図である。 図３に示す蛍光検査器の測定系を示す図である。 図２に示す大麻成分検査用デバイスを用いた大麻成分の抽出及び抗原抗体反応を行わせる方法を示す図である。 大麻成分の抽出法の概要を示す図である。 アルコール濃度と抗原抗体反応による大麻成分の検出の関係を示す図である。 アルコール濃度と抗原抗体反応による大麻成分（THC）の検出の関係を示す図である。 アルコール濃度と抗原抗体反応による大麻成分（THC-A）の検出の関係を示す図である。 ハイブリドーマA-04が産生するモノクローナル抗体のTHCA、THC及びCBNとの反応性を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、大麻であると疑われる対象植物検査片である検査対象物が大麻であるか否かを検査するための大麻成分を抽出する方法である。
　大麻とは、マリファナ（marijuana）ともいい、アサ属（Cannabis属）に属するアサの花冠、葉を乾燥又は樹脂化、液体化したものをいう。本発明においては、葉、茎、根、種及び花弁等のアサの植物の部分又はその植物片を検体とする。通常、これらの植物の部分又はその植物片は、乾燥した状態で乾燥大麻として使用される。本発明においては、好ましい検査対象物はこれらの乾燥大麻である。特に乾燥大麻植物片が好ましい。
　大麻には、カンナビノイドと呼ばれる化学物質が大麻成分として含まれ、カンナビノイドは多幸感、鎮痛作用、幻覚作用等の種々の薬理作用を有する。カンナビノイドには、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）、カンナビノール（CBN)、カンナビジオール（CBD)等があり、本発明においては、これらの中でも強い幻覚作用を有するテトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)の抽出を目的とする。THCには、二重結合の位置異性体があり、Δ8-THCとΔ9-THCがある。THCという場合、Δ8-THCもΔ9-THCも含まれる。THC、THC-A及びCBNの化学構造式を図１に示す。
　従来、大麻の検査においては、THCやTHC-AやCBNの大麻成分を大麻植物片からメタノール等の有機溶媒を用いて抽出しており、大麻成分を検出可能に抽出するには、高濃度、例えば、100wt（質量）％の高純度の有機溶媒を用いる必要があると認識されていた。一方、有機溶媒は抗原抗体反応を阻害するため、高濃度の有機溶媒で抽出した大麻成分をそのまま抗原抗体反応を利用して測定することはできなかった。従って、大麻植物片中の大麻成分を抽出し、該抽出液を用いて直接抗原抗体反応を利用して大麻成分を測定することはできないと認識されていた。
　本発明においては、従来、大麻成分の抽出ができないと認識されていた低濃度の有機溶媒を用いて大麻植物片より大麻成分を抽出し、大麻成分の抽出液をそのまま直接検体として用いて、大麻成分を抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法により測定し検出する。すなわち、本発明により、大麻成分を抽出するときのアルコール成分の使用を制限することが可能になる。
　大麻成分抽出用の有機溶媒としては、炭素数の小さいアルコールを用い、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノールを用い、この中でもメタノールが好ましい。また、アルコールを含まない抽出用溶液を用いてもよい。すなわち、大麻成分抽出用溶液のアルコールは、０～40wt％、好ましくは０～30wt％で用いる。アルコールは、水で希釈してもよいが、好ましくは緩衝液又は生理食塩水で希釈して用いる。さらに、好ましくは界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）又は界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈して用いればよい。大麻成分抽出用アルコール水溶液は、好ましくは界面活性剤を含むが、界面活性剤を含まないアルコール水溶液も用いることができる。界面活性剤は、限定されないが、Tween-20、Tween-80等が好適に用いられる。
　この際、アルコール濃度が高いほど抽出効率は良くなるが、抗原抗体反応を行うためには、数μg/mL以上、例えば、３～４μg/mL以上の濃度でTHC、THC-A又はCBNが抽出できればよい。従って、低濃度のアルコールを含む溶液又はアルコールを含まない抽出用溶液で抽出しても抗原抗体反応で測定できる程度の濃度のTHC、THC-A又はCBNを抽出することが可能になる。大麻成分を抽出するときのアルコール濃度が低くなれば、アルコールを含む大麻成分抽出液を直接抗原抗体反応を利用した免疫学的測定の検体試料として用いることが可能になる。
　抽出は大麻植物片をアルコールを含む抽出用溶液中に入れ、撹拌、振動又は静置することにより行う。撹拌はボルテックスミキサー等の撹拌器を用いて行うことができる。また、超音波を照射して抽出してもよい。撹拌又は振動は、例えば、10秒～60分間行えばよい。また、静置により抽出する場合は、大麻成分抽出用溶液に大麻植物片を入れ、10秒以上静置すればよい。大麻植物片の大きさは限定されないが、例えば、1～10mm角片にして抽出すればよい。また、粉砕してから抽出してもよい。抽出に用いる容器も限定されず、例えば、ガラス製やポリプロピレン等の樹脂製のバイアルを用いればよい。また、大麻成分の抽出を行い、さらにその後の抗原抗体反応を行わせることができるデバイスを用いてもよい。
　抗体は、大麻成分に対する特異的抗体、好ましくは、抗THC抗体、抗THC-A抗体又は抗CBN抗体を用いる。なお、THC、THC-A及びCBNは構造が類似しており、免疫学的に交叉反応するので、抗THC抗体、抗THC-A抗体又は抗CBN抗体のいずれかを用いることにより、THC、THC-A及びCBNを測定することができる。抗体は、完全抗体でも抗体の機能性断片でもよい。機能性断片としては、Fab抗体、F(ab')2抗体、１個のFabと完全なFcを有するFab/c抗体等が挙げられる。また、Protein Aが結合する領域とProtein Gが結合する領域を有し、抗原と結合し得る構造をもった抗体の断片や人工抗体であってもよい。例えば、Protein Aが結合するVH領域とProtein Gが結合するCH1領域を有する抗体の断片や人工抗体が挙げられる。本発明において、抗体という場合、このような抗体の機能的断片や人工抗体も包含する。また、抗体は抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体又はその断片を用いてもよいし、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のDNA情報に基づいて、遺伝子組換え技術により作製した抗体を用いてもよい。そのようなハイブリドーマの例としてハイブリドーマA-04が挙げられ、該ハイブリドーマA-04は、2014年11月20日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depositary)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE BP-01970（「識別の表示」は、「A-04」）で国際寄託されている。これらの抗体の中でも１つの重鎖可変領域と１つの重鎖CH1領域並びに１つの軽鎖可変領域と１つの軽鎖CL領域を有するFab断片（Fab抗体）が好ましい。また、抗体の由来動物も限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、マスクラット、ヒツジ等のものを用いることができる。また、抗体は標識抗体でもよい。標識抗体としては、蛍光色素、酵素、化学発光物質等で標識した抗体が挙げられる。蛍光標識抗体であって、抗体が抗原に結合したときに、抗体が抗原に結合していないときに対して、蛍光の発生の有無や、蛍光強度が変化するように設計された蛍光標識抗体が好適に用いられる。すなわち、標識抗体が抗原に結合していないときには、標識に用いた蛍光物質が消光(クエンチ）されて蛍光を発しないか、特定の波長の蛍光を発生する状態にあるようにし、抗体に抗原が結合した場合に、蛍光色素の蛍光の発生状態が変化し得るようにする。例えば、抗体と抗原が結合していない状態で消光状態にあった蛍光色素が抗体と抗原が結合することにより蛍光を発するようになるか、あるいは抗体と抗原が結合していない状態で蛍光を発していた蛍光色素が抗体と抗原が結合することにより発生する蛍光の波長がシフトするようにする。このような抗体として、消光色素（クエンチャー）により蛍光強度の変化が生じる抗体、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET)により蛍光色素の発光状態が変化する抗体が挙げられる。すなわち、本発明においては、大麻成分と大麻成分に対する抗体が複合体を形成したときの蛍光強度が変化し得る抗体を用いる。蛍光強度が変化し得る抗体として、（１）抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが前記抗原を介して複合体を形成したときにクエンチが解消されて蛍光強度が増加する抗体と（２）前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原である大麻成分と結合して複合体を形成したときに、該抗原と抗原結合タンパク質の複合体が前記蛍光色素のクエンチャーとなり、該抗原と前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの複合体が形成したときに前記蛍光色素がより強くクエンチされることにより蛍光強度が減少する抗体が挙げられる。前者の抗体を用いた場合、測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が正の相関関係にあり、該抗体を測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が正の相関関係にある抗体という。後者の抗体を用いた場合、測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にあり、該抗体を測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にある抗体という。
　例えば、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が、抗体重鎖可変領域ポリペプチド又は抗体軽鎖可変領域ポリペプチドに標識された状態でクエンチされる蛍光色素により標識され、抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが前記抗原を介して複合体を形成したときにクエンチが解消されて蛍光強度が増加する抗体を好適に用いることができる。また、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されており、前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原である大麻成分と結合して複合体を形成したときに、該抗原と抗原結合タンパク質の複合体が前記蛍光色素のクエンチャーとなり、該抗原と前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの複合体が形成したときに前記蛍光色素がより強くクエンチされることにより蛍光強度が減少する抗体を用いることができる。本発明においてこのような抗体をＱ-body（商標）と呼び、測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が正の相関関係にあるＱ-body（商標）及び測定対象である抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にあるＱ-body（商標）を用いることができる。Ｑ-body（商標）をFab型複合体又はFab型抗体とも呼ぶ。
　特に抗体のVH領域に存在するトリプトファン残基を消光色素（クエンチャー）として利用する蛍光標識抗体が挙げられる。抗体のVH領域の第36番目、第47番目、第103番目（Kabatの番号付け系による）にはトリプトファン（W)残基が存在し、これらのトリプトファン残基はクエンチャーとして作用している（WO2011/061944号公報）。蛍光色素で標識した抗体抗原に結合したときに、蛍光色素がトリプトファン残基の近傍に位置しトリプトファン残基と相互作用して蛍光色素がクエンチするように設計する。すなわち、該蛍光標識抗体は抗原に結合していない状態では、クエンチされており、蛍光を発しない。抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が正の相関関係にある抗体を用いた場合、抗体に抗原が結合すると、抗体の立体構造が変化し、トリプトファンの近傍に位置していた蛍光色素はトリプトファンから離れ、トリプトファンと相互作用しなくなり、クエンチが解除され、蛍光を発するようになる。抗原が存在する場合、抗体と抗原が結合し、抗体の立体構造が変化し、蛍光色素のクエンチが解除され、蛍光を発するようになる。この蛍光を測定することにより、抗原の存在を検出することができ、また蛍光強度により抗原を定量することもできる。　一方、抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にある抗体を用いた場合、抗原と抗体の複合体が蛍光色素にクエンチャーとして作用し、蛍光色素はさらにクエンチされ、蛍光色素が発生する蛍光の蛍光強度は弱くなる。この際、抗体の抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び／又は抗体重鎖可変領域ポリペプチドの標識に用いられた蛍光色素は、抗体の抗原結合ポケット中に位置し、重鎖可変領域のトリプトファンとより近接した位置に存在し、トリプトファンとの相互作用がより強くなり、クエンチされる。抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドの両方が蛍光色素で標識されている場合、両方の蛍光色素が抗体の抗原結合ポケットに入り込み、２つの蛍光色素の間でも相互作用が生じ、蛍光色素間のクエンチング効果（H-dimer)が得られる。この際、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの標識に用いた蛍光色素と抗体重鎖可変領域ポリペプチドの標識に用いた蛍光色素が異なる蛍光色素であり、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる供与体色素とエネルギー受容体（アクセプター）となる受容体色素の組み合わせとなる場合、抗体が抗原と結合したとき、両方の蛍光色素すなわちエネルギー供与体とエネルギー受容体の向きが変化し、エネルギー供与体が発するエネルギーからのエネルギー受容体への蛍光共鳴エネルギー移動（FRET)が生じなくなり、発生する蛍光の蛍光強度が弱くなる。すなわち、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドからなり、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されている抗体を用いて抗原を測定、検出する場合、トリプトファン残基によるクエンチング、蛍光色素間のクエンチングに加え、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）効果によるクエンチングの効果が得られ、クエンチが大きくなる。蛍光色素は抗原と抗体の複合体と疎水的相互作用や静電的相互作用等により相互作用し、クエンチの程度が強くなる。
　抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にある抗体として、ハイブリドーマA-04（受託番号NITE BP-01970）が産生する抗体が挙げられ、該抗体の抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドにより、抗原濃度と蛍光色素の蛍光強度が負の相関関係にあるＱ-body（商標）を作製することができる。
　上記Ｑ-bodyの抗体重鎖可変領域ポリペプチドとしては、抗体重鎖遺伝子のＶ領域、Ｄ領域、及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。また、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第36番目、第47番目、又は第103番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましい。
　上記Ｑ-bodyの抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとしては、抗体軽鎖遺伝子のＶ領域及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。また、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第35番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましい。
　抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、及び、抗体軽鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域の両方を含む一本鎖抗体ポリペプチドは、公知の化学合成法、遺伝子組換え技術、抗体分子のタンパク質分解酵素による分解方法等を用いて調製することができるが、中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術により調製することが好ましい。
　Ｑ-bodyを標識する蛍光色素としては、抗体重鎖可変領域ポリペプチド又は抗体軽鎖可変領域ポリペプチドに標識された状態でクエンチ（消光）されるものであれば特に制限されず、ローダミン、クマリン、Cy、EvoBlue、オキサジン、Carbopyronin、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazole等を基本骨格として有する蛍光色素やその蛍光色素の誘導体を例示することができ、具体的には、CR110：carboxyrhodamine 110：Rhodamine Green(商標名)、TAMRA: carbocytetremethlrhodamine：TMR、ATTO655(商標名)、BODIPY FL(商標名)：4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 493/503(商標名)：4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid、BODIPY R6G(商標名)：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 558/568(商標名)：4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 564/570(商標名)：4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 576/589(商標名)：4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 581/591(商標名)：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、Cy3(商標名)、Cy3B(商標名)、Cy3.5(商標名)、Cy5(商標名)、Cy5.5(商標名)、EvoBlue10(商標名)、EvoBlue30(商標名)、MR121、ATTO 390（商標名）、ATTO 425（商標名）、ATTO 465（商標名）、ATTO 488（商標名）、ATTO 495（商標名）、ATTO 520（商標名）、ATTO 532（商標名）、ATTO Rho6G（商標名）、ATTO 550（商標名）、ATTO 565（商標名）、ATTO Rho3B（商標名）、ATTO Rho11（商標名）、ATTO Rho12（商標名）、ATTO Thio12（商標名）、ATTO 610（商標名）、ATTO 611X（商標名）、ATTO 620（商標名）、ATTO Rho14（商標名）、ATTO 633（商標名）、ATTO 647（商標名）、ATTO 647N（商標名）、ATTO 655（商標名）、ATTO Oxa12（商標名）、ATTO 700（商標名）、ATTO 725（商標名）、ATTO 740（商標名）、Alexa Fluor 350（商標名）、Alexa Fluor 405（商標名）、Alexa Fluor 430（商標名）、Alexa Fluor 488（商標名）、Alexa Fluor 532（商標名）、Alexa Fluor 546（商標名）、Alexa Fluor 555（商標名）、Alexa Fluor 568（商標名）、Alexa Fluor 594（商標名）、Alexa Fluor 633（商標名）、Alexa Fluor 647（商標名）、Alexa Fluor 680（商標名）、Alexa Fluor 700（商標名）、Alexa Fluor 750（商標名）、Alexa Fluor 790（商標名）、Rhodamine Red-X（商標名）、Texas Red-X（商標名）、5(6)-TAMRA-X（商標名）、5TAMRA（商標名）、SFX（商標名)を挙げることができるが、中でも、ローダミン系蛍光色素であるCR110やTAMRA、及びオキサジン系蛍光色素であるATTO655を特に好適に挙げることができる。
　Ｑ-bodyについては、特許第5043237号公報及びWO2013/065314に記載されている。
　抗原抗体反応を用いた免疫学的測定法は、限定されず、公知のELISA、イムノクロマトグラフィー等により測定することができる。大麻植物片から抽出した大麻成分と大麻成分に対する特異的抗体を混合し、抗原抗体複合体を検出すればよい。上記のＱ-bodyを用いる場合、抗体と大麻成分が結合したときに発生する蛍光を測定すればよい。免疫学的測定を行う抗原抗体反応系は、液系でも固相系でもよい。固相系は、乾燥した抗体を用いる。乾燥抗体としては、フリーズドライした抗体やマイクロタイタープレート等の担体に固定化した抗体を用いることができる。抗原抗体反応を行わせる容器に抗体溶液又は乾燥抗体を入れておき、その容器に大麻植物片より抽出した大麻成分抽出液を添加すればよい。
　抗原抗体反応時にアルコール成分を含むか、あるいは含まない大麻成分抽出液を検体試料として用いるが、抗原抗体反応が起こる際に反応系にアルコールが高濃度で含まれていると抗原抗体反応が阻害される。抗原抗体反応時のアルコール終濃度は、30wt％以下、好ましくは25wt％以下、さらに好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは10wt％以下、さらに好ましくは7.5wt％以下、さらに好ましくは５wt％以下、特に好ましくは０wt％である。
　本発明の方法においては、アルコールを含んでいてもよい抽出用溶液を用いて大麻植物片より大麻成分を抽出し、抽出用溶液としてアルコールを含む溶液を用いる場合、大麻成分抽出液をアルコールが含まれている状態で抗原溶液として用いるため、大麻成分抽出液と抗体を添加したときのアルコール終濃度が30wt％以下、好ましくは25wt％以下、さらに好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは10wt％以下、さらに好ましくは7.5wt％以下、さらに好ましくは５wt％以下、特に好ましくは０wt％となるように大麻成分抽出用溶液のアルコール濃度を調整する必要がある。乾燥させた抗体又は固相化した抗体を用いる場合は、大麻成分抽出用液中のアルコール濃度は、30wt％以下、好ましくは25wt％以下、さらに好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは7.5wt％以下とすればよい。また、大麻成分抽出液と抗体溶液を容積比１：１で混合して抗原抗体反応を行わせる場合は、大麻成分抽出用液のアルコール濃度を30wt％以下、さらに好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは10wt％以下、特に好ましくは０wt％とし、大麻成分抽出液と抗体溶液を容積比１：２で混合して抗原抗体反応を行わせる場合は、大麻成分抽出用液のアルコール濃度を30wt％以下、好ましくは22.5wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは０ｗt％とし、大麻成分抽出液と抗体溶液を容積比１：３で混合して抗原抗体反応を行わせる場合は、大麻成分抽出用液のアルコール濃度を30wt％以下、好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは０wt％とすればよい。通常、抗原抗体反応時は、大麻成分抽出液と抗体溶液を容積比１：１～１：３で混合する。従って、大麻成分の抽出効率と抗原抗体反応の両方を考慮した場合の大麻成分抽出用液中のアルコール濃度は、30wt％以下、好ましくは22.5wt％以下、さらに好ましくは20wt％以下、さらに好ましくは15wt％以下、さらに好ましくは10wt％以下、特に好ましくは０wt％である。
　免疫学的測定を行う際は、大麻植物片から大麻成分を抽出し、大麻成分に対する抗体と混合し抗原抗体反応を行わせることができる、大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせる検査用デバイスを用いてもよい。このようなデバイスとして、例えば、大麻植物片から大麻成分を抽出する容器部分と大麻成分と大麻成分に対する抗体とを混合し抗原抗体反応を行わせる容器部分を有するデバイスが挙げられる。該デバイスを、大麻成分検査用デバイスということもある。
　以下、大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせる検査用デバイス及び該デバイスを用いた大麻成分の抽出方法及び大麻成分抽出液と大麻成分に対する抗体とを混合し抗原抗体反応を行わせる方法について説明する。
　該デバイスは、第一の容器と第二の容器を備える。該デバイスは、第一の容器と第二の容器が隔壁を介して連続し、所定量を第一の容器から第二の容器へ液体を移動させ添加することが可能な一体型のデバイスでもいいし、第一の容器と第二の容器が連続していない別体のデバイスであってもいい。第一の容器にはアルコール濃度が30wt％以下の溶液を含み、第二の容器には大麻成分を抗原とした抗原抗体反応により抗原を検出するための大麻成分に対する抗体を含む。抗体は液体でも、乾燥物でもよい。乾燥物としては、凍結乾燥した抗体、第二の容器に固相化した抗体等が挙げられる。第一の容器において、大麻植物片から大麻成分が抽出され、大麻成分を含む抽出液が第二の容器に定容積移動されることにより添加され、第二の容器中で抗原抗体反応が起こる。
　第一の容器の容量は、1.2～4.8mL程度、第二の容器の容量は、50～200μL程度であり、デバイス全体の大きさは、長さ54～216mm、外径７～26mm程度である。
　該デバイスは、第一の容器でアルコールを含む抽出用溶液を用いて大麻成分を抽出した後に大麻成分を含む抽出液を第二の容器へ添加するための機構を有する定容積移動機構部を備えていてもよい。抽出用溶液を含む第一の容器に大麻植物片であると疑われる対象植物検査片を入れ、撹拌、振動又は静置することにより抽出する。
　該デバイスの第一の容器及び第二の容器は円筒形状を有しており、第二の容器は第一の容器の下方に装着される。第一の容器の内周側には、計量部材が嵌着され、該計量部材は、第一の容器に対して接離する方向に移動可能である。また、第一の容器の上方開口部には、キャップ部材が挿着され、該キャップ部材は、90度回転させ9mm押し込む、あるいは、取り外すことにより、前記計量部材に対して接離する方向に移動可能である。大麻成分検査用デバイスで大麻成分を抽出するときには、検査用デバイスのキャップ部材を回転させ取り外し、検査試料を入れ、その後キャップを閉め大麻成分を抽出すればよい。
　前記計量部材の底部には、液体が流通する液体流通開口部が形成され、前記計量部材の底部には、液体を計量するための計量用溝部を備えた計量ロッドが突設されている。
　第一の容器中で大麻成分を抽出した後、大麻成分を含む大麻成分抽出液が、計量部材の液体流通開口部を介して、計量用溝部に収容され、前記キャップ部材に対して接近する方向に移動させることにより、キャップ部材が計量部材に当接し、さらにキャップ部材を計量部材に対して接近する方向に移動させることにより、計量部材を第二の容器に接近する方向に移動させる。この結果、前記計量部材の計量用溝部に収容されている所定の量の大麻成分抽出液が、第二の容器に添加され、第二の容器に含まれる大麻成分に対する抗体と混合され、抗原抗体反応が生じる。
　すなわち、このデバイスを用いることにより、第一の容器中で抽出された大麻成分抽出液が、計量部材の液体流通開口部を介して、計量用溝部に収容される。その後、キャップ部材を計量部材に対して接近する方向に移動させることにより、キャップ部材が計量部材に当接し、さらにキャップ部材を計量部材に対して接近する方向に移動させることにより、計量部材が第二の容器に接近する方向に移動し、計量部材の計量用溝部に収容された所定の量の大麻成分抽出液を第二の容器中に含まれる大麻成分に対する抗体に添加することができる。
　前記計量部材は計量ロッドを備え、該計量ロッドが、第一の容器の内側に形成された計量用側壁に沿って、液密状態で摺動するように構成されている。
　このように構成することにより、計量部材の計量ロッドが、第一の容器の内周に形成された計量用側壁に沿って、液密状態で摺動するので、一旦計量用溝部に収容された所定の量の大麻成分抽出液が、漏洩することなく、常に所定の量の大麻成分抽出液を、第二の容器に収容した大麻成分に対する抗体に混合することができる。
　図２に上記の大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせる検査用デバイスの縦断面図を示す。該検査用デバイス１０は、大麻成分を抽出する抽出用溶液Ｌ１を収容する第一の容器１２を備えており、この第一の容器の下方には、大麻成分に対する抗体Ｌ２を収容する第二の容器１４が装着されている。
　また、第一の容器１２の内周側には、第二の容器１４に対して、接離する方向に移動可能な計量部材１６が嵌着されている。
　さらに、第一の容器１２の上方開口部１２aに、計量部材１６に対して、接離する方向に移動可能なキャップ部材１８が挿着されている。第一の容器１２は、略円筒形状の容器本体部２０を備えており、容器本体部２０の底部には、容器本体部２０の径よりも小径に形成された計量用側壁２２が形成されている。また、この計量用側壁２２の下端は、再び径が大きくなった係合部２４が延設されており、この係合部２４の外周に係合突起２４aが形成されている。
　また、容器本体部２０の内壁２０aには、計量部材１６を、第一の容器１２の内周側に嵌着した際に、計量部材１６を位置決めするための位置決め用突設部２６が形成されている。
　また、第一の容器１２の上方開口部１２aの近傍の内壁２０aには、上方開口部１２aにキャップ部材１８を装着した際に、キャップ部材１８を係止するための係止突設部２８が形成されている。
　第一の容器１２の上方開口部１２aの近傍の内壁２０aには、キャップ部材１８を計量部材１６に対して接近する方向に移動させる際に、キャップ部材１８を案内する案内溝３０が形成されている。
　図２に示したように、第二の容器１４は、略円筒形状の第二の容器本体１４ａを備えており、この第二の容器本体１４ａの内部に、大麻成分に対する抗体Ｌ２を収容するための有底筒状の抗体収容部３４が形成されている。
　また、第二の容器１４の本体１４ａの上部には、第一の容器１２の下方に装着した際に、第一の容器１２の容器本体部２０の外周に形成された係合突起２４ａと係合する、係合スリット１４ｂが形成されている。
　さらに、第二の容器１４の本体１４ａの下部には、対向する２つのスリット開口部３６が形成されており、例えば、これらのスリット開口部３６を介して、光を照射して、第二の容器１４の抗原抗体反応の検査ができるように構成されている。
　なお、本発明の大麻成分検査用デバイス１０の使用用途によっては、このようなスリット開口部３６を設けないようにすることも可能である。
　また、図２に示したように、計量部材１６は、略円筒形状の計量部材本体３８を備えており、この計量部材本体３８の底部には、液体が流通する液体流通開口部４０が形成されている。
　また、計量部材１６の計量部材本体３８の下端には、計量ロッド４４を備えており、この計量ロッド４４が、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２に沿って、液密状態で摺動するように構成されている。
　計量部材１６の計量部材本体３８の外径は、第一の容器１２の容器本体部２０の内径とほぼ同じか、僅かに小さく形成されており、計量部材１６が、第一の容器１２の容器本体部２０の内壁２０ａに沿って摺動して、第二の容器１４に対して、接離する方向に移動可能となっている。
　一方、キャップ部材１８は、図２に示したように、略円筒形状のキャップ部材本体５２と、上面５４と、キャップ部材本体５２から外側に離間して、上面５４の外周端部から下方に延設された操作部材５６とを備えている。
　この場合、キャップ部材本体５２の外径は、第一の容器１２の容器本体部２０の内径とほぼ同じか、僅かに小さく形成されており、後述するように、計量部材１６に対して、接離する方向に移動可能となっている。
　また、大麻成分検査用デバイス１０を誤って倒してしまった場合にも、第一の容器１２の容器本体部２０内に収容した抽出用液体Ｌ１が、外部に漏洩しないように、キャップ部材本体５２の外径は、第一の容器１２の容器本体部２０の内径に対して、液密的にシールするような寸法にするのが望ましい。
　また、操作部材５６の内径は、計量部材１６に対して、接離する方向に移動可能となるように、第一の容器１２の容器本体部２０の外径とほぼ同じか、僅かに大きくなるように形成されている。
　また、キャップ部材本体５２と操作部材５６との間に位置する、上面５４の下面５４ａに、第一の容器１２の上端１２ｂが当接してストッパーとして機能することによって、計量部材１６がこれ以上、第二の容器１４に対して、接近する方向に移動することがないように構成されている。
　なお、図示されていないが、キャップ部材１８のキャップ部材本体５２には、第一の容器１２の内壁に形成された案内溝３０に嵌合して摺動ずる案内突設部が形成されている。
　このように構成される本発明の大麻成分検査用デバイス１０は、例えば、下記のように使用される。
　先ず、図２に示したように、本発明の大麻成分検査用デバイス１０は、使用前に予め組み立てた状態となっている。
　すなわち、第一の容器１２の係合部２４の外周に形成された係合突起２４ａに、第二の容器１４の本体１４ａの上部の係合スリット１４ｂを係合することによって、第二の容器１４が、第一の容器１２の下方の係合部２４に装着されている。また、第二の容器１４の抗体収容部３４の内部に、予め抗体Ｌ２が収容されている。
　また、図２に示したように、第一の容器１２の容器本体部２０の内周側には、第二の容器１４に対して、接離する方向に移動可能な計量部材１６が嵌着されている。
　すなわち、計量部材１６を第一の容器１２の内周側に嵌着した際に、計量部材１６の計量部材本体３８の下端３８ａが、容器本体部２０の内壁２０ａに形成された位置決め用突設部２６に当接してストッパーとして機能して、計量部材１６が初期位置に位置決めされるようになっている。
　この状態では、計量部材１６の計量ロッド４４の下方シール部４８が、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２に嵌合した状態であり、液密的にシールされるようになっている。
　これにより、第一の容器１２の本体部２０内に収容した混合すべき大麻成分抽出液Ｌ１が、計量部材本体３８の底部に形成された液体流通開口部４０、容器本体部２０の計量用側壁２２に囲まれた開口部を介して、第二の容器１４の抗体収容部３４の内部に収容された抗体Ｌ２と混合されないように構成されている。
　また、この状態では、第一の容器１２の上方開口部１２ａに、計量部材１６が嵌着されている。そして、第一の容器１２の上方開口部１２ａの近傍の内壁２０ａに形成された係止突設部２８に、キャップ部材１８のキャップ部材本体５２の略中間に外側に突設するように形成された係止突設部５２ａが当接してストッパーとして機能し、キャップ部材１８が初期位置に係止されている。
　次に、再び、キャップ部材１８を第一の容器１２の上方開口部１２ａに、キャップ部材１８を嵌着する。
　そして、キャップ部材１８を回転させるごとによって、第一の容器１２の上方開口部１２ａの近傍の内壁２０ａに形成された案内溝３０と、キャップ部材１８のキャップ部材本体５２に形成された案内突設部を合致させる。
　そして、キャップ部材本体５２の操作部材５６を指などで把持して下方に押し下げることによって、又は、キャップ部材本体５２の上面５４を下方に押圧することによって、キャップ部材１８を第二の容器１４の方向に移動させる。
　これによって、キャップ部材１８のキャップ部材本体５２の下端５２ｂが、計量部材１６の計量部材本体３８の上端に当接して、計量部材１６の計量部材本体３８の下端３８ａと、容器本体部２０の内壁２０ａに形成された位置決め用突設部２６との間の当接状態が解除されて、計量部材１６が第二の容器１４の方向に、すなわち、下方に移動される。
　この状態では、第一の容器１２の容器本体部２０内に収容した混合すべき大麻成分抽出液Ｌ１は、計量部材１６の計量部材本体３８の底部に形成された液体流通開口部４０を介して、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６と下方シール部４８との間に形成された計量用溝部５０に浸入する。
　そして、さらにキャップ部材１８を第二の容器１４の方向に移動させることによって、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６が、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２に嵌合した状態となり、液密的にシールされる。
　これによって、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６と下方シール部４８との間に形成された計量用溝部５０と、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２との間に、空間が形成されることになる。
　これによって、該空間に収容された大麻成分抽出液Ｌ１が、計量されることになる。
　続いて、さらにキャップ部材１８を第二の容器１４の方向に移動させることによって、計量部材１６がさらに下方に、第二の容器１４の方向に移動される。
　これによって、計量部材１６の計量ロッド４４の下方シール部４８が、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２の下端から離間した状態となり、開口部が形成されることになる。
　これによって、この開口部を介して、前記空間に収容、計量された大麻成分抽出液Ｌ１が、第二の容器１４の抗体収容部３４に浸入して、第二の容器１４の抗体収容部３４に収容された抗体Ｌ２との混合が開始される。
　そして、さらにキャップ部材１８を第二の容器１４の方向に移動させることによって、計量部材１６がさらに下方に、第二の容器１４の方向に最終位置（混合完了位置）まで移動される。
　これによって、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６が、ピストンとして作用する。これにより、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６と下方シール部４８との問に形成された計量用溝部５０、すなわち、前記空間に収容され、計量された大麻成分抽出液Ｌ１が、第二の容器１４の抗体収容部３４に浸入して、第二の容器１４の抗体収容部３４に収容された抗体Ｌ２と混合されることになる。
　この最終位置の状態では、キャップ部材本体５２と操作部材５６との間に位置する、上面５４の下面５４ａに、第一の容器１２の上端１２ｂが当接してストッパーとして機能することによって、計量部材１６がこれ以上、第二の容器１４に対して、接近する方向に移動することがない。
　また、この最終位置の状態では、計量部材１６の計量ロッド４４の上方シール部４６が、第一の容器１２の内周に形成された計量用側壁２２に嵌合した状態であり、液密的にシールされている。
　従って、これ以上、第一の容器１２の容器本体部２０内に収容した大麻成分抽出液Ｌ１が、第二の容器１４の抗体収容部３４に浸入して、第二の容器１４の抗体収容部３４に収容された抗体Ｌ２と混合されないように構成されている。
　このように構成される本発明の検査用デバイス１０によれば、計量部材１６の計量用溝部５０、すなわち、前記空間に収容された所定の量の液体を、第二の容器１４の抗体収容部３４に収容した抗体Ｌ２に混合することができる。
　なお、本発明の検査用デバイス１０において、第一の容器１２、第二の容器１４、計量部材１６、キャップ部材１８の材質は、特に限定されるものではなく、例えば、ガラス、アルミニウムなどの金属、樹脂などから構成することができる。この場合、計量、操作性などから樹脂から構成するのが望ましく、使用できる樹脂としては特に限定されるものではなく、例えば、ポリエチレン樹脂（PE）、ポリプロピレン樹脂（PP）、ポリエチレンテレフタレート樹脂（PET）などが使用可能である。
　また、被混合物を光学的な試験や測定をする場合は、第二の容器１４をポリスチレン樹脂（PS）やアクリル樹脂（PMMA）などを使用すると有用である。
　また、第一の容器１２、第二の容器１４、計量部材１６、キャップ部材１８は、不透明、半透明、透明とすることができる。
　第二の容器において、大麻成分抽出液と大麻成分に対する抗体が混合され、抗原抗体反応が起こる。
　大麻成分検査用デバイスのアルコールを含有する大麻成分抽出用溶液を収容した第一の容器に大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ大麻成分を抽出する。第一の容器中の大麻成分を含む抽出液をデバイスの機構を利用して、大麻成分に対する抗体を含む第二の容器に移動させ添加し、抗原抗体反応を行わせる。第二の容器中の抗体は凍結乾燥品等の乾燥物として含まれていても抗体溶液として含まれていてもよい。抗体溶液として含まれる場合、アルコールを含む大麻成分抽出液と抗体溶液の混合比（容積比）は、１：１～１：５、好ましく１：２～１：４、さらに好ましくは１：３である。例えば、第一の容器に大麻成分抽出液を１～５mL、好ましくは２～３mL、さらに好ましくは2.4mL収容しておき、大麻を含むと疑われる植物片を入れ、抽出した後、抽出液を10～100μL、好ましくは20～50μL、さらに好ましくは25μLを第二の容器に移す。また、この際、抽出液中には大麻成分が４μg/mL以上、好ましくは４～400μg/mLの濃度で含まれていればよい。この際、第二の容器には、25～100μL、好ましくは50～100μL、さらに好ましくは75μLの大麻成分に対する抗体を含む抗体溶液を入れておけばよい（図７）。この結果、第一の容器中の大麻成分抽出液中の大麻成分濃度が４～400μg/mLのとき、第二の容器において抗原抗体反応を行わせるときの大麻成分濃度は１～100μg/mLとなる。
　抗原抗体反応は、４～44℃、好ましくは25～35℃で反応直後～3分、好ましくは3分以上行う。
　抗原抗体反応を行った後、反応液中で形成された抗原と抗体の複合体を検出する。例えば、抗体として蛍光標識抗体を用いた場合、抗原と抗体の複合体から発生する蛍光を測定すればよい。抗体としてＱ-bodyを用いた場合、測定は、第二の容器中の抗原抗体反応後の反応液を蛍光検査器で測定することにより行うことができる。
　蛍光検査器は、特定の波長の蛍光を検出し得る検出装置であればいかなる装置をも用いることができる。例えば、図３に示す携帯型蛍光検査器を用いることができる。上記の大麻成分検査用デバイスを用いて大麻植物片より大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせた後、反応液を試料として用いて蛍光検査器により蛍光を測定すればよい。この際、前記大麻成分検査用デバイスの抗原抗体反応液を含む第二の容器部分を該検査器に挿入し測定することもできる。
　該検査器は、少なくとも、容器内の液相対象物中の蛍光物質を励起して蛍光を放出させることが可能な励起光を放射する光源と、蛍光物質が放出した蛍光を検出する検出器と、光源からの励起光を容器内の液相対象物に導くとともに液相対象物からの蛍光を検出器に導く光学系とを備えている携帯型蛍光光度計である。該検査器は容器と光源、検出器及び光学系を一体に保持する筐体を備えている。図６に蛍光検査器の測定系を示す。
　図３に携帯型蛍光検査器の斜視概略図を示し、図４に内部構成を示す。図３に示すように、前記蛍光検査器は、全体としては扁平なほぼ直方体の箱状のものである。携帯型であるので、大きさとしては人の手のひらサイズかそれよりも少し大きい程度である。該蛍光検査器の筺体６２の前面には、光度計の動作状態や測定結果を表示する表示部６３と、幾つかの操作ボタン６４～６９が設けられている。
　該蛍光検査器の筺体６２は、上面部の一部が開閉蓋６１となっている。開閉蓋６１を開くと、筺体６２内に試薬セル装着部６０が形成されている。試薬セル装着部６０は、試薬セル７０の寸法形状に適合した枠状の部位である。
　試薬セル７０は、励起光や蛍光を十分透過する材料で形成されている。具体的には、硼珪酸ガラスや石英、サファイアのようなガラス製、PMMA（アクリル樹脂）、ポリスチレン、COC（環状オレフィン・コポリマー）のような樹脂製のものが試薬セル７０の材料として使用される。試薬セル７０に抗原抗体反応を行わせた後の反応液を添加し、蛍光を測定すればよい。
　試薬セル７０を蛍光検査器に装着する場合、図３に示すように、開閉蓋６１を開け、試料セル７０を試薬セル装着部６０の挿入孔に挿入する。試薬セル７０は、試薬セル装着部に装着されて所定位置で保持される。その後、開閉蓋６１は閉じられる。
　光源７２は、液相対象物中の蛍光物質を励起して蛍光を放出させることができる光（励起光）を放射するものである。光源としては、レーザ光、LED光等を用いることができるが、好ましくは、LEDランプが用いられ、例えば、波長525nmの緑色光を放射するLEDを用いればよく、レンズを備えた出力2mW程度のものを好適に用いることができる。
　蛍光検査器の光学系は、光源７２からの励起光を試薬セル７０のセル部に導くと共にセルの液相対象物からの蛍光を検出器７６に導くものである。検出器７６は、フォトダイオードを使用したものや光電管などの中から適宜選択されるが、フォトダイオードが好適に用いられる。図４に示す内部構造を有する検査器の場合、光学系は光源７２からの光を集光するレンズ７１、光路の折り曲げと光の選択を行うためのダイクロイックミラー７５、光路上に配置されたフィルタ（励起フィルタ７３及び蛍光フィルタ７４）等から構成されている。ダイクロイックミラー７５を挟んで、試薬セル装着部６０とは反対側の位置に、検出器７６が配置されている。前記蛍光検査器はさらに電源を供給する電池７７及び演算装置７８を備えている。演算装置は検知した蛍光強度から試料中の大麻成分濃度を算出し、表示部６３に表示することができる。演算装置には、記憶装置が備えられていてもよく、あらかじめ記憶装置に蛍光強度と大麻成分濃度を関連付けした式が記憶されており、該式に基づいて、大麻成分濃度を算出する。概式は、例えば、あらかじめ作成したキャリブレーションカーブを表す式である。
　このような小型の検査器を用いることにより、取得した試料を実験室に運んで測定することなく、取得現場でオンサイトで大麻成分を検出することが可能になる。
　本発明はさらに、上記の検査用デバイスを含む大麻成分検査用キット、あるいは上記の検査用デバイス及び蛍光検査器を含む大麻成分検査用キットを包含する。
　前記の大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせる検査用デバイスと前記蛍光検査器を用いて以下のように大麻成分の検出を行う。
　大麻であると疑われる対象植物検査片を、30wt％以下の濃度のアルコールを含む大麻成分抽出用溶液が収容された、大麻成分検査用デバイスの第一の容器に入れ、撹拌、振動又は静置により大麻成分を抽出する。大麻成分検査用デバイスの機構により、第一の容器中の大麻成分抽出液を、大麻成分に対する抗体が収容された、大麻成分検査用デバイスの第二の容器に移動添加させる。この後、第二の容器中で抗原抗体反応が進行する。
　抗原抗体反応を行わせた後、反応液を蛍光検査器の試薬セルに移し、測定を行う。この際、大麻成分検査用デバイスの第二の容器を試薬セルとして用いることもできる。
　抗体として、Ｑ-bodyを用いた場合、植物片中に大麻植物片が含まれる場合、抗体が抗原である大麻成分と結合することにより、蛍光を発するようになり、大麻植物片の存在を検出することができる。
　本発明の方法によれば、税関などの現場で簡易型の蛍光検査器を使用して、オンサイトで不法薬物である大麻の検査が可能となる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　大麻の葉からのTHC及びTHC-Aのアルコールを用いた抽出効率の検討
（１）　抽出時のメタノール濃度の検討
　抗原抗体反応では、４μg/mL以上の大麻成分の抽出ができれば反応確認ができる。抽出に用いるメタノール濃度を変え、４μg/mL以上の大麻成分の抽出が可能かを確認した。
　大麻の葉からの大麻成分の抽出用溶液としては、10wt％、30wt％又は40wt％のメタノールを含有するか、あるいはメタノールを含有しない（０wt％）PBS-T溶液（リン酸緩衝生理食塩水＋界面活性剤Tween20 0.05％＋防腐剤　アジ化ナトリウム0.05％）を用いた。なお、PBS-T中のアジ化ナトリウムは長期保存のための防腐剤であり抗原抗体反応には関与しない。
　上記溶液をポリプロピレン樹脂製の容器に入れた。大麻の葉を２０枚用意し、その葉を５mm角の四角い切片にし、重量にして約20mgを容器内に投入し溶液に浸し、容器に蓋をして上下振動させた。浸漬は３分間とし、抽出液50μLをHPLC（高速液体クロマトグラフィー）にて濃度定量する。浸漬時間の３分は、オンサイト検査での許容される時間として設定した。
　図８に大麻成分の抽出法の概要を示す。
　HPLC（高速液体クロマトグラフィ）測定条件は以下の通りであった。
(a)　カラム
XBridge BEH C18 Intelligent Speed (IS) Column, 130Å, 2.5 μm, 4.6 mm X 20 mm, 1/pkg（Waters Part number：186003088）
(b)Sample Injection: 50μl（原液）
(c)　バッファＡ：0.1% TFA（トリフルオロ酢酸）
　　バッファＤ：アセトニトリル
(d)Elution（溶出のためにバッファ液を流す条件）
　バッファＡは最初から流し、徐々にバッファＤの割合を変えていく。
0.00 [min]－5.00 [min], D conc 0% -100% gradient
5.00 [min]－6.00 [min], D conc 100% -0% gradient
6.01 [min]－11.00 [min], D conc 0 %
11.00min, Stop
(e）　Flow-rate:　1.5 mL / min、Temp:　30 ℃
　検出は、228nmの吸収ピークに基づいて行った。ピーク高さが高い場合、検出量が多いことを示す。
　各メタノール濃度で試料をそれぞれ５本ずつ用意し、濃度定量を行った（N=5)。
　その結果、大麻成分の平均的抽出量はメタノール濃度０wt％、10wt％、30wt％のPSB-T溶液それぞれで、この順番で、8.7μg/mL、9.3μg/mL、7.6μg/mLとなり、いずれも４μg/mLの最低抽出量を超えた。また、メタノール濃度０wt％でも大麻成分の抽出が可能であり、メタノール濃度10wt％、30wt％のときと比べても差がないことが分かった。
　後記の実施例２の結果より、メタノール濃度40wt％となると、抗体が変性されてしまい、測定に支障をきたすことが分かった。メタノール濃度０wt％のときはメタノール濃度10wt％、30wt％のときと比べて抗体の活性が高く保持され、抗体が変性されることなく、大麻成分を測定することができる。
　メタノール量が少なければ少ないほど抗体が変性されることなく抗原抗体反応の進行が高く維持されるという大きな効果がある。
（２）　純水とPBS-T溶液での大麻成分抽出の検討
　純水とPBS-T溶液を用いて（１）と同様の方法で大麻の葉から大麻成分の抽出を行い、濃度定量を行った(n=3)。
　その結果、大麻成分の平均的抽出量は純水で3.4μg/mL、PBS-T溶液で7.4μg/mLであり、PBS-T溶液では純水の２倍強の抽出濃度となった。大麻成分の抽出にはメタノールを含まない単なる純水ではなく、メタノールを含まないPBS-T溶液の方が望ましい。但し、純水を抽出液とした場合、PBS-T溶液に比べ抽出量は劣るものの抗原抗体反応に使う量の大麻成分の抽出は可能である。
　実施例１の結果、アルコール成分が30wt％以下の溶液に大麻の葉を検査片として投入し、当該検査片の成分を溶液中へ抽出させることが可能であることがわかった。
実施例２　抗原抗体反応を利用した大麻成分の測定におけるメタノールの影響
　抗体として大麻成分であるTHC及びTHC-Aに対する抗体を蛍光色素で標識した抗体であるＱ-body（T-3抗体）を用いた。大麻成分であるTHCに対する抗体Ｑ-bodyは、WO2013/065314に記載の方法で作製した。すなわち、WO2013/065314の実施例１に記載の方法で、大麻成分THCに対する抗体のTAMRAで標識された軽鎖可変領域（VL；配列番号１）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号２）を含むポリペプチドと、TAMRAで標識された大麻成分ＴＨＣに対する重鎖可変領域（VH；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（CH1；配列番号４）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルFab型複合体を合成し、Ｑ-bodyとして用いた。Ｑ-bodyは0.5％Tween20及び２％BSAを含むPBS中16nMの濃度で用いた。
　THCを100μg/mLの濃度で含み、メタノールを60wt％、50wt％、40wt％、30wt％、20wt％又は10wt％の濃度で含むPBS-T溶液を抗原溶液として用いた。
　抗体溶液30μLと抗原溶液30μLを混合し、抗原抗体反応を行わせた。抗原抗体反応時のメタノール終濃度は、30wt％、25wt％、20wt％、15wt％、10wt％又は５wt％であり、Ｑ-bodyの終濃度は８nMであった。抗原抗体反応は30℃で行った。それぞれ、n=3で測定を行った。
　反応液を蛍光プレートリーダー（Moleculardevices社、SpectraMax Paradigm S/N: 32 770 02-2092）を用いて蛍光を測定した。測定時の励起波長及び蛍光波長は、それぞれ530nm及び580nmであった。
　結果を図９に示す。図９のグラフの横軸は相対的な蛍光強度を示し、1.00以上は抗原を検出でき・BR>スことを示し、1.00未満は検出できなかったことを示す。図９に示すように、抗原抗体反応時のメタノール終濃度が15WT％以下の場合に、抗原抗体反応が起こり、THCを測定することができた。
　さらに、上記方法と同じ方法で、抗原としてTHC又はTHC-Aを用い、メタノールを添加しない抗原液（メタノール終濃度０wt％）も用いて測定を行った。n=5で測定を行った。
　図１０にTHC測定の結果、図１１にTHC-A測定の結果を示す。THC、THC-A共にメタノール終濃度25wt％～30wt％以下で測定できた。
実施例３　抗原抗体反応を利用した大麻成分の測定
１．抗テトラヒドロカンナビノール（THC)ハイブリドーマの製造
（１）　ハイブリドーマの製造
　マウス系統（BALB/ｃ）にBSA結合THC抗原（Genway Biotech社製）をアジュバンドと共に免疫し、血清力価が上昇後脾臓を摘出し、ミエローマ細胞NS-1株（P3.NS-1/1.Ag4.1）とのPEG法（40％）による細胞融合を実施した。さらにHAT培地による選択後、ELISAによる選抜を実施することで（２に詳細を示す）、抗THC抗体(IgG1,kappa)産生ハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマA-04は、2014年11月20日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)　特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depositary)（日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE BP-01970（「識別の表示」は、「A-04」）で国際寄託した。
（２）　ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の検定
　抗ＴＨＣ抗体の反応性を競合ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)により測定した。
(i)　96ウェルELISA用プレートに、THC-BSAの0.10M炭酸緩衝溶液(pH 8.6) (100 ng/mL) を分注(100μL/ウェル)して、室温で一夜放置した。
(ii)　溶液を吸引除去してプレートをPBSで3回洗浄し、2%スキムミルクを含むPBSを分注(300μL/ウェル)して37℃で1時間放置した。
(iii)　溶液を吸引除去してプレートを0.05％(v/v) Tween 20を含むPBSで3回洗浄し、抗原固定化プレートを得た。
(iv)　(iii)のプレートに、テトラヒドロカンナビノール(THC)又はその類似化合物(テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール(CBN))の50％(v/v)エタノール溶液(25μL/ウェル)を分注した後、0.10％ゼラチンを含むPBSで適宜希釈したハイブリドーマA-04の培養上清(100μL/ウェル)を混和し、37℃で1時間インキュベートした。
(v)　溶液を吸引除去してプレートをT-PBSで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(Fc特異的)抗体(1.6μg/100μL/ウェル)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。
(vi)　再びプレートを0.05％(v/v) Tween 20を含むPBSで3回洗浄し、基質溶液｛o-PD (0.04％)及びH2O2[0.06％(v/v)]を含むクエン酸・リン酸緩衝液(pH 5.0)｝(100μL/ウェル) を加えて室温で30分インキュベートした。
(vii)　酵素反応停止液(1.0 M H2SO4) (100μL/ウェル)を加えて混和した後、490 nmの吸光度をマイクロプレートリーダー (Bio-Rad)で測定した。
　結果を図１２に示す。図１２に示すように、得られた抗体は、THCA、THC及びCBNに対して親和性を示した。
２　Fab型抗体を用いた測定
（１）　Fab型抗体
（発現ベクターの構築） 
　１で作製したテトラヒドロカンナビノール（THC）に対する抗体（受託番号NITE BP-01970（「識別の表示」は、「A-04」））の軽鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号５）を含むポリペプチドをコードするDNA配列に、Ｎ末端にProXタグ（９番目のアミノ酸に対応する塩基配列はTTTであり、翻訳されるとMSKQIEVNFSNET；配列番号６）のDNA配列を付与し、さらに、Ｃ末端にリンカー（配列番号７）及びFLAGタグのDNA配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。またTHCに対する抗体の重鎖可変領域（受託番号NITE BP-01970（「識別の表示」は、「A-04」））と抗体重鎖定常領域（CH1；配列番号８）を含むポリペプチドをコードするDNA配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むProXタグ（９番目のアミノ酸に対応する塩基配列はTAGであり、翻訳されるとMSKQIEVNXSNET（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号９）のDNA配列を付与し、さらに、Ｃ末端にリンカー（配列番号７）及びHisタグのDNA配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。これらの構築した発現ベクターは、挿入したVL又はVHのＮ末端にProXタグ（翻訳されるとVHは標識され、VLは非標識）が、Ｃ末端にHisタグ又はFLAGタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
（Fab型抗体の合成）
　反応液（60μL）は、３μLのEnzyme Mix、0.6μLのMethionine、30μLの２×Reaction Mix、20μLのE-coli Lysate、２μLの２種類のplasmid DNA（各200ng）、３μLの蛍光標識アミノアシル－tRNAamber（480pmol）、1.4μLのNuclease Free Waterを加えた。蛍光標識タンパク質を作製するための蛍光標識アミノアシル－tRNA（TAMRA-X-AF-tRNAamber）は、CloverDirect（商標名）tRNA Reagents for Site-Directed Protein Functionalization（プロテイン・エクスプレス社製）を用いた。反応液は、20℃、２時間で静置して反応させタンパク質合成を行なった後、さらに、４℃、16時間の反応により複合化形成を完成させた。反応終了後、反応液0.5μLを用いてSDS-PAGE（15％）を行い、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらに、抗Hisタグ抗体又は抗FLAGタグ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的の蛍光標識抗体可変領域含有ペプチドが合成されていることを確認した。
（蛍光標識Fab型抗体の精製）
　合成した蛍光標識Fab型抗体は、抗FLAG M2アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社製）やHis-Spin Trap Column（GEヘルスケア社製）により精製を行った。上記反応液（60μL）を、抗FLAG M2アフィニティーゲルを入れたカラムへアプライし、室温で15分間インキュベートした後にWash buffer（20mM Phosphate buffer（pH7.4）/0.5M NaCl/0.1％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回洗浄を行った。次に200μLのElute buffer（20mM Phosphate buffer（pH7.4）/0.5M NaCl/100μg FLAG peptide/0.1％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回溶出させた。次に溶出液は、His-Spin Trap Columnへアプライした。室温で15分間インキュベートした後にWash buffer（20mM Phosphate buffer（pH7.4）/0.5M NaCl/60mM imidazole/0.1％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回洗浄を行った。次に200μLのElute buffer（20mM Phosphate buffer（pH7.4）/0.5M NaCl/0.5M imidazole/0.1％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回溶出させた。さらに溶出液は、アミコンウルトラ－0.5遠心式フィルター10kDa（ミリポア社製）を使用し、PBS（+0.05％ Tween20）でバッファー交換、濃縮を行った。精製後のサンプルの濃度は、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて測定した。
　得られた蛍光標識Fab型抗体は以下のものであった。最初のアルファベット４文字表記はそれぞれの略称である。
(v)　HTLTタイプ
　TAMRAで標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとTAMRAで標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドからなる抗体（同色ダブルラベル）
　実施例１に記載の大麻成分抽出方法において、メタノール濃度０wt％の抽出用溶液を用いて大麻成分を抽出し、上記Fab型抗体を用いて大麻成分の測定を行った。測定は、図２に記載の検査用デバイスと図３に記載の蛍光検査器を用いて行った。
　検査用デバイスの第一の容器には抽出液としてアルコール濃度０の希釈バッファー２．４ｍＬを投入した。希釈バッファーとしてはPBS-T溶液（リン酸緩衝生理食塩水＋界面活性剤Tween20　0.05%＋防腐剤　アジ化ナトリウム0.05%）を用いた。その後大麻の葉を乾燥させて細かく砕いたものを秤量冶具にて約３０ｍｇ秤量して第一の容器に投入し、大麻成分を抽出した。
　第二の容器には、上記Ｆａｂ型抗体（10.7nM、75μL）を投入しておき、第一の容器で抽出した大麻成分25μlを第二の容器に混合した。反応は、25℃で行った。
　実験は３回行った。それぞれの実験で行ったサンプルをサンプルＡ、Ｂ及びＣとした。
　蛍光検査器の受光器が受ける蛍光量の指標である電圧値を調べ、蛍光量減少を確認した。サンプルＡ、Ｂ及びＣの電圧値の変化（蛍光量変化）を示す。
(i)　サンプルＡの蛍光量変化
混合直後　　　　　　　　1404.7ｍＶ　
混合40秒後（反応後）　1369.93ｍＶ
(ii)　サンプルＢの蛍光量変化　
混合直後　1360.64ｍＶ
混合20秒後（反応後）　1336.65ｍＶ
(iii)　サンプルＣの蛍光量変化
混合直後　1279.11ｍＶ
混合40秒後（反応後）　1255.94ｍＶ
　上記のように抗原抗体反応の前後で蛍光量が減少した。
　この結果は、抗原濃度と蛍光強度の間には負の相関関係があることを示す。
１０　大麻成分を抽出し抗原抗体反応を行わせる検査用デバイス
１２　第一の容器
１２a　上方開口部
１２b　上端
１４　第二の容器
１４a　第二の容器本体
１４b　係合スリット
１６　計量部材
１８　キャップ部材
２０　第一の容器本体部
２０a　内壁
２０b　外周側壁
２２　計量用側壁
２４　係合部
２４a　係合突起
２６　位置決め用突設部
２８　係止突設部
３０　案内溝
３２　指標部材３４　抗体収容部
３６　スリット開口部
３８　計量部材本体
３８a　下端
４０　液体流通開口部
４４　計量ロッド
４６　上方シール部
４８　下方シール部
５０　計量用溝部
５２　キャップ部材本体
５２a　係止突設部
５２b　下端
５４　上面
５４a　下面
５６　操作部材
６０　試薬セル装着部
６１　開閉蓋
６２　筺体
６３　表示部
６４～６９　操作ボタン
７０　試薬セル
７１　レンズ
７２　光源
７３　励起フィルタ
７４　蛍光フィルタ
７５　ダイクロイックミラー
７６　検出器
７７　電池
７８　演算装置
　本発明により、大麻成分を簡便に短時間で検出できるオンサイトの大麻成分検査方法を提供することができる。　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (21)

  1. 　アルコール濃度が30wt％以下の溶液に、大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分を溶液中へ抽出させることを含む大麻成分の抽出方法。
  2. 　アルコールを含まない溶液を用いる、請求項１に記載の大麻成分の抽出方法。
  3. 　溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、請求項１又は２に記載の大麻成分の抽出方法。
  4. 　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の大麻成分の抽出方法。
  5. 　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の大麻成分の抽出方法。
  6. 　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の大麻成分の抽出方法。
  7. 　大麻成分を検出するために用いる検査用デバイスであって、
    第一の容器と第二の容器とを備え、
    前記第一の容器にはアルコール濃度が30wt％以下の溶液が収容され、
    前記第二の容器には大麻成分に対する抗体が収容され、
    前記第一の容器内に大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分をアルコール濃度30wt％以下の溶液中へ抽出し、
    前記第二の容器内に前記第一の容器内の抽出液を所定量添加することにより第二の容器内で抗原抗体反応を生じさせる、大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  8. 　第二の容器内で生じる抗原抗体反応時のアルコール終濃度が7.5wt％以下である、請求項７記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  9. 　溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、請求項７又は８に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  10. 　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、請求項７～９のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  11. 　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  12. 　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、請求項７～１１のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  13. 　大麻成分に対する抗体が、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が、抗体重鎖可変領域ポリペプチド又は抗体軽鎖可変領域ポリペプチドに標識された状態でクエンチされる蛍光色素により標識され、前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原を介して複合体を形成したときにクエンチが解消されて蛍光強度が増加する抗体である、請求項７～１２のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  14. 大麻成分に対する抗体が、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されており、前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが抗原である大麻成分と結合して複合体を形成したときに、該抗原と抗原結合タンパク質の複合体が前記蛍光色素のクエンチャーとなり、該抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが負の相関関係にあり、該抗原と前記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの複合体が形成したときに前記蛍光色素がより強くクエンチされることにより蛍光強度が減少する抗体である請求項７～１２のいずれか１項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  15. 　大麻成分に対する抗体が、受託番号NITE BP-01970で国際寄託されている、テトラヒドロカンナビノール（THC)又はその誘導体に結合する抗体を産生するハイブリドーマが産生する抗体である、請求項7～１２のいずれか1項に記載の大麻成分を検出するための検査用デバイス。
  16. 　アルコール濃度が30wt％以下の溶液に、大麻であると疑われる対象植物検査片を入れ、当該検査片の成分を前記溶液中へ溶出させ、該抽出液を大麻成分に対する抗体に添加し、抗原抗体反応を生じさせることを含む、大麻成分の検査方法。
  17. 　前記抗原抗体反応時のアルコール終濃度が7.5wt％以下である、請求項１６記載の大麻成分の検査方法。
  18. 　前記溶液が、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-T）、界面活性剤を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は純水の溶液である、請求項１６又は１７に記載の大麻成分の検査方法。
  19. 　アルコールが、メタノール、エタノール及びプロパノールからなる群から選択される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の大麻成分の検査方法。
  20. 　大麻成分が、テトラヒドロカンナビノール（THC)、テトラヒドロカンナビノール酸（THC-A）又はカンナビノール（CBN)である、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の大麻成分の検査方法。
  21. 　対象植物検査片が、葉、茎、根、種及び花弁からなる群から選択されるいずれかの部位を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の大麻成分の検査方法。
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