KR101600497B1 - 곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤드레를 40-90 부피% 에탄올 수용액으로 추출한 후, 메탄올로 결정화시켜 곤드레로부터 플라보노이드를 분리하는 방법에 관한 것으로, 가열을 하지 않고 추출하여 열에 의한 활성성분의 파괴를 줄였으며 간단한 공정으로 높은 수율과 고순도로 플라보노이드 성분을 분리할 수 있다.

Description

곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법{Isolation method of flavonoid from Cirsium setidens}
본 발명은 곤드레로부터 플라보노이드를 분리하는 방법에 관한 것이다.
곤드레는(Cirsium setidens (Dunn) Nakai)는 국화과에 속하는 다년생 초본으로 우리나라에서만 자란다. 뿌리는 곧게 자라며 줄기에서 많은 가지가 나와 사방으로 퍼지고, 잎은 어긋나고 잎 가장자리에는 잔가시들이 나있으며, 잎 끝은 뾰족하나 잎 밑은 다소 넓다. 꽃은 가지 끝에 두상 꽃차례로 무리져 달리는데, 7-10월에 보라색으로 피며 봄철에 어린 순을 캐서 나물로 먹기도 한다.
곤드레는 전국 각지에 분포하는 우리나라 특산물 중 하나로 지혈, 토혈, 비혈 및 고혈압의 치료에 이용되어 왔기 때문에 다양한 생리활성을 짐작케 하나 이에 대한 체계적인 연구는 미미한 실정이다. 일반적으로 곤드레에는 많은 플라보노이드 성분들이 함유되어 있으며, 이 성분들이 생리활성에 많은 영향을 미칠 것으로 알려져 있다. 따라서 곤드레에 함유되어 있는 기능성 물질을 탐색하고, 이 물질의 건강 기능성 및 그 작용기전을 규명하는 연구가 최근 진행되고 있다.
대한민국 등록특허 제0728813호에는 고려엉겅퀴 추출물을 주요활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 고려엉겅퀴를 95 부피%의 에탄올로 추출하고 감압농축 및 동결하여 건조시킨 후, 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 고려엉겅퀴 추출물을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 고려엉겅퀴 추출물이 함유된 화장료는 항산화효과, 콜라겐 합성효과, 피부잔주름 방지효과 등 우수한 항노화효과를 나타낸다. 대한민국 공개특허 제2013-0066813호에서는 엉겅퀴추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 엉겅퀴 추출물을 탈지하고, 95% 주정으로 추출한 후, 여과하고 여과액에 염화칼슘을 첨가하여 침지시킨 후, 상등액을 컬럼에 흡착시켜 75-95%의 주정으로 분리하는 방법이 개시되어 있다. 상기와 같은 방법들은 여러가지 용매를 필요로 하여 복잡하다. 또한, 컬럼을 사용하는 방법은 용매의 사용량이 많아 경제적이지 않다는 단점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 곤드레로부터 플라보노이드를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 1) 곤드레를 건조시킨 후 세절하여 40-90 부피% 에탄올 수용액을 첨가하여 30분 내지 24시간 동안 교반시켜 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 2) 상기 에탄올 추출물을 농축 및 건조하여 곤드레 추출물을 제조하는 단계; 3) 상기 곤드레 추출물을 메탄올에 용해시킨 후, 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하는 단계; 4) 상기 상등액을 결정화시키는 단계; 및 5) 상기 결정화시켜 얻은 결정을 메탄올로 씻어주고 건조하여 플라보노이드 결정을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 1) 단계는 10 내지 40 ℃에서 수행될 수 있으며,
상기 4) 단계는 -40 내지 30 ℃에서 12 내지 96 시간 동안 보관시킴으로써 수행될 수 있으며,
상기 5) 단계는 1-3회 메탄올로 씻어주어 수행될 수 있다.
또한, 상기 5) 단계는 상기 건조시킨 결정을 용기에 넣고 질소가스로 퍼징하는 단계를 더 포함할 수 있으며,
상기 플라보노이드는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112013071173805-pat00001
본 발명에 의하면, 상기 플라보노이드 결정의 수율은 곤드레 추출물 대비 5-15 중량%이며, 건조시킨 곤드레 대비 1-3 중량%일 수 있는데,
상기 플라보노이드의 순도는 85 내지 90%일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 곤드레 추출물을 제공한다.
상기 곤드레 추출물은 플라보노이드를 포함할 수 있는데,
상기 플라보노이드는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 일 수 있다.
본 발명에 따른 곤드레로부터 플라보노이드를 분리하는 방법은 가열을 하지 않고 에탄올 수용액으로 추출하여 열에 의한 활성성분의 파괴를 줄였으며, 메탄올을 이용하여 재결정함으로써 간단한 공정으로 높은 수율과 고순도로 플라보노이드 성분을 분리할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 추출된 곤드레로부터 분리한 플라보노이드의 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 곤드레 조추출물의 HPLC 크로마토그래피이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 곤드레 조추출물중 지표물질의 PDA 스펙트럼 분석이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 곤드레 조추출물의 Preparative HPLC 크로마토그래피이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 Preparative HPLC로 분취한 분획의 HPLC 크로마토그램이다. (A) fraction 1, (B) fraction 2, (C) fraction 3.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 곤드레의 플라보노이드를 HPLC로 분석한 그래프이다.
곤드레에는 많은 플라보노이드 성분들이 함유되어 있으며, 항산화활성 이외에도 항염증, 항암, 항산화, 항당뇨 인지능력 향상 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있다. 이에 본 발명자들은 곤드레 지표물질 및 활성물질인 플라보노이드 성분을 간단한 방법으로 정제하기 위해 예의 노력한 결과, 에탄올 및 메탄올을 이용하여 추출 및 결정화시키는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 1) 곤드레를 건조시킨 후 세절하여 40-90 부피% 에탄올 수용액을 첨가하여 30분 내지 24시간 동안 교반시켜 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 2) 상기 에탄올 추출물을 농축 및 건조하여 곤드레 추출물을 제조하는 단계; 3) 상기 곤드레 추출물을 메탄올에 용해시킨 후, 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하는 단계; 4) 상기 상등액을 결정화시키는 단계; 및 5) 상기 결정화시켜 얻은 결정을 메탄올로 씻어주고 건조하여 플라보노이드 결정을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 1) 단계는 건조 곤드레 1 중량부에 대하여 40-90 부피% 에탄올 수용액 20-60 중량부를 이용하여 추출할 수 있는데,
상기 에탄올의 함량이 상기 범위 미만이면, 에탄올의 함량이 너무 적어 곤드레의 활성성분이 충분히 추출되기 어려우며, 상기 범위를 초과하면, 에탄올의 함량이 너무 많으면 원하지 않은 물질까지 추출될 수 있어 바람직하지 않다. 바람직하게는 에탄올의 함량이 60-70인 것이 불순물의 함량이 적으면서도 높은 수율로 플라보노이드를 추출할 수 있다.
또한, 상기 에탄올 수용액 대신 메탄올, 메탄올 수용액 또는 물을 사용하여 추출하는 경우 추출물의 수율이 좋지 않으며, 상기 추출물을 본 발명에 따라 메탄올로 결정화시켰을 때 결정이 생성되지 않거나, 끈적거리는 시럽을 형성하여 결정을 얻기 어려움으로 바람직하지 않다.
추출 온도는 10 내지 40 ℃에서 추출될 수 있는데, 상기 온도는 실험실의 온도일 수 있으며, 가온 가열을 하지 않은 온도이다.
추출 온도가 상기 범위 미만이면 온도가 너무 낮아 곤드레의 활성성분이 추출되기 어려우며, 추출온도가 상기 범위를 초과하면, 상기 곤드레의 활성성분이 파괴될 수 있으며, 플라보노이드 성분 이외의 물질들이 함께 추출될 수 있어, 이를 정제하기 위한 단계를 더 필요로 하므로, 경제적이지 않아 바람직하지 않다.
상기 추출 시, 곤드레를 건조한 후 세절하지 않고 통으로 사용해도 무방하나 세절하여 사용하는 것이 바람직한데, 곤드레를 세절하면 표면적이 증가되어 추출효율이 증가하므로 바람직하다.
또한, 상기 4) 단계는 -40 내지 30℃에서 12 내지 96시간 동안 보관시킴으로써 수행될 수 있는데, 바람직하게는 -30 내지 20 ℃에서 24 내지 72시간 동안 보관시킬 수 있으며, 좀 더 바람직하게는 -20 내지 10 ℃에서 36 내지 60시간 동안 보관하는 것이 높은 수율을 가지면서도 순도가 높은 결정을 얻을 수 있어 바람직하다.
상기 5) 단계는 결정화시켜 얻은 결정의 표면에 흡착된 불순물을 제거하기 위하여 메탄올로 1-3 회 씻어줄 수 있는데, 상기 메탄올의 온도가 높으면 결정화시킨 플라보노이드가 메탄올에 용해되어 수율이 저하될 수 있으므로 -20 내지 5 ℃의 차가운 메탄올로 씻어주는 것이 바람직하다.
또한, 상기 건조시킨 플라보노이드 결정을 용기에 넣고 감압하여 공기를 제거한 후 질소가스로 퍼징시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 플라스크의 공기를 제거하고, 질소가스로 교체하여 곤드레 플라보노이드를 안정화시키고, 감압하여 잔류하는 용매를 제거할 수 있다.
본 발명에 의하면 상기 플라보노이드 결정의 수율은 곤드레 추출물 대비 5-15 중량%이며, 건조시킨 곤드레 대비 1-3 중량%일 수 있고,
상기 플라보노이드의 순도는 85 내지 90%일 수 있는데,
상기 플라보노이드는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물일 수 있으며, 상기 불순물은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 이성질체일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112013071173805-pat00002
상기 분리방법에 의해 고려엉컹퀴 추출물을 제조할 수 있는데, 상기 곤드레 추출물은 상기 [화학식 1]의 화합물을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
가. 시장에서 구입한 건조 곤드레 500 g과 70 부피% 에탄올 수용액 20 L를 플라스크에 넣고 1 시간 동안 상온에서 교반한 후, 실온에서 4 시간 동안 방치한 후 여과지(Whatman No.1 filter paper, Maidstone, UK)로 여과하였다. 여과시킨 여과액을 농축기를 이용해 물만 남을 때까지 농축한 후, 동결건조하여 에탄올 추출물을 91.3 g을 얻었다. 70 부피% 에탄올 수용액 추출물의 수율은 건조 곤드레 대비 약 18.25 중량%였다.
나. 가 단계에서 동결건조시킨 에탄올 추출물을 메탄올로 녹인 후 원심분리기를 이용하여 원심분리(4,000g X 15분)하여 침전되는 불용성 물질은 제거하고 상등액을 취해서 실온 또는 냉장상태로 3-4일간 보관하였다.
다. 침전 결정이 생기면 0.45 um 여과지를 이용하여 여과한 후, 여과지에 남은 결정을 메탄올로 2회 세척하고 상온에서 건조하였다. 상기 건조물을 용기에 넣고 질소가스로 퍼징하여 최종 결정 5.7g을 얻었으며, 이를 하기 도 1에 나타내었다. 상기 결정의 수율은 에탄올 추출물 대비 6.22 중량%이며, 건조 곤드레 대비 약 1.2 중량%이다.
비교예 1.
실시예 (가)의 방법으로 70 부피% 에탄올 추출물을 제조하였다. 상기 에탄올 추출물을 결정화 용액으로 메탄올 대신 에탄올을 사용한 것을 제외하고는 실시예 (나)의 방법과 동일하게 수행하여 결정화를 시켰으나, 결정이 생성되지 않았다.
비교예 2.
70 부피% 에탄올 대신에 70 부피% 메탄올을 사용한 것을 제외하고는 실시예 (가)의 방법으로 70 부피% 메탄올 추출물을 제조하였다. 실시예 (나)의 방법과 동일하게 수행하여 결정화를 시켰으나, 결정이 생성되지 않았다. 상기 결정이 생성되지 않은 메탄올에 용해시킨 70 부피% 메탄올 추출물을 농축하였다. 상기 농축액을 실리카겔이 충진된 컬럼크로마토그래피에 흡착시킨 후, 클로로포름:메탄올:물=7:3:1 용매를 내려주어 분리하였다. 상기 분획물을 농축, 건조시킨 후, 메탄올로 재결정하여 흰색화합물 3.1 g을 얻었다. 상기 얻어진 화합물은 건조 곤드레 대비 0.62 중량%이다.
비교예 3.
시장에서 구입한 건조 곤드레 500 g을 5 시간 열수 추출하고 냉각시킨 후 여과지로 여과하였다. 상기 열수 추출물을 실시예 (나)의 방법과 동일하게 수행하여 결정화를 시켰으나, 결정이 생성되지 않았다. 상기 결정이 생성되지 않은 메탄올에 용해시킨 열수 추출물을 농축하였다. 상기 농축액을 실리카겔이 충진된 컬럼크로마토그래피에 흡착시킨 후, 클로로포름:메탄올:물=7:3:1 용매를 내려주어 분리하였다. 상기 분획물을 농축, 건조시킨 후, 메탄올로 재결정하여 흰색화합물 0.5 g을 얻었다. 상기 얻어진 화합물은 건조 곤드레 대비 0.10 중량%이다.
비교예 4.
시장에서 구입한 건조 곤드레 500 g을 95 부피% 에탄올 수용액으로 5 시간 환류 추출하고 냉각시킨 후 여과지(Whatman No.1 filter paper, Maidstone, UK)로 여과하였다. 상기 여과액을 감암 농축 및 동결건조하여 95 부피% 에탄올 열수추출물을 제조하였다. 상기 95 부피% 에탄올 열수추출물을 메탄올로 처리하여 결정화시켰으나 결정이 생기지 않았다. 상기 결정이 생성되지 않은 메탄올에 용해시킨 95 부피% 에탄올 열수추출물을 농축하였다. 상기 농축액을 실리카겔이 충진된 컬럼크로마토그래피에 흡착시킨 후, 클로로포름:메탄올:물=7:3:1 용매를 내려주어 분리하였다. 상기 분획물을 농축, 건조시킨 후, 메탄올로 재결정하여 흰색화합물 1.84 g을 얻었다. 상기 얻어진 화합물은 건조 곤드레 대비 0.29 중량%이다.
비교예 5.
시장에서 구입한 건조곤드레 500 g을 고압증기로 가압 탈지하여 수율이 75%가 되도록 하고, 탈지시킨 곤드레를 분쇄하여 95 부피% 에탄올 수용액 2.6 L로 5 시간씩 3회 환류 추출하고 냉각시킨 후 여과지(Whatman No.1 filter paper, Maidstone, UK)로 여과하였다. 상기 여과액에 염화칼슘을 4 g을 넣어 침지시킨 후, 침전물과 상등액으로 분리하고 분리된 상등액을 실리카겔이 충진된 컬럼크로마토그래피에 흡착시킨 후, 75 부피% 에탄올수용액, 85 부피% 에탄올수용액, 95 부피% 에탄올수용액 순으로 순차적으로 내려주며 분리하였다. 상기 분획물을 농축, 건조시켜 최종결정 2.8g을 얻었다. 상기 얻어진 화합물은 건조 곤드레 대비 0.56 중량%이다.
시험예 1. 수득율 분석
상기 실시예 및 비교예 1-3에 따라 제조된 최종 플라보노이드의 수율을 측정하였으며 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
건조곤드레 (g) 500 500 500 500 500 500
결정화성공여부 o x x x x x
추출용매 70%에탄올 70%에탄올 70%메탄올 물 95%에탄올 95%에탄올
가열(환류) x x x o o o
수득량 (g) 5.7 - 3.1 0.5 1.84 2.8
수득율 % 1.2 - 0.62 0.10 0.29 0.56
실시예의 방법에 따라 분리된 플라보노이드의 비교예에 비하여 2-10 배 우수하였다. 상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 에탄올 수용액으로 환류추출한 비교예 4의 경우, 곤드레에 함유된 플라보노이드 이외의 불순물이 함께 추출되는 것으로 확인되었으며, 이로 인하여 메탄올에서 결정이 잘 생성되지 않아 컬럼크로마토그래피로 분리하여야 했다. 또한, 결정화 용액으로 메탄올 대신 에탄올을 사용한 비교예 1의 경우에는 결정이 생성되지 못하고 용액상태로 존재하였다.
한편, 열수추출을 한 비교예 3의 경우는 추출물의 양이 매우 적었으며, 메탄올의 결정화 역시 이루어지지 않았다. 추출용매로 메탄올 수용액을 사용한 실시예 2의 경우에는 메탄올추출물의 양은 다른 비교예에 비하여 많았으나, 불순물이 다량 섞인 것으로 TLC에서 확인되었으며, 메탄올을 이용한 결정화 역시 이루어지지 않았고, 컬럼크로마토그래피를 통해 불순물을 제거한 후에야 메탄올에서 결정이 이루어졌다.
상기와 같은 결과를 통해, 곤드레를 추출하는 온도가 높으면, 불순물의 함량이 높아지고 활성성분의 파괴가 이루어져 결정화 방법을 통해 손쉽게 플라보노이드를 수득할 수 없었으며, 수율이 좋지 못하였다.
시험예 2. 곤드레 조추출물의 분석
시험예 2.1 HPLC 분석 및 PDA 분석
실시예의 샘플을 채취하여 HPLC(Jasco HPLC, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 상기 HPLC는 degasser, AS-2075 Plus autosampler, 그리고 MD-2010 Plus multiwavelength detector로 구성되었다. 분석 컬럼은 SunfireTM C18(4.6×250 mm i.d., 5 μm, Waters)를 사용하였고, 주입량은 10 μL, 유속은 0.5 mL/min, 컬럼온도는 25℃, 자외선 검출기 흡광파장은 332 nm로 설정하여 분석하였다. 이동상으로는 (A) 0.5 부피% phosporic acid와, (B)메탄올을 초음파 세척기로 탈기하여 사용하였고, 기울기 용리조건(gradient system)은 하기 표 2와 같다.

시간		 Composition of mobile phase(%)
0.5(v/v)% phosphoric acid in water methanol
0 75 25
25 45 55
55 45 55
75 0 100
78 0 100
83 75 25
90 75 25
상기 조건으로 실시예 (가)에서 얻은 샘플(곤드레 조추출물)을 분석하였으며, 이를 하기 도 2에 나타내었다.
분석결과에서 알 수 있듯이 곤드레 조추출물의 경우 3개의 주 피크로 구성된 것을 확인할 수 있다. 봉우리 영역을 살펴보았을 때, 44.0분의 봉우리가 17.3% 45.4분의 봉우리가 75.5%, 75.9분의 봉우리가 12%를 나타내어 45.4분의 봉우리가 곤드레 추출물의 지표물질로 추정되었다.
45.4분 봉우리의 흡광스펙트럼을 살펴본 결과 332 nm에서 최대 흡광파장을 나타내는 것을 확인하였으며, 이를 하기 도 3에 나타내었다.
시험예 2.2. Preparative HPLC 분석
Preparative HPLC system을 이용하여 실시예 (가)에서 얻은 샘플(곤드레 조추출물)로부터 곤드레 지표물질을 분리하였다. 곤드레 중 지표물질 분리를 위해 사용된 기기는 Jasco preparative HPLC로 PU-2086 Plus prep. pump, MX-2080-31 solvent mixing module 그리고 UV-975 UV/VIS detector(prep cell 1 mm)로 구성되었다. 분리용 컬럼은 Luna 5 μ C18(10.0×250 mm i.d., 5 μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) semi prep 컬럼을 사용하였고, 주입량은 1 mL, 유속은 1.5 mL/min, 자외선 검출기 흡광파장은 332 nm로 설정하여 분리하였다. 이동상으로는 (A) 0.5 부피% phosporic acid와, (B) methanol을 초음파 세척기로 탈기하여 사용하였고, 기울기 용리조건(gradient system)은 상기 표 2와 같다. 곤드레 추출물을 preparative HPLC에 적용한 결과는 하기 도 4와 같다.
도 4에서 확인할 수 있듯이 머무름 시간 8분경에 unbonding fraction으로 예상되는 피크가 봉우리가 검출되었으며, 15분부터 기준선이 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 머무름 시간 53분과 55분 부근에 주요 봉우리가 검출되는 것을 확인하였으며, 도 4에 표기된 fraction 1-3를 분취하여 HPLC로 분석한 결과는 도 5에 나타내었다. fraction 1-3는 각각 A-C와 대응된다.
시험예 3. 플라보노이드 구조분석( NMR , FAB - MS , GC / MS )
시험예 2.2에 따라 얻어진 fraction 3에 존재하는 최종화합물의 1H NMR, 13C-NMR spectrum 데이터를 검토하고 2D-NMR (HMQC, HMBC, COSY)기법을 이용하여 화합물의 구조를 확인하였고 FAB-MS로 정확한 분자량을 확인하였다. 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, COSY, DEPT는 AVANCE 600 (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Germany) 600 MHz NMR spectrometer를 이용하여 수행하였고, GC/MS는 JMS-700 (JEOL, Tokyo, Japan) 모델을 이용하여 fast atom bombardment (FAB) mode로 측정하였다. 1H 와 13C-NMR spectrum 데이터로 곤드레 지표성분에 대하여 검토하고 2D-NMR (HMQC, HMBC, COSY)로 확인한 결과, pectolinarin의 구조가 도출되었고, 참고문헌의 1H 와 13C-NMR 데이터를 비교하고, 일치함을 확인하여 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물로 확인되었다.
[화학식 1]
Figure 112013071173805-pat00003
1H-NMR (600 ㎒, (CD3)2SO) δ 8.10 (d, J=8.9 ㎐, 2H), 7.23 (d, J=8.9 ㎐, 2H), 7.01 (s, 1H), 5.57 (s, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.19 (d, J=7.2 ㎐, 1H), 4.81 (d, J=3.8 ㎐, 1H), 4.69 (d, J=3.7 ㎐, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.54 (d, J=2.9 ㎐, 1H), 3.94 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.83 (s, 1H), 3.72~3.68 (m, 2H), 3.55~3.52 (m, 2H), 3.49~3.36 (m, 5H), 3.25~3.23 (m, 2H), 1.12 (d, J=6.2 ㎐, 3H)
13C-NMR (150 ㎒, (CD3)2SO) δ 182.43, 164.14, 162.45, 156.60, 152.59, 152.26, 132.70, 128.50, 122.76, 114.82, 105.95, 103.43, 100.44, 100.38, 94.38, 76.49, 75.78, 73.20, 72.05, 70.81, 70.49, 69.54, 68.38, 65.99, 60.40, 55.62, 17.83
MS (FAB) m/z: 623(rel. int., %: 19.9), 622(3.5), 477(4.7), 392(4.8), 391(14.7), 343(4.4), 315(100), 314(23.5), 285(9.4), 201(5.4), 185(39.0), 149(68.6), 93(74.3), 79(69.3), 57(27.3), 41(21.0), 27(8.7)
시험예 4. 화학식 1 화합물의 분석 ( HPLC , GC / MS )
실시예 (다)에 따라 생성된 최종생성물을 HPLC로 분석하였으며, 이를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있듯이 두 개의 깨끗한 봉우리를 확인할 수 있는데, 이중 화학식 1 화합물의 면적이 85.03%였다.
상기 최종생성물을 GC/MS로 분석한 결과 분자량은 623으로(도 7), 곤드레 조추출물을 prep-HPLC로 분리한 GC/MS 결과(도 8)의 메이저 피크와 일치하였다. 또한 14.97%의 면적을 차지한 피크는 화학식 1 화합물의 이성질체로 판단되었다.

Claims (12)

1) 곤드레를 건조시킨 후 세절하여 70 부피% 에탄올 수용액을 첨가하여 1 시간 동안 교반시켜 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
2) 상기 에탄올 추출물을 농축 및 건조하여 곤드레 추출물을 제조하는 단계;
3) 상기 곤드레 추출물을 메탄올에 용해시킨 후, 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하는 단계;
4) 상기 상등액을 결정화시키는 단계; 및
5) 상기 결정화시켜 얻은 결정을 메탄올로 씻어주고 건조하여 플라보노이드 결정을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법에 있어서,
상기 1) 단계는 10 내지 40 ℃에서 수행되며, 상기 건조 곤드레 500g 에 대하여 70 부피% 에탄올 수용액 20L를 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하며,
상기 4) 단계는 -40 내지 30 ℃에서 12 내지 96 시간 동안 보관시킴으로써 수행되며,
상기 5) 단계는 메탄올로 1-3회 씻어주고,
상기 5) 단계는 상기 건조시킨 결정을 용기에 넣고 질소가스로 퍼징하는 단계를 더 포함하며,
상기 플라보노이드는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이며,
상기 플라보노이드 결정의 수율은 곤드레 추출물 대비 5-15 중량%이며, 건조시킨 곤드레 대비 1-3 중량%이며,
상기 플라보노이드의 순도는 85 내지 90%인 것을 특징으로 하는 곤드레로부터 플라보노이드의 분리방법.
[화학식 1]
Figure 112015112676182-pat00004
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