KR101659423B1 - 에피갈로카테킨갈레이트의 고순도 양산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EGCG의 고순도 양산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고순도 EGCG의 양산방법은 크로마토그라피와 재결정법을 병행하는 것을 특징으로 한다.

Description

에피갈로카테킨갈레이트의 고순도 양산 방법{Mass-Production of Highly Pure Epigallocatechin gallate}

본 발명은 녹차잎으로부터 하기의 구조식의 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 고순도로 대량 양산하는 방법에 관한 것이다.

녹차는 국내외에서 널리 사용되고 있는 식품 소재로서, 원료의 주요 공급지로 중국이 잘 알려져 있으며 일본과 미국에서 큰 시장을 형성하고 있다. 최근에는 녹차의 물 또는 주정 추출물이 식품 원료로 사용되고 있다. 뿐만 아니라 차에서 추출한 카테킨은 “차카테킨”으로 식품첨가물로 허용되어 있는데, 이는 폴리페놀 화합물의 일종으로 특유의 쓴맛을 가지고 있으며 flavan-3-ol을 기본구조로 하고 있다.

녹차의 인체에 대한 건강 효능은 세계적으로 주목을 받고 있고, 세계 각국에서 생체 효능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 녹차 카테킨 중 EGCG(Epigallocatechin gallate)는 항산화, 중성지방 상승억제, 중추신경계 활성화 작용, 콜레스테롤 저하, 혈압강하, 심장혈관질환 억제에 이르는 다양한 효과가 임상시험으로 보고되고 있다.

이러한 효과를 가지는 녹차의 대표적인 카테킨 성분은, 주로 EGC(Epigallocatechin), C(Catechin), EC(Epicatechin), EGCG(Epigallocatechin gallate), ECG(Epicatechin gallate)와 이들의 광학이성질체 등이 존재한다. 일반적으로 이 5가지가 차카테킨류로 불리워지는데 이 중 EGCG가 가장 많은 양을 차지하며 생리활성 또한 가장 높은 것으로 알려져 있다.

현재 시중에 나와 있는 녹차 관련 기능성 소재들은 단순한 녹차추출물이거나 카테킨 분획물로서 이들은 모두 epigallocatechin gallate(EGCG) 이외에도 epicatechin (EC), epicatechin gallate (ECG) 및 epigallocatechin (EGC) 등 다양한 차카테킨류와 더불어 다량의 카페인을 함유하고 있다.

따라서 차카테킨 중 가장 우수한 기능성을 보여주는 EGCG 이외의 차카테킨류 및 카페인을 완전 제거한 고순도 EGCG를 효과적으로 생산할 경우 이는 종래의 녹차관련 기능성 소재들과는 달리 고부가가치성 식품 소재로 평가될 수 있으며 기능성식품시장에서 널리 활용되어질 수 있다.

따라서 상기 녹차잎으로부터 추출된 차카테킨으로부터 고순도의 EGCG를 정제하는 기술이 제안되고 있다.

따라서 EGCG를 순수 분리하여 식품 및 의약품, 화장품 소재로 사용하려는 종래의 기술로는 컬럼 크로마토그라피가 이용되었는데 순상 크로마토그라피에서는 MC(메틸렌클로리드)-MeOH 용매계를, 역상 크로마토그라피에서는 물-MeOH 용매계를 통상적으로 사용하여 소규모 분리정제가 가능하겠지만 산업적 수요 증가에 따른 EGCG의 양산 목적으로 활용하기에는 종래의 크로마토그라피 방법은 부적합하였다.

이러한 예로는 EP1077211호에서는 다공성 극성 충진물이 채워진 칼럼 크로마토그래피와 용리액으로서 알코올과 같은 유기용매를 사용하여 EGCG 분리하는 공정에 대해 제시하고 있지만 순도가 90% 내외로서 낮고 또한 컬럼크로마토그래피의 용리액이 이소프로판올을 채택하고 있어서 식품용등에서는 잔존 유기물의 조건을 만족시키기 위하여는 정제공정이 복잡하므로 실재 사용되기는 어렵다.

또한 출원번호 KR2001-0076527호 및 KR 2004-0097357호에서는 컬럼크로마토그래피와 재결정을 하는 방법에 알려져 있지만, 여전히 순도에서 개선하여야 할 점이 있고, 또한 재결정단계에서 결정이 잘 되지 않아 일부의 유기산을 채택하는 등 최종 생성물의 잔존 유기물을 제어하기 위해서는 보다 복잡한 공정이 요구되어 좋지 않다.

따라서 본 발명자들은 종래의 크로마토그래피 방법에 따른 용매의 사용을 감소하고 상업적 규모로 생산할 수 있는 새로운 방법을 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

KR 2001-0076527호 KR 2004-0097357호

본 발명은 녹차 유래 EGCG를 고순도 양산할 목적으로 역상 크로마토그라피와 함께 재결정법과 병행하여, 상기 역상 컬럼 크로마토그래피 전단계에서 카테킨-카페인복합물을 열수에 용해 및 급냉에 의한 석출하는 단계를 더 가짐으로써 보다 순도가 높은 EGCG를 제조할 수 있고 높은 수율로 얻을 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 녹차 추출물로부터 EGCG를 상업적 규모로 고순도의 제품으로 양산하기 위해서,

(A) 녹차잎을 물중탕하여 차카테킨을 추출하는 단계,

(B) 추출물을 농축한 후 유기용제를 이용하여 유기상으로 추출하는 단계,

(C)유기 상을 분리농축한 후 열수에 재용해한 후 열수를 급냉하여 EGCG를 포함하는 카테킨-카페인 복합물을 석출하고 필터링하는 단계,

(D) 상기 카테킨-카페인 복합물을 8 ~ 30중량%의 에탄올수용액을 용리액으로 하여 컬럼분리하는 단계,

(E) 물을 이용하여 재결정화 하는 단계,

를 포함하여 EGCG를 고순도로 또한 높은 수율로 얻을 수 있는 새로운 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 (D)단계 후, 분리액을 농축하여 유기용제, 예를들면 에틸아세테이트와 접촉시켜 유기상으로 농축물을 추출 및 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 본 발명의 또 다른 양태로 포함한다.

본 발명의 상기 제조방법에 따르면 종래의 순도 보다 훨씬 우수한 EGCG를 95%이상, 좋게는 98%이상의 고순도로 분리하여 식품 또는 의약재료로 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 따르면, 재결정시 순수한 물만으로도 재결정이 잘되어 고순도 함량으로 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 상기 종래기술에서 살핀 바와 같이 재결정액으로 소량의 유기산을 사용하지 않고도 높은 고순도의 EGCG를 제조할 수 있다.

따라서 본 발명은 녹차 추출물로부터 고순도 EGCG의 양산 방법과 식품원료 규격에 맞는 기타 유기물의 함량을 최소화하는 분리정제 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명의 각 단계에 대하여 설명한다.

본 발명에 따른 물중탕에 의해 녹차잎으로부터 차카테킨을 추출하는 단계는 제한되지 않지만, 50~90℃에서 추출한다. 추출시간은 제한하지 않지만 충분히 추출할 수 있는 시간이라면 제한하지 않는다. 예를 들면 시간은 10분 내지 24시간 등 다양하게 할 수 있다. 추출 시 물중탕은 1회 또는 복수회로 추출할 수도 있으며, 복수 추출 시 이를 혼합한 후 농축하여 다음 단계로 진행할 수 있다.

농축은 특별히 제한되지 않지만, 물중탕 볼륨의 1~30부피%로 농축할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

다음 본 발명의 (B)단계에 대하여 설명한다. 본 발명에서 수상 추출물로부터 차카테킨을 유기상으로 추출하는 유기용매는 다양하게 채택할 수 있지만, 본 발명에서는 제한하지 않지만 예를 들면 에틸아세테이트가 수율면에서 가장 좋다. 추출시 에틸아세테이트는 물의 0.4 배이상, 좋게는 0.4배 내지 10배의 부피비로서 추출할 수 있지만 이에 한정하는 것은 아니다. 추출한 유기용액은 농축하여 추가 정제단계를 거치게 된다.

다음 본 발명의 (C)단계에 대하여 설명한다. 본 발명의 (C)단계는 유기상을 상분리에 의해 분리한 후, 농축하고, 이를 다시 열수에 용해한 후 열수를 급냉하여 EGCG를 포함하는 카테킨-카페인 복합물을 석출 및 필터링하는 단계로서, 본 발명의 상기 (C)단계를 수행함으로서 더욱 순도가 높은 EGCG를 얻을 수 있는 중간체를 얻을 수 있다. 명확하지는 않지만 이러한 열수 재용해 후 급냉하여 석출함함으로써 불필요한 불순물이 용해도에 의해 제거됨으로서 더욱 우수한 순도를 가지는 중간체를 얻을 수 있어서 좋다.

본 발명의 중간체에서 EGCG의 순도는 80~85%정도로 유지할 수 있는 놀라운 순도를 가지는 중간혼합물을 얻을 수 있었다. 이러한 순도는 HPLC를 통하여 분석할 수 있다.

본 발명에서 상기 열수는 50 내지 100℃ 미만이라면 크게 제한되지 않지만, 좋게는 끓는 열수를 이용하여 용해한 후, 제한되지 않지만 좋게는 20~70℃/분의 속도로 급냉하는 것이 좋다. 급냉 후에는 필요에 의해서 10분 내지 2일 정도의 시간동안 방치하는 것에 의해 침전되어 석출된다. 석출된 혼합물을 분리하면 대부분이 EGCG를 포함하는 카페인등이 주 혼합물로서, 본 발명에서는 이를 카테킨-카페인복합물이라 칭한다.

급냉은 4~30℃, 더욱 좋게는 5~20℃로 급냉하여 유지되도록 냉각하는 것이 좋지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 급냉 또는 급냉후 저온에서 일정기간 유지함으로서 카테킨-카페인복합체가 충분히 석출되며 석출된 상기 복합체를 필터링하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계로 분리한다.

다음 본 발명의 (D) 단계에 대하여 설명한다. 본 발명의 D단계는 상기 카테킨-카페인 복합물을 8~25중량%의 에탄올수용액을 용리액으로 하여 컬럼크로마토그래피 분리하는 단계이다. 상기 용리액의 에탄올의 함량을 조절하는 것은 불필요한 에탄올의 사용을 억제하기 위한 것으로서, 용리액은 좋게는 10%, 15% 및 20%의 에탄올 수용액을 이용하여 분별 분리한 후 이를 합쳐서 물에 의해 재결정하는 것이 좋지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 D단계에서는 특히 EGCG의 순도를 80%이상 85%로 조절함으로써 더욱 순도가 높은 EGCG를 제조할 수 있게 된다. 이는 상기의 농도로 조절하는 경우 순수물에서 재결정이 매우 잘 되기 때문이다.

상기 (D)단계에서 컬럼크로마토그래피에서 컬럼은 비이온성가교스티렌계 고정상을 이용하여 분리하는 것을 특징으로 하는데, 예를 들어 상기 고정상은 상업화된 Dianion HP-20등을 사용하는 것을 예로들 수 있고, 상기 고정상을 채택하는 경우 컬럼에 상기 고정상의 충전부피(L) 대비 시료량(kg) 값이 0.06이하일 경우 매우 우수한 분리능을 나타낸다.

따라서, 본 발명에서는 종래의 유기용매로서 MC (dichloromethane)이나 MeOH (methanol) 용매계를 사용해야 하는 순상 크로마토그라피 정제방법을 채택하지 않고, 물-주정 용매계로 역상 크로마토그라피 방법으로 부분정제 하는 수단을 채택하는 것에 하나의 특징이 될 수 있다.

본 발명은 상기 물-주정 용매계로 역상 크로마토그라피 정제한 후, 이어서 물로 재결정화함으로써 본 발명이 목적으로 하는 95%이상의 고순도의 제품을 얻을 수 있다.

본 발명에서 정제방법은 종래의 순상 크로마토그래피에 의해 채택할 수밖에 없는 과량의 유기용매나 일부의 유기산 성분을 채택하고 있지 않아 유기용매의 과량 소비나 또는 이를 정재하기 위한 환경적 문제 나 또는 제품에 일 부 남아 있을 수 있는 유기용제나 유기산의 잔류량의 걱정을 하지 않아도 되는 좋은 장점을 가진다.

다음 본 발명의 (E)단계에 대하여 설명한다. (E)단계는 물을 이용하여 재결정화 하는 단계이다. 종래기술로 물을 이용한 재결정화하는 경우 일부의 아세트산 등의 유기산을 채택하고 있지만 본 발명에서는 상기 단계를 조합함으로써 유기산을 채택할 필요가 없이 재결정이 잘되어 고순도의 고함량의 EGCG를 분리할 수 있다. 통상 상기 (D)단계에서 재결정은 1번 이상, 좋게는 2번 이상 복수로 함으로서 더욱 고순도의 EGCG를 정제할 수 있다. 본 발명의 물을 이용한 재결정단계에서 얻어지는 EGCG 순도는 95%이상 좋게는 98%이상, 더욱 좋게는 99%이상 고순도로 얻어져서 좋다.

또한 본 발명은 상기 재결정단계전에 컬럼분리액으로부터 얻어진 분리물을 에틸아세테이트로 용매분해한 후 다시 농축하고 이를 열수에 재용해하는 단계를 더 가질 수 있다. 이렇게 함으로써 상기 열수를 급냉하여 재결정함으로써 매우 우수한 순도를 가지는 EGCG를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 추가적으로 더 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 녹차 추출물로부터 고순도 EGCG를 양산하기 위하여

(A) 녹차 분말을 물 혹은 주정(발효에탄올)로 추출, 농축한 후 초산에틸(EA)로 용매분배하는 단계,

(B) EA 층을 분리농축한 후 열수에 재용해한 후 열수를 급냉하여 EGCG를 포함하는 카테킨-카페인 복합물을 석출 및 필터링하는 단계,

(C) 카테킨-카페인 복합물을 비온성 다공성충진제(Diaion HP-20 수지) 컬럼에서 물-주정 용매계로 통과하여 EGCG를 분획, 정제하는 단계,

(D) 마지막으로 EGCG위주 분획물(Crude EGCG)로부터 소량 EC, 카페인, ECG 등의 분순물을 제거하기 재결정화를 반복하여 EGCG를 고순도 분리하는 단계를 가진다.

녹차분말을 추출하고 용매분배한 후 얻은 EA층을 충분히 농축한 다음 80℃ 온수에 녹였다가 4~20℃로 급냉하고 방치하여 두면 gum형 침전물이 가라앉는다. 이는 아마도 카페인이 카테킨류와 복합체(catechins-caffeine complex, CCC)를 형성함으로 해서 침전을 보다 용이하게 하는 듯하다. 상등액은 따라내고 침전물을 바로 컬럼으로 로딩하거나 또는 온수로 다시 녹여 Diaion HP-20수지 컬럼에 로딩(loading)하여준 다음, 5% EtOH(5배수), 15% EtOH(5배수), 20% EtOH(5배수)로 용출하여 씻어준다. 15% EtOH 및 20% EtOH 용출액을 합친 후 EA로 4회 용매분배하여 농축하면 EGCG위주분획물(순도 80~85%)이 얻어진다.

다음 EGCG위주 분획물을 재결정화 하여 순도를 극대화하는 과정이다.

본 발명자들이 주목한 재결정법은 용매에 대한 화학물 상호간의 용해도차를 이용하는 방법이다. EGCG위주 분획물을 가열하여 용해시켰다가 다시 온도를 낮출 때 EGCG는 결정체로 석출되고 타 화학종은 결정화되지 않고 상등액에 남아 있어야 바람직하다.

앞의 역상 크로마토그라피(Diaion HP-20) 정제로 소량 함유되어 있던 EGC 및 C는 충분히 제거된 반면, EC 및 카페인, 그리고 ECG는 감소하긴 했지만 상당량이 여전히 불순물로 남아 있다. 그러나 재결정화 과정을 거치면 EC 및 카페인은 쉽게 제거되며 ECG 역시 반복 재결정화를 통해 만족스러울 정도까지 제거할 수 있다. 재결정을 반복할수록 순도가 증가하면서 상등액의 색이 유색에서 순도가 97%이상에서는 완전히 무색으로 변하게 되는데 이를 보고 고순도에 도달했음을 육안으로 확인할 수 있다.

본 발명은 녹차 유래 EGCG를 95%이상의 고순도 양산할 수 있는 새로운 제조방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 재결정이 더욱 잘되는 카테킨-카페인 복합체를 제공함으로써 물에서 원활한 재결정을 유도할 수 있는 새로운 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 역상 크로마토그라피와 함께 재결정법과 병행하여, 상기 역상 컬럼 크로마토그래피 전단계에서 카테킨-카페인복합물을 열수에 용해 및 급냉에 의한 석출하는 단계를 더 가짐으로써 보다 순도가 높은 EGCG를 제조할 수 있고 높은 수율로 얻을 수 있다.

도 1은 최종 재결정 후 얻어진 EGCG에 대한 역상 HPLC Profile을 나타낸다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 출원인은 두 분리정제 단계, 즉 역상 크로마토그라피에서와 재결정화 과정에서의 정제 효율을 높일 수 있는 방안을 강구하였다.

[실시예]

녹차분말을 70℃의 물에서 6시간 추출하고 부피의 1/3으로 농축한 후 에틸아세테이트와 접촉하여 상분리에 의해 EA층에서 추출물을 회수하였다. HPLC로 확인한 결과 하기와 같은 성분과 함량을 가지는 것을 확인하였다.

상기 에틸아세테이트 상을 농축한 다음 80℃ 온수에 녹였다가 10℃로 급냉하고 3일간 방치하여 두면 gum형 침전물 형태의 카페인이 카테킨류와 복합체(catechins-caffeine complex, CCC)를 형성한 침전물을 수득하였다.

이를 온수로 다시 녹여 Diaion HP-20수지 컬럼에 로딩(loading)한 다음, 5% EtOH(5배수), 15% EtOH(5배수), 25% EtOH(5배수) 및 30%EtOH(5배수)로 용출하였다.

상기 용출액 중에서 15% EtOH 및 20% EtOH 용출액을 합쳐서 EGCG위주 분획물을 얻었으며 이때 HPLC를 이용하여 측정한 EGCG의 순도는 84%였다.

충진제 Diaion HP-20 수지의 최대 capacity 영향 평가

GL컬럼(Ф12x100cm)에 Diaion HP-20 수지를 5L로 전체적으로 채우고 아래와 같이 반복실험을 행하였다. 시료는 카페인복합체침전물(CCC PPT)을 대상으로 하였으며 이동상은 100% H₂O(5L), 5% EtOH(5L), 10% EtOH(5L), 20% EtOH(5L), 25% EtOH(5L)를 순차적으로 사용하였다. 그 결과 각 용리액에 따라 얻어진 분획물의 양과 순도를 비교한 결과 하기 표에서 보듯이 Diaion HP-20 수지 5L 볼륨으로 충진한 경우에 시료 300g이상을 로딩하게 되면 순수 물로 용출했을 경우조차 EGCG가 충진제를 통과하여 빠져나오는 것을 보여준다. 따라서 수지충전부피(L) 대비 시료량(kg) 값이 0.06이하가 되도록 로딩하는 것이 EGCG를 분리하는데 매우 좋은 것임을 알 수 있다.

재결정 시료의 온도의존도 검토

상기 시료무게 300g을 로딩하여 얻은 분획물을 모두 모은 후 이를 에틸아세테이트와 혼합하여 에틸아세테이트 상으로 용매분배한 한 후, 분리하고 농축한 후, 열수를 가하여 용해한 후 급냉 및 냉각 등의 다양한 조건으로 온도를 낮추어 재결정하였다. 냉각온도가 재결정 수율과 순도에 어떤 영향을 주는지를 판단하기 위하여 아래와 같이 반복실험을 행하였다. 재결정 시료(Crude EGCG) 200g을 물 2L에 넣고 80℃로 가열하여 녹인 다음 아래와 같이 조치하였다.

그 결과 냉장고에 저장하는 기간이 길수록 수율이 증가하며, 상온(20℃)보다는 저온(4℃)에 저장할 때 수율이 높아진다. 또한 서서히 냉각시키는 것보다는 급냉(quenching)하였다가 저장할수록 수율이 높아진다. 따라서 저온에서 재결정함으로써 EGCG 순도를 높일 수 있다. 본 발명에 따른 순도는 95%이상의 순도를 가지는 것임을 알 수 있다.

Claims (10)

1. (A) 녹차잎을 물중탕하여 차카테킨을 추출하는 단계;
   (B) 추출물을 농축한 후 유기용제를 이용하여 유기상으로 추출 및 농축 후 50~100℃미만의 열수에 용해한 후 20~70℃/분으로 급냉하여 4~30℃에서 카테킨-카페인 복합물을 석출하는, EGCG를 포함하는 카테킨-카페인 복합물을 석출 및 필터링하는 단계;
   (C) 상기 카테킨-카페인 복합물을 에탄올수용액을 용리액으로 하여 컬럼에 의해 분리하는 단계; 및
   (D) 컬럼 분리된 에탄올수용액을 농축한 후 유기용매상에서 용매분배하고 농축한 후 컬럼용출물을 열수에 용해하고, -10~-30℃로 급냉한 후 2~30℃에 보관하여 재결정화 하는 단계;
   를 포함하여 제조하는 에피갈로카테킨갈레이트의 추출정제방법으로,
   상기 재결정화를 1회 또는 2회 이상 수행함으로써 95%이상의 EGCG 순도를 가지는 에피갈로카테킨갈레이트의 추출정제방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 (C)단계의 에탄올수용액은 8~30중량%의 에탄올 수용액인 에피갈로카테킨갈레이트의 추출정제방법.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서,
   상기 (C)단계에서 컬럼크로마토그래피에서 컬럼은 비이온성가교스티렌계 고정상을 이용하여 분리하는 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨갈레이트의 추출정제방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 고정상이 Dianion HP-20이고, 고정상의 충전부피(L) 대비 시료량(kg) 값이 0.06이하인 것을 특징으로 하는 에피갈로카테킨갈레이트의 추출정제방법.
   
9. 삭제
10. 삭제

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