KR102345875B1

KR102345875B1 - 탈카페인 및 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트의 양산 방법

Info

Publication number: KR102345875B1
Application number: KR1020190113722A
Authority: KR
Inventors: 류건식; 서은혜; 김은정; 전성봉; 윤민지
Original assignee: (주)알앤오식품
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2022-01-03
Also published as: KR20210032224A

Abstract

본 발명은 탈카페인 및 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법에 관한 것으로, (S1) 녹차잎을 물중탕하여 녹차 추출물을 추출하는 단계; (S2) 상기 녹차 추출물을 이온교환수지 컬럼을 통과시켜 탈카페인하는 단계; (S3) 상기 탈카페인된 녹차 추출물을 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 정제하는 단계; 및 (S4) 상기 정제 및 탈카페인된 녹차 추출물을 열수에 용해한 후 급냉하여 결정화하는 단계; 를 포함한다.

Description

탈카페인 및 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트의 양산 방법 {Mass-production method of decaffeined and highly pure epigallocatechin gallate from green tea extract}

본 발명은 녹차잎으로부터 하기 구조식의 에피갈로카테킨 갈레이트 (Epigallocatechin gallate, EGCG)를 탈카페인 상태 및 초고순도로 대량 양산하는 방법에 관한 것이다.

녹차는 최근 건강식품으로 주목을 받고 있는 물질로서 많은 유용한 성분을 포함하고 있으며, 그 중 카테킨 성분은 항산화 효과가 크기 때문에, 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 녹차의 추출물에는 약 3-4% 정도의 카페인이 존재하며 카테킨이라고 알려져 있는 Polyphenol계 성분들이 10-18% 정도 함유되어 있어 카페인과 카테킨은 녹차의 주성분으로 알려져 있다. 상기 카테킨 성분은 Catechin (C), Epicatechin (EC), Epigallocatechin gallate (EGCG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin gallate (ECG) 등으로 구성되어 있으며 이중 EGCG가 전체 카테킨의 절반 이상을 차지하고 있다.

현재 시중에 나와있는 녹차 관련 기능성 소재들은 모두 EGCG 이외도 EC, ECG 및 EGC 등 다양한 카테킨류와 더불어 다량의 카페인을 함유하고 있다. 따라서 카테킨 중 가장 우수한 기능성을 보여주는 EGCG 이외의 카테킨류 및 카페인을 완전 제거한 초고순도의 EGCG를 효과적으로 생산할 경우, 종래의 녹차관련 기능성 소재들과는 달리 고부가가치성 식품소재로 평가될 수 있으며 기능성 식품시장에서 널리 활용될 수 있다.

이에, 상기 녹차잎으로부터 추출된 녹차 추출물로부터 고순도의 EGCG를 분리정제하는 기술들이 제안되고 있다. 현재까지 실험실 수준 또는 시험생산 수준에서는 순도 95% 정도의 EGCG의 생산이 가능하지만, 수백 키로 내지 수톤 스케일의 대량생산 시스템에서는 새로운 문제점들이 발생하게 된다. 구체적으로, EGCG의 대부분이 GCG로 전환되어, GCG의 완전 제거가 어려워 최종제품에 혼입하게 됨으로써 결과적으로 최종제품의 순도를 감소시킨다. 또한, 대량생산 시스템에서는 EGCG와 함께 대량의 카페인이 함께 용출되기에, 제품 중에 혼입된 카페인을 완전히 제거하기 위해서는 분리정제과정을 여러번 반복해야 하는 문제점이 있어 작업시간 장기화 및 고비용 등의 문제도 발생한다.

따라서, 대량생산 시스템에도 적용가능하며, 최종제품 중 GCG 및 카페인의 혼입으로 인한 순도 감소 문제를 완전히 해결하여, 탈카페인 및 초고순도 EGCG의 양산 방법이 필요한 실정이다.

KR 10-0690928 B1 (2007.02.27)

본 발명의 목적은 대량생산 시스템에도 적용가능하며, 최종제품 중 GCG 및 카페인의 혼입으로 인한 순도 감소 문제를 해결하여, 탈카페인 및 초고순도 EGCG의 분리방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 탈카페인 및 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법을 제공하며,

(S1) 녹차잎을 물중탕하여 녹차 추출물을 추출하는 단계;

(S2) 상기 녹차 추출물을 이온교환수지 컬럼을 통과시켜 탈카페인하는 단계;

(S3) 상기 탈카페인된 녹차 추출물을 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 정제하는 단계; 및

(S4) 상기 정제 및 탈카페인된 녹차 추출물을 열수에 용해한 후 급냉하여 결정화하는 단계;

를 포함한다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 (S1) 단계는 30 내지 50℃에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 이온교환수지는 강산성 양이온 교환수지인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 강산성 양이온 교환수지의 캐퍼시티 (용리액 속 고형분 질량/용리액 부피, Capacity)는 250 내지 450 g/L 인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 이온교환수지 컬럼 통과 속도는 0.8 내지 2 L/min인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 (S3) 단계의 크로마토그래피 컬럼은 비이온성 가교스티렌계 고정상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 (S3) 단계는 에탄올수용액을 용리액 (Eluent)으로 하여 분획물을 얻는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 에탄올수용액은 5 내지 30 중량%의 에탄올수용액일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시예에 있어, 상기 (S4) 단계 후, 에피갈로카테킨 갈레이트의 순도는 98% 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 EGCG 분리방법은 최종산물에 카페인 및 GCG가 혼입되어 있지 않아 분리정제 과정을 여러 번 반복해야 하는 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 EGCG 분리방법은 수백 키로 내지 수톤 스케일의 대량생산 시스템에서도 98% 이상의 초고순도 EGCG를 분리할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 명세서에서 기재된 효과 및 그 내재적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급된다.

도 1은 본 발명에 따른 강산성 양이온 교환수지 컬럼 통과 후의 용출액 내의 카페인 함량을 분석한 고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 증류수 및 에탄올수용액을 이용한 단계적 용출과정에서 얻은 각 용출액에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 추출물에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Trilite SCR-B 컬럼 용출액에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미하고, 중량%는 달리 정의되지 않는 한 전체 조성물 중 어느 하나의 성분이 조성물 내에서 차지하는 중량%를 의미한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.

본 명세서의 용어, '포함한다'는 '구비한다', '함유한다', '가진다' 또는 '특징으로 한다' 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.

또한, 본 명세서의 용어, '실질적으로'는 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양 또는 정도로 존재할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 달리 정의하지 않는 한, 용리액 (Eluent)은 컬럼 안으로 들어가는 액체, 용출액 (Eluate)은 컬럼을 빠져나오는 액체, 및 용리 (Elution)는 상기 컬럼을 통해 액체가 통과하는 과정을 의미한다.

본 발명은 (S1) 녹차잎을 물중탕하여 녹차 추출물을 추출하는 단계; (S2) 상기 녹차 추출물을 이온교환수지 컬럼을 통과시켜 탈카페인하는 단계; (S3) 상기 탈카페인된 녹차 추출물을 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 정제하는 단계; 및 (S4) 상기 정제 및 탈카페인된 녹차 추출물을 열수에 용해한 후 급냉하여 결정화하는 단계;를 포함하는 탈카페인 및 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG)의 분리방법을 제공한다.

앞서 서술한 바와 같이, 기존의 EGCG 분리방법은 녹차 추출 과정에서 EGCG의 대부분이 GCG로 변환되는 문제점이 있으며, 유기용매 사용에 따른 잔류용매 문제뿐만 아니라, 분리정제 과정에서 카페인이 완전이 제거되지 않은 문제점이 있어, 실험실 스케일에서는 95% 이상 순도의 EGCG 분리가 가능할 수 있지만, 수백 키로 또는 수톤 스케일에서는 상술한 문제들이 더욱 심각해져 EGCG의 순도를 95% 이하로 현저히 감소시키게 된다. 하지만, 본 발명에 따른 EGCG 분리방법은 상술한 문제점들이 없을 뿐만 아니라, 수백 키로 내지 수톤 스케일에서도 98% 이상의 초고순도 EGCG를 분리할 수 있다.

본 발명은 녹차를 추출 한 후, 이온교환수지 컬럼 및 크로마토그래피 컬럼을 차례로 통과시킴으로써, 기존의 카테킨-카페인 복합물을 우선 석출한 후, 탈카페인 및 정제과정을 통해 EGCG를 분리하는 방법과는 달리, 상기 이온교환수지 컬럼을 통해 녹차 추출물의 탈카페인 과정을 수행한 후, 크로마토그래피 컬럼을 통해 탈카페인된 녹차 추출물의 분리정제 과정을 수행함으로써, 실험실 스케일에서는 물론, 수백 키로 내지 수톤 스케일의 대량생산 시스템에서도 98%이상의 초고순도 EGCG를 분리할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 (S1) 단계는 30 내지 50℃, 좋게는 35 내지 50℃, 더욱 좋게는 40 내지 50℃에서 추출할 수 있다. 추출시간은 녹차 추출물을 충분히 추출할 수 있는 시간이라면 크게 제한하는 것은 아니지만, 구체적으로 10분 내지 24시간 동안 추출할 수 있다. 본 발명은 상기 온도범위에서 녹차 추출물을 추출함으로써, 녹차 추출물 중의 EGCG가 GCG로 변환되는 과정을 막을 수 있어, 녹차가 함유하고 있는 본래의 EGCG를 대부분 확보할 수 있다. 녹차 추출온도가 상기 온도보다 높을 경우, 추출시간은 단축시킬 수 있으나, 온도에 의한 이성질체화에 의해 EGCG의 상당량이 GCG로 변환되는 문제가 발생하여, 최종 생성물 중의 EGCG 함량이 감소되는 반면, GCG의 함량이 증가하게 된다. 상기 (S1) 단계는 1회 또는 복수회로 수행할 수 있으며, 복수회 추출 시, 얻어진 녹차 추출물을 혼합한 후 다음 단계 (S2)로 진행할 수 있다.

상기 (S2) 단계는 (S1) 단계에서 추출된 녹차 추출물을 탈카페인하는 단계로써, 이온교환수지 컬럼을 통과시켜 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 이온교환수지 컬럼은 강산성 양이온 교환수지일 수 있으며, 상기 (S2) 단계를 통해 녹차 추출물 내의 카페인이 상기 강산성 양이온 교환수지에 바인딩되며, 그 외 성분은 용출되는 것을 특징으로 한다. 상기 강산성 양이온 교환수지의 수지 모체, 구조 및 관능기는 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로, 수지 모체로는 스티렌-디비닐벤젠 등의 스티렌계, 아크릴계, 메타크릴계를 들 수 있다. 또한 수지 구조는 겔형 또는 포러스형을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 겔형이란, 팽윤에 의해 생기는 세공인 마이크로포어만을 갖는 것을 지칭하며, 포러스형은 마이크로포어 이외에, 건조 상태에서도 소멸하지 않는 물리적 세공인 마크로포어를 갖는 것을 지칭한다. 또한 상기 강산성 양이온 교환 수지의 관능기로는 술폰산기를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 강산성 양이온 교환 수지의 구체 예로는, Trilite SCR-B, SCR04, SCR10, SCR12, CMP08, CMP16, CMP18 CMP20, CMP28 (삼양사 제조), 다이아 이온 SK1B, SK1BH, SK102, SK116, PK208, PK212 (미츠비시화학사 제조) 및 앰버라이트 200CT, IR118, IR120B, IR124 (다우·케미컬사 제조) 등을 들 수 있다.

상기 강산성 양이온 교환수지의 캐퍼시티는 250 내지 450 g/L, 좋게는 300 내지 400 g/L, 더욱 좋게는 350 내지 400 g/L일 수 있다. 여기서 캐퍼시티는 용리액 속 고형분의 질량과 용리액의 부피 비를 지칭한다. 또한 상기 용리액은 상기 (S1) 단계에서 추출한 녹차 추출물을 지칭하며, 고형분은 상기 녹차 추출물에 포함된 고형분을 지칭한다. 상기 범위에서 상기 양이온 교환수지가 과부하되는 문제점을 막을 수 있으면서도, 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 양이온 교환수지 로딩 후 얻은 첫번째 용출액 내에서도 카페인이 전혀 검출되지 않아, 탈카페인 과정을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다.

상기 (S2) 단계에서 상기 이온교환수지 컬럼 통과 속도는 0.8 내지 2 L/min, 좋게는 1.2 내지 2 L/min, 더욱 좋게는 1.4 내지 1.8 L/min일 수 있다. 상기 범위에서 이온교환수지 컬럼이 우수한 분리능을 나타냄으로써, 총 용출시간을 단축시키면서도, 녹차 추출물 속의 카페인을 효율적으로 제거할 수 있다. 상기 (S2) 단계에서 탈카페인 과정을 수행한 후, 세척액을 이용하여 상기 이온교환수지 컬럼에 잔류한 EGCG를 용출할 수 있다. 구체적으로, 상기 세척액은 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 이온교환수지 용량 대비 1.5 내지 4배, 좋게는 2 내지 3배에 해당하는 양의 세척액을 사용하여 상기 이온교환수지 컬럼을 세척함으로써, 녹차 추출물 속의 EGCG의 손실을 최대한 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 (S2) 단계에서 얻은 용출액 및 상술한 세척액을 모두 혼합한 탈카페인 녹차 추출물을 다음 단계인 (S3) 단계의 크로마토그래피 컬럼을 통과시킬 수 있다. 상기 이온교환수지 컬럼은 1 내지 5%, 좋게는 2 내지 4%의 염산용액을 이용하여 세척한 후, 상기 이온교환수지 부피 대비 4배의 증류수를 흘러줌으로써 충분히 세척한 후, 다시 재사용이 가능하다.

상기 (S3) 단계는 상기 탈카페인된 녹차 추출물을 분리정제하는 단계로써, 상기 크로마토그래피 컬럼은 비이온성 가교스티렌계 고정상을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 상기 고정상은 상업화된 Diaion HP-20을 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피 컬럼은 상기 고정상의 충전부피 대비 시료량의 값이 0.06이하, 좋게는 0.01 내지 0.05일 경우, 우수한 분리정제능을 나타낸다.

또한, 상기 (S3) 단계는 에탄올수용액을 용리액으로 하여 분획물을 얻을 수 있으며, 구체적으로, 상기 에탄올수용액은 5 내지 30 중량%, 좋게는 10 내지 30 중량%의 에탄올수용액일 수 있으며, 스텝바이스텝 (Step by step) 방식으로 용리할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 스텝바이스텝 방식은 상기 (S2) 단계에서 얻은 탈카페인 녹차 추출물을 크로마토그래피 컬럼에 로딩한 다음, 10 중량% 에탄올수용액, 20 중량% 에탄올수용액, 25 중량% 에탄올수용액 및 30 중량% 에탄올수용액을 각각 단계적으로 용출하여 세척하는 것일 수 있다. 상기 용출액 중, 20 중량% 에탄올수용액 용출액을 확보한 후, 다음 단계인 (S4) 단계를 수행할 수 있다. 상기 20 중량% 에탄올 수용액 용출액은 여러 번 나누어서 얻어진 용출액을 혼합한 용출액일 수 있다.

상기 (S3) 단계에서 얻어진 20 중량% 에탄올 수용액 용출액은 (S4) 단계에서 결정화 과정을 거치게 된다. 상기 용출액은 탈카페인 및 분리 정제된 녹차 추출물이며, 상기 결정화 과정을 통해, 용출과정에서 혼입된 성분들을 제거할 수 있을 뿐만 아니라, EGCG의 순도를 더욱 높일 수 있다. 특히, 상기 결정화 단계 전에 상기 (S2) 및 (S3) 단계로 인해, 결정화 과정에서 산화 등으로 인한 갈변현상을 막을 수 있다. 기존의 최종산물인 EGCG는 상기 갈변과정에 의해 색소가 존재하여 옅은 분홍색을 띄게 되지만, 상기 (S2) 및 (S3) 단계에 따른 탈카페인 및 분리정제 과정 후 결정화 단계를 수행함에 따라 색소가 포함되지 않는 순수한 백색 EGCG 분말을 얻을 수 있다.

구체적으로, 상기 결정화 과정은 용매에 대한 화합물의 용해도 차이에 의한 것으로, 상기 (S3) 단계에서 얻은 정제 및 탈카페인된 녹차 추출물을 열수에 용해한 뒤 급냉하여 결정화할 수 있다. 상기 열수는 50 내지 100℃, 좋게는 60 내지 100℃, 좋게는 70 내지 90℃일 수 있으며, 상기 급냉 온도는 -30 내지 -10℃, 좋게는 -25 내지 -15℃일 수 있다. 상기 급냉 과정 후, 상온에서 녹인 다음 3일 이상, 좋게는 5일 내지 10일 동안 냉장보관 (4℃)하는 단계를 더 수행할 수 있다.

상기 (S4) 단계 수행 후, 순도 98% 이상, 좋게는 98.5% 이상의 초고순도 EGCG를 추출할 수 있을 뿐만 아니라, 얻어진 EGCG는 갈변과정 없이 백색을 나타낼 수 있다. 특히, 실험실 수준을 벗어나, 수백 키로 내지 수톤 스케일의 대량생산 과정에서도 상술한 바와 같이, 초고순도의 EGCG을 얻을 수 있으며, 카페인 또한 완전히 제거할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

개방형 추출조에서 녹차잎 100 ㎏에 증류수 1500 L를 가한 후, 45℃에서 6시간씩 2회 반복하여 추출하여 합친 후, 이중 반은 미리 H⁺ form으로 치환시켜둔 Trilite SCR-B 컬럼 (160 L, Φ 60 x 60 cm)에 1.6 L/min로 로딩하였다. 다음, 상기 컬럼을 증류수 400 L로 세척하였으며 상기 얻어진 용출액 및 세척액을 혼합한 후, 즉시로 Diaion HP-20 컬럼 (160 L, Φ 60 x 60 cm)에 서서히 주입하여 흡착시켰다. 다음, 상기 Diaion HP-20 컬럼을 증류수 400 L로 세척한 후, 각각 10 중량% 에탄올 수용액, 15 중량% 에탄올수용액, 20 중량% 에탄올수용액 및 25 중량% 에탄올수용액을 400 L씩 단계적으로 용출시켰으며, 이 중 20 중량% 에탄올수용액의 용출액을 확보하였다. 이후 나머지 추출물도 동일한 방법으로 로딩, 정제 및 용출하여 얻은 20 중량% 에탄올수용액 용출액을 모두 합쳐서 EGCG 분획물을 얻었다.

다음, 상기 EGCG 분획물을 농축한 후, 80℃ 열수 50 L에 용해한 다음, -20℃로 급냉하여 결정화 하였으며, 상기 열수용해 및 급냉에 따른 결정화 과정을 두번 반복한 후, 여과 및 건조하여 최종적으로 순도 99%의 흰색 EGCG 분말 5.2 ㎏를 얻었다.

상기 에탄올수용액을 이용한 단계적 용출과정에서 얻은 각 용출액에 대해 HPLC 분석을 진행하였으며, 구체적으로 Kromasil 100-5-C18 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛) (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였고, 그 분석 결과를 도 2에 도시하였다.

구체적으로, 도 2 (a)는 증류수로 세척한 후 얻은 세척액에 대한 분획물 분석 결과이며, 도 2 (b)는 10 중량% 에탄올수용액, 도 2 (c)는 15 중량% 에탄올수용액, 도 2 (d)는 20 중량% 에탄올수용액 및 도 2 (e)는 25 중량% 에탄올수용액 용출액에 대한 분획물 분석결과를 나타낸 도면이다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 20 중량% 에탄올수용액 용출액에서 EGCG가 검출되었으며, 세척액, 10 중량% 에탄올수용액, 15 중량% 에탄올수용액 및 25 중량% 에탄올수용액 용출액에서는 각각 Gallic acid, EGC, EC 및 ECG가 주로 검출되었다. 따라서, 본 발명에 따른 실시예에서는 20 중량% 에탄올수용액 용출액을 확보하여 최종 EGCG 분획물을 추출하였다.

상기 실시예 1에서 추출온도를 45℃ 대신 50℃로 수행한 것을 제외하고는 동일하게 실시하였으며, 최종적으로 순도 98.5%의 흰색 EGCG 분말 4.8 ㎏를 얻었다.

상기 실시예 1에서 추출온도를 45℃ 대신 80℃로 수행한 것을 제외하고는 동일하게 실시하였으며, 최종적으로 순도 98%의 흰색 EGCG 분말 5.6 ㎏를 얻었다.

상기 실시예 1에서 Trilite SCR-B 컬럼 로딩속도를 1.6 L/min 대신 2 L/min로 수행한 것을 제외하고는 동일하게 실시하였으며, 최종적으로 순도 98.2%의 흰색 EGCG 분말 4.9 ㎏를 얻었다.

(비교예 1)

개방형 추출조에서 녹차잎 100 ㎏에 증류수 1500 L를 가한 후 60 ℃에서 6 시간씩 2회 반복하여 추출하여 합친 후, 여과지로 여과 후 얻은 여액을 같은 량의 ethylacetate (EA)로 추출하고 EA층을 농축하였다. 농축된 EA층을 증류수 50 L에 현탁시킨 후 Diaion HP-20 컬럼 (160 L, Φ 60 x 60 cm)에 서서히 주입하여 흡착시켰다. 이후 Diaion HP-20 컬럼을 400 L의 증류수로 수회 세척한 후 10% 중량% 에탄올수용액, 20% 중량% 에탄올수용액, 30 중량% 에탄올수용액을 각각 400 L씩 단계적으로 용출시켰으며 이 중 20 중량% 에탄올수용액 용출액을 취하여 주정이 제거될 때까지 농축하고 농축액은 같은 방법으로 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 한 번 더 반복하고 잔류 에탄올이 제거될 때까지 농축하여 생성된 농축물을 물로 희석한 후 재결정을 반복하여 최종적으로 순도 93%의 EGCG 분말 4.6 ㎏을 얻었다.

실험예 1: 녹차 추출물의 HPLC 분석

상기 실시예 1 내지 3에 따른 녹차 추출물에 대해 HPLC 분석을 진행하였으며, 그 분석 결과를 도 3에 도시하였다.

구체적으로 도 3 (a)는 녹차 추출물에 포함되는 각 카테킨 표준물질의 HPLC 프로파일로써, 1은 에피갈로카테킨 갈레이트 (Epigallocatechin, EGC), 2는 카페인, 3은 에피카테킨 (Epicatechin, EC), 4는 에피갈로카테킨 갈레이트 (Epigallocatechin gallate, EGCG), 5는 갈로카테킨 갈레이트 (Gallocatechin gallate, GCG) 및 6은 에피카테킨 갈레이트 (Epicatechin gallate, ECG)에 대한 피크를 나타낸다.

도 3 (b)는 실시예 1에 따른 녹차 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 도면이며, 도 3 (c)는 실시예 2, 도 3 (d)는 실시예 3에 따른 녹차 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 도면이다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 추출온도가 45℃일 때, 5번 피크, 즉 GCG가 전혀 검출되지 않았으며, 추출온도가 50℃ 및 80℃로 증가하면서 GCG가 조금씩 검출된 것을 알 수 있다. 즉, 추출온도 50℃이하에서 EGCG → GCG로의 변환과정을 억제할 수 있는 것을 알 수 있다.

실험예 2: Trilite SCR-B 컬럼 로딩속도에 따른 HPLC 분석

상기 실시예 1 및 4에 따른 Trilite SCR-B 컬럼 용출액에 대해 HPLC 분석을 진행하였으며, 구체적으로, 각 용출액에 포함된 카페인의 함량을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 도시하였다.

구체적으로, 앞서 설명한 바와 같이, 2번 피크는 카페인에 대한 피크를 나타낸다. 도 4 (a)는 실시예 1에 따른 Trilite SCR-B 컬럼 용출액에 포함된 카페인 함량을 나타낸 결과이며, 도 4 (b)는 실시예 4에 따른 Trilite SCR-B 컬럼 용출액에 포함된 카페인 함량을 나타낸 결과이다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 로딩속도가 1.6 L/min일 때, 상기 용출액 내에서 카페인이 전혀 검출되지 않았으며, 로딩속도가 2 L/min으로 증가하면서 카페인이 소량 검출된 것을 알 수 있다. 즉 Trilite SCR-B 컬럼의 로딩속도가 2 L/min 이하 일 때, 탈카페인 효율이 더욱 우수한 것을 알 수 있다.

Claims

(S1) 녹차잎을 물중탕하여 녹차 추출물을 추출하는 단계;
(S2) 상기 녹차 추출물을 이온교환수지 컬럼을 통과시켜 탈카페인하는 단계;
(S3) 상기 탈카페인된 녹차 추출물을 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 정제하는 단계; 및
(S4) 상기 정제 및 탈카페인된 녹차 추출물을 열수에 용해한 후 급냉하여 결정화하는 단계;를 포함하며,
상기 (S2) 단계는 상기 탈카페인 후, 상기 이온교환수지 용량 (L) 대비 1.5 내지 4배 부피의 세척액을 이용하여 상기 이온교환수지 컬럼을 세척하는 단계를 더 포함하고,
상기 (S3) 단계의 탈카페인된 녹차 추출물은 상기 이온교환수지 컬럼을 세척한 세척액을 더 포함하며,
상기 이온교환수지는, 캐퍼시티 (용리액 속 고형분 질량/용리액 부피, Capacity) 250 내지 450 g/L를 갖는 강산성 양이온 교환수지이며,
상기 (S2) 단계에서 이온교환수지 컬럼 통과 속도는 0.8 내지 2 L/min인 탈카페인 및 98% 이상의 초고순도 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법.
제1항에 있어서,
상기 (S1) 단계는 30 내지 50℃에서 수행되는 것인 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법.
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제1항에 있어서,
상기 (S3) 단계의 크로마토그래피 컬럼은 비이온성 가교스티렌계 고정상을 포함하는 것인 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법.
제1항에 있어서,
상기 (S3) 단계는 에탄올수용액을 용리액 (Eluent)으로 하여 분획물을 얻는 것인 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법.
제7항에 있어서,
상기 에탄올수용액은 5 내지 30 중량%의 에탄올수용액인 에피갈로카테킨 갈레이트의 분리방법.
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