KR101584384B1

KR101584384B1 - 종양 형성의 치료에서 히알루론산에 결합된 항종양 약물을 포함하는 신규한 제약학적 조제물의 치료적 용도

Info

Publication number: KR101584384B1
Application number: KR1020107024351A
Authority: KR
Inventors: 모니카 캄피시; 데이비드 레니에르; 파스쿠알레 피에리마르치; 아날루시아 사라피노
Original assignee: 피디아 파마슈티치 에스.피.에이.
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2016-01-12
Also published as: RU2581972C2; KR20100134710A; CA2722376A1; BRPI0910570A2; US20110189265A1; JP2011518217A; CN102014966B; EP2279006A1; CA2722376C; EP2279006B1; ES2525066T3; JP5572152B2; WO2009130564A1; CN102014966A; RU2010143715A; US9789200B2

Abstract

본 발명에서는 히알루론산(HA) 및 원발성 종양과 전이를 치료하기 위한 화학치료 산물(이후, 상표명 ONCOFID?), 특히 이리노테칸, 독소루비신, 파클리탁셀, 시스-플라티늄과 5-플루오르우라실(5-FU) 사이에 접합(conjugation)에 의해 수득되는 분화 작용제로서 생물접합체의 종양학 분야에서 신규한 용도를 기술한다. 특히, 이러한 생물학적 행태는 물에서 가용성인 ONCOFID? 유도체의 제약학적 조제물의 작용 기전(action mechanism), 효능(efficacy)과 내약성(tolerability)의 관점에서 기술된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 종양 세포의 변형되지 않은 표현형으로의 분화 촉진에서, 기준 약물 이리노테칸(또는 CPT11, 이의 활성 형태는 SN38로 의해 대표된다) 및 독소루비신과 비교하여, ONCOFID-S(HA-SN38 접합체)와 ONCOFID-D(HA-독소루비신 접합체)에 기초된 조성물에 의해 증명되는 놀라운 생물학적, 그리고 약리학적 효과에 관계한다.

Description

종양 형성의 치료에서 히알루론산에 결합된 항종양 약물을 포함하는 신규한 제약학적 조제물의 치료적 용도{THERAPEUTIC USE OF NEW PHARMACEUTICAL PREPARATIONS CONTAINING ANTITUMORAL DRUGS BOUND TO HYALURONIC ACID IN THE TREATMENT OF NEOPLASIAS}

본 발명의 목적

본 발명에서는 히알루론산(HA) 및 원발성 종양과 전이를 치료하기 위한 화학치료 산물(이후, 상표명 ONCOFID®), 특히 이리노테칸, 독소루비신, 파클리탁셀, 시스-플라티늄과 5-플루오르우라실(5-FU) 사이에 접합(conjugation)에 의해 수득되는 분화 작용제(differentiating agent)로서 생물접합체의 종양학 분야에서 신규한 용도를 기술한다. 특히, 이러한 생물학적 행태(biological behavior)는 물에서 가용성인 ONCOFID® 유도체의 제약학적 조제물의 작용 기전(action mechanism), 효능(efficacy)과 내약성(tolerability)의 관점에서 기술된다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 종양 세포의 변형되지 않은 표현형으로의 분화 촉진에서, 기준 약물 이리노테칸(또는 CPT11, 이의 활성 형태는 SN38로 의해 대표된다) 및 독소루비신과 비교하여, ONCOFID-S(HA-SN38 접합체)와 ONCOFID-D(HA-독소루비신 접합체)에 기초된 조성물에 의해 증명되는 놀라운 생물학적, 그리고 약리학적 효과에 관계한다.

본 발명의 배경기술

최근에, 종양과 이의 전이의 시작, 발달, 분산과 이식을 결정하는 중요한 과정에 관한 진전된 지식은 연구자들에게 신규한 항종양 약물로서 신규한 화학 분자를 연구하고, 합성하고 및/또는 시험하는 가능성을 제공했을 뿐만 아니라 항신생 약물의 독성에 연관된 문제를 극복할 수 있는 신규한 치료 요법의 연구와 완성을 용이하게 하였다. 실제로, 항종양 활성을 갖는 다수의 약물은 일반적으로, 아래와 같은 일련의 부정적인 특성을 갖는다:

- 물에서 낮은 용해도(solubility); 많은 분자들이 투여하기 어려운 소수성 물질이다,

- 종양 세포에 대한 낮은 선택성(selectivity); 결과적으로, 비-암성(non-carcinogenic) 세포에 대한 독성,

- 전신 수준에서 바람직하지 않은 다양한 효과,

- 낮은 혈장 반감기(plasmatic half-life); 결과적으로, 반복된 투여가 요구됨,

- 종양에서 화학치료적 처리에 대한 내성의 유도.

종양 치료에서 더욱 효과적인 신규한 활성 성분에 대한 탐색 이외에, 과학계에서는 대등하게, 세균발육억제(antiblastic) 활성이 이미 알려져 있는 최적 분자를 탐구하고, 이들의 성능을 향상시키고, 앞서 기술된 바와 같은 부정적인 특성을 감소시키기 위하여 노력하고 있다.

항종양 약물의 내적 독성을 감소시키는데 가장 폭넓게 이용되는 전략 중의 하나는 활성 성분을 종양 세포로 직접적으로, 그리고 선택적으로 안내하는 가능성과 연관된다.

유망한 접근법은 활성 표적화(active targeting)가 제공된 기(group)들에 항종양 약물의 화학적 접합에 의해 제공되고, 이들 기는 신생물 세포의 수용 부위(receptorial site)와 특이적으로 상호작용함으로써, 종양 조직 내에서 상기 약물의 높은 선택성을 담보한다. 다른 접근법은 거대분자(즉, 중합체)와의 결합으로 대표되고, 이들 분자는 높은 분자량을 공여함으로써, EPR(Enhanced Retention and Permeation) 효과에 기인한 종양 형성(neoplasia)에서 활성 성분의 더욱 높은 축적, 다시 말하면, 림프계에 의해 부적절하게 방출된 종양을 공급하는 혈관의 창문 상피(fenestrated epithelium)를 통한 통과와 연관된 축적(수동 표적화(passive targeting))을 가능하게 한다.

수년간, 종양학 분야에 이용되는 다수의 항종양 약물은 활성 성분의 방출로 이어지는 자발적 가수분해 과정 및/또는 효소 분해로 인하여 생체내에서만 활성을 나타내고, 그 결과로서 치료 효능(therapeutic efficacy)이 증가하는 프로드러그(prodrug), 치료 불활성 유도체를 수득하기 위하여 화학적으로 변형되었다.

순환계(circulatory system)에서 화학치료 약물의 용해도는 이들의 약리학적 효과에 필수적인 조건을 대표한다. 실제로, 다양한 유형의 종양에서 강한 활성을 나타내는 것으로 증명된 일부 약물, 예를 들면, 캄포테신, 파클리탁셀, 그리고 빈카(Vinca)로부터 유래하는 알칼로이드는 높은 불용성(insolubility)으로 인하여, 정맥내(그리고, 호르몬과 항-호르몬의 경우에, 근육내) 투여가 어렵고, 이는 그들의 임상적 적용을 제한할 수 있다.

이들 이유로, 신규한 화학치료 약물이 합성되었는데, 이들은 고전적 약물 및 활성 성분에 중요한 물리-화학적 특성(가령, 높은 용해도)을 공여할 뿐만 아니라 활성 성분에 활성 및/또는 수동 표적화를 제공하여 이의 효능을 증가시킬 수 있는 소위 "치료 중합체(therapeutic polymer)" 사이에 화학적(직접적인, 또는 스페이서를 통해 간접적인) 결합에 의해 산출된다. 이들 치료 중합체는 실제로, 상기 약물에 대한 담체(carrier)로서 기능하거나, 또는 이들은 본질적인 생물 활성을 발휘할 수 있다.

이들 중합체 중에서, 히알루론산(HA)의 이용이 극히 유망한 것으로 증명되었는데, 히알루론산은 우호적인 특성으로 인하여, 항-신생물제의 투여를 위한 담체로서 적합하다.

HA 및 ONCOFID®의 상표명으로 확인되고 당분야에 공지된 항종양 약물(WO2004/035629와 WO2007/014784)의 신규한 생물접합체는 아래의 특성을 갖는다:

- 상기 약물의 내재된 독성에 관련된 문제점을 극복; 상기 생물접합체는 다수의 종양 표현형이 그들의 표면에서 HA에 특이적인 수용체 CD-44를 과다-발현하기 때문에, 종양 세포로 직접적으로 안내됨,

- 용해도 증가; HA와 같은 강한 친수성 분자에 지용성 약물의 결합은 순환계에서 약물 자체의 용해도를 현저하게 증가시키는 것으로 증명됨,

- 고전적인 항종양 약물에 의해 유도된 내성 문제점을 극복,

- 새로운 물리-화학적 특성(가령, 약물 안정성(stability)의 증가, 그 결과로서 종양 부위 내에서 약물 성능의 증가).

SN-38은 캄포테신의 약리학적 유도체인 이리노테칸의 활성 대사산물인데, 이의 이용은 다양한 유형의 종양, 예를 들면, 흑색종, 유방 암, 난소 종양, 위, 폐, 뇌, 체장 종양 및 결장-직장 암의 치료에 관계한다. 상기 약물은 높은 항종양 활성을 갖지만 물에 용해되지 않기 때문에 그대로 투여될 수 없고, 이런 이유로, HA와 화학적으로 접합되었다.

결장-직장 종양은 가장 공격적인 형태의 종양 중의 하나이고, 서구 국가에서 종양 형성에 의한 가장 빈번한 사망 원인 중의 하나이다.

결장-직장 내에서 암의 형성은 상기 장기 내에 정렬하는 점막 세포의 통제되지 않은 증식에 기인하고, 역학 연구에서 아래와 같은 가능한 위험 인자(risk factor)가 확인되긴 했지만, 이의 병인(etiology)은 여전히 불분명하다:

- 식습관(food habit)

- 유전 인자(genetic factor)

- 신생물 폴립(neoplastic polyp)

- 장내 염증 질환.

결장-직장의 암종(carcinoma)과 선종(adenoma)의 전조성 생물학적 인자 중의 하나는 APC(선종성 결장 폴립증, Adenomatous Polyposis Coli) 유전자인 것으로 알려져 있다. 가족성 결장 폴립증(familial colic polyposis)의 원인이 되는, 상기 유전자의 체세포 돌연변이(somatic mutation)는 결장의 선종과 암종의 자연사(natural history)에서 첫 번째 현상이다.

정상적인 조건(종양 형성의 부재)하에, APC 유전자는 5번 염색체 상에 위치하고, 종양의 전이화(metastatization) 이외에 세포 주기(cell cycle)의 아폽토시스(apoptosis), 세포내 상호작용(inter-cellular interaction)과 유착(adhesion), 이동(migration) 과정의 조절에서 핵심적인 역할을 수행하는 세포기질(cytoplasmatic) 단백질(APC 단백질)을 인코딩한다. APC 단백질의 가장 널리 알려진 기능은 세포질 내에, 그 결과로서 핵 내에 존재하는 유리(free) β-카테닌의 양의 조절을 위한 GSK-3β 단백질(glycogen-synthetase kinase 3β 단백질)과의 결합이다: 이들 단백질은 실제로, 세포기질 수준에서 유리 β-카테닌을 인산화시킴으로써 이의 분해를 촉진한다. β-카테닌은 세포 유착(cellular adhesion) 과정에 관여하는 막 단백질, E-카드헤린(cadherin)의 세포기질 도메인에 자체적으로 결합할 수 있는 단백질이다. E-카드헤린-β-카테닌 세포내 복합체의 파괴(비-종양 세포의 신생물 세포로의 전환과 연관된 현상)는 세포간 유착 능력의 상실을 유발하고, 그 결과로서 전이의 형상을 조장한다. 양쪽 첫 번째 단계에서, 그리고 상이한 종양 형성, 예를 들면, 유방 종양, 피부 종양(특히, 흑색종), 골 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 두경부 종양, 림프계 종양, 폐 암, 그리고 중피, 식도, 위, 결장, 결장-직장, 췌장, 간, 신장, 요관과 방광, 전립선, 자궁내막과 난소(모든 다른 복부 장기 포함) 암의 진행에서 이러한 과정이 어떻게 발생하는 지를 지시하는 많은 과학적 증거가 존재한다. 이러한 주장의 증거로서, 종양 세포주에서 E-카드헤린의 정상적인 합성/압력의 회복을 위하여 수행된 실험은 악성 종양 형태의 변형되지 않은 표현형, 다시 말하면 비-신생물로의 복귀를 증명하였다 (Birchmeier W. et al., Biochim Biophys Acta, 1994, 1198 (1): 11-26; De Vita V. et al., CANCER, 6th Edition, 2001, Chapter 8).

많은 암종에서, APC 유전자에서 돌연변이는 GSK-3β 단백질에 결합하여 β-카테닌을 조절하는 능력이 없는 비정상, 비활성 APC 단백질의 형성을 유발하고, 상기 β-카테닌은 세포질로부터 핵 내로 이동하고 여기에서 축적되며, 침입 과정과 전이를 촉진하는 세포외 프로테아제(extracellular protease)(MMP7) 이외에, 종양유전자 성장 활성인자와 세포 증식(c-MYC, 사이클린 D1)의 보조-활성인자(co-activator)로서 기능하는 전사 인자(transcription factor)(가령, Tcf-4)와 복합체를 형성한다(도 1 참조). 도 1에서는 정상 세포(오른쪽)와 종양 세포(왼쪽)에서 β-카테닌 조절의 개요를 도시한다.

이런 이유로, β-카테닌은 종양단백질(oncoprotein)의 모든 특징을 갖는 반면, 복합체 APC/GSK-3β는 β-카테닌의 활성을 조절하는 능력으로 인하여 종양-억제자(onco-suppressor)로서 정의된다 (Rollings F. et al, Digestion, 2002, 66:131-144). 핵 내에 축적된 β-카테닌의 신속한 하향 조절(down-regulation)은 실제로, APC(변형되지 않음)와 GSK-3β 단백질의 작용에 힘입어 달성되고, 이들 단백질은 핵 내로 이동할 때, 종양단백질에 결합하여 이를 분해시키고 및/또는 이를 다시 세포기질 수준으로 운반하고, 여기서 종양 단백질은 인산화되고, 이후 분해된다 (Neufeld K. et al., EMBO reports, 2000, 1, 6:519-523). 이러한 과정은 APC/GSK-3β 복합체가 비활성인 종양 세포에서 부재하고, 따라서 β-카테닌의 핵내 양과 활성의 비-조절은 악성 종양 형성의 발생과 전이화에서 일차적으로 중요한 현상이다.

화학요법(chemotherapy)은 종양의 치료에서 근본적인 역할을 한다. 전이 단계에 있는 결장-직장의 암종을 앓는 환자를 관리할 때, 다양한 치료 절차가 채택되고 있다: 전신 화학요법, 국소-부위 화학요법, 절제 요법과 수술.

화학치료적 처리는 이러한 환자 군에 가용한 치료 가능성의 지주(fulcrum)를 대표한다. 화학요법으로 획득되는 객관적 반응 비율(objective response percentage)은 짧은 반응 지속 기간과 낮은 비율의 완전 반응(단지 5%)으로, 20%에 불과하다; 상기 질환의 안정화는 대략 30-40%에 해당한다.

40년 이상 동안, 5-FU는 진전된 단계에서 결장-직장의 암종에서 가용한 유일한 치료 수단이었다.

최근에, 결장-직장의 전이성 선종과 암종을 앓는 환자의 생존을 향상시키기 위한 시도로, 5-FU와 연합되거나 연합되지 않은 신규한 약물이 연구되었다. 이들 중에서, 이리노테칸과 옥살리플라티늄이 근본적인 역할을 수행한다. 최근에, 5-FU와 연합된 이리노테칸이 대략 17개월의 전체 생존으로, 5-FU 단독으로 치료된 환자에 비하여 더욱 높은 객관적 반응 비율과 진행 시간을 보였다.

CPT-11로 알려져 있는 이리노테칸은 염산염의 형태로 가용하고, 삼원 약물-DNA-국소위성화효소(topoisomerase) I 복합체를 형성함으로써 기능하고, 국소위성화효소는 DNA 전사(transcription) 또는 복제(replication) 작업 동안 과다-외피(super-enveloped) DNA 분자를 비틀림 긴장(torsional tension)이 없는 DNA 분자로 전환시킨다. 캄포테신으로 상기 삼원 복합체의 형성은 DNA의 전단(shear) 단계 동안 시스템의 안정화를 산출하고, 상기 세포가 더 이상, 자가 복제하여 아폽토시스에 의한 사멸을 유발하지 못하도록 담보한다.

이리노테칸은 본질적으로 비활성이지만, 카르바믹 결합(carbamic bond)의 생체내 가수분해가 활성 대사산물 SN38의 방출로 이어지는데(도 2), SN38은 세포독성 작용을 주도하는 실질적인 약물이지만, 물에서 불용성이기 때문에, 투여를 위하여 특정한 부형제를 필요로 한다. 도 2에서는 각각, 이리노테칸^®과 SN38의 화학 구조를 도시한다.

본 발명에서 출원자들은 WO2004/035629와 WO2007/014784에서 기술된 상표명 ONCOFID^®로 확인되는 HA-항종양 약물의 접합체의 새로운 생물학적, 그리고 약리학적 행태를 기술하는데, 이는 새로운 치료적, 그리고 약역학적 특성을 포함한다는 점에서, 비-접합된 기준 약물에 의해 나타나는 행태와 실질적으로 상이하다.

이런 이유로, 본 발명에서는 아폽토시스의 유도보다는 종양 세포의 변형되지 않은 표현형으로의 분화/복귀에 기인한 항-증식성 치료 작용(그 결과로서, 항종양)의 촉진에서 ONCOFID^®에 기초된 조성물로부터 획득되는 놀랍고 예상치 못한 생물학적, 그리고 약리학적 효과를 기술하고 청구한다.

본 발명의 상세한 설명

앞서 명시된 바와 같은 ONCOFID^®의 유도체는 항종양 약물에 유익한 특성, 예를 들면, 물에서 용해도, 안정성, 종양 조직에 대한 선택성, 화학요법에 대한 내성 감소, 그리고 약리학적 효능의 강화를 공여하는 것으로 알려져 있다.

가장 널리 확산된 치명적인 종양 중의 하나는 결장-직장 암종 또는 선종이고, 이러한 종양 형성의 치료에서 가장 효과적인 치료법 중의 하나는 복막내에서 CPT-11에 기초된 치료인 것으로 알려져 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 이러한 유형의 종양에서, APC 유전자의 돌연변이/불활성화는 β-카테닌의 핵내 축적, 그 이후에 세포 침입과 전이를 조장하는 전사 인자의 활성화로 이어지는 일련의 현상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 ONCOFID^®, 특히 HA-SN38 생물접합체(bioconjugate)로 대표되는 ONCOFID-S 및 HA-독소루비신 생물접합체로 대표되는 ONCOFID-D에 기초된 신규한 조성물의 종양학 분야에서 신규한 치료적 용도를 기술하고 청구한다.

일정한 농도의 상기 생물접합체를 포함하는 ONCOFID-S와 ONCOFID-D에 기초된 조성물은 실제로, 비-접합된 약물과 완전히 상이한 작용 기전(action mechanism)으로, 시험관내와 생체내 둘 모두에서 결장-직장 종양과 흑색종의 치료에서 놀랍고 전혀 예상치 못한 결과를 제공하고, 그 결과로서 특히, 현재 고려되는 치료 활성 용량과 상이한 용량에서 효과적이기 때문에, 상기 생물접합체의 상이한 용도를 가능하게 한다.

실시예 10에서 지시된, 세포 증식에 대한 효과의 평가는 놀랍게도, ONCOFID가

1. APC/GSK-3β 단백질 복합체의 활성화에 의해;

2. β-카테닌의 핵내 축적의 감소에 의해; 그리고

3. β-카테닌과 E-카드헤린의 작용에 관련된 과정의 조절, 따라서 세포 유착 능력 및 특히, 변형되지 않은 분화된 세포의 접촉 저해를 재확립하고, 그 결과로서 아폽토시스에 의한 종양 세포의 사멸을 유도하지 않음으로써, 신생물 세포의 분화 효과(differentiative effect)에 기인한 세포 증식의 차단 기전을 유도한다는 것을 보여주고, 따라서 신생물 세포는 악성 신생물 세포의 변형되지 않은 표현형, 다시 말하면, 비-종양 표현형으로의 복귀 과정을 겪는다(SN38은 이에 반하는 것으로 알려져 있음). 세포 주기의 종결 시점에서, 이들 세포는 새로운 전이의 발생 없이, 그리고 원발성 종양의 성장에 기여 없이 사멸한다.

더 나아가, 후속 실험에서, 본 출원인은 ONCOFID 접합체가 단계 1(gap1로서 정의됨)과 단계 S의 급격한 하락을 유발하고, 세포가 "봉쇄된 상태"로 있는 단계 2(gap2로서 정의됨)를 증가시킴으로써 신생물 세포의 상이한 수명 단계를 신속하게 변화시킬 수 있음을 증명한다. 이러한 결과는 ONCOFID 접합체가 신생물 세포의 모든 생명 단계(여기서, 세포 주기의 DNA 합성의 S 단계가 고도로 증가된다)를 조절하고, 이들을 분화시키고, 그리고 새로운 DNA의 합성 단계, 그 결과로서 활성 세포 증식을 차단할 수 있음을 증명한다. 결과적으로, 원발성 종양의 성장 과정 및 전이화 과정의 차단이 달성된다.

이들 실험 검사의 종결 시점에서, 실시예 13에서는 동일한 용량으로 투여된 비-접합된 약물에 비하여, ONCOFID-S 접합체의 생체내 최대 항-종양 효능을 명백하게 증명한다.

이들 결과에서 확인되는 바와 같이, 종양 형성에 대한 신규한 약리 치료제로서 문제 약물의 이용이 가능한데, 그 이유는 HA-SN38 접합체가 물에 가용성이고 임상적 프로토콜(clinical protocol)에서 통상적으로 이용되는 용량보다 훨씬 낮은 용량에서 더욱 효과적이어서, SN38의 전신 독성에서 현저한 감소를 유도하고, 따라서 약물 자체의 치료 지수(therapeutic index)가 증가하기 때문이다.

본 발명에서는

- 신생물 병리의 치료를 위한 신생물 세포의 변형되지 않은 비-종양 표현형으로의 분화 작용제의 제조를 위한;

- β-카테닌의 핵내 축적과 연관된 신생물 병리를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한;

- APC-GSK-3β 복합체의 불활성화와 연관된 신생물 병리를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한;

- 종양 세포 수명의 S 단계의 증가와 연관된 신생물 병리를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한;

- 원발성 종양 또는 이의 전이를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 항종양 약물에 결합된 히알루론산으로 구성되는 생물접합체의 용도를 개시하고 청구한다.

각각, β-카테닌의 핵내 축적, APC-GSK-3β 복합체의 불활성화, 그리고 종양 세포 수명의 S 단계의 증가와 연관된 신생물 병리의 실례는 아래와 같다: 유방 종양, 피부 종양(특히, 흑색종), 골 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 두경부 종양, 림프계 종양, 폐 암, 그리고 중피, 식도, 위, 결장, 결장-직장, 췌장, 간, 신장, 요관과 방광, 전립선, 자궁내막과 난소(모든 다른 복부 장기 포함) 암.

상기 약물은 전신(정맥내 또는 동맥, 근육내, 복막내, 림프내, 피하 또는 경구 적용) 투여되거나, 척수강내 투여되거나, 국소 적용(경피 흡수로, 또는 기관지 적하에 의해)에 이용되거나, 또는 직접 주사(국소-부위 치료)에 의해 종양 부위 내로 직접적으로 투여될 수 있다.

아래의 실시예에서, 본 출원인은 1 내지 20% 중량/중량의 유도체화 등급(derivatization degree)을 갖는, 항종양 약물, 예를 들면, SN38(ONCOFID-S)과 독소루비신(ONCOFID-D)으로 HA 접합체의 제조가 어떻게, 가용성이고 수성 용액에서 2 내지 15 ㎎/㎖의 농도로 효과적인 ONCOFID 유도체를 생산하는 지를 보여준다.

특히, 본 출원인은 결장의 선암종 및 인간 흑색종(작용 기전의 이해를 위하여 필요)의 종양 세포주를 이용하여 시험관내에서 수행된 실험 연구를 통해, 이들 생물접합체의 전혀 예상치 못한 생물학적, 그리고 약리학적 행태를 증명하였다. 이들 데이터로부터, 세포 증식의 차단이 기준 약물의 아폽토시스 작용과 상이한 기전으로 발생하고, 따라서 ONCOFID^?의 유도체가 종양 형성, 예를 들면, 유방 종양, 피부 종양(특히, 흑색종), 골 종양, 뇌 종양, 갑상선 종양, 두경부 종양, 림프계 종양, 폐 암, 그리고 중피, 식도, 위, 결장, 결장-직장, 췌장, 간, 신장, 요관과 방광, 전립선, 자궁내막과 난소(모든 다른 복부 장기 포함) 암의 치료를 위한, 새로운 치료 활성과 상이한 용량에서 훨씬 높은 효능을 갖는 약물이 될 수 있는 것으로 추론될 수 있다. 이를 논증하기 위하여, 본 출원인은 접합체의 생체내 투여후 외식(外植)된 조직으로부터 획득된 탈체 연구의 결과, 그리고 ONCOFID^?의 놀라운 종양 저해 능력을 보여주는 생체내 연구의 결과를 제공한다.

ONCOFID^®(앞서 기술된 바와 같음)은 스페이서를 통해 공유 결합된 히알루론산(HA)과 항종양 약물에 기초된 생물접합체의 새로운 그룹으로 식별되는데, 이는

- 항대사물질, 예를 들면, 엽산(folic acid)의 유사체(그중에서도 특히, 메토트렉세이트), 피리미딘의 유사체(그중에서도 특히, 5-플루오르우라실과 1-β-D-아라비노-푸라노실-시토신, (Ara-C));

- 알칼로이드/천연 산물, 예를 들면, 빈크리스틴과 빈블라스틴(빈카 알칼로이드), 이리노테칸의 활성 대사산물: SN38, 탁산(Taxane), 예를 들면, 파클리탁셀과 도세탁셀;

- 항생제와 유사 산물, 예를 들면, 독소루비신과 에피루비신;

- 생물 반응 조절제;

- 디테르페노이드;

- 알킬화제, 예를 들면, 니트로소우레아;

- 플라티늄의 착물, 예를 들면, 카르보플라티늄과 시스플라티늄;

- 합성 호르몬과 항호르몬, 예를 들면, 에스트라디올을 포함한다.

독소루비신, 파클리탁셀, 그리고 이리노테칸의 대사물질, SN38이 본 발명의 목적에 특히 적합하다.

본 발명에서 이용되는 히알루론산은 400 내지 3,000,000 Da, 바람직하게는 5,000 내지 1,000,000 Da, 더욱 바람직하게는 30,000 내지 500,000 Da 범위의 분자량을 보유한다; 이는 추출, 발효 또는 생합성으로 기원될 수 있다. 스페이서와의 공유 결합은 1 내지 100%(치환 등급) 범위의 비율에서 중합체의 반복 단위(repetitive unit)의 D-글루쿠론산(glucuronic acid)의 카르복실 기를 필요로 하고, 카르복실 기는 히알루론산과 화학치료 약물 사이에 연결 수단으로서 기능하는 선택된 분자 스페이서(molecular spacer)의 기능기(functional group)와 에스테르 또는 아미드 결합을 형성한다. 스페이서 작용제(spacer agent)는 선형 또는 가지형이고 헤테로원자가 존재하거나 존재하지 않는 지방족(aliphatic), 방향지방족(araliphatic), 지방족환형(alicyclic) 또는 헤테로환형(heterocyclic) 사슬로 구성되고, 상기 사슬은 히드록실, 카르복실, 카르보닐, 아민 기(히드라지드(hydrazide)와 폴리펩티드 제외), 에폭시 기, 산성 염화물, 티올, 니트릴, 할로겐, 무수물, 이소시아네이트, 그리고 이소티오시아네이트를 포함한다; C₂-C₁₀ 지방족 사슬을 갖는 카르복실 산의 브롬화물, 요오드화물과 염화물, 특히, 브로모 프로피온산(bromo propionic acid), 브로모 부티르산(bromo butyric acid), 브로모 부탄올(bromo butanol) 또는 브로모 프로판올(bromo propanol)과 같은 브롬화물이 바람직하다. 치환 등급은 바람직하게는, 1 내지 50% 중량/중량, 더욱 바람직하게는 1 내지 25% 범위에 있다; 독소루비신과의 접합의 경우에 3 내지 20%의 치환이 바람직하고, SN38의 경우에 1 내지 15% 중량/중량이 바람직하다.

특히, ONCOFID-P는 HA와 파클리탁셀 사이에 접합체이고, ONCOFID-S는 HA와 SN38 사이에 접합체이고, ONCOFID-D는 HA와 독소루비신 사이에 접합체이고, 그리고 ONCOFID-Pt는 HA와 시스-플라티늄 사이에 접합체이다.

더욱 구체적으로, ONCOFID-S는 4개의 탄소 원자를 갖는 스페이서, 예를 들면, 브로모 부티르산에 미리 연결된 HA(200 kDa의 분자량 보유)와 SN38의 에스테르 유도체이다. 치환 등급은 합성 단계 동안 이용된 몰 비율(molar ratio)에 기초하여 1 내지 15% 범위에서 변할 수 있다.

ONCOFID-S의 합성은 특허 출원 PCT Publ. N. WO2007/014784의 상세한 설명 및 실시예 1-2에서 상세하게 기술된다.

ONCOFID-D는 카르바믹 결합을 통해 독소루비신에 차례로 결합된 스페이서, 예를 들면, 브로모 부탄올 또는 브로모 프로판올을 보유하는 히알루론산의 에스테르이다.

ONCOFID-D의 합성 역시 특허 출원 PCT Publ. N. WO2007/014784의 상세한 설명 및 실시예 10에서 상세하게 기술된다.

ONCOFID-P는 특허 출원 PCT Publ. N. WO2004/035629에서 이미 상세하게 기술되었다.

최종적으로, 본 출원인은 문제의 생물접합체가 현저하게 용해되는 것으로 입증된 상이한 수성 제약학적 조성물(즉, β-시클로덱스트린, 글루코오스 또는 리포좀의 존재에서)의 제조를 기술하는데, 상기 조성물 모두 문제 약물의 생체이용효율(bioavailability)/용해도에 관련된 문제점 없이 치료 효과량으로 활성 성분의 투여가 가능하고, 따라서 앞서 기술되고 하기에 증명된 새로운 화학적/물리학적/치료적 특성으로, 효능을 증가시키는데 기여한다.

도 1에서는 정상 세포(오른쪽)와 종양 세포(왼쪽)에서 β-카테닌 조절의 개요를 도시한다.
도 2에서는 각각, 이리노테칸^?과 SN38의 화학 구조를 도시한다.
도 3에서는 중간생성물 브로모숙시네이트디아미노-플라티늄의 합성 개요를 도시한다.
도 4에서는 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 HA, SN38 또는 ONCOFID-S로 처리후 시간과 관련하여 세포 생존능 그래프를 도시한다.
도 5에서는 실험후 분석된 종양 세포 상에서 시험관내 처리에 의해 유도된 형태학적 변형(morphological modification)의 주사 전자 현미경 분석(scanning electron microscope analysis, SEM)을 도시한다.
도 6에서는 48시간 처리후, 조사된 ONCOFID-S의 용량(0.125, 0.25, 0.5, 1 ㎍/㎖)에 관련하여 세포 생존능의 측면에서 획득된 결과를 그래프 형태로 도시한다.
도 7에서는 문제의 접합체로 처리하면 gap1과 S 단계가 급격하게 붕괴하고 gap2 단계가 증가하여, ONCOFID가 기준 약물로부터 차별화된다는 것을 도시하는데, 상기 기준 약물은 이에 반하여, 첫 번째 단계와 S 단계 둘 모두 증가한다.
도 8에서는 24시간의 약리학적 중지(pharmacological suspension) 이후에도, gap1과 S 단계의 차단이 지속된다는 것을 보여준다.
도 9에서는 흑색종 M14의 세포주의 24시간 처리후. 용량(0.25, 0.5, 20 ㎍/㎖)에 관련하여 ONCOFID-D(OF-D)와 비-접합된 독소루비신에 의해 유도된 세포독성 효과(cytotoxic effect)를 그래프 형태로 도시한다.
도 10에서는 검사의 종결 시점(T28)에서, 종양의 평균 체적이 처리되지 않은 대조 군(15.5 ㎤)과 비교하여, CPT-11 군(5.9 ㎤)에서 처리에 대한 우수한 반응 및 ONCOFID-S 군(1.8 ㎤)에서 더욱 우수한 반응을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 11에서는 종양 체적의 결과와 완전히 일관되게, 검사의 종결 시점(T28)에서 채취된 출혈 복수(종양)의 평균 체적이 대조 군에서 46.7 ㎖, CPT-11로 처리된 군에서 21.5 ㎖, 그리고 ONCOFID-S로 처리된 군에서 단지 1.9 ㎖이라는 것을 보여준다.
도 12에서는 처리된 동물의 혈구계 프로필(haematocytometric profile)의 분석 결과(T28에서)를 도시한다.
도 13에서는 대조 동물과 비교하여 증가된 발현이 분화되지 않은 종양 표현형의 분화된 비-종양, 따라서 비-증식성 표현형으로의 복귀를 지시한다는 것을 보여준다.

앞서 기술된 접합체의 특정한 생물학적 행태를 보여주는 시험관내, 탈체와 생체내 연구의 일부 실례와 함께, ONCOFID 조성물의 제조의 일부 실시예가 순전히 예시의 목적으로 하기에 제공되고, 이들 실시예는 본 발명을 결코 한정하지 않는다.

실시예 1

대략 8%의 치환 등급을 갖는, MW 200 kDa의 히알루론산과 SN-38의 에스테르 유도체의 제조

첫 번째 단계: 500 ㎎의 SN-38이 DMF. 0.8866 g의 EDC, 0.7011의 4-브로모부티르산에 용해되고, 최종적으로, 0.1163 g의 DMAP가 차후 첨가된다. CHCl₃/CH₃CN 60/40의 혼합물을 이용하여, TLC(실리카 겔 60 F₂₅₄)로 반응이 모니터된다.

대략 1시간후, 반응은 완결된 것으로 간주되고, 10 ㎖의 메탄올이 첨가되고, 그리고 생성된 혼합물은 대략 30' 동안 교반된다. 산물은 이후, 물에서 침전되고, 여과되고, CHCl₃에 첨가되고, H₂O로 세척되고, 분리 깔때기를 통해 HCl(pH

4)로 약하게 산성화된다.

건조된 유기 상은 황색을 띤 산물을 제공하고, 상기 산물은 중력 크로마토그래피 칼럼(gravity chromatography column)에서 정제되고, CHCl₃ 100%에서 CHC1₃/CH₃OH 95:5로 구배 용리(gradient elution)된다.

회수된 BrC4SN38은 회전농축기(rotavapor)에서 건조되고 하룻밤동안 자연 건조된다.

두 번째 단계: 1.4347 g의 HATBA(200 kDa)(히알루론산의 테트라알킬 암모늄 또는 테트랄부틸 암모늄 염)이 3개 목 유리 재킷 반응기(glass jacketed reactor) 내로 채워지고, 자석 교반되고, 100 ㎖의 DMSO에 용해된다; 생성된 혼합물은 완전한 용해 때까지 교반되고, 상기 반응기는 온도 조절 장치에 의해 38℃에서 조절된다.

DMSO에 용해된 380 ㎎의 중간생성물 BrC4SN38이 HATBA의 용액에 첨가되고, 그리고 생성된 혼합물은 38℃에서 대략 48시간 동안 교반된다. 반응의 종결 시점에서, 14 ㎖의 포화된 NaBr 용액이 첨가되고, 그리고 생성된 혼합물은 TBA-Na 양이온의 교환을 완결하고 나트륨 HA를 획득하기 위하여 대략 60분 동안 교반된다. 이후, 에탄올로 침전이 달성된다; 획득된 고체는 Gooch 4에서 여과로 회수되고, 에탄올로 차후 세척을 위하여 비커로 이전되고, 최종적으로 40℃에서 진공 하에 건조된다.

실시예 2

대략 3.5%의 치환 등급을 갖는, MW 200 kDa의 히알루론산과 SN-38의 에스테르 유도체의 제조

첫 번째 단계: 199 ㎎의 SN-38이 100 ㎖의 ACN에 용해되고, 생성된 용액에 383 ㎎의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(EDC), 258 ㎎의 4-브로모부티르산과 60 ㎎의 DMAP가 첨가된다. TLC 크로마토그래피(형광 인디케이터(fluorescence indicator)와 클로로포름-아세토니트릴 용리제 60:40을 포함하는 실리카 정지 상)에 의해 용액의 방향이 모니터된다. 산물은 회전농축기에서 용매의 제거로 회수되고 실리카 칼럼에서 크로마토그래피로 정제된다. 이렇게 획득된 중간생성물은 높은 진공 하에 실온에서 건조되고 최종적으로 칭량된다.

두 번째 단계: 160 ㎎의 BrC4SN38 중간생성물이 20 ㎖의 NMP에 용해되고, 차후에 38℃에서 온도 조절 장치에 의해 미리 조절된 120 ㎖의 NMP에 녹인 HATBA 1.2 g의 용액에 첨가된다. 생성된 혼합물은 38℃에서 72시간 동안 방치되고, 그 이후에 5 ㎖의 물과 8 ㎖의 포화된 염화나트륨 용액으로 희석된다. 전체 혼합물은 상기 나트륨이 TBA 이온으로 교환되도록 1시간 동안 교반된다. 산물은 이후, 에탄올의 방울방울 첨가에 의해 침전되고, 최종적으로 에탄올에서 세척에 의해 정제되고 진공 하에 40℃에서 건조된다.

실시예 3

대략 10%의 치환 등급을 갖는, MW 200 kDa의 히알루론산과 독소루비신의 에스테르 유도체의 제조

첫 번째 단계: 770 ㎎의 염화수소 독소루비신이 칭량되고, 770 ㎕의 트리에틸아민의 존재에서 120 ㎖의 무수성 DMF에 용해되고, 차후에 N-히드록시숙시니미드로 미리 활성화된 560 ㎎의 3-브로모 부탄올이 첨가된다. TLC 크로마토그래피 (형광 인디케이터와 클로로포름-에탄올 용리제 80:20을 포함하는 실리카 정지 상)에 의해 반응이 모니터되고, 15분후 완결된 것으로 간주된다. 산물은 탈염수에서 침전되고 Gooch 5에서 여과로 회수된다. CHCl₃에 첨가된 고형 잔류물은 H_2O로 세척되고, 분리 깔때기를 통해 HCl(pH

4 )로 약하게 산성화된다.

건조된 유기 상은 진한 적색 산물을 제공하고, 이는 정제를 위하여, 중력 크로마토그래피 칼럼 내로 채워지고 CHCl₃ 100%에서 CHCl₃/CH₃CH₂OH 95:5로 구배 용리된다.

회수된 중간생성물 BrC30Dox는 회전농축기에서 건조되고 하룻밤동안 자연 건조된다.

두 번째 단계: 964 ㎎의 HATBA(200 kDa)가 3개 목 유리 재킷 반응기 내로 채워지고, 자석 교반되고, 100 ㎖의 DMSO에 용해된다; 생성된 혼합물은 완전한 용해 때까지 교반되고, 상기 반응기는 온도 조절 장치에 의해 38℃에서 조절된다.

DMSO에서 550.5 ㎎의 중간생성물 BrC30Doxo sciolti이 HATBA의 용액에 첨가된다; 반응은 교반 하에 38℃에서 대략 48시간 동안 유지된다.

반응의 종결 시점에서, 8 ㎖의 포화된 NaBr 용액이 방울방울 첨가되고, 그리고 생성된 혼합물은 TBA-Na 양이온의 교환을 완결하고 나트륨 HA를 획득하기 위하여 대략 30분 동안 교반된다. 이후, 에탄올로 침전이 달성된다; 획득된 고체는 Gooch 4에서 여과로 회수되고, 에탄올로 차후 세척을 위하여 비커로 이전되고, 최종적으로 40℃에서 진공 하에 건조된다.

실시예 4

대략 12%의 치환 등급을 갖는, MW 200 kDa의 히알루론산과 백금 도금된 화합물의 에스테르 유도체의 제조

200 ㎎의 시스-디아미노(디클로로) 플라티늄(II)(0.666 mmol)이 20 ㎖의 탈염수에 용해되고 60℃에서 6시간 동안 2 당량(equivalent)의 AgNO₃과 반응되어 디아민(디니트레이트) 플라티늄(II)으로 전환된다. 이후, 140 ㎎의 브로모숙신산(0.7 mmol)이 첨가되고, 이들 리간드의 교환 반응이 6O℃에서 24시간 동안 수행된다. 도 3에서는 중간생성물 브로모숙시네이트디아미노-플라티늄의 합성 개요를 도시한다. 합성 중간생성물은 침전되고, 히알루론산과의 차후 반응을 위하여 정제된다.

240 ㎎의 브로모숙시네이트디아미노-플라티늄(II)이 20 ㎖의 DMSO에 용해되고, DMSO에 녹인 히알루론산 테트랄부틸 암모늄 염(HATBA)(150 ㎖에서 1.750 g) 용액에 천천히 첨가된다. 상기 반응은 38℃에서 48시간 동안 수행되고, 그 이후에 TBA-Na 양이온의 교환을 완결하고 나트륨 HA를 획득하기 위하여 교반 하에 대략 60분 동안 14 ㎖의 포화된 NaBr 용액이 첨가된다. 이후, 에탄올로 침전이 달성된다; 획득된 고체는 Gooch 4에서 여과로 회수되고, 에탄올로 세척되고, 최종적으로 40℃에서 진공 하에 건조된다. 접합체의 플라티늄 함량은 ICP(유도 결합 플라즈마, inductively coupled plasma) 기술을 통해 결정된다.

실시예 5

글루코오스 용액에서 5% w/v로, ONCOFID-Pt에 기초된 용액의 제조

카르복실 잔기에서 3 내지 15% w/w의 치환 등급을 갖는, 실시예 4에서 기술된 바와 같이 획득된 60 ㎎의 ONCOFID-Pt가 5% w/v의 글루코오스를 포함하는 29 ㎖의 수성 용액에 용해된다. 생성된 용액은 상기 접합체의 완전한 용해 때까지 자석 교반된다; 이는 이후, 멸균 필터(sterilizing filter)에서 재생된 셀룰로오스(RC) 상에서 0.22 ㎛ 세척기로 여과된다. 여과후 접합체의 전체 회수를 확증하기 위하여 여과 전후에, 상기 용액의 역가(titer)(ONCOFID에서 3 ㎎/㎖)가 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정된다.

실시예 6

β-시클로덱스트린의 용액에서 1.5% w/v로, ONCOFID-S에 기초된 제약학적 조제물.

카르복실 잔기에서 3 내지 15% w/w의 치환 등급을 갖는, 앞서 기술된 바와 같이 획득된 62 ㎎의 ONCOFID-S가 1.5% w/v의 β-시클로덱스트린을 포함하는 22 ㎖의 수성 용액에 용해된다. 생성된 용액은 상기 접합체의 완전한 용해 때까지 자석 교반기로 교반된다; 이는 이후, 멸균 필터(sterilizing filter)에서 재생된 셀룰로오스(RC) 상에서 0.22 ㎛ 세척기로 여과된다. 여과후 접합체의 전체 회수를 확증하기 위하여 여과 전후에, 상기 용액의 역가(titer)(ONCOFID-S에서 2.8 ㎎/㎖)가 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정된다.

실시예 7

글루코오스 용액에서 5% w/v로, ONCOFID-S에 기초된 제약학적 조제물

카르복실 잔기에서 3 내지 15% w/w의 치환 등급을 갖는, 앞서 기술된 바와 같이 획득된 56 ㎎의 ONCOFID-S가 5% w/v의 글루코오스를 포함하는 20 ㎖의 수성 용액에 용해된다. 생성된 용액은 상기 접합체의 완전한 용해 때까지 자석 교반기로 교반된다; 이는 이후, 멸균 필터(sterilizing filter)에서 재생된 셀룰로오스(RC) 상에서 0.22 ㎛ 세척기로 여과된다. 여과후 접합체의 전체 회수를 확증하기 위하여 여과 전후에, 상기 용액의 역가(titer)(ONCOFID-S에서 2.8 ㎎/㎖)가 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정된다.

실시예 8

글루코오스 용액에서 5% w/v로, ONCOFID-P에 기초된 제약학적 조제물

특허 WO2004035629의 실시예 5, 6, 7, 9와 10에서 기술된 바와 같이 획득된 100 ㎎의 ONCOFID-P가 5% w/v의 글루코오스를 포함하는 20 ㎖의 수성 용액에 용해된다. 생성된 용액은 상기 접합체의 완전한 용해 때까지 자석 교반기로 교반된다; 이는 이후, 멸균 필터(sterilizing filter)에서 재생된 셀룰로오스(RC) 상에서 0.22 ㎛ 세척기로 여과된다. 여과후 접합체의 전체 회수를 확증하기 위하여 여과 전후에, 상기 용액의 역가(titer)(ONCOFID-P에서 5 ㎎/㎖)가 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정된다.

실시예 9

글루코오스 용액에서 5% w/v로, ONCOFID-D에 기초된 제약학적 조제물

카르복실 잔기에서 3 내지 15% w/w의 치환 등급을 갖는, 앞서 기술된 바와 같이 획득된 60 ㎎의 ONCOFID-D가 5% w/v의 글루코오스를 포함하는 20 ㎖의 수성 용액에 용해된다. 생성된 용액은 상기 접합체의 완전한 용해 때까지 자석 교반기로 교반된다; 이는 이후, 멸균 필터(sterilizing filter)에서 재생된 셀룰로오스(RC) 상에서 0.22 ㎛ 세척기로 여과된다. 여과후 접합체의 전체 회수를 확증하기 위하여 여과 전후에, 상기 용액의 역가(titer)(ONCOFID-D에서 3 ㎎/㎖)가 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정된다.

실시예 10

결장 선암종의 전임상 모형(preclinical model)에서 생물접합체 ONCOFID-S의 시험관내 실험

이러한 시험관내 실험의 목적은 주로, 수성 용액에서 제조된 실시예 2의 SN38에 결합된 HA로 구성되는 생물접합체의 활성 프로필(activity profile)을 정의하고, ONCOFID 유도체 vs 기준 약물의 항신생물 활성(antineoplastic activity)을 평가/비교하고, 따라서 비교 항신생물제에 관한 이들의 약리학적 효능 및 작용 기전을 결정하는 것이다.

검사된 산물 및 검사된 활성 성분

- SN38: 대조 기준 산물;

- ONCOFID-S: 카르복실(w/w)에서 3.5%의 에스테르화(esterification) %를 갖는, SN38에 공유 결합된 HA의 에스테르 유도체

검사된 제약학적 조제물

- SN28은 실온에서, DMSO/CH3CN/EtOH(10:45:45)로 구성된 혼합물에 용해되었다.

- β-시클로덱스트린에 녹인 ONCOFID-S의 용액: 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조됨.

이용된 세포주

HA CD44에 대한 수용체를 발현하는 쥐 DHD/K12/Trb의 결장의 선암종 세포

실험 프로토콜

1) 시험되는 세포주는 편평 바닥을 갖는 24개 웰(well)을 보유하는 평판에서, 6x1O⁴개 세포/㎠의 농도로 도말된다;

2) 24시간후, 배양 배지에서 적절하게 희석된 검사 용액이 이들 세포에 첨가된다;

3) 처리후 24시간 또는 48시간 시점에, 세포 생존능(cell vitality)이 생존 세포와 대사 활성 세포로부터 배제되지만, 푸른색으로 변하는 사멸 세포에 의해 억류되는 염료인 Tripan blue 배제 방법으로 평가된다.

결과

24시간 처리후, 비-접합된 SN38의 IC50 값과 비교하여 신규한 접합체 ONCOFID-S의 IC50 값 이외에, 용량과 관련하여 세포 DHD/K12/Trb의 생존능의 측면에서 획득된 결과는 SN38과 비교하여 ONCOFID-S의 더욱 높은 효능을 증명하였다. 상기 SN38과 ONCOFID-S의 IC50 값은 각각, 1.4 ㎍/㎖와 0.4 ㎍/㎖인 것으로 밝혀졌다. 문제의 접합체 ONCOFID-S가 SN38에서 중량으로 3.5% 유도체화되었다는 점을 고려하면, 이러한 SN38 등가물(HA에 접합됨)의 IC50 값은 기준 약물보다 훨씬 낮고(0.014 ㎍/㎖), 다시 말하면, 100배 높은 활성을 보이고, 이는 히알루론산과 접합될 때 이의 약리학적 효능이 강화된다는 것을 확증한다.

도 4에서는 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 HA, SN38 또는 ONCOFID-S로 처리후, 시간과 관련하여 세포 생존능 그래프를 도시한다. 결장-직장 암종의 형성과 진행에서 β-카테닌을 조절하는 역할의 중요성으로 인하여, ONCOFID-S로 처리가 앞서 기술된 바와 같이, 상기 단백질의 조절 과정에 관여하는 분자의 세포내 발현과 분포를 변형할 수 있는 지를 검증하였다. 이런 이유로, DHD/Trb 세포 내에서 E-카드헤린, β-카테닌, APC-GSK-3β의 세포내 분포에 대한 ONCOFID-S로 처리의 효과가 형광 검경(fluorescence microscopy)으로 분석되었다. 상기 단백질에 대하여 특이적인 항체가 이용되었는데, 이들 단백질은 형광색소(fluorochrome), 예를 들면, 로다민(rodamin)과 플루오레세인(fluroescein)에 결합된 이차 항체의 이용으로 가시화되었다.

획득된 결과로부터, 도 4에 도시된 생물접합체 ONCOFID-S로 처리의 항증식 효과, 그 결과로써 항종양 효과에 앞서,

- APC 단백질과 GSK-3S 키나아제 둘 모두의 핵 내로의 전좌(translocation)(도 4a), 여기서 이들은 인산화(phosphorylation)를 통해 β-카테닌의 축적을 조절할 수 있고(앞서 지시된 바와 같음), 결과적으로 세포 증식을 정지시킨다;

- 핵으로부터 β-카테닌(앞서 기술된 바와 같이, 이는 종양 세포의 증식에 관여하는 종양유전자를 축적하고 활성화시키는 것으로 알려져 있다)의 세포질로의 전좌(도 4b), 여기서 세포 막의 수준에서 E-카드헤린과 연합함으로써, 이는 E-카드헤린-β-카테닌 세포내 복합체를 재형성하고, 상기 복합체는 세포 유착을 조절하고 세포 분화의 명백한 신호를 나타낸다;

- 세포간 유착 과정 및 세포-세포 연접(cell-cell joining)의 형성(이는 알려진 바와 같이, 접촉 저해와 세포 분화를 결정하는데 근본적인 역할을 한다)에 관여하는 막 단백질인 E-카드헤린의 결과적인 증가된 발현(도 4b); E-카드헤린의 발현에서 이러한 증가는 실제로, 건강한 결장 점액(colic mucous)의 비-종양 상피 세포의 분화의 마커로 간주된다;

- 건강한 결장 점액(colic mucous)의 비-종양 상피 세포의 분화의 두 번째 마커인 시토케라틴(cytokeratin) 20(CK20)의 발현에서 증가(도 5)가 선행하는 것으로 밝혀졌다. 세포 분화에 관련된 상기 변형 모두 비-접합된 SN38로 처리된 생물에서는 나타나지 않는다.

이들 데이터는 도 4에 도시된 ONCOFID-S로 처리된 샘플에서 신생물 세포의 증식의 정지 기전이 아폽토시스에 의한 대규모 세포 사멸의 유도가 아닌 분화 효과(differentiating effect)에 기인할 수 있음을 분명하게 증명한다(SN38은 이에 반하는 것으로 알려져 있음). 도 5에서는 실험후 분석된 종양 세포 상에서 시험관내 처리에 의해 유도된 형태학적 변형(morphological modification)의 주사 전자 현미경 분석(scanning electron microscope analysis, SEM)을 도시하는데, 이들 변형은 신생물 세포의 변형되지 않은 표현형, 다시 말하면, 비-종양으로 생물접합체의 분화 효과, 이후 접촉 저해를 담당하는 세포간 유착 능력의 복원, 그 결과로써 종양 증식의 차단 유도를 확증한다. 도 5에서는 CK20 발현 및 쥐 결장 선암종 세포 DHD/K12/Trb의 형태에 대한 48시간 처리후 ONCOFID-S의 효과를 보여준다: 처리후 CK20을 발현하는 세포수가 비-처리된 대조 및 히알루론산으로 처리된 세포 배양액과 비교하여 증가하였다. 상기 생물접합체로 처리된 세포의 세포 형태는 분화된 상피 세포의 전형적인 특징, 예를 들면, 더욱 큰 기질 유착, 더욱 큰 편평화(flattening) 및 단단한 세포-세포 연접의 존재를 보인다.

결론

CD44 수용체의 발현에 대하여 양성인 결장 선암종의 세포주에서, 낮은 용량에서 ONCOFID-S 유도체는 SN38에서 관찰되는 바와 같은 아폽토시스의 유도보다는 변형되지 않은 상피 세포, 다시 말하면, 비-종양, 따라서 비-증식성 세포에서 선암종 세포의 분화/복귀에 기인한 놀라운 항-증식 효과를 보인다. 이들 세포는 세포 주기를 완결하면, 새로운 전이의 발생 없이, 그리고 종양 형성의 성장에 기여 없이 사멸한다.

실시예 11

결장 선암종의 전임상 모형에서 생물접합체 ONCOFID-S의 시험관내 실험

이러한 시험관내 실험의 목적은 주로, 수성 글루코오스 용액에서 제조되고 더욱 높은 유도체화 등급을 갖는 ONCOFID 유도체의 활성 프로필을 정의하고, 항-신생물 활성을 기준 약물의 항신생물 활성과 평가/비교하고, 따라서 비교 항신생물제에 관한 약리학적 효능을 결정하는 것이다.

검사된 산물 및 검사된 활성 성분

- SN38: 대조 기준 산물;

- ONCOFID-S: 실시예 1에 따라 제조된, 카르복실(w/w)에서 8%의 에스테르화(esterification) %를 갖는, SN38에 공유 결합된 HA의 에스테르 유도체

검사된 제약학적 조제물

- 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조된, 글루코오스에 녹인 ONCOFID-S의 용액.

이용된 세포주

쥐 DHD/K12/Trb의 결장의 선암종 세포

실험 프로토콜

3) 처리후 24시간 또는 48시간 시점에, 세포 생존능이 생존 세포와 대사 활성 세포로부터 배제되지만, 푸른색으로 변하는 사멸 세포에 의해 억류되는 염료인 Tripan blue 배제 방법으로 평가된다.

결과

48시간 처리후, 조사된 ONCOFID-S의 용량(0.125, 0.25, 0.5, 1 ㎍/㎖)에 관련하여 세포 생존능의 측면에서 획득된 결과가 하기에 그래프 형태로 제공된다(도 6).

용량 250 ng/㎖는 IC50에 해당하고, 실시예 1에 따라 제조된 ONCOFID-S (IC50은 실시예 5의 결과에서 지시된 바와 같이, 0.4 ㎍/㎖에 해당한다)와 비교하여, 실시예 2에 따라 제조된 ONCOFID-S의 훨씬 높은 효능을 확증한다; 결과적으로, 효능이 비-접합된 SN38보다 훨씬 높다.

이러한 결과는 3.5%에서 유도체화된 ONCOFID-S(OF-S)와 비교하여 SN38에서 더욱 높은 유도체화 비율, 다시 말하면, 중량으로 8%에 기인할 수 있다.

비-접합된 기준 약물 SN38과 비교하여, 상이한 치환 등급(3.5와 8%)을 갖는 2가지 접합체 및 접합된 SN38에서 개별 등가물의 IC50의 표가 하기에 제공된다.

IC50

비-접합된 SN38 1.4 ㎍/㎖

OF-S 3.5% w/w 0.4 ㎍/㎖

SN38 등가물 0.014 ㎍/㎖

OF-S 8% w/w 0.25 ㎍/㎖

SN38 등가물 0.02 ㎍/㎖

결론

상기 ONCOFID-S 유도체는 비-접합된 SN38 약물에서 관찰되는 것보다 5배 높은 효능을 보이지만, 등가의 SN38의 농도를 고려하면, 이러한 효능은 기준 약물의 효능보다 대략 70배 높다. 더 나아가, 더욱 낮은 유도체화 비율을 갖는 접합체에 관한 연구와의 비교는 히알루론산이 SN38에서 더욱 많이 유도체화될수록, ONCOFID-S의 효능이 더욱 높아진다는 것을 증명한다.

실시예 12

이러한 실험의 목적은 다양한 세포 수명 단계에 대한 ONCOFID-S 유도체의 영향을 연구하여, ONCOFID-S 유도체 활성 vs 기준 약물 SN38의 활성을 평가하는 것이다.

실험 개요

검사된 산물 및 검사된 활성 성분

- SN38: 대조 기준 산물;

- ONCOFID-S: 실시예 2에 따라 제조된, 카르복실(w/w)에서 3.5%의 에스테르화(esterification) %를 갖는, SN38에 공유 결합된 HA의 에스테르 유도체

검사된 제약학적 조제물

이용된 세포주

쥐 DHD/K12/Trb의 결장의 선암종 세포

실험 프로토콜

실시예 8과 9에서 기술된 바와 동일.

결과

ONCOFID-S 접합체(0.5 ㎍/㎖의 농도에서)의 효과는 유세포분석(cytofluorometric) 유형의 분석법을 이용하여 측정되었다; 24시간의 약리학적 처리후, 세포 단계는 요오드화프로피디엄(propidium iodide)으로 세포를 착색한 이후, DNA 함량의 유세포분석에 의해 FACS-Scan(Becton Dickinson)으로 확인된다.

도 7에서는 획득된 결과를 도시한다: 문제의 접합체로 처리하면 gap1과 S 단계가 급격하게 붕괴하고 gap2 단계가 증가하여, ONCOFID가 기준 약물로부터 차별화되고, 상기 기준 약물은 이에 반하여, 첫 번째 단계와 S 단계 둘 모두 증가한다.

획득된 데이터가 시간의 흐름에서 지속하는 지를 평가하기 위하여, 48시간 처리후, 배양 배지가 처리 없는 새로운 배지로 교체되는 유출 검사(Wash out test)가 수행되었다: 이들 세포 단계는 이후, TO으로서 정의된 시점에서, 그리고 24시간 배양후, T24에서 다시 규정되었다.

획득된 결과는 도 8에서 확인할 수 있다: 이들 결과는 24시간의 약리학적 중지(pharmacological suspension) 이후에도, gap1과 S 단계의 차단이 지속된다는 것을 명백하게 증명하고, 이는 약물의 효과가 비가역적인 이유를 지시한다.

결론

모든 증식성 포유동물 세포에서, 게놈의 복제 및 세포 자체의 분열은 gap1, S, gap2로 확인된 특정한 세포 수명 단계에서 발생한다. gap1에서 세포는 새로운 DNA가 합성되는 단계 S에 대비하기 위하여 필수적인 모든 생화학적 변형에 직면한다: S 단계에서, 실제로, 세포의 유전 물질(genetic material)의 정확한 사본이 산출되고, 이러한 사본은 차후 유사분열 과정(mitosis process) M을 통해 2개의 딸 세포(daughter cell)로 분열될 것이다. S에 후행하고 M에 선행하는 단계는 gap2로 정의되고 유사분열 준비 단계이다. 획득된 결과는 신생물 세포의 가장 중요한 수명 단계: 비-종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 현저하게 증가하는, 종양의 차후 증식과 성장을 위한 새로운 DNA의 능동적 합성의 S 단계의 실질적인 감소에 생물접합체 ONCOFID가 얼마나 효과적인 지를 증명한다. 이런 이유로, 낮은 용량에서, 상기 신규한 약물은 기준 약물 SN38과 전혀 상이한 방식으로, 종양 증식을 차단함으로써 세포 성장 단계를 조절할 수 있는 것으로 증명되었다.

실시예 13

인간 흑색종의 전임상 모형에서 생물접합체 ONCOFID-D의 시험관내 실험

이러한 시험관내 실험의 목적은 주로, 수성 글루코오스 용액에서 제조된 ONCOFID-D 유도체의 활성 프로필을 정의하고, 항-신생물 활성을 기준 약물의 항신생물 활성과 평가/비교하고, 따라서 비교 항-신생물제(독소루비신)에 관한 약리학적 효능을 결정하는 것이다.

실험 개요

검사된 산물 및 검사된 활성 성분

- 독소루비신: 대조 기준 산물;

- ONCOFID-S: 실시예 3에 따라 제조된, 카르복실(w/w)에서 10%의 에스테르화(esterification) %를 갖는, 독소루비신에 공유 결합된 HA의 에스테르 유도체

검사된 제약학적 조제물

- 독소루비신은 실온에서, 글루코오스 용액에 5% w/v로 용해되었다.

- 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조된, 글루코오스에 녹인 ONCOFID-D의 용액.

이용된 세포주

HA CD44에 대한 수용체를 발현하는 인간 흑색종 세포 M14.

실험 프로토콜

- 시험되는 세포주는 편평 바닥을 갖는 24개 웰(well)을 보유하는 평판에서, 6x1O⁴개 세포/㎠의 농도로 도말된다;

- 24시간후, 배양 배지에서 적절하게 희석된 검사 용액이 이들 세포에 첨가된다;

- 처리후 24시간 시점에, "Live Dead" 세포 생존능 검사 시약(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 착색함으로써 공초점 검경(confocal microscopy)에서 세포독성(cytotoxicity)이 평가된다. 이러한 관찰은 LEICA TCS SP5 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 수행되었다.

결과

흑색종 M14의 세포주의 24시간 처리후, 용량(0.25, 0.5, 20 ㎍/㎖의 농도)에 관련하여 ONCOFID-D(OF-D)와 비-접합된 독소루비신에 의해 유도된 세포독성 효과(cytotoxic effect)가 하기에 그래프 형태로 제공된다(도 9).

결론

흑색종 세포주는 CD44 수용체의 발현에 대하여 강한 양성을 나타내는 것으로 확인되었다; 공초점 검경에서 세포독성의 평가는 ONCOFID-D가 상응하는 비-접합된 독소루비신보다 이러한 흑색종 세포주에 대한 더욱 강한 세포독성 효과를 발휘할 수 있다는 것을 지시한다. 더 나아가, 생물접합체 ONCOFID-D에서 접합된 독소루비신의 비율이 중량으로 10%에 필적한다는 것을 고려하면, 상기 약물의 활성은 10배 더 높다.

실시예 14

동계(syngenic) 결장의 암종 세포주에 의해 쥐에서 유도된 실험적 종양 모형에서 생물접합체 ONCOFID-S의 생체내 항-종양 효과의 평가

생체내 실험을 통해 ONCOFID 유도체에 의해 발휘되는 높은 효능을 확증하고, 또한 시험관내에서 세포독성 작용을 확증하기 위하여, BDIX 쥐가 복부 종양의 유도에 이용되었다. 복막내 접종된 세포주 DHD/K12/Trb는 실제로, 복막 암종증(peritoneal carcinomatosis) 및 종양 복수(ascites)의 형성을 유발하였다.

이후, 복막내 투여된 40 ㎎/㎏ 농도의 CPT-11 vs 40 ㎎/㎏(이는 생물접합체가 8%로 유도체화되는 경우에, 3.2 ㎎/㎏의 활성 성분 SN38에 해당한다) 농도의 ONCOFID-S의 생체내 항-종양 효능이 비교되었다.

이러한 생체내 연구의 목적은 아래와 같았다:

1. 대조 군(control group)과 비교하여 종양 성장의 평가 및/또는 복막 종양 병소의 퇴행 또는 소멸 및 복수 관찰;

2. 시험관내 연구에서 획득된 항-종양 효과의 결과의 확증;

3. 처리에 의해 유발된 혈액 독성과 생체조직(tissular) 독성의 평가.

실험 개요

이용된 약물: 검사된 활성 성분

- 이리노테칸^®(또는 CPT-11) : 대조 기준 산물;

- ONCOFID-S: 실시예 1에 따라 제조된, 카르복실(w/w)에서 8%의 에스테르화(esterification) %를 갖는, SN38에 공유 결합된 HA의 에스테르 유도체;

검사된 제약학적 조제물

- 이리노테칸은 가열된(7O℃) 글루코오스 용액에 대략 1시간 동안, 5% w/v로 에 용해되었다.

- 실시예 7에서 기술된 바와 같이 제조된, 글루코오스에 녹인 ONCOFID-S의 용액.

처리된 동물: 36 마리의 7주령 수컷 BDIX 쥐(대략 200 g)가 실험 기준에 따라, 아래의 군(각 군은 12 마리의 동물로 구성된다)으로 분할되었다:

1. 대조 군: DHD/K12/trb 접종.

2. CPT-11 군: DHD/K12/trb 접종 + CPT-11 40 ㎎/㎏ 복막내 처리.

3. ONCOFID-S 군: DHD/K12/trb 접종 + ONCOFID-S 40 ㎎/㎏ 복막내 처리.

14일간의 사육(stabling)후, 1x10⁶개 DHD/K12/trb 세포/쥐가 복막내 접종되었다. 7일후, 4회 치료 주기(therapy cycle)로 구성되는 계획된 치료적 처리가 시작되었다. 이들 동물의 희생은 최종 약리학적 처리후 7일 시점에 실행되었다. 이들 동물은 체중 측정에 의해 독성의 가능 징후의 출현에 대하여, 그리고 복수의 가능 출현에 대하여 주1회 평가되었다. 희생의 시점에서, 모든 동물에서 심장내 샘플링(intracardiac sampling)이 수행되고, 약리학적 처리에 기인한 혈액 독성이 평가되었다. 종양과 복수는 제거되고 측정되었다. 이들 제거된 조직은 조직학적(histological) 평가와 면역조직화학적(immunohistochemical) 평가를 위하여 포르말린(formalin)에서 고정되었다.

결과

복막 암종증의 체적 평가.

종양 결절의 성장 평가가 처리의 종결 시점에서 수행되었다; 도 10에서는 검사의 종결 시점(T28)에서, 종양의 평균 체적이 처리되지 않은 대조 군(15.5 ㎤)과 비교하여, CPT-11 군(5.9 ㎤)에서 처리에 대한 우수한 반응 및 ONCOFID-S 군(1.8 ㎤)에서 더욱 우수한 반응을 나타낸다는 것을 보여준다.

출혈 복수(bloody ascites)의 존재의 평가

출혈 복수는 복강 내에서 종양의 파종(dissemination)에 기인한다; 임상적으로 이는 주로, 위장과 난소 기원의 종양과 연관된다. 악성 복수의 형성을 주도하는 기전은 특히, 림프 배액(lymphatic drainage)의 차단이지만, 복수액(ascitic fluid) 내에서 종양 세포의 농도가 높을 때(> 4,000/mm³), 그들의 존재만으로도 자극 효과를 갖는 화학적 매개인자(사이토킨, 히스타민, 락트산)의 생산으로 복수가 발생할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

도 11에서는 종양 체적의 결과와 완전히 일관되게, 검사의 종결 시점(T28)에서 채취된 출혈 복수(종양)의 평균 체적이 대조 군에서 46.7 ㎖, CPT-11로 처리된 군에서 21.5 ㎖, 그리고 ONCOFID-S로 처리된 군에서 단지 1.9 ㎖이라는 것을 보여준다.

대조 군 및 CPT-11로 처리된 군의 동물 중에서 100%와 83%가 출혈 복수가 발생한 반면, ONCOFID-S로 처리된 군의 동물 중에서 16%만 별로 많지 않은 양의 복수가 발생하였다.

혈액 독성의 평가:

도 12에서는 처리된 동물의 혈구계 프로필(haematocytometric profile)의 분석 결과(T28에서)를 도시한다. 화학치료적 처리에 의해 주로 영향을 받는 백색 혈구(globule) 집단인 과립구(granulocyte)의 값이 표시된다.

복수가 없는, ONCOFID-S로 처리된 군에서는 약리학적 독성으로부터 백혈구 감소(leucopenia)가 기록되지 않는 반면, 별로 많지 않은 복수가 발생한 동물은 정상 범위에 속하는 과립구 총수를 갖고, 따라서 본 발명의 생물접합체의 비-독성을 확증한다.

결론

시험관내 연구로부터 획득된 결과와 일관되게, 이러한 생체내 실험은 유리 약물과 비교하여 HA에 접합된 약물의 효능에서 놀라운 차이를 증명한다. 유도체 ONCOFID-S는 88%(vs CPT-11로 처리된 군에서 62%)의 종양 질량(tumoral mass)에서 평균 감소를 유도할 뿐만 아니라 혈액 독성 데이터 및 종양 진행의 지표인 복수의 체적 측정으로부터, 문제의 처리에 의해 유도된 감소된 약리학적 독성이 관찰된다.

실시예 15

생물접합체 ONCOFID-S의 작용 기전을 평가하기 위한 탈체 연구.

아폽토시스가 아닌 분화 유형의 항-증식성 효과를 나타내는 ONCOFID 유도체의 놀라운 생물학적/약리학적 행태를 확증하기 위하여, 앞서 기술된 바와 같이 유도된 종양이 외식되고 면역조직화학적 연구가 수행된다.

실험 프로토콜

추출 직후에 외식된 이들 종양은 생리 용액으로 조심스럽게 세척되고, 완충된 포르말린으로 고정되고, 파라핀에서 함입을 위하여 가공되고, 4 ㎛의 두께를 갖는 절편으로 절단되었다. 조직학적 분석은 헤마톡실린(haematoxylin)/에오신(eosin)으로 착색된 절편에서 수행되는 반면, 면역학적 분석은 광학 현미경으로 수행될 수 있는 분석을 위하여 페록시다아제(peroxidase)에 결합된 이차 항체의 도움으로 노출되는, 조사 단백질에 대한 특이적인 항체의 이용으로 수행되었다.

결과

복막내 종양의 이러한 탈체 면역조직화학적 분석으로부터, 아폽토시스가 아닌 분화 및 그 결과로서 비-증식성 유형의 효과의 유도를 위한, E-카드헤린-β-카테닌 복합체의 조절에 관한 생물접합체의 작용 기전에서 시험관내에서 획득된 데이터의 확증이 제공되었다.

간단히 말하면, 상기 탈체 분석으로부터 획득된 결과는 아래와 같다:

1) ONCOFID-S로 처리된 동물로부터 외식된 종양에서, 시험관내에서 이용된 세포 모형에서 관찰되었던 것과 완전히 유사한 종양단백질/종양-억제자 복합체의 발현 패턴이 관찰될 수 있는데, 이는 종양 표현형의 정상 표현형으로의 복귀를 지시한다. ONCOFID-S, β-카테닌으로 처리된 동물로부터 외식된 종양에서는 실제로, 핵으로부터 세포-세포 연접(cell-cell junction)으로 이동이 나타나는 반면, APC 단백질과 GSK3β 단백질은 핵 내로 이동한다(도 10).

2) ONCOFID-S로 처리된 동물로부터 외식된 종양에서, 결장 점액의 상피 세포의 분화 마커인 E-카드헤린과 CK20은 시험관내에서 처리된 세포 모형에서 관찰되는 바와 정확히 동일하게, 대조 동물과 비교하여 발현이 증가한다. 이러한 증가된 발현 역시 분화되지 않은 종양 표현형의 분화된 비-종양, 따라서 비-증식성 표현형으로의 복귀를 지시한다(도 13).

결론

결과적으로, 세포 증식을 차단하고, 종양 세포의 변형되지 않은 비-종양 표현형으로의 분화를 촉진하는 ONCOFID 유도체의 특정한 생물학적/약리학적 행태가 생체내에서도 확증된다.

본 발명의 상세한 설명에 비추어, 이들 방법이 다양하게 변형될 수 있음은 명백하다. 이들 변형은 본 발명의 기술적 사상과 견해로부터 일탈로서 간주되지 않으며, 당업자에게 명백한 모든 변형은 아래의 특허청구범위에 포함된다.

Claims

β-카테닌 단백질의 핵내 축적과 연관된 신생물 병리의 치료 또는 APC-GSK-3β 단백질 복합체의 불활성화와 연관된 신생물 병리를 치료를 위한 신생물 세포의 변형되지 않은 비-종양 표현형으로의 분화 작용제(differentiating agent)의 제조에 이용되는, 항종양 약물에 결합된 히알루론산으로 구성되는 생물접합체(biocongugate)를 포함하는 약학 조성물에 있어서,
이때 상기 신생물 병리는 유방종양, 피부종양, 골종양, 뇌종양, 갑상선종양, 두경부종양, 임파계 종양, 폐종양, 중피종양, 식도종양, 위종양, 결장직장, 췌장종양, 간종양, 신장신장, 요관과 방광종양, 전립선종양, 자궁내막과 난소종양에서 선택되며;
상기 생물접합체는 항종양 약물에 결합된 히알루론산으로 구성되며;
상기 항종양 약물은 SN38(도2 참고)과 독소루비신에서 선택되며,
이때 SN38은 이리노테칸의 활성 대사물질로써, 4-브로모부틸산으로 구성된 스페이서를 통하여 히알루론산에 공유적으로 결합하여 히알루론산과 함께 에스테르 결합을 형성하고, 히알루론산의 카르복실에서 SN38의 치환도(substitution degree)는 3.5% 내지 8%이며;
이때 독소루비신은 브로모부탄올 또는 브로모프로판올에서 선택된 스페이서를 통하여 히알루론산에 공유적으로 결합하여 히알루론산과 함께 에스테르 결합을 형성하고, 히알루론산의 카르복실에서 독소루비신의 치환도(substitution degree)는 3% 내지 20%가 되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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청구항 1에 있어서, 결장-직장 종양 치료용 약제 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 흑색종의 치료를 위한 약제의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 전신 투여, 국소 투여, 또는 종양 부위 내로 직접 주입에 적합한 약제의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 10에 있어서, 투여는 정맥내 또는 동맥, 근육내, 경피, 복막내, 척수내, 림프내 적용, 기관내 적하(endotracheal instillation)에 의한 적용, 피하, 경구 또는 국소-부위 적용에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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청구항 1에 있어서, 히알루론산은 400 내지 3x10⁶Da 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 18에 있어서, 히알루론산은 5,000 내지 1x10⁶ Da 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 19에 있어서, 히알루론산은 30,000 내지 0.5x10⁶ Da 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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청구항 1에 있어서, β-시클로덱스트린 또는 리포좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 제약학적 조성물.
청구항 27에 있어서 β-시클로덱스트린을 1.5% w/v로 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 제약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 제약학적 조성물.
청구항 29에 있어서, 5% w/v로 존재하는 글루코오스 용액 안에 생물접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 제약학적 조성물.