ITPD20080125A1 - Uso terapeutico di nuove preparazioni farmaceutiche contenenti farmaci antitumorali legati all'acido ialuronico nel trattamento delle neoplasie - Google Patents
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Description
Descrizione di una domanda di brevetto industriale dal titolo "Uso terapeutico di nuove preparazioni farmaceutiche contenenti farmaci antitumorali legati all'acido ialuronico nel trattamento delle neoplasie"
OGGETTO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione descrive il nuovo utilizzo come agenti differenzianti in campo oncologico, di bioconiugati ottenuti dalla coniugazione tra l'acido ialuronico (HA) ed un chemioterapico (identificati con il marchio ONCOFID<®>) tra cui, in modo particolare, ririnotecan, la Doxorubicina, il Paclitaxel e il 5-Fluorouracile; in particolare viene descritto il comportamento biologico in termini di meccanismo d'azione, efficacia e tollerabilità di preparazioni farmaceutiche solubili in acqua di derivati ONCOFID<®>.
Più specificatamente, l'invenzione riguarda il sorprendente effetto biologico e farmacologico dimostrato da formulazioni a base di ONCOFID-S (coniugati HA-SN38) e ONCOFID-D (coniugati HA-Doxorubicina), nel promuovere la differenziazione di cellule tumorali verso un fenotipo non trasformato, in comparazione al farmaco di riferimento Irinotecan (o CPT11 la cui forma attiva è rappresentata dall'SN38) e Doxorubicina.
CAMPO DELL'INVENZIONE
In questi ultimi anni, la progressiva conoscenza dei processi vitali che determinano l'inizio, lo sviluppo, la disseminazione e l'impianto di un tumore e delle sue metastasi, ha offerto agli studiosi non solamente la possibilità di studiare, sintetizzare e/o sperimentare nuove molecole chimiche come nuovi agenti anti-tumorali, ma ha facilitato lo studio e il perfezionamento di nuove terapie di cura che permettono il superamento delle problematiche legate alla tossicità dei farmaci antineoplastici. Infatti, molti dei farmaci ad attività antitumorale generalmente presentano una serie di caratteristiche negative quali:
-scarsa solubilità in acqua, in quanto molte molecole sono sostanze idrofobiche di difficile somministrazione;
-scarsa selettività verso le cellule tumorali con conseguente tossicità verso cellule non cancerogene;
-molteplicità di effetti indesiderati a livello sistemico;
-bassa emivita piasmatica, con conseguente necessità di ripetute somministrazioni;
-induzione della resistenza al trattamento chemioterapico nel tumore.
Π mondo scientifico, oltre a ricercare nuovi principi attivi sempre più efficaci in terapia oncologica, parallelamente cerca di sfruttare al meglio molecole di cui è già nota l'attività antiblastica, migliorandone le prestazioni e cercando di ridurne le caratteristiche negative, come sopra scritto.
Una delle strategie più adottate per la riduzione della tossicità intrinseca dei farmaci antitumorali è legata alla possibilità di guidare il principio attivo direttamente e selettivamente alla cellula tumorale.
Un promettente approccio è offerto dalla coniugazione chimica dell' antitumorale a gruppi dotati di targeting attivo i quali, interagendo specificatamente con i siti recettoriali della cellula neoplastica, garantiscono un'elevata selettività del farmaco nei tessuti tumorali; un diverso approccio è rappresentato dell legame a macromolecole (i.e. polimeri) che, conferendo un alto peso molecolare, consente un maggiore accumulo del principio attivo nelle neoplasie per effetto EPR (Enhanced Ritendon and Permeation), ovvero un accumulo legato al passaggio attraverso l'epitelio fenestrato dei vasi che irrorano il tumore ( targeting passivo) scarsamente drenato dell sistema linfatico.
Da diversi anni, molti farmaci antitumorali utilizzati in campo oncologico sono stati chimicamente modificati per ottenerne dei prodrug, derivati terapeuticamente inattivi che diventano attivi solamente in vivo, grazie a spontanei processi di idrolisi e/o degradazioni enzimatiche che portano alla liberazione del prindpio attivo aumentandone così l'efficada terapeutica.
La solubilità dei farmaci chemioterapici nel letto circolatorio rappresenta la condizione essenziale per il loro effetto farmacologico. Infatti, alcuni farmaci dimostratisi estremamente attivi in varie tipologie di tumori come, ad esempio, le Camptotecine, il Paclitaxel e gli alcaloidi derivati della Vinca, per la loro elevata insolubilità presentano problemi di somministrazione intravenosa (e, per ormoni ed anti-ormoni anche intramuscolare) che possono limitarne e restringere l'applicazione clinica. Per le motivazioni precedentemente elencate sono stati sintetizzati nuovi farmaci chemioterapici che nascono dal legame chimico (diretto o indiretto tramite uno spaziatore) fra il farmaco classico e i cosiddetti "polimeri terapeutici", che oltre a conferire importanti caratteristiche chimico-fisiche al principio attivo (come una maggior solubilità), sono in grado di conferirgli un targeting attivo e/o passivo potenziandone l'efficacia. Tèdi polimeri terapeutici possono infatti avere la funzione di carrier per il farmaco, oppure possono anche esibire un'attività biologica intrinseca. Fra questi polimeri, molto promettente si è mostrato l'utilizzo dell'acido ialuronico (HA), le cui caratteristiche favorevoli ne fanno un adeguato carrier per la somministrazione di antineoplastici.
I nuovi bioconiugati di HA e antitumorali, identificati con il marchio ONCOFID<®>(W 02004035629 e W02007014784) noti alla stato dell'arte, rivendicano le seguenti caratteristiche :
• superamento del problema relativo alla tossicità intrinseca del farmaco in quanto guidato direttamente alla cellula tumorale, poiché molti fenotipi tumorali over-esprimono sulla loro superficie cellulare il recettore CD-44 specifico per l'HA.
• Aumento della solubilità, poiché è stato dimostrato come il legame di farmaci liposolubili a molecole fortemente idrofiliche quelli ΓΗΑ, aumenti notevolmente la solubilità del farmaco stesso nel torrente circolatorio.
• Superamento del problema della resistenza indotta dai farmaci antitumorali classici.
• Nuove caratteristiche chimico-fisiche (come, ad esempio, l'aumento della stabilità del farmaco e quindi Γ aumento della sua permanenza nel sito tumorale).
L'SN-38 è il metabolita attivo dell'Irinotecan, derivato farmacologico della Camptotecina, il cui utilizzo riguarda il trattamento di diversi tipi di tumori quali il melanoma, il tumore mammario, l'ovarico, il tumore gastrico, polmonare, cervicale, pancreatico e del colon-reto. Questo farmaco presenta un'elevata attività antitumorale ma non può essere somministrato come tale in quanto non solubile in acqua e, per questo motivo, è stato coniugato chimicamente all' HA.
Il tumore del colon-retto è uno dei più aggressivi e rappresenta una delle più frequenti cause di morte per neoplasia nei paesi occidentali.
L'insorgenza del cancro del colon-retto è dovuta alla proliferazione incontrollata delle cellule della mucosa che riveste quest'organo, la sua eziologia è ancora oggi sconosciuta, anche se studi epidemiologici hanno identificato possibili fattori di rischio, quelli:
abitudini alimentari
fatori genetici
polipi neoplastici
malattìe infiammatorie intestinali.
E' noto che uno dei fattori biologici prognostici del carcinoma e dell' adenoma del colon retto è il gene APC (Adenomatous Polvposis Colli. Ritenuto responsabile della poliposi colica familiare, mutazioni somatiche di tale gene rappresentano il primo evento nella storia naturale dell' adenoma e del carcinoma del colon.
In condizioni normali (in assenza di neoplasie), il gene APC è localizzato sul cromosoma 5 e codifica per una proteina citoplasmatica (APC protein) che riveste un ruolo chiave nella regolazione dell'apoptosi, del ciclo cellulare, dell'interazione ed adesione inter-cellulare, dei processi di migrazione nonché della metastatizzazione del tumore. La funzione meglio conosciuta dell' APC protein è la sua associazione alla GSK-3p protein (glycogen-synthetase kinase 3 β protein) per la regolazione della quantità di β-catenina libera presente nel citoplasma e quindi nel nucleo: infatti, le suddette proteine, fosforilando la β-catenina libera a livello citoplasmatico, ne promuovono la degradazione. La β-catenina è una proteina capace di legarsi al dominio citoplasmatico di una proteina di membrana, la E-caderina, coinvolta nel processo di adesione cellulare. La distruzione del complesso intra-cellulare E-caderina-p-catenina (evento associato alla conversione di una cellula non tumorale in neoplastica), determina la perdita della capacità di adesione inter-cellulare e facilita quindi la formazione di metastasi. Molte sono le evidenze scientifiche che indicano come questo processo avvenga sia nelle prime fasi che nella progressione di diverse neoplasie, come per il tumore alla mammella, alla pelle (in particolare il melanoma!, alle ossa, al cervello, alla tiroide e nei tumori testa-collo, al sistema linfatico, al polmone e nel mesotelioma, all'esofago, allo stomaco, al colon, al pancreas, al fegato, al rene, agli ureteri e alla vescica, alla prostata, all'endometrio e ovaio (con tutti gli altri organi addominali). A dimostrazione di quanto affermato, esperimenti effettuati per il ripristino della normale sintesi/ espressione della E-caderina in linee cellulari tumorali, hanno evidenziato la reversione della forma tumorale maligna vs un fenotipo non trasformato, quindi non più neoplastico (Birchmeier W. et al., Biochim Biophys Acta, 1994, 1198(1):11-26; De Vita V. et al., CANCER, , 6th Edition, 2001, Chapter 8) .
In molti carcinomi, una mutazione del gene APC determina la formazione di un APC protein anomala, incapace di legare e pertanto regolare la βcatenina che, quindi, dal citoplasma migra nel nucleo dove si accumula e forma complessi con fattori di trascrizione (come il Tcf-4) fungendo da coattivatore di oncogeni attivatori di crescita e proliferazione cellulare (c-MYC, qfclin DI), nonché di proteasi extracellulari (MMP7), che facilitano i processi di invasione e metastasi (vedi figura 1). La β-catenina presenta quindi tutte le caratteristiche di una oncoproteina, mentre il complesso APC/GSK-3p, per la sua capacità di regolazione dell'attività della βcatenina, è definito come onco-soppressore (Kollings F. et al, Digestion, 2002, 66:131-144). Infatti, la rapida doxvnregulation della β-catenina accumulata nel nucleo è ottenuta grazie all'azione di APC (quando non mutato) e GSK-3P proteine che traslocando nel nucleo legano l'oncoproteina degradandola e/o la trasportano nuovamente a livello citoplasmatico dove viene fosforilata, quindi degradata (Neufeld K. et al., EMBO reports, 2000, 1, 6:519-523). Questo processo è assente nelle cellule tumorali dove, quindi, la non-regolazione della quantità nucleare e dell'attività della β-catenina risultano eventi di primaria importanza nello sviluppo e nella metastatizzazione delle neoplasie maligne.
La chemioterapia svolge un ruolo fondamentale nella cura del tumore. Nella gestione dei pazienti affetti da carcinoma del colon retto in fase metastatica sono state impiegate diverse modalità terapeutiche: la chemioterapia sistemica, la chemioterapia locoregionale, le terapie ablative e la chirurgia.
Il trattamento chemioterapico rappresenta il fulcro delle possibilità terapeutiche disponibili in questo gruppo di pazienti. Le percentuali di risposta obiettiva ottenute con la chemioterapia sono pari al 20% con una breve durata di risposta ed una bassa percentuale di risposte complete (solo il 5%); le stabilizzazioni di malattia rappresentano circa il 30-40%.
Il 5-FU è stato per oltre 40 anni l'unica arma terapeutica disponibile nel carcinoma del colon retto in fase avanzata
Negli ultimi anni nuovi farmaci sono stati studiati in associazione o meno con il 5-FU per cercare di migliorare la sopravvivenza in pazienti affetti da adenoma e carcinoma metastatico del colon-retto. Tra questi l'Irinotecan e l'Oxaliplatino rivestono un ruolo fondamentale. L'Irinotecan in associazione con il 5-FU, recentemente ha mostrato percentuali di risposte obiettive e tempo alla progressione maggiori rispetto ai pazienti trattati con solo 5-FU con una sopravvivenza globale di circa 17 mesi.
L'Irinotecan, anche noto come CPT-11, è disponibile sotto forma di idrocloruro, agisce formando un complesso ternario farmaco-DNA-topoisomerasi I, enzima che converte una molecola di DNA superawolta in una priva di tensione torsionale nelle operazioni di trascrizione o replicazione del DNA. La formazione del complesso ternario con la suddetta camptotecina crea una stabilizzazione del sistema nella fase di taglio del DNA e fa sì che la cellula non sia più in grado di duplicarsi determinandone la morte per apoptosi.
L'Irinotecan è di per sé inattivo, ma l'idrolisi in vivo del legame carbammico, porta alla liberazione del metabolita attivo SN38 (figura 2) che è il reale farmaco responsabile dell'azione citotossica, ma che essendo insolubile in acqua necessita di particolari accorgimenti per la sua somministrazione.
Nella presente invenzione, la Richiedente descrive il nuovo comportamento biologico e farmacologico dei coniugati HA-antitumorali identificati con il marchio ONCOFID<®>- descritti in W02004035629 e W02007014784, comportamento diverso da quello mostrato dai farmaci di riferimento non coniugati, con il conferimento di nuove caratteristiche terapeutiche e farmacodinamiche.
La presente invenzione quindi descrive e rivendica il sorprendente e inaspettato effetto biologico e farmacologico ottenuto da formulazioni a base di ONCOFID<®>nel promuovere un'azione terapeutica antiproliferativa (quindi antitumorale) dovuta alla differenziazione /reversione delle cellule tumorali verso un fenotipo non trasformato, piuttosto che all'induzione dell' apoptosi.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE E' noto che i derivati ONCOFID<®>, come precedentemente riportato, conferiscono vantaggiose caratteristiche ai farmaci antitumorali, quali solubilità in acqua, stabilità, selettività nei confronti dei tessuti tumorali, riduzione della resistenza al chemioterapico e potenziamento dell'efficacia farmacologica.
E' noto che uno dei tumori mortali più diffusi è rappresentato dal carcinoma o dall' adenoma colon-rettale e che una delle terapie più efficaci nel trattamento di questa neoplasia è quella a base di CPT-11 per via intraperitoneale. Come sopra riportato, è noto che in questa tipologia di tumori la mutazione del gene APC comporta una cascata di eventi che si risolvono nell'accumulo nucleare di β-catenina e, quindi, nell'attivazione di fattori di trascrizione che facilitano l'invasione cellulare e le metastasi. La presente invenzione descrive e rivendica il nuovo utilizzo terapeutico in campo oncologico di nuove formulazioni a base di ONCOFID<®>, e in modo particolare di ONCOFID-S, rappresentato dal bioconiugato HA-SN38, e di ONCOFID-D, rappresentato dell bioconiugato FIA-Doxorubidna.
Formulazioni a base di ONCOFID-S e di ONCOFID-D contenenti determinate concentreizioni dei suddetti bioconiugati, hanno infatti dimostrato sorprendenti e del tutto inaspettati risultati nel tratamento di tumori colon-rettali e del melanoma sia in vitro che in vivo, con un meccanismo di azione completamente diverso dal feirmaco non coniugato permettendo, quindi, un uso diverso del bioconiugato poiché particolarmente efficace a dosaggi diversi da quelli ad oggi considerati terapeuticamente attivi.
La valutazione degli effetti sulla proliferazione cellulare riportati nell'Esempio 8 hanno sorprendentemente rivelato come ONCOFID<®>determini un meccanismo di blocco della proliferazione cellulare imputabile ad un effetto differenziativo della cellula neoplastica che, quindi, subisce un processo di reversione dal fenotipo di cellula neoplastica maligna verso un fenotipo non trasformato, cioè non tumorale, mediante :
1. regolazione dell'azione del complesso proteico APC/ GSK-3p 2. regolazione dei processi relativi all'azione della β-catenina e della E-caderina, ristabilendo così quella capacità d'adesione cellulare e d'inibizione da contatto propria di una cellula differenziata non trasformata, non inducendo, quindi, la morte della cellula tumorale per apoptosi (come invece noto per TSN38). A conclusione del proprio ciclo cellulare, le suddette cellule muoiono senza aver originato nuove metastasi e senza aver contribuito all' accrescimento della neoplasia.
Inoltre, la sperimentazione in vivo descritta nell'Esempio 11 chiaramente dimostra la maggiore efficacia anti-tumorale dei coniugati ONCOFID-S rispetto al farmaco non coniugato, a parità di dose somministrata.
Come mostrato nei risultati, l'utilizzo del farmaco in oggetto come nuova terapia farmacologica nelle neoplasie, è possibile in quanto il coniugato HA-SN38 determina una notevole riduzione della tossicità sistemica dell'SN38, aumentando così l'indice terapeutico del farmaco stesso, essendo:
solubile in acqua;
maggiormente efficace a dosi decisamente inferiori a quelle normalmente utilizzate nei protocolli clinici.
Il suddetto farmaco può essere somministrato in modo sistemico (per via endovenosa o arteriosa, intramuscolare, intraperitoneale, intralinfatica, sottocutanea oppure orale), intratecale, può essere utilizzato per una applicazione topica (con un assorbimento transdermico oppure per istillazione endo-tracheale,), o essere somministrato direttamente nel sito tumorale per iniezione diretta (trattamento loco regionale).
La Richiedente, negli esempi che seguono, ha dimostrato come la preparazione di coniugati HA con antitumorali quali SN38 (ONCOFID-S) e Doxorubicina (ONCOFID-D), con un grado di derivatizzazione dal 1 al 20% peso/peso, porti a derivati ONCOFID solubili ed efficaci in soluzioni acquose alla concentrazione da 2 a 15 mg/ mi.
In particolare la Richiedente ha dimostrato, mediante studi sperimentali in vitro eseguiti utilizzando linee cellulari tumorali di adenocarcinoma del colon e di melanoma umano (necessari alla comprensione del meccanismo di azione), un comportamento biologico e farmacologico dei suddetti bioconiugati del tutto inaspettato. Da questi dati si evince che il blocco della proliferazione cellulare avviene con un meccanismo diverso da quello apoptotico proprio del farmaco di riferimento, rendendo così il derivato ONCOFID<®>un farmaco con una nuova attività terapeutica e un'efficacia decisamente superiore ottenuta con differenti dosaggi, per il trattamento di neoplasie quali il tumore alla mammella, alla pelle (e in particolare il melanoma), alle ossa, al cervello, alla tiroide e nei tumori testa-collo, al sistema linfatico, al polmone e nel mesotelioma, all'esofago, allo stomaco, al colon, al pancreas, al fegato, al rene, agli ureteri e alla vescica, alla prostata, all'endometrio e ovaio (con tutti gli altri organi addominali). A dimostrazione di ciò, la Richiedente riporta i risultati degli studi ex-vivo ottenuti dai tessuti espiantati dopo somministrazione in vivo dei coniugati, e i risultati degli studi in vivo che hanno rivelato la sorprendente capacità di inibizione tumorale dell'ONCOFID<®>.
ONCOFID<®>(come precedentemente descritto) identifica una nuova classe di bioconiugati a base di Acido Ialuronico (HA) e farmaci antitumorali covalentemente legati attraverso imo spaziatore, che comprendono:
• antimetaboliti: come, ad esempio, analoghi dell'acido folico (tra cui il methotrexate), analoghi della pirimidina (tra cui il 5-fluorouracile e Ι-β-D-Arabino-furanosylcytosine: Ara-C), • alcaloidi/NflfarflZ products : come, ad esempio, vincristina e vinblastina (alcaloidi della Vinca), il metabolica attivo dell'irinotecan: SN38, i Taxani: paclitaxel e docetaxel, • antibiotici ed analoghi: come, ad esempio, doxorubicina e epirubicina,
• modificatori della risposta biologica,
• diterpenoidi,
• nitrosouree,
• ormoni e antiormoni sintetici: come, ad esempio, l'estradiolo.
Particolarmente adatti agli scopi della presente invenzione sono la doxorubicina, il paclitaxel ed il metabolica dell'irinotecan, SN38.
L'acido ialuronico impiegato nella presente invenzione ha un peso molecolare variabile tra 400 e 3.000.000 Da, preferibilmente compreso tra 5.000 e 1.000.000 Da, e ancor più preferibilmente tra 30.000 e 500.000 Da; può essere di origine estrattiva, fermentativa o biosintetica. Il legame covalente con lo spaziatore coinvolge il gruppo carbossilico dell'acido D-glucuronico dell'unità ripetitiva del polimero, in una percentuale variabile tra 1 e 100% (grado di sostituzione), che forma un legame estereo o ammidico con il gruppo funzionale dello spaziatore molecolare scelto che quindi funge da collegamento tra l'acido ialuronico e il chemioterapico. L'agente spaziatore è costituito da una catena alifatica, arilalifatica, aliciclica, o eterociclica, lineare o ramificata contenente o meno eteroatomi, che comprende gruppi ossidrilici, carbossilici, carbonilici, amminici (con esclusione delle idrazidi e di polipeptidi), gruppi epossidici, cloruri degli acidi, tioli, nitrili, alogeni, anidridi, isocianati, e isotiocianati; risultano preferiti i bromuri, gli ioduri e cloruri di acidi carbossilici con catena alifatica da C2 a CIO, ed in particolare i bromuri come l'acido bromo propionico, l'acido bromo butirrico, il bromobutanolo o il bromopropanolo. Il grado di sostituzione è preferibilmente compreso tra 1 e 50% peso/peso, e ancor più preferibilmente tra 1 e 25%; per la coniugazione con doxorubicina è preferibile una sostituzione tra 3 e 20% mentre per SN38 tra 1 e 15% peso/ peso.
In particolare l'ONCOFID-P è il coniugato fra HA e Paclitaxel, l'ONCOFID-S è il coniugato fra HA e SN38 e l'ONCOFID-D è il coniugato fra HA e Doxorubicina.
Più specificatamente, l'ONCOFID-S è il derivato estereo di HA (avente un peso molecolare di 200 kDa), e SN38 previamente legato ad imo spaziatore a quattro atomi di carbonio come l'acido bromo butirrico. Il grado di sostituzione può variare dal 1 al 15% in base al rapporto molare usato durante le fasi di sintesi.
La sintesi dell'ONCOFID-S è stata ampiamente descritta nella descrizione dettagliata e negli esempi 1-2 di W02007014784.
L'ONCOFID-D è un estere dell'acido ialuronico con uno spaziatore come il bromobutanolo o il bromopropanolo, a sua volta legato alla doxorubicina mediante un legame carbammico.
Anche la sintesi delTONCOFID-D è stata ampiamente descritta nella descrizione dettagliata e nell'Esempio 10 di W02007014784.
L'ONCOFID-P è stato ampliamente descritto precedentemente in W02004035629.
Infine, la Richiedente descrive la preparazione di diverse formulazioni farmaceutiche acquose in cui i bioconiugati in oggetto sono risultati essere particolarmente solubili, ma soprattutto di formulazioni che permettono la somministrazione dei principi attivi a dosi terapeuticamente attive senza problematiche legate alla biodisponibilità/ solubilità dei farmaci in oggetto, contribuendo, quindi, con le nuove proprietà chimico/ fisico/ terapeutiche sopra descritte e di seguito dimostrate, ad aumentarne l'efficacia.
A scopo puramente descrittivo e non limitativo vengono di seguito riportati alcuni esempi di preparazione dei formulati ONCOFID e alcuni esempi di studi in vitro, ex vivo e in vivo che dimostrano il singolare comportamento biologico dei coniugati sopra descritti:
Esempio 1
Preparazione di un derivato estereo dell'acido ialuronico di PM 200 kDa e SN-38 con un grado di sostituzione di circa 8%
Primo step: 500 mg di SN-38 vengono disciolti in DMF. Successivamente vengono aggiunti 0.8866 g di EDC, 0.7011 di acido 4-Bromobutirrico e infine 0.1163 g di DMAP.
La reazione viene monitorata tramite TLC (Silica gel 60 F254), usando una miscela CHCI3/CH3CN 60/40.
Dopo circa Ih la reazione si ritiene conclusa e vengono aggiunti 10 mi di metanolo e si lascia ad agitare per circa 30'. Successivamente il prodotto viene precipitato in acqua, filtrato, ripreso in CHCI3, e lavato con H2O, leggermente acidificata con HC1 (pH » 4), mediante imbuto separatore. Le fasi organiche tirate a secco danno un prodotto giallino che viene purificato in una colonna cromatografica a gravità ed eluita a gradiente, da CHCI3 100% a CHCI3/CH3OH 95:5.
Il BrC4SN38 recuperato viene tirato a secco al rotavapor e lasciato a seccare per una notte.
Secondo step: in un reattore a tre colli, munito di camicia di termostatazione e ancoretta magnetica si introducono 1.4347 g di HATBA (200 kDa) (sale di tetraalchilammonio o tetrabutilammonio dell'acido ialuronico) che vengono disciolti in 100 mi di DMSO; si lascia ad agitare fino a completa dissoluzione, termostatando il reattore a 38 °C.
380 mg di intermedio BrC4SN38 sciolti in DMSO vengono aggiunti alla soluzione di HATBA e si lascia in agitazione per circa 48 ore a 38 °C.
Al termine della reazione vengono aggiunti 14 mi di una soluzione satura di NaBr e si lascia ad agitare per circa 60 minuti in modo da completare lo scambio di cationi TBA-Na e ottenere HA sodico. Si procede quindi alla precipitazione con Etanolo; il solido ottenuto viene recuperato mediante filtrazione su Gooch 4 e trasferito in un becker per i successivi lavaggi con Etanolo per essere infine seccato sotto vuoto a 40°C.
Esempio 2
Preparazione di un derivato estereo dell'acido ialuronico di PM 200 kDa e SN-38 con un grado di sostituzione di circa 3,5%
Primo step: 199 mg di SN-38 sono sciolti in 100 mi di ACN e alla soluzione sono aggiunti 383 mg di l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimmide (EDC), 258 mg di acido-4-bromobutirrico e 60 mg di DMAP. H procedere della soluzione viene monitorato mediante cromatografia TLC (fase stazionaria silice con indicatore di fluorescenza e eluente cloroformio -acetonitrile 60:40). Il prodotto viene recuperato mediante eliminazione del solvente al rotavapor e purificato per cromatografia su colonna di silice. L'intermedio così ottenuto, è seccato a temperatura ambiente sotto alto vuoto e infine pesato.
Secondo step: 160 mg di intermedio BrC4SN38 vengono sciolti in 20 mi di NMP e successivamente aggiunti ad una soluzione di HATBA 1.2 g in 120 mi di NMP previamente termostatati a 38°C. La miscela viene lasciata a 38°C per 72h e poi diluita con 5 mi di acqua e 8 mi di satura di sodio bromuro. Il tutto viene lasciato in agitazione per 1 ora per permettere lo scambio del sodio con lo ione TBA. Successivamente il prodotto viene precipitato mediante aggiunta goccia a goccia di etanolo e infine purificato mediante lavaggi in etanolo e seccato sotto vuoto a 40°C.
Esempio 3
Preparazione di un derivato estereo dell'acido ialuronico di PM 200 kDa e Doxorubicina con un grado di sostituzione di circa 10%
Primo step: 770 mg di Doxorubicina cloridrato vengono pesati e solubilizzati in 120 mi di DMF anidra in presenza di 770 pi di trietilammina, successivamente vengono aggiunti 560 mg di 3-bromobutanolo, previamente attivati con N-idrossisuccinimide. La reazione viene monitorata mediante cromatografia TLC (fase stazionaria silice con indicatore di fluorescenza e eluente cloroformio - etanolo 80:20) e si ritiene conclusa dopo 15 minuti. Il prodotto viene precipitato in acqua demineralizzata e viene recuperato mediante filtrazione su Gooch 5. H residuo solido, ripreso in CHC13, viene lavato con H2O, leggermente acidificata con HG (pH » 4), mediante imbuto separatore.
Le fasi organiche tirate a secco danno un prodotto rosso scuro che viene caricato in una colonna cromatografica a gravità ed eluita a gradiente, da CHCI3100% a CHCI3/CH3CH2OH 95:5, per la purificazione.
L'intermedio BrC30Dox recuperato viene tirato a secco al rotavapor e lasciato a seccare per ima notte.
Secondo step: in un reattore a tre colli, munito di camicia di termostatazione e ancoretta magnetica si introducono 964 mg di HATBA (200 kDa) che vengono disciolti in 100 mi di DMSO; si lascia ad agitare fino a completa dissoluzione, termostatando il reattore a 38 °C.
550.5 mg di intermedio BrC30Doxo sciolti in DMSO vengono aggiunti alla soluzione di HATBA; la reazione viene mantenuta sotto agitazione per circa 48 ore a 38 °C.
Al termine della reazione vengono aggiunti 8 mi di una soluzione satura di NaBr goccia a goccia e si lascia ad agitare per circa 30 minuti in modo da completare lo scambio di cationi TBA-Na e ottenere HA sodico. Si procede quindi alla precipitazione con Etanolo; il solido ottenuto viene recuperato mediante filtrazione su Gooch 4 e trasferito in un becker per i successivi lavaggi con Etanolo per essere infine seccato sotto vuoto a 40°C.
Esempio 4
Preparazione farmaceutica a base di ONCOFID-S in soluzione di β-ciclodestrine alVl, 5% pfo.
62 mg di ONCOFID-S, ottenuto come riportato precedentemente , con un grado di sostituzione sui residui carbossilici dal 3 al 15% p/p, sono sciolti in 22 mi di soluzione acquosa contenente Γ 1.5% p/v di β-ciclodestrine. La soluzione viene lasciata sotto agitazione con un agitatore magnetico fino a completa dissoluzione del coniugato, successivamentee viene filtrata su filtri sterilizzanti in cellulosa rigenerata (RC) per siringa da 0.22 pm. Il titolo della soluzione (2.8 mg/ mi in ONCOFID-S) viene determinato per via spettrofotometrica prima e dopo filtrazione per accertare un recupero totale del coniugato dopo filtrazione
Esempio 5
Preparazione farmaceutica a base di ONCOFID-S in soluzione di glucosio al 5% pfo.
56 mg di ONCOFID-S, ottenuto come riportato precedentemente, con un grado di sostituzione sui residui carbossilici dal 3 al 15% p/p, sono sciolti in 20 mi di soluzione acquosa contenente il 5% p/v di glucosio. La soluzione viene lasciata sotto agitazione con un agitatore magnetico fino a completa dissoluzione del coniugato, successivamente viene filtrata su filtri sterilizzanti in cellulosa rigenerata (RC) per siringa da 0.22 pm. Il titolo della soluzione (2.8 mg/ mi in ONCOFID-S) viene determinato per via spettrofotometrica prima e dopo filtrazione per accertare un recupero totale del coniugato dopo filtrazione.
Esempio 6
Preparazione farmaceutica a base di ONCOFID-P in soluzione di glucosio al 5% p/o.
100 mg di ONCOFID-P, ottenuto come riportato negli Esempi 5, 6, 7, 9 e 10 del brevetto W02004035629, sono sciolti in 20 mi di soluzione acquosa contenente il 5% p/v di glucosio. La soluzione viene lasciata sotto agitazione con un agitatore magnetico fino a completa dissoluzione del coniugato, successivamentee viene filtrata su filtri sterilizzanti in cellulosa rigenerata (RC) per siringa da 0.22 pm. Il titolo della soluzione (5 mg/ mi in ONCOFID-P) viene determinato per via spettrofotometrica prima e dopo filtrazione per accertare un recupero totale del coniugato dopo filtrazione.
Esempio 7
Preparazione farmaceutica a base di ONCOFID-D in soluzione glucosata al 5% p/o.
60 mg di ONCOFID-D, ottenuto come riportato precedentemente, con un grado di sostituzione sui residui carbossilici dal 3 al 15% p/p, sono sciolti in 20 mi di soluzione acquosa contenente il 5% p/v di glucosio. La soluzione viene lasciata sotto agitazione con un agitatore magnetico fino a completa dissoluzione del coniugato; successivamente viene filtrata su filtri sterilizzanti in cellulosa rigenerata (RC) per siringa da 0.22 pm. Il titolo della soluzione (3 mg/ mi in ONCOFID-D) viene determinato per via spettrofotometrica prima e dopo filtrazione per accertare un recupero totale del coniugato dopo filtrazione.
Esempio 8
Sperimentazione in vitro del bioconiugato ONCOFID-S in modelli preclinici di adenocarcinoma del colon
Lo scopo della sperimentazione in vitro è principalmente quello di definire il profilo di attività dei bioconiugato costituito da HA legato all'SN38 preparato nell'Esempio 2 formulato in soluzione acquosa, per valutare/ comparare l'attività antineoplastica dei derivati ONCOFID vs i farmaci di riferimento, determinandone così la potenza farmacologica relativa all' antineoplastico di confronto e il meccanismo di azione.
Schema sperimentale:
Prodotti testati: principi attivi sperimentati
SN38 : prodotto di riferimento di controllo;
ONCOFID-S : derivato estereo dell'HA covalentemente legato aH'SN38 con ima % di esterificazione al carbossile (p/ p) del 3.5% Preparazioni farmaceutiche sperimentate
L'SN38 è stato sciolto in una miscela costituita da DMSO/CH3CN/EtOH (10:45:45) a temperatura ambiente.
Soluzione di ONCOFID-S in β-ciclodestrine: preparata come riportato nell'esempio 4
Linee cellulari utilizzate
Cellule di adenocarcinoma del colon del ratto DHD/K12/Trb esprimenti il recettore per l'FIA CD44
Protocollo sperimentale
1) la linea cellulare in esame viene piastrata alla concentrazione di 6x1 0<4>cellule per cm<2>, in piastre da 24 pozzetti a fondo piatto
2) 24 ore dopo, alle cellule vengono addizionate le soluzioni da testare opportunamente diluite nel mezzo di coltura
3) Dopo 24 o 48h dal trattamento la vitalità cellulare viene valutata con il metodo di esclusione del Tripan blue, colorante che viene estruso dalle cellule vitali e metabolicamente attive, trattenuto invece dalle cellule morte che si colorano in blu.
Risultati
I risultati ottenuti in termini di vitalità delle cellule DHD/K12/Trb in funzione della dose, nonché i valori di IC50 del nuovo coniugato ONCOFID-S in comparazione a quella dell'SN38 non coniugato dopo 24h di trattamento, hanno mostrato una maggiore efficacia di ONCOFID-S rispetto alTSN38. Le IC50 delTSN38 tal quale e dell'ONCOFID-S sono state trovate rispettivamente di 1.4 ini e 0.4 pj^ml. Considerando che il coniugato ONCOFID-S in oggetto era derivatizzato al 3.5% in peso in SN38, la IC50 delTSN38 equivalente (coniugato all'FIA) risulta ancora più bassa (0.014 p{^ml,) ovvero 100 volte più attivo del farmaco di riferimento, confermando un potenziamento della sua efficacia farmacologica quando viene coniugato all'acido ialuronico.
In Figura 3 è riportato il grafico di vitalità cellulare in funzione del tempo dopo trattamento con HA, SN38 o ONCOFID-S alla concentrazione di 0.5 pg/ml.
Data l'importanza del ruolo di regolazione della fi-catenina nell'insorgenza e nella progressione del carcinoma colon-rettale, si è inteso verificare se il trattamento con Qncofid-S è in grado di modificare l'espressione e la distribuzione intracellulare delle molecole coinvolte nel processo di controllo della suddetta proteina, come precedentemente descritto. E' stato quindi analizzato l'effetto del trattamento con ONCOFID-S sulla distribuzione intracellulare di E-caderina, fi-catenina, GSK-3fi a APC nelle cellule DHD/Trb mediante microscopia a fluorescenza. Sono stati utilizzati specifici anticorpi per le proteine sopra elencate, visualizzandole mediante l'utilizzo di anticorpi secondari legati a fluorocromi come rodamina e fluoresceina.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che l'effetto antiproliferativo, quindi antitumorale, del trattamento con il bioconiugato Oncofid-S dimostrato in Figura 3, è preceduto :
- dalla traslocazione nel nucleo sia dell' APC protein che di GSK-3fi chinasi (Figura 3a), dove sono in grado di regolare l'accumulo di β-catenina tramite fosforilazione (come precedentemente scritto) con conseguente arresto della proliferazione cellulare;
- dalla traslocazione di β-catenina dal nucleo (in cui, come precedentemente descritto, è nota attivare oncogeni coinvolti nella proliferazione della cellula tumorale) al citoplasma (Figura 3 b), dove, associandosi a livello della membrana cellulare con E-caderina, riforma il complesso intra-cellulare E-caderina-[3⁄4-catenina che regola l'adesione cellulare e che rappresenta un chiaro segno di differenziamento cellulare; - dalla conseguente aumentata espressione della E-caderina, (Figura 3 b), proteina di membrana coinvolta nei processi di adesione inter-cellulare e nella formazione delle giunzione cellula-cellula, (che hanno, come è noto, un ruolo fondamentale nel determinare l'inibizione da contatto e il differenziamento cellulare); l'aumento di espressione di E-caderina è, infatti, considerato un marcatore del differenziamento delle cellule epiteliali non tumorali della mucosa colica sana ;
- dall'aumento dell'espressione della citocheratina 20 (CK20), 2° marcatore del differenziamento delle cellule epiteliali non tumorali della mucosa colica sana (Figura 4). Tutte le suddette modificazioni relative al differenziamento cellulare non sono evidenti nei campioni trattati con l'SN38 non coniugato.
Questi dati chiaramente dimostrano che il meccanismo d'arresto della proliferazione di cellule neoplastiche registrato nei campioni trattati con ONCOFID-S dimostrato con Figura 3, è imputabile ad un effetto differenziante e non all' induzione di una massiccia morte cellulare per apoptosi, come invece noto per l'SN38.
Figura 4 inoltre mostra le analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM) delle modificazioni morfologiche indotte dal trattamento in miro sulle cellule tumorali analizzate dopo sperimentazione, modificazioni che confermano l'effetto differenziante del bioconiugato nei confronti di cellule neoplastiche verso un fenotipo non trasformato cioè non tumorale, ripristinando, quindi, la capacità di adesione inter-cellulare responsabile dell'inibizione da contatto, causando così il blocco della proliferazione del tumore.
Conclusioni
Sulla linea cellulare di adenocardnoma del colon, risultata positiva per l'espressione dei recettori CD44, il derivato ONCOFID-S a basse dosi dimostra un sorprendente effetto antiproliferativo dovuto non tanto all'induzione dell'apoptosi, come osservato e noto per l'SN38, quanto ad una differenziazione/ reversione delle cellule di adenocarcinoma in cellule epiteliali non trasformate, cioè non tumorali, quindi non proliferanti. Le suddette cellule, concluso il proprio ciclo cellulare, muoiono senza aver originato nuove metastasi e senza aver contribuito all'accrescimento della neoplasia.
Esempio 9
Sperimentazione in vitro del bioconiugato ONCOFID-S in modelli preclinici di adenocarcinoma del colon
Lo scopo di questo esperimento in vitro è principalmente quello di definire il profilo di attività del derivato ONCOFID a più alto grado di derivatizzazione e formulato in soluzione acquosa glucosata, per valutare/ comparare l'attività antineoplastica con quella del farmaco di riferimento, determinandone così la potenza farmacologica relativa all' antineoplastico di confronto.
Schema sperimentale:
Prodotti testati: principi attivi sperimentati
SN38 : prodotto di riferimento di controllo;
ONCOFID-S : derivato estereo dell'HA covalentemente legato all'SN38 con una % di esterificazione al carbossile (p/p) dell' 8% preparato come da Esempio 1;
Preparazioni farmaceutiche sperimentate
L'SN38 è stato sciolto in ima miscela costituita da DMSO/CH3CN/EtOH (10:45:45) a temperatura ambiente.
Soluzione di ONCOFID-S in glucosata: preparata come riportato nell'Esempio 5
Linee cellulari utilizzate
Cellule di adenocarcinoma del colon del ratto DHD/K12/Trb Protocollo sperimentale
1) la linea cellulare in esame viene piastrata alla concentrazione di 6x10<4>cellule per cm<2>, in piastre da 24 pozzetti a fondo piatto;
2) 24 ore dopo, alle cellule vengono addizionate le soluzione da testare opportunamente diluite nel mezzo di coltura.
3) dopo 24 o 48h dal trattamento, la vitalità cellulare viene valutata con il metodo di esclusione del Tripan blue, colorante che viene estruso dalle cellule vitali e metabolicamente attive trattenuto dalle cellule morte, che si colorano in blu.
Risultati
Vengono qui di seguito riportati in forma grafica (figura 5) i risultati ottenuti in termini di vitalità cellulare in funzione della dose di ONCOFID-S testata (concentrazioni di 0.125, 0.25 e 0.5 e 1 pg/ml) dopo 48h di trattamento.
La dose 250 ng/ml corrisponde all'IC50 e conferma l'efficacia molto più alta dell'ONCOFID-S preparato seguendo l'Esempio 2, rispetto a quello preparato seguendo l'Esempio 1 (IC50 pari a 0.4 pg/ml, come riportato nei risultati dell'esempio 5); conseguentemente l'efficacia risulta molto più alta dell'SN38 non coniugato.
Tale risultato è imputabile alla più alta percentuale di derivatizzazione in SN38, ovvero 8% in peso, rispetto all'OF-S derivatizzato al 3.5%.
Di seguito è riportata ima tabella delle IC50 dei 2 coniugati a diverso grado di sostituzione (3.5 e 8%), e dei rispettivi equivalenti in SN38 coniugati, rispetto al farmaco di riferimento SN38 non coniugato.
IC50
SN38 non coniugato 1.4 Jlg/ mi
Conclusioni.
Il derivato ONCOFID-S mostra un efficacia cinque volte maggiore di quella osservata per il farmaco non coniugato SN38 ma, se si considera la concentrazione di SN38 equivalente, l'efficacia risulta essere circa 70 volte maggiore a quella del farmaco di riferimento. Inoltre, la comparazione con gli studi del coniugato a minore percentuale di derivatizzazione mostra che l'efficacia dell'ONCOFID-S è tanto maggiore quanto maggiormente l'acido ialuronico è derivatizzato in SN38.
Esempio 10
Sperimentazione in miro del bioconiugato ONCOFID-D in modelli preclinici di melanoma umano
Lo scopo di questo esperimento in vitro è principalmente quello di definire il profilo di attività del derivato ONCOFID-D formulato in soluzione acquosa glucosata, per valutare / comparare l'attività antineoplastica con quella del farmaco di riferimento, determinandone così la potenza farmacologica relativa all' antineoplastico di confronto (Doxorubidna). Schema sperimentale:
Prodotti testati: principi attivi sperimentati
Doxorubidna : prodotto di riferimento di controllo;
ONCOFID-D : derivato estereo dell'HA covalentemente legato alla Doxorubidna con una percentuale di esterificazione al carbossile (p/p) del 10% preparato come da Esempio 3 ;
Preparazioni farmaceutiche sperimentate
La Doxorubidna è stata sriolta in soluzione di glucosio al 5% p/v a temperatura ambiente.
Soluzione di ONCOFID-D in glucosata: preparata come riportato nell'Esempio 7.
Linee cellulari utilizzate
Cellule di melanoma umano M14 esprimenti il recettore per ΓΗΑ CD44 Protocollo sperimentale
- la linea cellulare in esame viene piastrata alla concentrazione di óxlO<4>cellule per cm<2>, in piastre da 24 pozzetti a fondo piatto;
- 24 ore dopo, etile cellule vengono addizionate le soluzioni da testare opportunamente diluite nel mezzo di coltura.
- dopo 24 dal trattamento, viene vellutata la dtotossicità in microscopia confoceile mediemte colorazione con un test "Live Dead" Celi Vitality Assay (Molecular Probes, Eugene, OR). L'osservazione è stata effettuata mediante microscopio confoceile LEICA TCS SP5.
Risultati
Viene di seguito riportato in forma grafica (Figura 6) l'effetto citotossico indotto da ONCOFID-D (OF-D) e dalla Doxorubicina non coniugata in funzione della dose (concentrazioni di 0.25, 0.5, 20 pg/ml) dopo 24h di trattamento della linea di cellule di melanoma M14.
Conclusioni
La linea cellulare di melanoma è risultata fortemente positiva per l'espressione dei recettori CD44; la valutazione della citotossicità in microscopia confocale, indica che l'ONCOFID-D è in grado di esercitare su questa linea di melanoma un effetto citotossico maggiore del corrispondente non coniugato Doxorubicina. Inoltre, se si considera che nel bioconiugato ONCOFID-D la percentuale di doxorubicina coniugata è pari al 10% in peso, l'attività del farmaco risulta 10 volte più alta.
Esempio 11
Valutazione degli effetti antitumorali in vivo del bioconiugato ONCOFID-S in un modello di tumore sperimentale indotto nel ratto da una linea di carcinoma del colon singenica.
Allo scopo di confermare anche mediante sperimentazione in vivo l'elevata efficacia mostrata deli derivati ONCOFID nell'azione citotossica in vitro, sono stati utilizzati ratti BDIX per l'induzione di tumori addominali. L'inoculo della linea cellulare DHD/K12/Trb, effettuato per via intraperitoneale, ha infatti determinato la formazione di carcinosi peritoneale ed ascite tumorale.
È quindi stata messa a confronto la capacità antitumorale in vivo del CPT-11 alla concentrazione di 40 mg/kg vs ONCOFID-S, sempre alla concentrazione di 40 mg/ kg (che corrisponde a 3,2 mg/ kg del principio attivo SN38 essendo il bioconiugato derivatizzato per 8%), somministrati entrambi per via intraperitoneale.
Gli obiettivi dello studio in vivo sono stati i seguenti:
1. valutare la crescita tumorale rispetto al gruppo di controllo e/o la regressione o scomparsa delle lesioni tumorali peritoneali e il riscontro dell'ascite.
2. confermare i risultati dell'effetto antitumorale ottenuto negli studi in vitro.
3. valutare la tossicità ematologica e tessutale causata dai trattamenti. Schema sperimentale:
Farmaci utilizzati: principi attivi sperimentati
Irinotecan ® (o CPT11) : prodotto di riferimento di controllo;
ONCOFID-S : derivato estereo dell'HA covalentemente legato all'SN38 con una % di esterificazione al carbossile (p/ p) dell' 8% preparato come da Esempio V,
Preparazioni farmaceutiche sperimentate
L'Irinotecan è stato sciolto in soluzione glucosata 5% p/v a caldo (70°C) per 1 ora circa.
Soluzione di ONCOFID-S in glucosata: preparata come riportato nell'Esempio 5.
Animali trattati: 36 Ratti maschi BDIX di 7 settimane (circa 200g) sono stati divisi secondo criteri sperimentali nei seguenti gruppi (ogni gruppo è composto da 12 animali):
1. Gruppo di Controllo: inoculo DHD/K12/ trb
2. Gruppo CPT-11: inoculo DHD/K12/trb trattamento CTP-11 40 mg/ Kg via intraperitoneale.
3. Gruppo ONCOFID-S: inoculo DHD/ TRB trattamento ONCOFID-S 40 mg/ Kg via intraperitoneale.
Dopo 14gg di stabulazione sono state inoculate 1 x IO<6>cellule DHD/TRB per ratto per via intraperitoneale. Dopo 7gg si è dato inizio al trattamento terapeutico previsto, costituito da 4 cicli di terapia. Il sacrificio degli animali è stato fissato dopo 7gg dall'ultimo trattamento farmacologico. Gli animali sono stati valutati una volta a settimana per la comparsa di eventuali segni di tossicità, mediante misura del peso corporeo, e per la eventuale comparsa di ascite. Al momento del sacrificio è stato effettuato un prelievo intracardiaco in tutti gli animali ed è stata valutata la tossicità ematologica dovuta ai trattamenti farmacologici. I tumori e l' ascite sono stati prelevati e misurati. I tessuti prelevati sono stati fissati in formalina per la valutazione istologica ed immunoistochimica.
Risultati:
Valutazione dei volumi della carcinosi peritoneale :
La valutazione della crescita dei noduli tumorali è stata effettuata alla fine dei trattamenti; la figura 7 mostra come alla fine del test (T28) il volume della media dei tumori ha rivelato una buona risposta al trattamento nel gruppo del CPT-11 (5.9 cm<3>) ed una eccellente risposta nel gruppo delTONCOFID-S (1,8 cm<3>) rispetto al gruppo di controllo non trattato (15,5 cm<3>)
Valutazione della presenza di ascite emorragica:
L'ascite emorragica è dovuta alla disseminazione di un tumore nella cavità peritoneale; in clinica si verifica soprattutto con i tumori di origine gastrointestinale e ovarica. Il meccanismo responsabile della formazione dell'ascite maligna è soprattutto il blocco del drenaggio linfatico, tuttavia, è stato dimostrato che quando la concentrazione delle cellule tumorali nel fluido ascitico è elevata (> 4.000/mm<3>), la loro presenza da sola può produrre l'ascite a causa della produzione di mediatori chimici (citochine, istamina, acido lattico) con effetto irritativo.
Figura 8, in perfetta coerenza al risultato dei volumi tumorali, evidenzia come alla fine del test (T28) il volume medio dell'ascite emorragica (tumorale) prelevata è di 46,7 mi nel controllo, di 21.5 mi nel gruppo trattato con CPT- 11 mi e solo di 1,9 mi nel gruppo trattato con ONCOFID-&
Da evidenziare che mentre il 100% e l'83% degli animali del gruppo di controllo e del gruppo trattato con CPT11 presentavano asdte emorragica, soltanto il 16% degli animali del gruppo trattato con ONCOFID-S presentava modeste quantità di ascite.
Valutazione della tossicità ematologia:
Figura 9 illustra l'analisi (a T 28) del quadro ematocitometrico degli animali trattati.
Sono riportati i valori dei granulociti, la popolazione dei globuli bianchi che più risente della trattamento con chemioterapia.
Nel gruppo trattato con ONCOFID-S senza ascite non si registra la leucopenia da tossicità farmacologica, mentre gli animali che hanno sviluppato una modesta ascite presentano un numero di granulociti che rientra nella nonna, confermando così la non tossicità del bioconiugato oggetto della presente invenzione.
Conclusioni.
In linea con i risultati ottenuti dagli studi in vitro, la sperimentazione in vivo dimostra una sorprendente differenza di efficacia del farmaco coniugato all'HA rispetto al farmaco libero. Non solo il derivato ONCOFID-S determina una riduzione media della massa tumorale dell'88% (vs del 62% nel gruppo trattato con CPT11), ma dai dati di tossicità ematologia e dalla misura del volume di ascite, indice della progressione del tumore, si evince la ridotta tossicità farmacologica indotta dal trattamento in oggetto.
Studi ex vivo per la valutazione del meccanismo di azione del bioconiugato ONCOFID-S.
Allo scopo di confermare il sorprendente comportamento biologico/farmacologico dei derivati ONCOFID, i quali hanno dimostrato un effetto antiproliferativo di tipo differenziativo piuttosto che apoptotico, sono stati espiantati i tumori indotti come precedentemente descritto per effettuare studi di immunoistochimica .
Protocollo sperimentale:
I tumori espiantati, immediatamente dopo il prelievo, sono stati lavati accuratamente con soluzione fisiologica, fissati con formalina tamponata, processati per l'inclusione in paraffina e tagliati in sezioni di 4pm di spessore. L'analisi istologica è stata effettuata su sezioni colorate con ematossilina/eosina mentre l'analisi immunologica è stata effettuata mediante l'utilizzo di anticorpi specifici per le proteine studiate, evidenziati con l'ausilio di anticorpi secondari legati a perossidasi per un'analisi effettuabile al microscopio ottico.
Risultati:
Dall'analisi ex-vivo in immunoistochimica dei tumori intraperitoneali si è avuta la conferma dei dati ottenuti in vitro sul meccanismo di azione del bioconiugato relativamente alla regolazione del complesso E-caderina-βcatenina, per l'induzione di un effetto di tipo differenziante quindi non proliferativo piuttosto che apoptotico.
In sintesi i risultati ottenuti dall'analisi ex-vivo sono i seguenti :
1) nei tumori espiantati dagli animali trattati con l'ONCOFID-S è osservabile un pattern di espressione dei complessi oncoproteina/oncosopressore del tutto simile a quanto osservato nel modello cellulare utilizzato in vitro, indice della reversione del fenotipo tumorale verso un fenotipo normale. Infatti, nei tumori espiantati dagli animali trattati con l'ONCOFID-S, fi-catenina si sposta dal nucleo verso le giunzioni cellula-cellula mentre l'APC protein e GSK3P protein si spostano nel nucleo (Figura 10).
2) E-caderina e CK20, marcatori del differenziamento delle cellule epiteliali della mucosa colica, nei tumori espiantati dagli animali trattati con l'ONCOFID-S presentano un aumento d'espressione rispetto agli animali di controllo, esattamente come osservato nel modello cellulare trattato in vitro. Anche tale aumento d'espressione è indicativo della reversione del fenotipo tumorale indifferenziato verso un fenotipo differenziato non più proliferante in quanto non più tumorale (Figura 10).
Conclusioni
Quindi, anche in vivo viene confermato il singolare comportamento biologico/farmacologico del derivato ONCOFID nel bloccare la proliferazione cellulare promuovendo la differenziazione delle cellule tumorali verso un fenotipo non trasformato non tumorale.
Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'invenzione e tutte le modifiche che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell'ambito delle seguenti rivendicazioni.
Claims (25)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali per il differenziamento della cellula neoplastica verso un fenotipo non trasformato non tumorale.
- 2. Uso di bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali nella regolazione del complesso E-caderina-|3-catenina associato allo sviluppo di neoplasie.
- 3. Uso di bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali nella regolazione del complesso costituito dalle proteine APC -GSK-3p associato allo sviluppo di neoplasie.
- 4. Uso di bioconiugati secondo rivendicazione 1 come agenti differenzianti delle cellule tumorali verso un fenotipo non tumorale mediante la regolazione del complesso E-caderina-p-catenina e del complesso costituito dalle proteine APC -GSK-3p.
- 5. Uso di bioconiugati come rivendicato nelle rivendicazioni 1-4 per il trattamento del tumore alla mammella, alla pelle, alle ossa, al cervello, alla tiroide e per i tumori testa-collo, al sistema linfatico, al polmone e nel mesotelioma, all'esofago, allo stomaco, al colon, al pancreas, al fegato, al rene, agli ureteri e alla vescica, alla prostata, all'endometrio e ovaio.
- 6. trattamento del tumore al colon-retto.
- 7. Uso di bioconiugati come rivendicato nelle rivendicazione 5 per il trattamento del melanoma.
- 8. Uso di bioconiugati come rivendicato nelle rivendicazioni 1-7 per il trattamento sistemico, per ima applicazione topica o per somministrazione direttamente nel sito tumorale per iniezione diretta.
- 9. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 8 per via endovenosa o arteriosa, intramuscolare, transdermica intraperitoneale, intratecale, intralinfatica, per istillazione endotracheale, sottocutanea, orale o loco-regionale.
- 10. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 1 in cui i farmaci antitumorali covalentemente legati attraverso imo spaziatore all'acido ialuronico sono scelti tra le seguenti classi: antimetaboliti, alcaloidi/ naturai produci, antibiotici ed analoghi, modificatori della risposta biologica, diterpenoidi, nitrosouree, ormoni ed antiormoni sintetici.
- 11. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 10 in cui il farmaco è Γ SN38, metabolita attivo delTirinotecan.
- 12. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 10 in cui il farmaco è un antibiotico come la doxorubicina.
- 13. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 11 in cui il grado di sostituzione dell'SN38 al carbossile dell'acido ialuronico è compreso tra 1 e 15% peso/ peso.
- 14. Uso di bioconiugati come rivendicato nella rivendicazione 12 in cui il grado di sostituzione della doxorubicina al carbossile dell'acido ialuronico è compreso tra 3 e 20% peso/ peso.
- 15. Uso di bioconiugati secondo la rivendicazione 1 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare compreso tra 400 e 3x10^ Da.
- 16. Uso di bioconiugati secondo la rivendicazione 15 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare preferibilmente compreso tra 5.000 e lxlO<6>Da.
- 17. Uso di bioconiugati secondo la rivendicazione 16 in cui l'acido ialuronico ha un peso molecolare preferibilmente compreso tra 30.000 e 0,5xl0<6>Da.
- 18. Formulazioni farmaceutiche contenenti bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali per il differenziamento della cellula neoplastica verso un fenotipo non trasformato non tumorale.
- 19. Formulazioni farmaceutiche contenenti bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali nella regolazione del complesso E-caderina-p-catenina associato allo sviluppo di neoplasie.
- 20. Formulazioni farmaceutiche contenenti bioconiugati costituiti da acido ialuronico legato a farmaci antitumorali nella regolazione del complesso costituito dalle proteine APC -GSK-3P associato allo sviluppo di neoplasie.
- 21. Formulazioni farmaceutiche contenenti bioconiugati secondo rivendicazione 18 come agenti differenzianti delle cellule tumorali verso un fenotipo non tumorale mediante la regolazione del complesso E-caderina-p-catenina e del complesso costituito dalle proteine APC -GSK-3p.
- 22. Formulazioni farmaceutiche acquose di bioconiugati secondo rivendicazione 18-21 contenenti P-ciclodestrine.
- 23. Formulazioni farmaceutiche acquose di bioconiugati secondo rivendicazione 22 contenenti β-ciclodestrine alTl,5 % p/ v.
- 24. Formulazioni farmaceutiche acquose di bioconiugati secondo rivendicazione 18-21 contenenti glucosio.
- 25. Formulazioni farmaceutiche acquose di bioconiugati secondo rivendicazione 24 in soluzione di glucosio al 5% p/v.
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