KR101513841B1 - 응집성의 자성 알콕시실란-코팅된 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자성(magnetic) 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물의 현탁액을 제조하는 방법으로서, 자성 금속 나노입자의 수성 현탁액을 알콕시실란과 함께 인큐베이션하되, 상기 인큐베이션은 본질적으로 유기 용매의 부재 하에 수행한다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 방법으로 수득가능한, 자성 알콕시실란-코팅된 금속을 포함하는 나노입자 응집물의 현탁액, 및 상기 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 응집물의 평균 크기는 광산란으로 측정 시, 30 nm 내지 450 nm, 바람직하게는 50 nm 내지 350 nm, 특히 70 nm 내지 300 nm이다.

Description

응집성의 자성 알콕시실란-코팅된 나노입자{AGGLOMERATING MAGNETIC ALKOXYSILANE-COATED NANOPARTICLES}
항체와 같이, 고형 종양에 대한 종양 치료법의 최근의 진전에도 불구하고, 보다 효과적이고 비용-효율적인 치료법이 요구되고 있다.
열치료법 또는 보다 구체적으로는 고온온열요법(hyperthermia)은 화학치료법 또는 방사선 치료법과 비교해, 이의 물리적인 작용 방식으로 인해, 광범위한 종양 질환에 대해 부작용이 덜할 것으로 예상되므로, 흥미로운 암 치료 방법이다. 그러나, 현재 이용가능한 치료 방법은 여전히 차선이며 (Moroz et al. 2002), 충분히 개선될 필요가 있다.
하나의 바람직한 열치료 방법은, 자성 나노입자가 종양에 직접 도입되는 방법이다. 이어서, 상기 나노입자는 교번자기장(alternating magnetic field)에서 가열된다. 치료 기간 및 달성되는 종양내 온도(intratumoral temperature)에 따라, 종양 세포는 직접 파괴되거나 (열소작요법(thermal ablation)), 또는 함께 이용되는(concomitant) 화학치료법 또는 방사선치료법에 민감하게 된다 (고온온열요법). 이러한 새로운 방식을 이용하면, 종양을 그 내부에서부터 외부 방향으로 처치하여, 주변의 건강한 조직은 남겨둘 수 있다. 이러한 치료 방법은 교모세포종(glioblastoma)의 치료 시, 조짐이 좋은 치료 효과를 나타낸 바 있다 (Maier-Hauff 등 2011).
임상 1상의 결과가 긍정적임에도 불구하고, 이러한 치료법의 효능을 개선하고 및/또는 잠재적인 부작용이나 한계를 감소시킬 필요성은 여전히 존재한다. 해결되지 않은 문제점들 중 하나는, 나노입자의 점적주입(instillation) 동안, 표적 영역 외부의 주변 조직에 자성 나노입자가 침적된다는 것이다. 이러한 외부 침적물은, 교번자기장에서의 가열 시 표적 영역 외부의 온도를 높이거나, 또는 이러한 주변 조직의 가열을 피한다고 해도, 나노입자 침적물을 가열하는 데 사용되는 적용가능한 자기장 세기를 한정하므로, 원하지 않는 부작용을 야기한다. 이러한 문제점은, 주입된 종양 조직 내의 고압으로 인해, 주입 중이나 또는 주입 직후에, 침적된 나노입자가 외부로 유출되어서일 수 있다. 더욱이, 높은 전자파흡수율(specific absorption rate, SAR)을 가지기 위해서는 나노규모의 입자가 필요하지만, 이러한 나노입자는 간극 공간(interstitial space) 내에서 쉽게 이동할 수 있어서, 표적 영역으로부터 이탈하게 될 수 있다. 아울러, - 우선 나노입자를 침적시킨 후, 후속해서 교번자기장에 의해 여기시킴으로써 - 종양 내에 "침적될" 수 있는 열의 양은, 나노입자의 차선적인 전자파흡수율 (SAR)/지금까지도 병원에서 사용되는 자성 유체로 인해 한정적이다.
부가적으로는, 이러한 나노입자는 대규모에서 이상적인 비용으로 조절 방식(controlled fashion)으로 제조될 필요가 있으며, 시장성 제품이 되기 위해서는 안정한 제형에서 제형될 수 있어야 한다.
Gupta 및 Gupta (2005)에 의해 리뷰된 바와 같이, 이러한 나노입자의 방법 및 용도는 선행 기술분야에 많이 기술되어 있다.
Lesniak 등 (1997)은 응집물-무함유 나노입자의 제조 방법을 기술하고 있다. 이러한 방법은, (i) 부분적으로 응집물을 형성하는 산화철 나노입자의 수성 현탁액을 제조하는 단계, (ii) 트리알콕시실란 및 수-분산성 극성 유기 용매, 예를 들어, 에틸렌 글리콜을 첨가하는 단계, (iii) 생성되는 현탁액을 초음파로 처리하여, 응집을 감소시키는 단계, (iv) 초음파의 작용 하에 증류에 의해 물을 제거하는 단계; 및 (v) 잔존하는 응집물을 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 알콕시실란을 기재로 하는 가수분해-내성 코팅이 피복된, 응집물-무함유 나노입자를 생성한다. 그러나, 이들 나노입자는 고형 종양에 국소 적용되는 경우, 아마도 응집물을 포함하지 않는 특성으로 인해 주입 부위에 단지 부분적으로만 잔존한다. 이들 나노입자는 신체에 광범위하게 분포되게 되어, 표적 영역 내 나노입자의 잔존량을 한정시킬 뿐만 아니라, 주변 조직이나 신체 부위에 나노입자가 축적됨으로 인해 부작용의 발생 위험을 증가시킨다. 더욱이, 사용된 에틸렌 글리콜은, 이것이 알콕시실란 코팅의 아미노기와 상호작용하고 비점이 높아서 (197℃), 제거되기가 매우 어렵다. 따라서, 최종 산물에 에틸렌 글리콜이 존재함으로써, 안정성 및 조절 측면에서 나노입자의 적용가능성이 한정된다.
Ruefenacht 등 (2006)은 액체 담체 중 발열 나노입자의 주입가능한 중합체-기재의 제형을 개시하고 있으며, 이는 체액 또는 조직과 접촉 시, 원위치 이식물(in-situ implant)을 형성할 수 있다. 이러한 제형은 나노입자가 종양으로부터 유출되는 문제점을 해결하는 듯 보이지만, 이러한 시스템은 바람직하게는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 또는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 용매를 사용한다. 이러한 두 가지 용매는 모두 일반적으로, 독성이 낮은 것으로 생각되어, 약물의 경구 및 경피 제형에 자주 사용된다. 그러나, 이러한 용매를 조직 또는 종양, 특히 뇌종양의 경우 뇌에 주입하는 것은 거의 알려져 있지 않다. 따라서, 이러한 용매는 피해야 한다. 더욱이, 이러한 제형은 주입 시 규정된(defined) 이식물을 형성하는 반면, 본 발명의 맥락에서, 주입된 나노입자가 종양/조직 내에서 어느 정도 분포되는 것으로 생각되며, 이는 종양/조직에 국한된다. 이러한 시스템의 다른 단점은, 종양 내에서의 예상되는 용적 증가로, 이들 주입가능한 중합체-기재의 제형이 종양 내로 주입되는 경우, 이는 특히 두개골 내 공간이 한정되어 있는 뇌종양의 경우와 같이 특정한 종양의 증상에 문제점을 야기할 수 있다. 또한, 이러한 중합체-기재의 제형은 비-수술적 종양(non-operable tumor)의 치료에는 적합하지 않다.
Gao, J., et al. (2011). WO 2011/082796. Guardia, P., et al. (2012). ACS Nano 6(4): 3080-91. Guardia, P., et al. (2010 a). Chem Commun (Camb) 46(33): 6108-10. Guardia, P., et al. (2010 b). Langmuir 26(8): 5843-7. Gupta, A. K. and M. Gupta (2005). Biomaterials. 26(18): 3995-4021. Ivkov, R., et al. (2005). Therapy via Targeted Delivery of Nanoscale Particles. US 2005/0090732. Johannsen, M., et al. (2007). Eur Urol. 52(6): 1653-61. Epub 2006 Nov 17. Jordan, A. (2009). Implantable Products comprising Nanoparticles. WO 2009/100716. Jordan, A., et al. (2008). Nanoparticle/Active Ingredient Conjugates. US 2008/0268061. Jordan, A., et al. (2008). Method of Carrying Therapeutic Substances into Cells. US 2008/0187595. Jordan, A., et al. (1993). Int J Hyperthermia. 9(1): 51-68. Jordan, A., et al. (1996). Int J Hyperthermia. 12(6): 705-22. Lesniak, C., et al. (1997). US 6,183,658. Maier-Hauff, K., et al. (2011). J Neurooncol 103(2): 317-24. Massart, R. (1981). IEEE Trans. Magn. 17(2): 1247-48. Mohapatra, M. and S. Anand (2010). Int J of Engineering, Science and Technology. 2(8): 127-46. Moroz, P., et al. (2002). Int J Hyperthermia. 18(4): 267-84. Ruefenacht, D., et al. (2006). WO 2006/125452. Schnoor, A., et al. (2010). Chemie Ingenieur Technik 82(3): 317-26. Thiesen, B. and A. Jordan (2008). Int J Hyperthermia. 24(6): 467-74. Waldoefner, N. and K. Stief (2011). Magnetic Transducers. US 2011/0052609.
따라서, 본 발명의 목적은, 개선된 생체적합성 자성 나노입자를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은, 종양 치료용의 개선된 생체적합성 자성 나노입자를 제공하는 것이다.
실시예에 나타내는 바와 같이, 현재 본 발명의 발명자들은, 유기 용매의 부재 하에 산화철 나노입자의 조절된 아미노실란화에 의해, 표면의 아미노실란이 불완전하게 축합된 자성 나노입자가 생성되며, 이는 매우 농축될 수 있는 자성 나노입자의 안정한 수계 제형 (자성 유체)을 생성함을 발견하였다. 조직 또는 종양에 주입 시, 이들 자성 유체는 표적 조직 내에서의 체류율이 높은 바람직한 침적물을 형성한다. 이에, 본 발명의 발명자들은, 생체적합성이 개선되고, 표적 영역 내에서의 침적물 형성이 개선되며, 유기 용매의 부재로 인해 부작용이 거의 없으며, 및/또는 침적된 나노입자의 치료 영역으로부터의 유출이 감소한, 개선된 제조 방법, 개선된 나노입자, 및 적절한 현탁액 및 조성물 (자성 유체)을 제공한다.
결과적으로, 본 발명은, 종양 조직에 일반적인 방식으로 주입될 수 있으며, 의도하는 치료 영역, 예를 들어 종양 내의 주입 부위 또는 그 부근에 잔존하며, 실질적으로 주변 조직으로는 분산되지 않는, 전자파흡수율(SAR)이 높은 생체적합성 자성 나노입자를 제공한다. 아울러, 본 발명은 이러한 생체적합성 자성 나노입자의, 효과적이며(robust) 비용-효율적인 제조 방법을 제공한다.
정의
"전자파흡수율(SAR)"은, 교번자기장에 노출 시, 나노입자에 의해 에너지가 흡수되는 속도에 대한 측정값이다. 이는, 자기장 세기, 및 자기장의 극성화의 교번 진동수에 의존한다. SAR은 바람직하게는 Jordan et al. (1993)에 의해 개발된 방법에 따라 100 kHz의 진동수 및 18　kA/m 이하, 바람직하게는 3.5 kA/m의 장의 세기(field strength)에서 측정되며, 철과 같이 사용되는 금속의 질량을 지칭한다 (단위 W/g 금속).
"제타 전위(zeta potential)"는 수성 환경에서의 콜로이드성 나노입자의 전기 전위(electrical potential)의 측정값을 지칭하며, pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성 (각각 25℃에서 측정됨)에서 Malvern ZetaSizer 3000 HSA와 같은 장비를 이용해 측정된다. 제타 전위는 벌크 용액(bulk soultion)과, 유체역학 전단층 또는 확산층 영역 간의 경계에서의 전위이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약(about)"은 주어진 수 또는 값으로부터의 ±10%, 바람직하게는 ±5%, 특히 ±1%의 편차를 의미한다.
용어 "자성"은 자성, 상자성(paramagnetic), 강자성(ferromagnetic), 반-강자성(anti-ferromagnetic), 페리자성(ferrimagnetic), 반-페리자성(anti-ferrimagnetic) 및 초상자성(superparamagnetic)을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 나노입자는 상자성, 보다 바람직하게는 강자성, 페리자성, 반-페리자성 또는 초상자성이다.
특히 바람직한 실시 양태에서, 나노입자는 초상자성이다.
용어 "나노입자"는 나노미터 범위의 나노입자를 의미하며, 전자 현미경으로 측정 시, 금속 코어에 대해 1 nm 내지 100 nm의 나노입자를 의미한다. 바람직하게는, 나노입자의 크기는 5 nm 내지 25 nm, 보다 바람직하게는 7 nm 내지 20 nm, 특히 9 nm 내지 15 nm이다.
"금속 나노입자"는 금속 또는 금속 이온을 포함하는, 자성 나노입자를 지칭한다.
"유기 용매"는 고체, 기체, 또는 액체를 용해시킬 능력을 가진 액체 유기 화합물, 즉, 탄수화물을 의미한다. 본 발명에 따른 유기 용매의 예로는, 에틸렌 글리콜, 아세톤, 톨루올(toluol) 및 등가물(equivalent)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
용어 "알콕시실란 코팅"은 알콕시실란의 중축합으로 인한 코팅을 지칭하며, "아미노실란 코팅"으로도 지칭되는 과정이다. 본원에서, 용어 "중축합"은 일반적으로, 단량체와 2개의 관능기가 반응하여 중합체를 형성하는 축합 반응을 의미한다.
제1 측면에서, 본 발명은 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물의 현탁액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 자성 금속 나노입자의 수성 현탁액을 알콕시실란과 인큐베이션하되, 상기 인큐베이션은 본질적으로 유기 용매의 부재 하에 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "인큐베이팅" 또는 "인큐베이션"은, 알콕시실란이 중축합되고, 이로 인해 나노입자가 아미노실란으로 코팅되게 할 수 있는, 실험 설정, 실험 조건(들), 또는 반응 혼합물(들)을 의미한다.
실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 맥락에서, 종양 및 다른 질환들의 치료에 있어서, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물은, 응집물을 형성하지 않는 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자보다, 표적 영역 내에서 침적물을 보다 양호하게 형성할 수 있으며, 순환 시에 소실되거나 또는 표적 영역의 외부에서 침적물을 형성하는 나노입자의 수도 보다 적은 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 맥락에서 "응집성"은, 몇몇의 개별 나노입자들이 나노입자의 응집물 또는 클러스터(cluster)를 형성하는 것을 의미한다. "응집물"은 응집된 나노입자 또는 나노입자의 클러스터를 지칭한다.
본 발명에서 필수적인 단계는, 본질적으로 유기 용매의 부재 하에 알콕시실란과 인큐베이션/반응시키는 단계이다. 유기 용매의 맥락에서, "본질적으로 ~의 부재 하에"란, 소량의 유기 용매가 존재할 수 있으며, 바람직하게는 유기 용매의 양이 10 부피% 미만, 보다 바람직하게는 5 부피% 미만, 보다 더 바람직하게는 1 부피% 미만, 특히 0.5 부피% 미만임을 의미한다. 예를 들어, 반응 도중 최소량의 메탄올이 생성될 수 있으며, 따라서 산물에 어느 정도 잔존할 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 코팅은 유기 용매의 부재 하에 수행되며, 특히 상기 코팅은 첨가되는 유기 용매의 부재 하에 수행된다. 코팅 반응에 바람직한 용매는 물이다. 과학적인 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 발명자들은, 이들 반응 조건이 알콕시실란의 규정된, 그러나 불완전한 축합 반응을 일으켜서, 나노입자의 응집 특성을 부여하는 것으로 가정한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는, 에틸렌 글리콜의 부재 하에 수행된다. 에틸렌 글리콜은 본 발명의 코팅 반응을 방해한다. 더욱이, 통상 상대적으로 다량의 에틸렌 글리콜이 나노입자의 코팅에 부착된 채로 있으며, 이의 비점이 197℃로 높기 때문에, 나노입자 제제로부터 이를 완전히 제거하는 것은 불가능한 것은 아니라도 적어도 매우 어려운 일이다. 이는 또한, Lesniak 등 (상기 1997)에 따라 제조되는 제제에서도 마찬가지이다. 유럽 약전(European Pharmacopeia)에 따르면, 단지 600 ppm의 에틸렌 글리콜이 최종 의약품에 허용되며, 이보다 높은 양의 에틸렌 글리콜이 포함된 나노입자 제제는 상업적인 임상 용도로는 허용되지 않는다.
일 실시 양태에서, 금속 나노입자는 철, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염을 포함하지만, 철 염이 바람직하다. 철을 포함하는 나노입자는 코발트 또는 니켈과 같은 다른 자성 금속에 비해 그 독성이 낮으므로 바람직하다. 바람직한 실시 양태에서, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염은 본질적으로 다른 금속 및 다른 오염물질을 포함하지 않으므로, 독성이 없다. 당해 기술분야에서는, 화학물질이 미량의 오염물질을 포함할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 이러한 맥락에서, "본질적으로 ~을 포함하지 않는"은, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염에 다른 오염물질들이 바람직하게는 1 중량% 미만, 바람직하게는 0.1 중량% 미만으로 포함되어 있음을 의미한다. 특히 바람직하게는, 철 염은 다른 오염물질들을 본질적으로 포함하지 않는다.
특히 바람직한 실시 양태에서, 철 염은 산화철, 바람직하게는 자철광 및/또는 마그헤마이트이다. 산화철로 제조된 이러한 철 나노입자는, 염화철(III) 및 염화철(II)과 수산화나트륨의 혼합물을 포함하는 용액을 침전시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따르면, "철 나노입자"는 Fe 원자 또는 Fe 이온을 포함하는 나노입자이다.
이에, 바람직한 실시 양태에서, 산화철 나노입자의 수성 현탁액은 염화철(III) 및 염화철(II)과 수산화나트륨의 혼합물을 포함하는 용액을 침전시킴으로써 제공된다.
본원에서, 염화철(III) : 염화철(II)의 비율은 바람직하게는 약 2:1이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "나노입자" 및 "산화철 나노입자"는 동일하게 사용된다.
적절한 침전 반응 및 조건은 Massart (1981)에 의해 기술되었으며, Mohapatra 및 Anand (2010)에 의해 리뷰된 바 있다. 바람직한 침전 반응 조건에서, (i) 염화철(III) : 염화철(II)의 비율은 약 2:1이며; (ii) 염화철(III) 및 염화철(II) 용액을 수산화나트륨 용액에 약 2.13 M의 농도로 부으며; (iii) 침전 온도는 약 25℃이고; (iv) 침전 반응의 시간은 약 52분이다. 선택적으로는, 수산화나트륨 용액을 약 15℃에서 약 39분 동안 염화철 용액에 붓는다 (또는 그 반대로 시행함). 용액에서 철 염을 침전시킴으로써, 코팅된 산화철 나노입자를 제조하는 방법은 예를 들어, 실시예 1.1에 예시되어 있다.
다르게는, 산화철 나노입자의 수성 현탁액은 철 염 또는 철 착화합물의 열분해에 의해 제공될 수 있다. 본원에서, 용어 "철 착화합물"은 일반적으로, 철을 포함하는 착물, 바람직하게는 착물화된 철을 포함하는 화합물을 의미한다. 적절한 방법은 Waldoefner 및 Stief (2011)에 의해 기술된 바 있다. 간단히 말하자면, 철-함유 화합물 및 유기 용매를, 50℃ 내지 반응온도보다 50℃ 낮은 온도 사이의 온도에서 10분 동안 방치한다. 그런 다음, 상기 용액을 200℃ 내지 400℃로 가열하여, 나노입자를 수득한다. 상기 나노입자를 산소, 과산화물 또는 3차 아민 산화물로 산화시키고, 질산 및 질산철로 처리하여, 마그헤마이트 나노입자를 생성한다. 열분해에 의해 산화철 나노입자를 제조하는 다른 적절한 방법은 Guardia 등에 의해 기술된 바 있다 (Guardia 등 2010 a; Guardia 등 2010 b; Guardia 등 2012). 간단히 말하자면, 철 (III) 아세틸아세토네이트를 다이벤질 에테르 중 데칸산과 혼합한다. 상기 용액을 200℃ 이하로 지속적으로 가열한다. 200℃에서 2시간 후, 상기 용액을 가열 환류하고, 이 온도에서 1시간 동안 유지시킨 다음, 마지막으로 실온으로 냉각시키고, 세정한 후, 원심분리로 수집한다. 두 방법 모두 생성되는 나노입자의 SAR이 높으므로 바람직하다. 본 발명에 따른 열분해에 의한 산화철 나노입자의 제조 방법은 예를 들어, 실시예 1.2에 기술되어 있다.
이에, 다른 바람직한 실시 양태에서, 산화철 나노입자의 수성 현탁액은 철 염 또는 철 착화합물의 열분해에 의해 제공된다.
본 발명의 방법에 적용가능한 철 염 및 철 착물은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이로는 염화철(III), 염화철(II), 철 (III) 아세틸아세토네이트, 철 카르보닐 및 등가물을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
바람직한 실시 양태에서, 금속 나노입자는 알콕시실란과 인큐베이션/반응하기 전에 H2O2로 처리된다. 이러한 선택적인 단계는, 규정된 조건 하에 철이 완전히 Fe2O3 (마그헤마이트)로 산화되며, 그 결과 후속적인 반응 단계가 보호 가스 (예를 들어, 아르곤)의 부재 하에 수행될 수 있으므로, 바람직하다. 그렇지 않은 경우, H2O2의 부재 하에, 아르곤과 같은 보호 가스 하에 작업하여 반응 조건을 조절하는 것이 바람직하다.
알콕시실란은 바람직하게는 트리알콕시실란이다. 이는, 바람직하게는 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필-트리메톡시실란 (DIAMO), 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES), 트리메톡시실릴프로필-다이에틸렌트리아민 (TRIAMO) 및 N-(6-아미노헥실)-3-아미노프로필-트리메톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 알콕시실란은 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필-트리메톡시실란이다.
다른 바람직한 실시 양태에서, 코팅 반응은 금속 0.9 mol 당 트리알콕시실란을 0.3 x 10-3 mol 내지 0.6 x 10-3 mol, 바람직하게는 0.4 x 10-3 mol 내지 0.5 x 10-3 mol, 특히 0.43 x 10-3 mol 내지 0.45 x 10-3 mol로 첨가함으로써 수행된다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에 따르면, 알콕시실란과의 인큐베이션/반응은 pH 2 내지 pH 6 (이는 pH 2 또는 pH 6도 이 범위에 포함됨을 의미함), 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5, 특히 pH 4.5±1에서 수행된다. 상기 인큐베이션/반응 동안, pH는 필요하다면 상기 값으로 조정될 수 있다. 아세트산이 사용되어, pH가 이에 맞게 조정될 수 있다.
바람직하게는, 금속 자성 나노입자는 알콕시실란과의 인큐베이션/반응 전에 분해된다. 상기 나노입자는 바람직하게는 초음파 처리로 분해되어, 볼-형 또는 큐빅형 전자-밀집 나노입자의 현탁액을 생성하며, 이는 이후에 코팅 반응으로 처리될 수 있다. 일 실시 양태에서, 초음파 처리는, 초음파 배쓰(ultrasonic bath)에서 45 kHz에서 30분 내지 2시간, 특히 약 1시간 동안 수행된다. 이러한 분해 방법은 바람직하게는 산성 조건, 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 3.0에서 수행된다. 본 발명에 따른 나노입자의 분해는 예를 들어, 실시예 1.1에 기술되어 있다.
나노입자를 분해하는 다른 적절한 방법은 레이저-기재의 탈응집화/레이저 분절화 기술이다 (Schnoor 등 2010).
본 발명의 방법은, 알콕시실란과의 인큐베이션/반응을 시작한 후, 응집물을 분해하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 전술한 바와 같이 수행할 수 있다. 일 실시 양태에서, 나노입자의 분해는 코팅 단계와 함께 또는 그 후에 시작된다. 그러나, 다른 바람직한 실시 양태에서, 분해 단계는 코팅 단계 전에 시작되며, 추가적으로는 상기 코팅 단계와 동시에 및/또는 이후에 수행된다. 특히, 분해는 코팅 단계 전에 시작되어 상기 코팅 단계 도중과 그 이후에도 계속된다. 바람직하게는, 분해는 총 약 24시간 이상 동안 수행된다.
코팅 및 분해 시, 현탁액은 실온에서 안정하게 보관될 수 있도록 생성될 수 있으며, 이는 바람직한 실시 양태를 이룬다. 어떤 과학적인 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 대부분의 개별 나노입자는, 알콕시실란으로 완전히 코팅되어, 인접한 나노입자에 쉽게 부착되어 본 발명에 따른 응집물을 형성하는 것으로 가정되며, 이는 도 1을 참조할 수 있다. 그럼에도, 상기 현탁액은 주사기를 쉽게 통과하여 종양 조직에 주입될 수 있을 정도로 충분히 유동성이다.
바람직한 실시 양태에서, 불완전하게 코팅된 응집물 및/또는 매우 큰 응집물 (예를 들어, 2,000개가 넘는 나노입자의 응집물)을 현탁액으로부터 제거하는 부가적인 단계가 수행된다. 이러한 단계에 적절한 방법은 (예를 들어, 2,000 rpm에서 10분간의) 원심분리 및 (예를 들어, 포어 크기가 12 ㎛ 내지 25 ㎛인 플리티드 필터(pleated filter)를 통한) 여과이다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 원심분리 및 여과가 둘 다 수행된다. 알콕시실란으로 거의 코팅된 나노입자 및 완전히 코팅된 나노입자는 예를 들어, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리되더라도, 현탁액으로부터 침강하지 않는 것으로 관찰되었다. 즉, 원심분리 시의 상층액 및/또는 여과 시의 통과액(flow-through)은 본 발명에 따른 현탁액으로, 1일, 바람직하게는 1주일, 특히 1달 동안 침강하지 않으며, 따라서 장기간 보관될 수 있다.
한편, 불완전하게 코팅된 나노입자는 예를 들어, 이러한 원심분리에 의해 현탁액으로부터 상당히 제거될 수 있다. 이러한 불완전하게 코팅된 나노입자의 제거는, 불완전하게 코팅된 나노입자는 SAR이 감소되어 있어서 현탁액의 SAR 용적을 줄이므로, 바람직하다.
분해 단계(들) 및 선택적으로는 제거 단계는 바람직하게는, 금속 나노입자 응집물의 평균 크기 (z-평균)가 광산란으로 측정 시, 30 nm 내지 450 nm, 바람직하게는 50 nm 내지 350, 특히 70 nm 내지 300 nm가 될 때까지 수행된다. 이러한 맥락에서, 평균 크기는 실시예 3에 따라 수중에서 측정된다. 이러한 광산란 측정을 이용해, 이러한 응집물을 형성하고 있는 볼형 또는 큐빅형 전자-밀집 나노입자의 크기에 대해 나노입자 응집물의 크기가 측정된다. 응집물의 크기에 대해 "Z-평균"은, 실시에 3에서 수행되는 바와 같은 광산란 크기 측정의 판독값을 의미한다. 주어진 범위를 초과하는 Z-평균값은 나노입자의 침강을 야기하며, 따라서, 이들 나노입자의 예상된 적용(foreseen application)에는 일반적으로 적합하지 않다. 상기 분산액이 종양에 점적주입되기 전에 재구성될 수 있더라도, 크기가 큰 응집물은, 상기 분산액이 완충액과 응집물로 부분적으로 분리될 수 있으며, 이 응집물들은 니들(needle)을 통과하나, 나노입자를 조직 내에 불균등하게 분포시키므로, 심각한 문제점을 야기할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 양태에서, 응집물의 현탁액은 이의 금속 함량으로 측정 시, 약 2　M 이상, 바람직하게는 약 3　M 이상, 보다 바람직하게는 약 4 M 이상, 더 바람직하게는 약 5 M 이상, 특히 약 6 M 이상의 농도로 농축된다. 본 발명에 따른 현탁액에서 바람직한 금속 농도는 회전 증발기(rotation evaporator)에서 물을 증발시킴으로써 조정될 수 있다. 현탁액 샘플은 후술하는 방법을 이용해 고체 함량 및 금속 농도에 관하여 분석될 수 있다 (예를 들어, 실시예 2 참조).
놀랍게도, 본 발명에 따른 조성물 내 나노입자는, 의료 기기(medical device) 또는 약제로서의 유용성을 상실하지 않으면서, 2 M 이상의 고농도의 금속 함량으로 농축될 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 매우 농축된 현탁액들은 여전히 일상적으로 투입 또는 주입될 수 있으며, 중요하게는 수 개월 동안 보관될 수 있다. 현탁액을 오토클레이브한 후, 일부 젤화가 관찰될 수 있으나, (예를 들어, 약 12시간 동안의) 강도높은 보텍싱(vortexing)에 의해 원상복구될 수 있다. 금속 농도가 더 낮은 현탁액과 비교해, 이들 현탁액은 고 점도 및 용적을 토대로 더 높은 전자파흡수율(SAR)을 가진다. 놀랍게도, 본 발명의 나노입자의 경우, 종양과 같은 의도되는 조직 내에 이러한 나노입자의 침적물이 형성되는 것은 나노입자의 농도에 의존하는 것으로, 즉, 나노입자 농도가 증가하면 침적물 형성도 개선되는 것으로 나타났다. 당해 기술분야의 당업자는, 주입된 나노입자의 농도가 조직 내에서 서로 다른 농도에 대해 신속하게 균등화되어, 서로 다른 농도의 동일한 나노입자는 상이하게 거동하지 않는 것으로 타당하게 가정할 수 있기 때문에, 이러한 결과는 예상치 못한 것이었다.
본 발명의 다른 측면은 전술한 방법으로 수득가능한, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물의 현탁액이다. 후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이러한 현탁액은 일반적으로 종양에 주입될 수 있으며, 종양 조직 내에 잔존하므로, 따라서 고온온열요법 및 열소작요법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 알콕시실란-코팅은 나노입자가 응집되는 특성을 부여하여, 조직에 주입 시, 상기 응집물은 대체로 주입 부위에 근접하여 머무르나, 취급은 여전히 용이한 것으로 밝혀진 바 있다. 이로써, 이들 응집물은 특히, 고온온열요법 및/또는 열소작요법을 위해, 종양 조직에 주입되기에 적절하게 된다.
본 발명의 다른 측면은 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물을 포함하는 조성물로서, 상기 응집물의 평균 크기는 광산란으로 측정 시, 30 nm 내지 450 nm, 바람직하게는 50 nm 내지 350 nm, 특히 70 nm 내지 300 nm이다. 본 발명에 따른 응집화된 나노입자의 크기 측정은 예를 들어, 실시예 3에 기술되어 있다.
바람직하게는, 응집물을 포함하는 이러한 조성물은 실질적으로 유기 용매를 포함하지 않는다. 이러한 맥락에서 "실질적으로 유기 용매를 포함하지 않는"은, 소량의 유기 용매가 존재할 수 있으며, 예를 들어, 유기 용매의 양이 5 부피% 미만, 바람직하게는 1 부피% 미만, 보다 바람직하게는 0.5 부피% 미만, 특히 0.1 부피% 미만임을 의미한다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 유기 용매는 나노입자 제제에서 일반적인 방법으로 검출될 수 없다.
이러한 조성물의 금속 나노입자는 바람직하게는, 전자 현미경으로 측정 시, 크기가 5 nm 내지 25 nm, 바람직하게는 7 nm 내지 20 nm, 특히 9 nm 내지 15 nm인 금속 코어를 가진 나노입자이다. 현탁액의 응집물은 바람직하게는 이러한 개별 나노입자 수십 개 내지 수백 개로 이루어진 반면, 투과 전자 현미경(TEM)으로 측정 시, 10개 미만의 나노입자로 이루어진 작은 응집물은 거의 없으며 - 바람직하게는 700 nm x 700 nm 및 1000개 이상의 나노입자를 보여주는 대표적인 TEM 사진에서 10개 이하의 나노입자로 된 응집물은 3개 미만이다. 본 발명에 따른 투과 전자 현미경은 예를 들어, 실시예 6에 나타나 있다.
즉, 700 nm x 700 nm 및 1000개 이상의 나노입자를 보여주는 대표적인 TEM 사진에서, 개별적인 나노입자는 10개 미만, 바람직하게는 5개 미만, 특히 1개 이하로 검출될 수 있다. 이러한 맥락에서 나노입자는, 투과 전자 현미경에서 관찰가능한 기본적으로 볼형 또는 큐빅형인 전자-밀집 나노입자이다. 단일 나노입자는, 하나 이상의 다른 나노입자에 부착되지 않은 나노입자이다.
바람직하게는, 단일 나노입자의 모양은 볼형 또는 큐빅형이다. 나노입자의 크기 및 모양은 pH, 이온 세기, 온도, 염 (퍼클로레이트, 클로라이드, 및 니트레이트)의 특성, 또는 Fe(II)/Fe(III) 농도 비를 조정함으로써 맞춰질 수 있다 (Mohapatra 및 Anand 2010에 의해 리뷰됨).
바람직하게는, 금속 나노입자는 철, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염, 바람직하게는 철 염을 포함한다. 철 염은 바람직하게는 산화철, 특히 자철광이다. 바람직한 나노입자는 전술한 방법으로 수득될 수 있으며, 바람직하게는 염화철(III) 및 염화철(II)과 수산화나트륨의 혼합물을 포함하는 용액을 침전시켜, 산화철 나노입자의 현탁액을 제공함으로써 수득될 수 있다.
바람직한 실시 양태에서, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물을 포함하는 조성물의 제타 전위는 25 mV 내지 80 mV, 바람직하게는 35 mV 내지 70 mV, 특히 45 mV 내지 60 mV이다. 상기 조성물의 제타 전위는 실시예 4에 기술된 바와 같이 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성 (각각은 25℃에서 측정됨)에서 측정된다. 제타 전위는, 알콕시실란의 아미노기에 의존하므로, 나노입자의 성공적인 코팅에 의존한다. 더 낮은 제타 전위는 나노입자의 불충분한 코팅을 가리킨다. 제공된 범위 내의 적당한 제타 전위는, 조직에 주입 시 나노입자의 특성, 즉, 주입된 나노입자가 예를 들어 종양 내의 주입 부위 또는 그 부근에 잔존하며, 적용가능한 자기장을 한정하여 치료방법의 성공 역시 제한할 주변 조직으로의 분산은 허용하지 않는다는 특성에 기여한다. 더욱이, 제공된 범위 내의 제타 전위는 최적의 콜로이드 안정성을 보장하며, 따라서 나노입자 조성물의 반감기를 연장한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 양태는 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물이며, 상기 응집물은 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액 내에서 현탁화된다. 생리학적으로 허용가능한 완충액은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이로는 예를 들어, (25℃에서) pH 5 내지 pH 8, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 6, 특히 pH 5.1 내지 pH 5.8, 및 (25℃에서) 1.5 mS/cm 내지 2.5 mS/cm, 바람직하게는 1.7 mS/cm 내지 2.3 mS/cm의 전도성에서 아세테이트, 시트레이트, 카르보네이트 또는 포스페이트를 포함한다. 적절한 현탁액의 삼투질 농도는 0.01 Osmol/kg 내지 0.05 Osmol/kg, 바람직하게는 0.02 Osmol/kg 내지 0.04 Osmol/kg이다. 이러한 현탁액은 바람직하게는, 전신 치료용 투입액, 또는 간질(interstitial) 또는 종양내 적용용 주사액으로서 사용할 준비가 된 것이다.
본 발명의 조성물의 나노입자 농도는 바람직하게는 이의 금속 함량으로 측정 시, 약 2　M 이상, 바람직하게는 약 3　M 이상, 보다 바람직하게는 약 4 M 이상, 더 바람직하게는 약 5 M 이상, 특히 약 6 M 이상이다. 바람직하게는, 나노입자 농도는 약 8 M 미만으로, 일부 적용의 경우 농도가 너무 높으면, 분산액의 점도가 높아서 주입이 되는 동안 어려움을 야기할 수도 있다. 철의 경우, 2 M은 112 mg/ml이다. 금속의 농도는 광도 측정에 의해 측정될 수 있으며, 철과 같은 특정한 금속 착물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 철(II) 페난트롤린 착물로 변환된 후 측정될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 조성물 내 나노입자는, 의료 기기 또는 약제로서의 이들의 유용성을 상실하지 않으면서도, 2 M 이상의 높은 금속 함량의 농도로 농축될 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 매우 농축된 현탁액은 여전히 일반적인 방식으로 투입 또는 주입될 수 있으며, 중요하게는 수 개월 동안 보관될 수 있다. 현탁액을 오토클레이브한 후, 일부 젤화가 관찰될 수 있으나, (예를 들어, 약 12시간 동안의) 강도높은 보텍싱에 의해 원상복구될 수 있다. 금속 농도가 더 낮은 현탁액과 비교해, 이들 현탁액은 고 점도 및 용적을 토대로 더 높은 SAR을 가진다. 놀랍게도, 본 발명의 나노입자의 경우, 종양과 같은 의도되는 조직 내에 이러한 나노입자의 침적물이 형성되는 것은 나노입자의 농도에 의존하는 것으로, 즉, 나노입자 농도가 증가하면 침적물 형성도 개선되는 것으로 나타났다. 당해 기술분야의 당업자는, 주입된 나노입자의 농도가 조직 내의 서로 다른 농도에 대해 신속하게 균등화되어, 서로 다른 농도의 동일한 나노입자는 상이하게 거동하지 않는 것으로 타당하게 가정할 수 있으므로, 이러한 결과는 예상치 못한 것이었다.
실시예 9에서 참조할 수 있듯이, 매우 농축된 조성물의 경우, 보다 많은 나노입자가 종양 내에 침적될 수 있었다 (예를 들어, 0일째에, 6 M 현탁액의 경우 주입된 철 중 95% 대(vs) 2 M 현탁액의 경우 90%). 이러한 발견은, 2 M 현탁액과 비교해, 6 M 현탁액의 경우, 폐, 간 및 비장에서 철이 거의 발견되지 않은 결과와 일치한다 (예를 들어, 0일째에 3% 대 14%). 이에, 농도가 더 높을수록, 순환되어 다른 기관에 들어가게 되는 나노입자의 수는 더 적은 것으로 결론지어진다.
아울러, 본 발명의 보다 농축된 나노입자는 7일이라는 시간대 내에 종양에 잔존하며 (6 M 현탁액의 경우: 0일째에 95% 대 7일째에 96%), 반면에 보다 낮은 현탁액의 경우 동일한 시간대에서 철 함량이 다소 손실되는 것을 관찰할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (2 M 현탁액의 경우: 0일째에 90% 대 7일째에 86%). 이러한 발견은, 당해 기술분야의 당업자는, 나노입자가 주입 시 종양 조직에 신속하게 희석되어, 장기간에 걸쳐 상이한 거동을 나타내지 않음을 예상할 것이므로, 특히 놀랍다.
본 발명의 조성물의 점도는 바람직하게는, 회전형 레오메트리(rotational rheometry)로 측정 시, 100/s의 전단율에서 0.005 Pa s 이상, 바람직하게는 0.01 Pa s 이상, 보다 바람직하게는 0.1 Pa s 이상, 특히 1 Pa s 이상이다. 본 발명에 따른 회전형 레오메트리는 예를 들어, 실시예 8에 예시되어 있다. 본 발명에 따른 현탁액의 경우 점도는, 나노입자 또는 철 농도를 증가시키면, 따라서 증가한다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 조성물 내 나노입자의 전자파흡수율 (SAR)은 Jordan 등 (1993)에 의해 기술된 방법에 따라 3.5 kA/m의 자기장 세기 및 100 kHz의 진동수에서 측정 시, 각각의 금속 (예를 들어, 철)의 경우, 2 W/g 이상, 바람직하게는 3 W/g 이상, 특히 4 W/g 내지 50 W/g이다. 결과적으로 교번자기장에 노출되는 동안 보다 높은 온도가 달성될 수 있으므로, 일반적으로, SAR 값은 높은 것이 바람직하다. 나노입자의 SAR 값이 너무 낮은 경우, 즉, 제공된 숫자보다 더 낮은 경우, 교번자기장에 노출 시, 종양 전체에 걸쳐 달성된 온도는 치료 효과를 수득하기에는 너무 낮은 경향이 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 양태는, 아이소제닉(isogenic) 종양 모델에 주입 시, 주입 후 7일째 또는 이후에, 적용된 금속 중 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 98% 이상이 상기 주입된 종양 내에 잔존하는, 본 발명에 따른 조성물이다. 본 발명에 따른 아이소제닉 종양 모델은, 종양을 유도하는 데 사용되는 종양 세포가 숙주 동물과 유전적으로 매칭되는 종양 모델이다. 예를 들어, C3H RS1 유방암종 세포주가 사용되어, C3H-HeN 계통의 마우스에서 종양을 발생시킨다. 종양 내에 잔존하는 금속은 분광분석법을 이용한 금속 회수율(metal recovery)에 의해, 예를 들어, Tecan Infinite M 200 분광계에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 양태는 본 발명의 방법 중 임의의 방법으로 수득가능한 조성물이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 현탁액 또는 조성물을 포함하는 의료 기기이다. 자성 나노입자는, 교번자기장에 노출 시 물리적인 작용 방식으로 열의 발생을 통해 치료 효과를 발휘하며, 환자의 대사작용과 직접 상호작용하지 않으므로, 이들 나노입자는 다중의 적용범위(multiple jurisdiction)에서 의료 기기로 분류된다. 그래도, 이들은 고온온열요법 및/또는 열소작요법을 통한 종양 질환 및 다른 질환들의 치료 또는 예방을 위한 강력한 수단으로서 사용될 수 있으며, 이때, 세포들은 신체의 특정 영역에서 그 기능이 고장나 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 이러한 다른 질환들의 예로는, 류머티즘, 관절염, 관절증, 및 박테리아 감염이다. 본 발명에 따른 나노입자로 치료될 수 있는 종양 질환은 바람직하게는 고형 종양, 특히 비-수술적 전이와 같은 국소적인 문제점을 야기하는 국소적이거나 또는 국소적으로 진행된 종양 또는 전신성 종양 질환이다. 그 예로는, 교모세포종 및 성상세포종과 같은 뇌종양, 뇌 전이, 전립선암, 췌장암, 간세포암종, 두경부암, 방광암, 위암, 신장세포암종, 난소암종, 자궁경부암종, 육종, 기저세포암종 및 흑색종이 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 현탁액 또는 조성물을 포함하는 약제이다. 본 발명의 현탁액 또는 조성물은 화학치료제와 같은 항암제 (알킬화제, 항신생물제, 항생제, 대사길항물질, 천연 공급원 유도체로 분류될 수 있음), 호르몬/성장인자 또는 호르몬/성장인자 유사체 또는 저해제, 신호전달 저해제 및 면역 치료제와 같은 활성 약물과 함께 제형될 수 있다. 적절한 약물은 예를 들어 Waldoefner 및 Stief (2011, 단락 [0096] 내지 [0102])에 열거되어 있다. 이에, 본 발명의 일 측면은, 본 발명에 따른 나노입자가 이러한 활성 약물과 조합되는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 전후에 정의되는 환자에서 전후에 추가로 기술되는 바와 같이, 증식성 질환, 암, 종양, 류머티즘, 관절염, 관절증, 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 현탁액 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 전후에 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명의 현탁액 또는 조성물을 인간 또는 동물 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환, 암, 종양, 류머티즘, 관절염, 관절증 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법이다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되기 위한 현탁액 또는 조성물, 또는 본 발명에 따른 질환의 치료 또는 예방 방법은 환자를 교번자기장에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. 통상, 교번자기장은, 현탁액 또는 조성물을 환자의 표적 영역, 예를 들어 종양에 주입한 후 수 시간 또는 수 일간 적용된다 (Johannsen 등 2007; Thiesen 및 Jordan 2008; Maier-Hauff 등 2011).
Jordan 등 (2008)과 유사하게, 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 현탁액 또는 조성물은 더 나아가, 나노입자 응집물을 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 개별 단계에서 1종 이상의 항암제를 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 용매와 함께 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 활성을 증가시키는 방법에 사용될 수 있다. 2번의 투여는 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있으며 (처음에 나노입자가 투여되고, 그 다음에 항암제가 투여되거나, 또는 그 반대임), 그러나, 나노입자 및 항암제가 환자의 신체 내에서 동시에 존재하여 함께 작용하여 서로의 치료 효과를 증진시키는 방식으로 투여될 수 있다. 반면, 본 발명에 따르면, 나노입자 응집물은 표적 영역 내의 조직 내에서 수 개월 또는 수년 동안 잔존하며, 교번자기장에 노출 시 열을 발생시킬 수 있으며, 투여되는 항암제는 전형적으로 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 작용한다. 따라서, 이러한 맥락에서 "함께 작용한다"는 것은, 충분히 약리학적으로 활성인 수준의 항암제가 상기 조직에 존재한다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 다른 일 측면은, 나노입자 및 항암제가 환자의 신체 내에서 동시에 존재하도록 항암제와 함께 투여되는, 종양 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 나노입자이다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 나노입자의 응집물은 당해 기술분야에 알려진 활성 약제, 또는 항체, 항체 절편 또는 리간드와 같은 표적화 제제(targeting agent)와 착물을 이루거나 또는 이와 공유 결합된다. 예를 들어, 활성 약제 및/또는 리간드가 나노입자에 커플링되는 것은 Jordan 등 (2008), Gao 등 (2011), Waldoefner 및 Stief (2011) 및 Ivkov 등 (2005)에 기술되어 있다.
현탁액 이외의, 본 발명에 따른 나노입자의 응집물의 기타 적절한 약물 또는 의료 기기 형태는 예를 들어, 투입 또는 주입 전에 재구성될 수 있는 흡입용 분말 또는 동결건조물, 또는 본 발명에 따른 나노입자의 응집물을 포함하는 이식물, 예를 들어, Jordan (2009)에 추가로 기술된 바와 같은 고형 또는 젤형 의료 기기, 스폰지 또는 필름이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 약제 또는 의료 기기는 질환의 각각의 치료 또는 예방에 사용되는 통상적인 치료법, 예컨대 화학치료법 또는 방사선치료법과 쉽게 조합될 수 있다. 이들은, 개별 치료의 효능을 증가시키며, 및/또는 본 발명의 약제 또는 의료 기기와 조합되는 경우 이들의 용량을 낮춤으로써 통상적인 치료법이 가지는 부작용을 줄이도록 사용될 수 있다.
전술한 일반적인 논의를 바탕으로, 하기의 구체적인 도면 및 실시예는 단지 예시적일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 당해 기술분야의 당업자는 다른 일반적이고 특정한 배치를 알 수 있을 것이다.
도 1: 실시예 1에 따라 제조된 자성 산화철 나노입자의 2 M 현탁액의 투과 전자 현미경 사진.
도 2: 실시예 1에 따른 3가지의 서로 다른 철-산화물 나노입자 제제의 점도는 실시예 8에 따라 회전형 레오메트리로 측정되었다. Pa s로 나타낸 전단 점도는 AS1(6 M Fe) [충전된 다이아몬드], AS2(3 M Fe) [열린 원모양], 및 AS1(2 M Fe) [충전된 사각형]의 경우 /s의 전단율에 따라 도시되어 있다.
도 3: 실시예 1에 따른 3가지의 서로 다른 나노입자의 SAR은 실시예 5에 따라 측정되었다. W/g Fe로 나타낸 SAR은 AS1(6 M Fe) [충전된 다이아몬드], AS2(3 M Fe) [열린 원모양], 및 AS1(2 M Fe) [충전된 사각형]의 경우, kA/m로 나타낸 교번자기장 세기에 따라 도시되어 있다.
실시예
1. 코팅된 자성 산화철 나노입자의 제조
1.1. 철 염 용액 ( AS1 및 AS2 )으로부터 산화철을 침전시키는 방법
침전 및 세정: NaOH를 칭량해서 플라스크에 넣고, 정제수에 용해시켜 농도가 2.13 M이 되게 한 다음, 25℃로 냉각시킨다. 염화철(III) 및 염화철(II) (2:1 비율)을 유리병에 충전하고, 정제수에 용해시켜 0.48 M 염화철(III) / 0.24 M 염화철(II) 용액을 수득한다. 상기 염화철 용액을 NaOH 용액에 붓고, 약 53분 동안 혼합하며, 그동안 온도는 25℃에서 계속 유지시킨다. 생성된 나노입자가 침강하도록 방치한 다음, 상층액을 제거한다. 나노입자는, 상층액의 전도성이 <5mS/cm가 될 때까지 탈기수(degassed water)로 세정한다.
선택적으로는, NaOH 용액은 15℃에서 약 39분 동안 염화철 용액에 붓는다 (그 반대로도 수행함). 이러한 변형된 방법은 AS2 나노입자의 경우에 수행하였다.
코팅 및 분해
상기의 나노입자 현탁액은, pH가 2.5 내지 3.0이 될 때까지, 희석된 HCl로 조정한다. 이후, 플라스크를 초음파 배쓰에 두고, 교반하면서 45 kHz의 초음파로 1시간 동안 처리한다. 이때, 90분 동안, 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필)트리메톡시실란 (Fluka, 1.2 ℓ 나노입자 현탁액 당 48 ml)을 적가하고, 한편, pH는 산성 산을 몇 방울 첨가하여 역치인 5.5 미만으로 유지시키나, pH는 5.0 미만이어서는 안 된다. 이 단계 후에, pH는 희석된 HCl을 이용해 4.65로 조정하고, 현탁액은 23시간 동안 초음파로 더 처리한다. 이러한 프로토콜에 따라 제조된 입자 (선택적인 단계가 없음)는 AS1 나노입자로 지칭된다.
선택적으로는, 나노입자는 코팅 전에 H2O2로 2일 동안 처리하여, 보다 미세한 나노입자 분산액 및 보다 양호한 콜로이드성 안정성을 수득한다. 또한, H2O2를 사용하면, 조절된 조건 하에 Fe를 Fe2O3로 완전히 산화시킬 수 있다. 그 결과, 후속적인 반응은 보호 가스 (예를 들어, 아르곤)의 부재 하에 수행할 수 있다. 이러한 선택적인 단계는 상기의 AS2 나노입자의 경우 수행하였다.
투석: 현탁액은 탈기된 초순수(ultrapure water)에 대한 혈액 투석 카트리지 (Fresenius F8 HPS)를 이용해, 전도성이 400 μS/cm가 될 때까지, 정제한다.
원심분리 및 농축: 생성되는 현탁액 중 절반은 원심분리 버킷(bucket)에 충전하고, 2,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음, 상층액을 플리티드 필터 (12 ㎛ 내지 25 ㎛)를 통해 여과시켜, 이미 아르곤으로 5분 동안 헹궈둔 유리병에 넣는다. 이 과정은 제2 현탁액에도 동일하게 반복한다. 이후, 나노입자 현탁액을 회전 증발기를 이용해 원하는 Fe 농도 (예를 들어, 112 mg/ml Fe는 2 M Fe와 동일하며, 168 mg/ml Fe는 3 M Fe와 동일하며, 또는 335 mg/ml Fe는 6 M Fe와 동일함)로 농축시킨다. 나노입자 샘플은 고체 함량 및 Fe-농도에 관해 분석할 수 있다.
1.2. 철 착물 ( AS4 및 AS5 )의 열분해 방법
AS4 입자는 Waldoefner 및 Stief (2011)에 기술된 방법과 유사하게 제조하였다. 간단히 말하자면, 염화철(III) 소듐 아세테이트, 다이아미노헥산 및 에틸렌글리콜을 3-구 플라스크에서 조합하고, 균질한 용액을 수득할 때까지 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을, 비점에 근접할 때까지 세게 가열하였으며, 5시간 동안 환류시켰다. 원심분리를 통해 입자를 세정하고 수집한 후, 건조된 입자를 에틸렌 글리콜 중 트리메틸렌옥사이드와 혼합하고, 130℃로 가열한 후, 2시간 동안 유지시켰다. 이후, 상기 혼합물을 1시간 동안 환류 하에 가열하였다. 하기의 산화 단계의 경우, 세정된 입자를 질산에 재현탁시키고, 질화철로 처리하였다. 그런 다음, 원심분리로 입자를 세정하고 수집한 후, 상기 입자를 테트라알콕시실란으로 코팅시켜, 두꺼운 SiO2-껍질을 형성하였다. 생성되는 입자를 원심분리로 수집하고, 물에 재현탁시켰다. 최종적인 코팅, 분해 및 정제 (투석, 원심분리 및 농축)는 AS1-입자에 대해 전술한 것과 동일한 방식으로 수행할 수 있다.
AS5 입자는 Guardia 등 (Guardia 등 2010 a; Guardia 등 2010 b; Guardia 등 2012)에 의해 기술된 방법과 유사하게 제조하였다.
다이벤질 에테르 중 철(III) 아세틸아세토네이트 및 데칸산의 용액을 교반 하에 200℃까지 신속하게 가열하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 교반하고, 15분 내에 298℃로 가열하였다. 이 온도에서 1시간 더 유지시켰다. 마지막으로, 상기 현탁액을 실온으로 냉각되게 방치하였다.
그런 다음, 아세톤을 상기 혼합물에 첨가하고, 침전물을 기건(air-dried)하였다. 입자를 물에 재현탁시켰다. 최종적인 코팅, 분해 및 정제는 AS1-입자에 대해 전술한 것과 동일한 방식으로 수행할 수 있다.
2. 철 농도/고체 함량 측정
현탁액 중 철 농도의 측정은 철(II) 페난트롤린 착물의 소광(extinction)을 광도 측정한 것을 토대로 한다. 상기 착물은, 나노입자를 염산을 이용해, 시각적으로 확인 시 완전히 추출될 때까지 추출함으로써 생성된다. 함유된 철은 모두 하이드록실아민-하이드로클로라이드를 사용해 철 (II)로 환원시키고, 아세트산/아세테이트 완충액 중 페난트롤린 착물로 변환시킨다. 착물의 소광은 철(II) 에틸렌다이암모늄 설페이트 표준 (Merck, Darmstadt)에 대해 Shimadzu UV-1700 Pharmaspec을 이용해 513 nm에서 측정한다.
현탁액의 고체 함량은, 예를 들어, 용매 (예를 들어, 물)를 증발시키기 전과 증발시킨 후에 현탁액 1 ml을 칭량함으로써 측정한다.
3. 입자 크기 측정
나노입자의 평균 크기를 측정하기 위해, 광산란 과정을 이용하여, 나노입자 제제 (예를 들어, Malvern ZetaSizer 3000 HSA 또는 Malvern Zetasizer Nano ZS)의 수력학적 크기를 측정한다. 일차적인 파라미터는 z-평균값으로, 이는 산란 강도에 의해 칭량된다. 따라서, 다분산 분포의 경우, 크기가 더 큰 나노입자는 더 작은 것보다 더 강하게 칭량된다. 더욱이, 이러한 방법은 나노입자 응집물의 평균 크기를 측정하며, 단일 또는 1차 나노입자의 크기는 측정하지 않는다.
원리: 나노입자 또는 분자를 레이저로 비추는 경우, 더 작은 크기의 나노입자는 용매 분자에 의해 더 "걷어차여서(kicked)" 보다 신속히 움직이므로, 산란된 광의 세기는 나노입자/응집물의 크기에 좌우하는 속도에 따라 변동한다. 이러한 세기의 변동을 분석하면, 브라운 운동(Brownian motion)의 속도를 수득하여, 결국 스토크스-아인슈타인 관계식(Stokes-Einstein relationship)을 이용해 나노입자의 크기를 수득한다.
절차: 시험 성분 중 작은 일부(small part)를 이의 농도 (1:1000 내지 1:3000)에 따라 희석한다. 희석된 현탁액의 샘플을 측정 기기에 두고, Malvern ZetaSizer 3000 HSA의 권고사항에 따라 처리한다.
4. 제타 전위 측정
나노입자의 제타 전위를 측정하기 위해, 샘플을 30초 동안 보텍싱한다. 초순수 중 Fe (또는 다른 금속)의 경우, 약 0.11 mg/ml 농도의 용액을 1:1000 희석시킨 희석액 75 ml을 제조하고, 초음파로 15분 동안 처리한다. 상기 용액 20 ml을 Malvern ZetaSizer 3000 HSA (또는 Malvern Zetasizer Nano ZS)의 측정 셀(measuring cell)에 주입하고, 제조업체의 권고사항에 따라 측정한다. 상기 용액의 pH는 개별의 pH 미터로 측정한다.
5. SAR 측정
실시예 1의 샘플의 SAR은 Jordan 등 (1993)에 의해 개발된 방법에 따라 100 kHz의 진동수 및 3.5 kA/m 이하의 장의 세기에서 측정하였다. 3.5 kA/m 및 보다 높은 장의 세기에 대한 결과는 표 1에 나타낸다.
전자파흡수율
100 kHz에서의 장의 세기 (W/g) SAR
AS1 112 mg/ml Fe 3.5 3.5
AS1 112 mg/ml Fe 7.5 9.45
AS2 168 mg/ml Fe 3.5 4,0
AS2 168 mg/ml Fe 6.0 8.56
AS1 335 mg/ml Fe 6.0 7.22
AS4 112 mg/ml Fe 3.0 4.02
AS4 112 mg/ml Fe 4.0 15.69
AS5 112 mg/ml Fe 6.0 11,99
서로 다른 교번자기장 세기에서의 AS1 및 AS2 나노입자의 몇 가지 제조 실험의 SAR 평균은 도 3에 나타나 있다.
6. 투과 전자 현미경
나노입자의 전자 현미경 촬영은 Jordan 등 (1996, 페이지 712, 3.2.2)에 의해 기술된 방법과 유사하게 TEM 분석으로 수행할 수 있다.
실시예 1에서 제조된 자성 산화철 나노입자의 2 M 현탁액을 TEM으로 분석하였다. 결과적인 현미경 사진은 도 1에 나타나 있다. 현미경 사진 상에서, 크기가 큰, 나노입자 응집물 (단일 나노입자는 화살표로 나타냄)을 볼 수 있다. 도시된 영역에서 개별의 나노입자는 관찰할 수 없으며, 나노입자는 모두 다른 것들에 부착되어 있다.
7. 현탁액 사양
실시예 1에 따른 제조 실험으로, 표 2에 도시된 물리적/화학적 사양을 수득한다.
대표적인 차지(charge)의 사양
AS1 AS4 AS5
입자 크기 (z-평균) 89 nm 179.6 180.8 nm
제타 전위 53.5 mV 47.8 mV 42.5 mV
전도성 (25℃) 2.16 mS/cm 0.90 mS/cm --
pH (25℃) 5.28 4.38 --
삼투질 농도 0.03 Osmol/kg 0.08 Osmol/kg --
SAR (100 kHz에서, 주어진 장의 세기에서) 10 W/g Fe
(7.5 kA/m)		 14 W/g Fe
(4 kA/m)		 12 W/g Fe
(6 kA/m)
총 금속 함량 (Fe) 15 중량% 18 중량% --
농도 (Fe) 1.99 mol/l 1.70 mol/l 1.88 mol/l
8. 회전 레오메트리 /점도 측정
나노입자 샘플의 점도는 20℃에서 회전형 레오메트리를 이용해 Malvern 물질 특징화 서비스에 의해 측정하였으며, 여기서 전단 점도 (Pa s)는 전단율 (7 /s 내지 1500 /s)에 따라 측정하였다. 실시예 1에 따른 나노입자 제제의 결과는 도 2에 나타나 있다.
9. 생체 내에서 자성 유체의 침착물 형성
C3H RS1 유방암종 세포주의 종양 세포 1x106개를 C3H-HeN 계통의 마우스 (Harlan Laboratories, Borchen)의 우측 뒷다리에 주입하였다. 일단 종양의 부피가 0.57　㎤ 내지 0.85　㎤ 정도로 유도되면, 동물들을 무작위로 (군 당 15마리로) 나누고, 우측 뒷다리의 종양에, Fe 농도가 112　mg/ml 또는 335　mg/ml인 실시예 1의 자성 유체를 주입하였다. 정확한 주입 용적 함량은, 주입 전과 주입 후의 주사기의 무게를 재고 그 차이를 계산하여 측정하였다 (평균적으로 31 ㎕ ± 5.8 ㎕).
마우스의 조직/종양의 총 Fe 함량은, Spektroquant 14761 테스트 (Merck, Darmstadt) 및 Cary 50 (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca, USA) 및 Tecan Infinite M 200 (Tecan Group Ltd, Maennedorf, Switzerland) 분광계를 사용해 565 nm에서 자외선-가시광선 측정에 의해 0일 또는 7일 후에 측정하였다. 처음에 적용 되 는 Fe 함량은 조직/종양의 총 Fe 함량에서 상기 조직의 초기의 함량 (비-접종된 좌측 다리의 Fe 함량을 측정함으로써 측정된 값) 및 접종 동안 사용된 면봉에 의해 흡수된 자성 유체의 손실량을 감산하여 측정하였다. Fe 회수율 (평균적으로 군 당 15개의 종양)은, 총 Fe 함량을 처음에 적용된 Fe 함량으로 나누어서 계산하였다.
Cary 50에 의해 측정된 Fe 회수율
Cary Fe 회수율
종양 [%]		 Fe 회수율
폐/간/비장 [%]		 Fe 회수율
종양/폐/간/비장 [%]
112 mg/ml Fe 0일째 90 14 104
7일째 86 10 96
335 mg/ml Fe 0일째 95 3 98
7일째 96 3 99
Tecan Infinite M 200에 의해 측정된 Fe 회수율
Tecan Fe 회수율
종양 [%]		 Fe 회수율
폐/간/비장 [%]		 Fe 회수율
종양/폐/간/비장 [%]
112 mg/ml Fe 0일째 95 16 111
7일째 93 13 106
335 mg/ml Fe 0일째 98 4 102
7일째 98 4 102
초기의 Fe 함량 (좌측 다리에서 측정함), 및 자성 유체의 보다 적은 접종 용적으로 인한 손실을 고려하면, 4개 군 모두에 대해 평균적인 총 Fe의 회수율은 Cary 50의 경우 99% 및 Tecan Infinite M 200의 경우 104%였다. 일반적으로, 회수값은 Cary 50 (표 3)에 비해 Tecan Infinite M 200 (표 4)을 사용한 경우 더 높았다.
112 mg/ml Fe 제형과 335 mg/ml Fe 제형 간의 Fe 회수율을 비교하면, 두 측정 모두에서, 335 mg/ml 제형의 경우 0일째에 더 많은 Fe 나노입자가 종양에 유지된 경향이 드러났다 (Cary로 측정 시 95% 대 90%, 및 Tecan으로 측정 시 98% 대 95%). 한편, 0일째에 다른 조직 (폐, 간 및 비장)에서 발견되는 Fe 나노입자의 양은 112 mg/ml Fe 제형의 경우 훨씬 더 많았다 (112 mg/ml의 경우 14%/16% 대 335 mg/ml의 경우 3%/3%). 따라서, 보다 더 농축된 제형과 비교해 보다 덜 농축된 제형의 경우, 적용 동안 및 적용 직후 잠재적으로 0일 이내에 더 많은 양의 Fe 나노입자가 종양으로부터 유출되는 것으로 결론지을 수 있다.
0일째에 종양에 효과적으로 적용된 Fe와 비교해, 7일 후 종양 내에 잔존하는 Fe의 비율을 측정하기 위해, 0일째의 Fe 회수율을 7일째의 Fe 회수율로 나누고, Cary 50과 Tecan Infinite M 200 사이에서 평균을 내었다 (그 결과는 표 5에 나타냄). 유사하게는, 폐, 간 및 비장에서 0일째에 축적된 Fe의 운명(fate)은, 7일째에 이들 장기들에 여전히 존재하는 Fe와 그 양을 비교하여 분석하였다.
7일 후에 종양/장기 내 잔존하는 Fe (0일째와 7일째 간의 비율, Cary 50과 Tecan Infinite M 200 사이에서 평균을 냄)
잔존하는 Fe
종양 [%]		 잔존하는 Fe
폐/간/비장 [%]
112 mg/ml Fe 97% 75%
335 mg/ml Fe 101% 100%
112 mg/ml Fe 제형의 경우, 0일째부터 7일째까지 약 3%의 Fe의 추가적인 손실이 존재한 반면, 335 mg/ml Fe 제형의 경우, Fe 함량은 이 기간 동안 일정하게 유지되었다. 흥미롭게도, 112 mg/ml Fe 제형의 경우 폐, 간 및 비장에서 발견된 Fe의 경우, 약 25%가 1주 이내에 소멸되었으나, 335 mg/ml 제형의 경우 0일째에 이들 장기들에서 발견된 Fe는 모두 7일째까지 그대로 유지되었다 (335 mg/ml Fe 제형의 경우 이들 장기에서 발견된 Fe의 총 함량은 112 mg/ml Fe 제형의 경우 이들 장기에서 발견된 Fe의 양의 단지 1/4이었음을 고려해야 하며, 표 3 및 표 4에서 컬럼 "Fe 회수율 폐/간/비장"을 참조함).
따라서, 보다 농축된 나노입자 제형은 부가적으로는, 7일 동안 종양 내 나노입자의 체류율을 개선하며, 이는 환자들을 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 자기장으로 여러 번 치료하는 경우, 그 중요성을 갖는다.

Claims (50)

  1. 자성(magnetic) 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물의 현탁액을 제조하는 방법으로서,
    자성 금속 나노입자의 수성 현탁액을 알콕시실란과 함께 인큐베이션하되,
    상기 인큐베이션은 10 부피% 미만의 유기 용매의 양에서 수행하며, 알콕시실란이 중축합되고, 이로 인해 나노입자가 아미노실란으로 코팅되게 할 수 있고,
    상기 알콕시실란은 트리알콕시실란이며,
    상기 트리알콕시실란 0.3 x 10-3 mol 내지 0.6 x 10-3 mol이 금속 0.9 mol 당 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 철, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염을 포함하는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 철 염은 산화철인, 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 철 염은 산화철, 자철광(magnetite) 및 마그헤마이트(maghemite)인, 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 철 염은 자철광 또는 마그헤마이트인, 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 산화철 나노입자의 수성 현탁액이
    a) 염화 철(III) 및 염화 철(II)과 수산화나트륨의 혼합물을 포함하는 용액을 침전시킴으로써 제공되거나, 또는
    b) 철 염 또는 철 착화합물의 열분해(thermal decomposition)에 의한 것인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성 금속 나노입자는 인큐베이션 전에 H2O2로 처리되는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트리알콕시실란은 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필-트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 트리메톡시실릴프로필-다이에틸렌트리아민 및 N-(6-아미노헥실)-3-아미노프로필트리메톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트리알콕시실란은 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필-트리메톡시실란인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    트리알콕시실란 0.4 x 10-3 mol 내지 0.5 x 10-3 mol이 금속 0.9 mol 당 첨가되는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    트리알콕시실란 0.43 x 10-3 mol 내지 0.45 x 10-3 mol이 금속 0.9 mol 당 첨가되는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 pH 2 내지 pH 6에서 수행되는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성 금속 나노입자는 알콕시실란과 인큐베이션되기 전에, 분해(disintegrated)되는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    자성 금속 나노입자의 수성 현탁액을 알콕시실란과 함께 인큐베이션하기 시작한 후, 자성 나노입자를 분해하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2,000개가 넘는 나노입자의 응집물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 응집물은, 광산란으로 측정 시, 평균 크기가 30 nm 내지 450 nm가 될 때까지 분해되는, 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 응집물은, 광산란으로 측정 시, 평균 크기가 50 nm 내지 350 nm가 될 때까지 분해되는, 방법.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 응집물은, 광산란으로 측정 시, 평균 크기가 70 nm 내지 300 nm가 될 때까지 분해되는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물 현탁액은, 이의 금속 함량으로 측정 시, 2 M 내지 8 M(±10%)의 농도로 농축되는, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물 현탁액은, 이의 금속 함량으로 측정 시, 4 M 내지 8 M(±10%)의 농도로 농축되는, 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물 현탁액은, 이의 금속 함량으로 측정 시, 6 M 내지 8 M(±10%)의 농도로 농축되는, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 자성 알콕시실란-코팅된 금속을 포함하는 나노입자 응집물의 현탁액.
  23. 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물로서,
    상기 응집물의 평균 크기는 광 산란으로 측정 시, 30 nm 내지 450 nm이며,
    상기 금속 나노입자의 제타 전위는 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성(conductivity)에서 25 mV 내지 80 mV인, 조성물.
  24. 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물로서,
    상기 응집물의 평균 크기는 광 산란으로 측정 시, 50 nm 내지 350 nm이며,
    상기 금속 나노입자의 제타 전위는 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성에서 25 mV 내지 80 mV인, 조성물.
  25. 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물로서,
    상기 응집물의 평균 크기는 광 산란으로 측정 시, 70 nm 내지 300 nm이며,
    상기 금속 나노입자의 제타 전위는 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성에서 25 mV 내지 80 mV인, 조성물.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 10 부피% 미만의 유기 용매의 양을 포함하는, 조성물.
  27. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는, 전자 현미경으로 측정 시, 크기가 5 nm 내지 25 nm인 금속 코어(metal core)를 가지는, 조성물.
  28. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는, 전자 현미경으로 측정 시, 크기가 7 nm 내지 20 nm인 금속 코어를 가지는, 조성물.
  29. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는, 전자 현미경으로 측정 시, 크기가 9 nm 내지 15 nm인 금속 코어를 가지는, 조성물.
  30. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 철, 철 착화합물, 철 카르보닐 화합물 또는 철 염을 포함하는, 조성물.
  31. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자의 제타 전위는, pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성에서, 35 mV 내지 70 mV인, 조성물.
  32. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 나노입자의 제타 전위는, pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성에서, 45 mV 내지 60 mV인, 조성물.
  33. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물은 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는, 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 나노입자의 농도는, 금속 함량으로 측정 시, 2 M 내지 8 M(±10%)인, 조성물.
  35. 제 33 항에 있어서,
    상기 나노입자의 농도는, 금속 함량으로 측정 시, 4 M 내지 8 M(±10%)인, 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서,
    상기 나노입자의 농도는, 금속 함량으로 측정 시, 6 M 내지 8 M(±10%)인, 조성물.
  37. 삭제
  38. 제 33 항에 있어서,
    수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액 중 상기 나노입자의 전자파흡수율(specific absorption rate, SAR)은, 3.5 kA/m의 자기장 세기 및 100 kHz의 진동수에서 측정 시, 2 내지 50 W/g Me인, 조성물.
  39. 제 33 항에 있어서,
    수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액 중 상기 나노입자의 전자파흡수율은, 3.5 kA/m의 자기장 세기 및 100 kHz의 진동수에서 측정 시, 3 내지 50 W/g Me인, 조성물.
  40. 제 33 항에 있어서,
    수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액 중 상기 나노입자의 전자파흡수율은, 3.5 kA/m의 자기장 세기 및 100 kHz의 진동수에서 측정 시, 4 내지 12 W/g Me인, 조성물.
  41. 제 33 항에 있어서,
    아이소겐(isogen) 종양 모델에 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액을 주입하는 경우, 주입 후 7일째 또는 그 이후에, 적용된 금속 중 90% 이상이 상기 주입된 종양에 잔존하는, 조성물.
  42. 제 33 항에 있어서,
    아이소겐 종양 모델에 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액을 주입하는 경우, 주입 후 7일째 또는 그 이후에, 적용된 금속 중 93% 이상이 상기 주입된 종양에 잔존하는, 조성물.
  43. 제 33 항에 있어서,
    아이소겐 종양 모델에 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액을 주입하는 경우, 주입 후 7일째 또는 그 이후에, 적용된 금속 중 95% 이상이 상기 주입된 종양에 잔존하는, 조성물.
  44. 제 33 항에 있어서,
    아이소겐 종양 모델에 수계의(water-based) 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 현탁화되는 현탁액을 주입하는 경우, 주입 후 7일째 또는 그 이후에, 적용된 금속 중 98% 이상이 상기 주입된 종양에 잔존하는, 조성물.
  45. 제 33 항에 있어서,
    자성 금속 나노입자의 수성 현탁액을 알콕시실란과 함께 인큐베이션하되, 상기 인큐베이션은 10 부피% 미만의 유기 용매의 양에서 수행하며, 알콕시실란이 중축합되고, 이로 인해 나노입자가 아미노실란으로 코팅되게 할 수 있고, 상기 알콕시실란은 트리알콕시실란이며, 상기 트리알콕시실란 0.3 x 10-3 mol 내지 0.6 x 10-3 mol이 금속 0.9 mol 당 첨가되는, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자 응집물의 현탁액을 제조하는 방법에 의해 수득가능한, 조성물.
  46. 제 22 항에 따른 현탁액, 또는 응집물의 평균 크기가 광 산란으로 측정 시, 50 nm 내지 350 nm이며, 금속 나노입자의 제타 전위가 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성(conductivity)에서 25 mV 내지 80 mV인, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물을 포함하는 의료 기기(medical device).
  47. 제 22 항에 따른 현탁액, 또는 응집물의 평균 크기가 광 산란으로 측정 시, 50 nm 내지 350 nm이며, 금속 나노입자의 제타 전위가 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성(conductivity)에서 25 mV 내지 80 mV인, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물을 포함하는 약제.
  48. 제 22 항에 있어서,
    상기 현탁액은 환자에서, 증식성 질환, 암, 종양, 류머티즘, 관절염, 관절증 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되는, 현탁액.
  49. 제 22 항에 따른 현탁액, 또는 응집물의 평균 크기가 광 산란으로 측정 시, 50 nm 내지 350 nm이며, 금속 나노입자의 제타 전위가 pH 5.2 및 2.0 mS/cm의 전도성(conductivity)에서 25 mV 내지 80 mV인, 자성 알콕시실란-코팅된 금속 나노입자의 응집물을 포함하는 조성물을 인간 이외의 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환, 암, 종양, 류머티즘, 관절염, 관절증 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 동물을 교번자기장(alternating magnetic field)에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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