KR101446508B1

KR101446508B1 - 생물학적 물질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101446508B1
Application number: KR1020087014064A
Authority: KR
Inventors: 비욘 프렌데우스; 롤란드 칼쏜
Original assignee: 바이오인벤트 인터내셔날 에이비
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2014-10-16
Also published as: CN101360760B; IL191868A; EP1960432B1; RU2008128471A; KR20150023914A; JP2009518052A; KR20140031402A; KR20080090393A; NZ569038A; NO341192B1; WO2007068485A3; CN101360760A; CA2632983A1; NO20082524L; UA100664C2; US9803013B2; NZ595644A; CA2632983C; HUE028363T2; US20140314793A1

Abstract

본 발명은 표적 세포의 세포 표면 항원에 선택적으로 바인딩하는 항체 분자를 포함하며, 상기 세포 표면 항원에 바인딩시 상기 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 바인딩 분자를 제공한다. 또한 아포토시스 유도를 위한 방법과 약학 조성물 그리고 이의 용도가 제공된다.

아포토시스, 표적 세포, 항원, 항체, 바인딩

Description

생물학적 물질 및 이의 용도{BIOLOGICAL MATERIALS AND USES THEREOF}

본 발명은 아포토시스(apoptosis) 유도에 관련된 분자, 아포토시스 유도를 위한 방법 및 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

항체는 최근에 암 표적을 위해서 뿐만 아니라 다른 징후들을 치료하기 위한 선택적 단백질 치료제가 되었다(Brekke et al. Nat Rev Drug Discov 2003;2:52-62). 항체 합성의 출현은 합성 파아지 라이브러리로부터 인간 항체를 생성하는 수단을 제공하였으며, 이는 이들의 인간적 기질 및 보다 높은 다양성에 기인한 감소된 면역원 및 증가된 특이성을 나타낸다(Weiner et al. Nat Biotechnol 2005;23:556-7). 네이브(Naive) 라이브러리는 면역화 및 새로운 라이브러리의 재구성과 관계없이 자가 항원(Griffiths et al. Embo J 1993;12:725-34)을 포함하는 어떠한 특이성에 대한 항체의 분리용으로 이용될 수 있기 때문에 특히 매력적이다. 세포 표면 리셉터는 소 분자 인히비터 및 항체를 포함하는 현대의 치료 약물에 의해 표적되는 매우 가장 성공적인 항원 그룹으로 구성된다. 특히 관심있는 것은 독특하게 발현되거나 혹은 표적 세포상에 증가된 발현 수준을 나타내며 부가적으로 세포에 대한 사멸 또는 생존 신호를 중계할 수 있는 세포 표면 리셉터이다. 이와 같이 고유의 시그널링 특성을 갖는 차등적으로 발현되는 리셉터는 미생물 감염되거나, 형질변형되거나 혹은 이와 달리 기능을 잃은 세포의 항체-기초 표적을 할 수 있다.

종양의 치료를 위해, 종양 세포를 표적시 아포토시스를 유도하는 능력을 갖는 한편 정상 조직에 대해서는 관대한 항체가 특히 관심 대상이다. 여러 가지 이러한 항체가 사용되며, 미국 식품의약청(FDA)에 등록되어 있으며 예를 들어, 임파종(CD 20을 표적하는 리툭시맵(rituximab)) 또는 유방암(Her-2 및 EGFR을 각각 표적하는 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 세툭시맵(cetuximab)과 같이 통상적인 암 치료를 위한 대체물로 제공된다.

또한 임상적 발달시 일반적으로 아포토시스 유도 효과를 갖는 다른 항체들이 있다. 그러나, 이러한 항체들이 환자 또는 동물 시험에서 유익한 영향을 나타냄에도 불구하고 채워지지 않은 임상적 요구가 여전히 존재한다.

B 세포 종양의 항-유전자형 면역글로블린 표적은 인간에서 수행된 첫번째 모노클로날 항체 치료법이었다(Miller et al. N Engl J Med 1982;306:517-22). 이러한 수동적인 항체 투여 수단(Riechmann et al. Nature 1988;332:323-7) 또는 환자 자신의 종양 면역글로블린 단백질을 이용한 적극적 백신접종(Kwak et al. N Engl J Med 1992;327:1209-15)과 같은 수단에 의한 종양 세포의 파괴는 다른 종류의 B 세포 흑색종을 갖는 환자에서 종양 퇴화 또는 종양 비활동 상태를 제공하는 것으로 나타났다. 보다 최근 보고에 의하면 마우스 항체 생성이 결핍된 유전자도입 마우스를 이용하고, 선택된 인간 항체 사슬 유전자 좌를 발현하여 완전히 인간 항-유전자형 항체를 생성하는 것이 기재되어 있다(Suarez et al. Mol Immunol 2004;41:519-26).

본 발명에서 경합 바이오패닝법(competition biopanning method)이 사용되며, 전 세포(whole cells) 형태의 표적 세포 항원 및 막소포(membrane vesicles) 형태의 잉여 서브스트랙터 세포 항원이 동시에 네이브 n-CoDeR^® 항체 파아지 라이브러리에 노출되고(WO 2004/023140; Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000; 18:852-6), 회수되고 후속적으로 B 임파종 표적 세포에 대한 우수한 선택성으로 시험 항체 프레그먼트에 노출된다. 또한, 선택된 바인딩 분자의 기능성은 표적 세포에서는 아포토시스를 유도하나 비-표적 세포에서는 아포토시스를 유도하지 않는 시험된 항체의 능력에 의해 증명된다.

확인된 항체 특이성은 HLA-DR/DP(본 발명의 B1 항체) 및 표면 IgM(본 발명의 C11 항체) 뿐만 아니라 종래에 알려지지 않은 아포토시스 유도와 관련된 부착 분자인 ICAM-1(본 발명의 B11 항체)을 포함한다. 분리된 항체는 이들을 표적 항체 치료 를 위해 선택하는 것이 직접적으로 가능한 서브나노몰 내지 나노몰 범위내의 친화도를 가졌다.

본 발명의 제1 견지에 의하면

a. 세포 표면 항원 ICAM-1을 디스플레이하는 하나 이상의 표적 세포를 제공하는 단계;

b. 세포 표면 ICAM-1에 선택적으로 바인딩하며, ICAM-1에 바인딩시 상기 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 하나 이상의 바인딩 분자를 제공하는 단계;

c. (a)의 표적 세포를 (b)의 바인딩 분자에 노출시켜 상기 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 단계

를 포함하는 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 방법이 제공된다.

바람직하게 상기 바인딩 분자는 항체 분자이다.

본 발명의 제2 견지에 의하면,

a. 세포 표면 항원, HLA-DR/DP 및/또는 표면 IgM을 디스플레이하는 하나 이상의 표적 세포를 제공하는 단계;

b. 세포 표면 HLA-DR/DP 및/또는 표면 IgM에 선택적으로 바인딩하며, HLA-DR/DP 및/또는 표면 IgM에 바인딩시 상기 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 하나 이상의 항체 분자를 제공하는 단계;

c. (a)의 표적 세포를 (b)의 항체 분자에 노출시켜 상기 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 단계

본 발명의 제3 견지에 의하면, 세포 표면 ICAM-1에 선택적으로 바인딩하며, ICAM-1에 바인딩시 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 바인딩 분자가 제공된다. 택일적으로 상기 바인딩 분자는 세포 표면 HLA-DR/DP 및/또는 표면 IgM에 선택적으로 바인딩하는 항체 분자이다.

ICAM-1은 또한 지정된 CD54이나, 본 출원의 목적상 ICAM-1이 사용될 것이다.

바인딩 분자는 다수의 라이브러리에서 널리 사용되는 항체로부터 유도되고 상기 항체 스카폴드에 기초할 수 있으나[Clackson T et al., Nature. 1991 Aug 15; 352(6336): 624-8, Marks JD et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97], 바인딩 분자는 또한 피브로넥틴 스카폴드[Weng S et al., Proteomics. 2002 Jan; 2(1): 48-57] 및 단백질 A 스카폴드[Nord K, et al., Nat Biotechnol 1997 Aug; 15(8): 772-7, Hogbom M et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Mar 18; 100(6): 3191-6]과 같은 다른 분자 스카폴드로부터 유도될 수 있다. 각각의 이러한 스카폴드는 적용에 따라 이들의 잇점을 가질 수 있다.

예를 들어, 항체 스카폴드는 자연 변이성과 식별불가능한 변이성을 생성하는데 유리하게 사용될 수 있다.

항체의 기본 구조, 가장 일반적으로 사용되는 스카폴드는 매우 잘 이해된다. 기본적으로, 두 개의 시트내에 정렬된 베타 스트랜드를 포함하는 프래임워크 구조는 항원 구조에 바인딩하는 능력을 갖는 소위 CDRs(Complementary Determining Regiions)인 한 세트의 가변 루프를 나타낸다. 항체는 스카폴드 구조가 다를 수 있음에도 불구하고, 가장 광범위한 변이성은 CDRs에서 나타난다. 항체들간의 큰 변이성은 근본적으로 모든 타입의 분자 구조에 기초하며, 특정 방식으로, 이들의 상호작용 능력에 기초한다. 이러한 능력에 기인하여, 항체들은 질병의 연구, 진단/예상을 포함하는 적용성을 갖는 특정 바인더의 생성을 위해 그리고 정의된 표적 구조에 특이적인 치료제로서 광범위하게 사용되었다[Borrebaeck CA and Carlsson R, Curr Opin Pharmacol. 2001 Aug; 1(4): 404-8].

본 발명에 유용한 다른 비-항체 바인딩 분자는 고도의 안정성을 가지나 특정 위치에 도입되는 변이성을 여전히 허용하는 스카폴드 구조를 갖는 것들이다. 다른 바인딩 분자의 예는 피브로넥틴 도메인 및 변이성에 내성이 있는 58 아미노산 라지 단백질 A 도메인이다. 일부 정도의 변이를 허용하는 다른 분자 폴드가 또한 존재한다. 이러한 예는 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 및 II 분자를 포함하며, 소위 디펜신(defensins)이라 불리는 최근의 새로운 분자 클래스가 기본 구조가 유사하며 한편으로 유전자 패밀리 멤버사이에 여전히 광범위한 서열 변이성을 갖는 것으로 확인되었으며, 이들은 분자 다양성을 갖기위한 스카폴드로서 적절함을 나타낸다. 또한, 표적 분자로서 ICAM-1의 경우에 예를 들어, LFA-1과 같은 천연 리간드(들) 또는 이들의 재조합 변이체가 표적 세포에서 아포토시스를 유도할 수 있는 특정 바인딩 분자를 구성할 수 있다.

또한, 상기 바인딩 분자는 표적 세포의 세포 표면에 선택적으로 바인딩하며, 바인딩시 상기 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 어느 분자일 수 있다.

일 구현으로 상기 세포 표면 항원은 ICAM-1이다.

본 발명의 스크리닝은 종래에 아포토시스와 관련된 것으로 알려지지 않았으며 세포에서 본래의 네가티브 시그널링 특성이라고 생각되지 않은 리셉터 ICAM-1에 특이적인 항체(B11)을 재발견하였다.

아포토시스-유도 분자로서 ICAM-1의 확인은 이들 각각의 아이덴티티에 대한 종래 지식에 관계없이 그리고 이러한 종래 지식 없이 표적 세포와 비-표적 세포사이에 차등적으로 발현되는 모든 세포 표면에 대한 특이성을 분리하도록 디자인된 스크리닝의 직접적인 결과이었다. ICAM-1 유도 세포 사멸은 미토콘드리아 멤브레인 탈분극을 포함한 활발한 아포토시스성 프로세스로서 증명되었다. 미토콘드리아 멤브레인 탈분극은 캐스파제 의존성 및 캐스파제 독립성 아포토시스 모두에 대해 종래에 기술된 바 있다(Nagy et al. J Mol Med 2003; 81: 757-65).

본 발견은 또한 B11 항체에 의해 바인딩된 에피토프가 다른 기원의 B 임파종 조직에서 발현되며, 그리고 휴면 말초 혈액 백혈구와 비교하여 특정 B 임파종 세포에서 상향 조절됨을 보여준다. 중요하게도, B 임파종 세포에 부가적으로 ICAM-1을 발현하는 암종 세포가 시험관내에서 ICAM-1 특이 B11 항체에 적용되는 경우 아포토시스를 겪었다(참조 실시예 6).

종래 연구들은 정상 인간 조직상에서 ICAM-1의 제한된 발현을 나타내었다(Smith et al. J Clin Pathol 1990; 43: 893-900). ICAM-1은 세포와 세포 부착에 관련되며 면역 반응 및 이의 리셉터 LFA-1과의 바인딩을 통한 염증반응에 중요한 역할을 한다. ICAM-1에 대한 항체는 병리학적 면역 반응 및 염증 반응을 저해하는데 사용되어 왔다. 시모로고스 원숭이에서 뮤린 항-ICAM-1 mAb의 생체내 투여(Cosimi et al. J Immunol 1990; 144:4604-12), 또는 류마티즘 관절염을 가진 환자 또는 신장 이식을 받는 환자에서 임상적 시도로서의 사용은 또한 외적인 독성을 나타내지 않았다(Kavanaugh et al. Arthritis Rheum 1994; 37:992-9; Haug et al. Transplantation 1993; 55:766-72).

ICAM-1 표적화가 아포토시스를 이끌 수 있다는 새로운 발견은 다른 기원이나 다만 이들이 그 항원을 발현하는 암 치료를 위한 항체와 같이 ICAM-1 특이적 바인딩 분자의 사용 가능성을 입증한다.

B11과 같은 아포토시스 유도 항-ICAM-1 항체로 잠재적으로 처리될 수 있는 ICAM-1 암 타입은 이들의 발현에 기초하여 B 임파종, 골수종(Huang et al. (1993) Hybridoma 12 p661-75; Huang et al., (1995) Cancer Res 55 p610-6; Smallshaw et al., (2004) J Immunolther 27 p419-24), 위암(Maruo et al., (2002) Int J Cancer 100 p486-90), 유방암(Rosette et al., (2005) Carcinogenesis 26-p943-50), 간암(Sun et al., (1999) J Cancer Res Clin Oncol 125 p28-34), 폐암(Grothey et al., (1998) Br J Cancer 77 p801-7), 흑색종(Wang et al., (2005) Int J Cancer 27 p419-24), 방광암(Roche et al., (2003) Thromb Haemost 89 1089-97) 및 전립선암(Aalinkeel et al., (2004) Cancer Res 64 p5311-21)을 포함한다. ICAM-1의 발현은 또한 ICAM-1 특이 항체를 이용하여 전이 프로세스에서 개입하는 가능성에 대해 지적함으써(Maruo et al., 2002), (Rosette et al., 2005), (Sun et al., 1999), (Grothey et al., 1998), (Aalinkeel et al., 2004) 입증된 바와 같이 종양 전이에서 확인되었다.

다른 구현으로 상기 세포 표면 항원은 HLA-DR/DP이다.

HLA-DR/DP는 일반적으로 예를 들어 B 세포상에 존재하며, B 임파종 세포상에서 상향조절되는 것을 발견될 수 있다.

현재까지 세 개의 다른 HLA-DR 특이 모노클로날 항체가 임상 단계 시도에 들어섰다. 이중에서 가장 최근에 추가된 것은 완전 인간 IgG₄ ID09C3이며, 이는 n-CoDeR^®과 비교하여 유사한 크기를 가진 네이브 파아지 라이브러리로부터, 정제된 항원에서 고형상 패닐을 이용하여 분리되었다(Nagy et al. Nat Med 2002; 8:801-7).

본 발명에서, 다수의 B-임파종 세포주에서 신속히 그리고 강하게 아포토시스를 유도하는 HLA-DR/DP에 대한 신규 인간 항체 (B1)이 확인되었으며, 이에 따라 HLA-DR/DP가 표적 세포에서 아포토시스의 유도와 연결되는 것이 입증되었다.

B1 항체는 다른 기원의 다수의 B 임파종 세포주에 바인딩되었으며(참조 실시예 1 및 표 1), HLA-DR/DP 항원 발현 세포에서 아포토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 또한, B1 항체는 Raji B 임파종 세포주에 대해 시험된 경우 Rituximab보다 강력한 것으로 나타났다. 이는 특히 B1 항체의 IgG₄ 형이 사용된 경우에 분명히 나타났다(도 8).

획득된 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 이러한 항체는 HLA-DR/DP 발현 B 임파종 세포의 치료에 적합한 특성을 갖는다. 또한, 류마티즘 관절염 및 Rituximab에 의한 SLE의 표적화와 유사하게, 상기 B1 항체는 HLA-DR/DP 발현 B 세포가 해로운 질환에서 활성화 B 세포를 제거하는데 효과적인 것으로 입증될 수 있다.

다른 구현으로 상기 세포 표면 항원은 표면 IgM이다.

IgM은 이의 자유 형태로 라지 펜타머 구조로서 존재하며, 이의 보다 높은 분자량은 혈관내에 구속되는 경향이 있다.

모노머릭 IgM은 B 림프구의 세포벽상에서 발견될 수 있으며, 항원 인지를 위한 항체 리셉터로서 작용한다.

본 발명의 C11 항체는 B 림프구 세포상에서 발현되는 표면 IgM에 바인딩시 신속하고 효율적인 방식으로 아포토시스를 유도한다(참조 실시예 1 및 표 1). B 임파종의 치료를 위한 임상에서 종래에 사용되었던 유전자형 특이 항-IgM 항체와 상반적으로, 상기 C11 항체는 다른 도너의 B 세포상에서 발현되는 비-다형 에피토프에 바인딩하며, 이에 따라 B 임파종 세포에 관계없이 B 임파종으로부터 고통받는 환자의 치료에 적합하다.

특히, 예를 들어 항-IgM 항체와 같은 이펙터 분자는 또한 다른 유전자형의 세포를 발현하는 IgM에서 아포토시스의 원인이 되는 어느 타입의 특이 바인딩 분자일 수 있다.

B1, B11 및 C11 IgG 유도 아포토시스의 동역학은 급속적이었으며, 최대 효능은 일부 세포주에서 3시간후에 이미 관찰되었다. 신속한 이펙터 기능은 예를 들어, 종양 항원 발현의 결핍(Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 1983; 157:1040-52; Kennedy et al. Br J Haematol 2002;119:412-6) 또는 에피토프 변이(Weiner et al. J Immunol 1989; 142:343-51; Bai et al. J. Clin. Invest. 2003; 111:1487-96)에서 비롯된 종양 회피에 대한 위험을 최소화하고 치료 기간 및 부작용을 잠재적으로 제한하기(Robert et al. Lancet Oncol 2005; 6:491-500) 때문에 치료 효능에 중요하다.

바람직하게 상기 표적 세포는 면역 세포 또는 상피 세포이며, 유리하게 상기 면역 세포는 B 림프구이다.

편리하게, 상기 표적 세포는 질병과 연관된다. 바람직하게 상기 질병은 암; 이에 한정하는 것은 아니나 류마티즘성 관절염 및 SLE을 포함하는 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 이에 한정하는 것은 아니나 HIV를 포함하는 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

유리하게, 상기 질병은 임파종(백혈병, 골수종), 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암으로부터 선택된 암이다.

본 출원의 정의부에서 정의한 바와 같이, 상기 언급된 항체 분자는 편의상 이용되며, 특히 항체, 항체 프레그먼트, 및 항체 유도체로 이용된다.

편리하게, 상기 항체 분자는 IgG이다. 상기 IgG는 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄ 중 어느 것일 수 있으나, 바람직하게 IgG₁ 및 IgG₄ 중 어느 것이다. 상기 항체 분자는 바람직하게 인간화된 것이거나 인간의 것이다.

편리하게, 본 발명의 바인딩 분자 또는 항체 분자는 도 9 내지 11의 가변부 서열 중 어느 하나의 서열 또는 이와 기능적으로 동등하게 상동적인 서열을 갖는다.

본 발명의 일 구현으로, 상기 바인딩 분자 또는 항체 분자는 도 9의 가변부 서열 또는 이와 기능적으로 동등하게 상동적인 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 구현으로, 상기 바인딩 분자 또는 항체 분자는 도 10의 가변부 서열 또는 이와 기능적으로 동등하게 상동적인 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 구현으로, 상기 바인딩 분자 또는 항체 분자는 도 11의 가변부 서열 또는 이와 기능적으로 동등하게 상동적인 서열을 갖는다.

본 발명의 제 4 견지로, 어느 앞선 청구항에 청구된 바와 같은 바인딩 분자 또는 항체 분자를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 제공된다.

편리하게, 상기 핵산은 도 9 내지 11 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 제 5 견지로, 본 발명의 제 1 또는 제 2 견지에서 정의된 바와 같은 바인딩 분자 또는 항체 분자를 표적 세포의 파괴가 요구되는 질병의 진단 및/또는 치료 및/또는 예방에 사용하는 용도가 제공된다. 또한, 본 발명의 제 1 또는 제 2 견지에서 정의된 바와 같은 바인딩 분자 또는 항체 분자를 표적 세포의 파괴가 요구되는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 제조에 사용하는 용도가 제공된다.

바람직한 구현으로, 상기 바인딩 분자는 항체 분자이다.

편리하게, 치료하고자 하는 질병은 암; 이에 한정하는 것은 아니나 류마티즘성 관절염 및 SLE을 포함하는 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 이에 한정하는 것은 아니나 HIV를 포함하는 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일 구현으로, 상기 바인딩 분자 또는 항체 분자는 ICAM-1에 특이적으로 바인딩하며 그리고/또는 도 10의 서열을 가지며 그리고 상기 열거된 질병과 관련되어 사용된다.

본 발명의 다른 구현으로, 상기 항체 분자는 HLA-DR/DP에 특이적으로 바인딩하며 그리고/또는 도 9의 서열을 가지며 그리고 임파종(백혈병, 골수종), 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암의 질병과 관련되어 사용된다.

본 발명의 다른 구현으로, 상기 항체 분자는 표면 IgM에 특이적으로 바인딩하며 그리고/또는 도 11의 서열을 가지며 그리고 임파종(백혈병, 골수종), 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암의 질병과 관련되어 사용된다.

본 발명의 제 6 견지로, 본 발명의 바인딩 분자 또는 항체 분자 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

바람직한 구현으로 상기 바인딩 분자는 항체 분자이다.

본 발명의 제 7 견지로

(i) 하나 이상의 표적 세포를 제공하는 단계;

(ii) 본 발명의 제 1 구현에서 정의된 하나 이상의 바인딩 분자 또는 항체 분자를 제공하는 단계;

(iii) 상기 표적 세포에서 아포토시스를 유도하도록 (i)의 표적 세포를 (ii)의 바인딩 분자 또는 항체 분자에 노출시키는 단계

를 포함하는 시험관내에서 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 방법이 제공된다.

바람직한 구현으로 상기 바인딩 분자는 항체 분자이다.

바람직하게 단계 (i)에서 제공되는 표적 세포는 면역 세포 또는 상피 세포이다. 유리하게, 상기 면역 세포는 B 림프구이다.

편리하게, 상기 표적 세포는 암; 이에 한정하는 것은 아니나 류마티즘성 관절염 및 SLE을 포함하는 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 이에 한정하는 것은 아니나 HIV를 포함하는 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 질병과 연관된다.

사용된 용어의 의미

용어 "항체 분자"는 항체, 항체 프레그먼트, 또는 항체 유도체 중 어느 하나를 칭하는 것으로 취해질 것이다. 이에 한정하는 것은 아니나 면역글로블린 경쇄 및/또는 중쇄 가변부 및/또는 불변부의 파아지 디스플래이에 의해 생성된 단일쇄 변형 항체 분자, 또는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 면역측정법 형식으로 항원에 바인딩할 수 있는 다른 면역상호작용 분자들과 같이 와일드 타입 항체, 합성 합체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "항체 프레그먼트"는 항체, 항체 프레그먼트, 또는 항체 유도체 중의 어느 하나를 칭하는 것으로 취해질 것이다. 이에 한정하는 것은 아니나 면역글로블린 경쇄 및/또는 중쇄 가변부 및/또는 불변부의 파아지 디스플래이에 의해 생성된 단일쇄 변형 항체 분자, 또는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 면역측정법 형식으로 항원에 바인딩할 수 있는 다른 면역상호작용 분자들과 같이 와일드 타입 항체(즉, 4 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 분자), 합성 합체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "항체 유도체"는 항체의 프레그먼트(예, Fab 또는 Fv 프레그먼트), 또는 하나 이상의 아미노산 또는 상기 항체와 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 커플링을 촉진시키 위한 다른 분자들(예, 특히 티로신, 리신, 글루타민산, 아스파트산, 시스테인 아미노산들 및 이의 유도체들, NH₂-아세틸기 또는 COOH-말단 아미노기)을 라지 캐리어 단백질 또는 고형 지지체에 첨가하여 변형되는 변형 항체 분자와 같이 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 면역측정법 형식으로 항원에 바인딩할 수 있는 어느 변형 항체 분자를 칭한다.

용어 "ScFv 분자"는 V_H 및 V_L 파트너 도메인이 가요성 올리고펩타이드를 통해 연결되는 어느 분자를 칭한다.

용어 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"는 교환적으로 사용될 수 있으며 뉴클레오타이드의 헤테로폴리머 또는 이들 뉴클레오타이드의 서열을 칭한다. 이러한 문구는 또한 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있는 게노믹 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 칭하며, 펩타이드 핵산(PNA) 또는 DNA-라이크 또는 RNA-라이크 물질에 대해 센스 또는 안티센스 스트랜드를 나타낼 수 있다. 서열에서, 여기서 A는 아데닌, C는 시토신, T는 티민, G는 구아닌이며, N은 A, C, G 또는 T(U)이다. 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우, 서열에서 T(티민)는 U(우라실)로 대체된다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 세그먼트는 게놈의 프레그먼트 및 짧은 올리고뉴클레오타이드 링커로부터 집합될 수 있으며, 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드나 각각의 뉴클레오타이드로부터 집합되어 미생물 또는 바이러스 오페론 또는 진핵 유전자로부터 유래된 조절 요소를 포함하는 재조합 전사 유니트에서 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공한다.

용어 "폴리펩타이드" 또는 "펩타이드" 또는 "아미노산 서열"은 올리고펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열 또는 이의 프레그먼트 및 자연적으로 발생된 또는 합성 분자를 칭한다. 폴리펩타이드 "프레그먼트", "부" 또는 "세그먼트"는 적어도 약 5 아미노산, 바람직하게 적어도 약 7 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 약 9 아미노산, 그리고 가장 바람직하게 적어도 약 17 이상의 아미노산의 아미노산잔기 스트레치이다. 활성화되기 위해, 어느 폴리펩타이드는 생물학적 그리고/또는 면역학적 활성을 나타내기 위해 충분한 길이를 가져야 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"은 표시된 핵산 또는 폴리펩타이드가 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 단백질 등과 같은 다른 생물학적 마크로분자의 실질적인 부재하에 존재함을 나타낸다. 일 구현으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 표시된 생물학적 마크로분자의 적어도 95중량%, 보다 바람직하게 적어도 99중량%로 존재하도록 구성되는 식으로 정제된다(하지만, 물, 버퍼, 및 다른 소분자, 특히 1000달톤미만의 분자량을 갖는 분자가 존재할 수 있다).

본 명세서에 사용된 용어 "분리된"은 이의 천연 공급원에서 핵산 또는 폴리펩타이드와 함께 존재하는 적어도 하나의 다른 성분(예, 핵산 또는 폴리펩타이드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩타이드를 칭한다. 일 구현으로, 상기 핵산 또는 폴리펩타이드는 (무엇이든) 단지 용매, 버퍼, 이온, 또는 이와 동일한 용액내에 일반적으로 존재하는 다른 성분의 존재하에서 발견된다. 용어 "분리된" 및 "정제된"은 이들의 천연 공급원내에 존재하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.

용어 "재조합"이 본 명세서에 사용되는 경우, 폴리펩타이드 또는 단백질을 가리키며, 이는 폴리펩타이드 또는 단백질이 재조합(예, 미생물, 곤출 똔느 포유류) 발현 시스템으로부터 유도되는 것을 의미한다. "미생물"은 박테리아 또는 균류(예, 이스트) 발현 시스템에서 생성된 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 가리킨다. 산물로서, "재조합 미생물"은 네이티브 내생성 물질이 본질적으로 없으며 관련 네이티브 글리코실화를 수반하지 않는 폴리펩타이드 또는 단백질을 정의한다. 예를 들어, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)와 같은 대부분의 박테리아 배양에서 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질은 글리코실화 변형이 없을 것이며; 이스트에서 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질은 포유류 세포에서 발현되는 것들과 일반적으로 다른 글리코실화 패턴을 가질 것이다.

용어 "선택적 바인딩" 및 "바인딩 선택성"은 본 발명의 항체의 가변부가 배타적으로 본 발명의 폴리펩타이드를 인지 및 바인딩하나(즉, 폴리펩타이드 패밀리에서 발견되는 서열 동일성, 상동성, 또는 유사성에도 불구하고 다른 유사한 폴리펩타이드와 본 발명의 폴리펩타이드를 구별할 수 있음), 상기 항체의 가변부외에서, 그리고 특히, 상기 분자의 불변부내에서의 서열과 상호작용을 통해 다른 백단질(예, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A 또는 ELISA 기술에서 다른 항체)과 상호작용할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 항체의 바인딩 선택성을 검출하기 위한 스크리닝 어세이는 잘 알려져 있으며 당해 기술분야에서 일상적으로 실행된다. 이러한 어세이의 포괄적인 디스커션에 대해서는 Harlow et al.(Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y.(1988), Chapter 6을 참조 바람. 본 발명의 폴리펩타이드의 프레그먼트를 인지 및 바인딩하는 항체가 또한 예상되며, 단 상기 항체는 무엇보다도 먼저 상기 정의한 바와 같이 본 발명의 전장 폴리펩타이드에 대해 선택적이다. 본 발명의 전장 폴리펩타이드에 대해 선택적인 항체와 마찬가지로, 프레그먼트를 인지하는 본 발명의 항체는 단백질 패밀리에서 발견되는 고유의 서열 동일성, 상동성, 또는 유사성에도 불구하고 동일한 패밀리의 폴리펩타이드로부터 폴리펩타이드를 구별할 수 있는 것들이다.

용어 "바인딩 친화도"는 항체와 항원간의 바인딩 강도의 의미를 포함한다.

용어 "면역 세포"는 이에 한정하는 것은 아니나 B 세포 및 T 세포를 포함하는 숙주 면역 또는 염증 반응에 관련된 어느 세포를 의미한다.

용어 "상피 세포"는 상피의 세포를 의미한다. 상피는 세포의 층으로 구성된 조직이다. 상피는 몸의 내부 내면(예, 내피, 이는 혈관의 내부를 감싼다) 또는 외부(예, 피부) 프리 표면에서 발견될 수 있다.

피부의 가장 바깥층은 편평상피 세포로 구성되며, 점막은 입과 몸 공동의 내부를 감싼다. 다른 상피 세포들은 폐, 위장관, 생식 및 비뇨기관의 내부를 감싸며, 외분비선 및 내분비선을 형성한다. 상피 세포의 기능은 분비, 흡수 및 보호를 포함한다. 상피 세포는 기저막상에 위치한다.

바람직한 구현

본 발명의 특정 바람직한 견지를 구현하는 예는 하기 도면을 참조하여 설명될 것이다.

도 1 - 차등 전 세포( differential whole cell )/세포막소포 바이오패닝에 의해 분리된 scFv 는 고 표적 세포 특이성을 나타낸다.

차등 바이오패닐에 의해 분리된 scFv 클론은 E. coli TOP10 세포에서 발현되었으며 Ramos 또는 Jurkat 세포로 배양되었으며, (A) scFv 클론은 일차 스크리닝에 대해 발현되거나 (B) 72개가 무작위로 채집되고 scFv 클론을 재발현하였다. 바인딩된 scFv는 항-His MAb 및 Cy5-항-마우스 폴리클로날 Ab로 검출되었다. 세포 바인딩은 FMAT Macroconfocal High Throughput Screening 도구로 검출되었다. 세포 바인딩은 표적 Ramos 세포(Y축) 대 비표적 Jurkat 세포(X축)에 대한 평균 형광 강도로 나타내어진다. (C) 7개의 유니크 scFv 클론의 Ramos 세포(검은 막대) 및 Jurkat 세포(열린 막대)에 대한 바인딩. 컨트롤 scFv(ctrl)은 상기 세포들의 어느 세포에도 바인딩하지 않았다.

도 2. 항- Ramos scFv 의 아포토시스 유도

Ramos B 임파종 세포는 (바인딩 되지않은 과잉 항체를 제거하기 위해 간헐적인 세척을 하면서) 연속적으로 얼음상에서 항-Ramos scFv, 항-His mAb, 및 항-마우 스 폴리클로날 Ab로 배양되었으며, 24시간동안 37℃에서 5% CO₂의 가습 분위기에서 배양되었다. 그 다음 세포를 거둬들이고 Annexin V-AF488(AV) 및 프로피디움 요오드(PI)로 혼합 염색되었다. 세포들은 AV 및 PI 염색에 대해 (도 2B에 스퀘어 게이트로 정의된) 차등 명백성(differential positivity)을 기준으로, 생존성(AV-PI-, 도 2C의 검은 원), 초기 아포토시스성(AV+ PI-, 도 2C의 열린 삼각형), 또는 말기 아포토시스성/괴저성(도 2의 AV+ PI+, 열린 다이아몬드)로서 스코어링되었다. 결과를 (A) 사이드 스캐터에 대한 포워드 스캐터(FSC-Height) 및 (B) PI(FL-3)에 대한 AV(FL-1)를 작도함으로써 나타내었다. scFv B1 및 F1의 적정 효과가 또한 나타내어진다(C). 7개의 유니크 scFv 클론을 (D) Ramos 또는 (E) Raji B 임파종 세포로 여러 가지 농도에서 24시간동안 37℃에서 배양하였으며, 아포토시스 유도에 대한 영향을 조사하였다. 3개의 scFv; B1, B11, 및 C11은 모든 세포주에 대해 적정 활성을 나타내는 반면에 scFv B10, C10 및 G12의 아포토시스 유도 능력은 Ramos B 임파종 세포에 제한된다.

도 3. 분리된 항체의 특이성은 HLA - DR / DP , IgM 및 ICAM -1을 포함한다.

A) 50-600 × 10⁶ Raji B 임파종 세포를 비이온 세제 Triton X-100을 이용하여 0.5%v/v으로 린스하고 완전 인간 IgG₁ 형태의 B1(래인 1) 및 B11(래인 2) 항체 100㎍으로 면역침전시킨 후, 단백질 A 세파로즈로 교차결합시켰다. 50×10⁶ 세포로부터 얻어진 Ramos B 임파종 세포 용해물을 20㎍ C11(래인 3)의 침전에 사용하였다. 항체-특이 밴드를 절개하고 트립신 분해 처리하고 MALDI-TOF로 분석하였다.

B) B 임파종 세포에 대한 B1 IgG, B11 IgG, 및 C11 IgG 바인딩은 각각 항-HLA-DR/DP, 항-ICAM-1 또는 항-IgM 항체로 예비배양함으로써 특이적으로 차단된다.

항체 클론 B1, B11, 및 C11의 검색된 MALDI-TOF 항원 아이덴티티를 확인하기 위해, 상업적으로 이용가능한 항체를 이용한 블로킹 시험이 수행되었으며 플로우 사이토메트리로 분석되었다. 세포들은 (인간 항체에 비교하여) 10배 몰 과량의 종-매칭된 블로킹 항체로 예비블로킹된 다음, 어느 분리된 인간 항체 클론의 첨가가 이루어졌다. 30분 후, 세포들은 세척되고, 세포에 대한 인간 항체의 바인딩은 PE-접합 염소 항-인간 IgG(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 의해 검출되었다. 본 시험에 사용된 블로킹 항체는 B1에 대해 마우스 모노클로날 항-HLA DR(Sigma, clone HK14) 또는 항-CD40(Beckton Dickinson, clone 5C3)가 사용되었으며, B11에 대해 토끼 폴리클로날 항-ICAM-1(Abcam, ab7815-250) 또는 항-CD22(Abcam, ab25135-100)이 사용되었으며; C11에 대해 염소 폴리클로날 항-IgM(Zymed, South San Francisco, CA, USA, 62-7500) 또는 항-IgG(Zymed, 62-8400)이 사용되었다.

도 4. ICAM -1은 프로그래밍된 세포사멸을 매개할 수 있는 B 임파종 관련 세포 표면 리셉터이다 .

A. 2㎍/ml의 B11 또는 항-FITC-8(컨트롤) IgG1을 4 × 10⁵ CL-01 B 임파종 세포에 첨가하고, 2시간동안 얼음상에서 배양한 다음, 10㎍/ml 교차결합 2차 Fab'2 염소 항-인간 Fc 항체를 첨가하였다. 세포들을 37℃에서 6시간동안 배양하고 항체 배양의 영향을 투 인디펜던트 아포토시스 어세이을 통해 검출하였다. 세포들을 상술한 바와 같이 마찬가지로 AV/PI로 염색하거나(상위 패널) 5㎍/ml의 미토콘드리아막 탈분극제 JC-1으로 RT에서 30분간 배양하여 염색하였다(하위 패널). 아포토시스의 유도는 적색(y축)/녹색(x축) 형광 강도 비율의 감소에 의해 검출가능하다. (B) B11 항체의 B 임파종 조직에 대한 대표적인 바인딩을 나타내는 조직학 섹션. 미분화 대세포 B 임파종을 갖는 환자로부터 얻어진 냉동보존 조직을 B11 또는 FITC-8(컨트롤) scFv 항체로 염색하였다. 항체 바인딩은 DAB(갈색)로 검출되었다. 곤충 사진은 컨트롤 scFv로 염색한 것을 나타낸다. (C) CD45-PerCp-Cy5.5mAb 예비표지된 Ramos 세포는 도너-유래 PBMCs와 혼합되고, 다른 세포 집단은 형광색소-접합 CD-특이 항체 및 Alexa Flour 647 Zenon 예비표지된 B11 IgG1 또는 컨트롤 FITC-8 IgG1로 염색되었다. 다른 세포 집단에 대한 IgG B11 바인딩은 FL4 채널에서 기록되었다.

도 5. B 임파종 세포에 대한 IgG B1 및 IgG B11의 친화도

Raji 세포(좌측 패널, IgG B1) 또는 Ramos 세포(우측 패널, IgG B11)를 증가량의 방사성표지 IgG B1 또는 방사성표지 IgG B11 단백질과 함께 이에 상응하는 비표지 IgG 단백질 0.2mg/ml의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 특이적 바인딩은 총 바인딩으로부터 비표지된 경합 단백질의 존재하에서의 바인딩을 감함으로써 검출되었다. 바인딩된 IgG B1 또는 IgG B11 단백질의 양은 자유 IgG 단백질의 양이 증가함에 따라 증가하였으며, 가포화(saturable) 바인딩은 각각 ~30nM IgG B1 및 ~1nM IgG B11에서 도달하였다(상위 패널). Rosenthal-Scatchard 플롯 분석(하위 패널)은 IgG B1에 대해 Raji 세포당 400,000 작용성 바인딩 사이트를 갖는 ~3nM의 해리 상수를 나타내었으며, 그리고 IgG B11(Raji 세포)에 대해 47,400 작용성 바인딩 사이트를 갖는 ~0.3nM의 해리 상수를 나타내었다.

도 6 - 다른 기원의 종양 세포주에 대한 B1, B11, C11 IgG ₁ 의 바인딩

다른 암종 세포에 대한 B1, B11, 및 C11 항체에 의해 표적되는 항원의 항원 분포를 플로우-사이토메트리에 의해 조사하였다. 히스토그램은 표시된 바와 같은 MCF=7 유방암, HPAC 췌장암, PC-3 전립선암, LS174 결장암, 및 THP-1 단핵구성 백 혈병 세포에 대한 Rituximab 항-CD20 Mab(제1열 가장 앞 부분 피크), B1 IgG₁(제2열 피크), B11 IgG₁(제3열 피크), 또는 C11 IgG₁(제4열 가장 뒷 부분 피크)의 바인딩을 보여준다.

도 7 - 암 세포에서 B11 IgG ₁ 아포토시스 유도

전립선암 세포주 PC-3를 6웰 플래이트에서 80% 컨플루언시가 되도록 완전 성장 배지(RPMI 1640, 10% FCS, 10mM HEPES, 및 2mM L-글루타민이 보충됨)로 배양하였다. 전립선암 세포주 DU145는 10% FCS, 1mM 소디움 피루베이트, 및 1mM 비필수 아미노산이 보충된 Earl의 염을 갖는 MEM에서 배양되었으며, 흑색종 세포주 MDA MB 435의 유도체가 10% FCS로 DMEM에서 배양되었다.

아포토시스 어세이를 위해 세포들은 PBS에서 세척되고, 연속적으로 희석된 B11 IgG₁(또는 B1 IgG₁, Trastuzumab 또는 컨트롤에 대한 음성 항체 컨트롤)을 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1-2시간 배양하면서 바인딩이 이루어지도록 하였다. 세포들은 세척되고, 교차결합 항체, Fab'2 염소 항-인간 Fab'2를 10㎍/ml로 함유하는 완전 성장 배지가 첨가되었다. 세포들은 5% CO₂를 갖는 37℃의 가습 분위기에서 16-24시간동안 배양되었다. 세포들은 트립신처리로 수집되고 제조자의 지시에 따라 Alexa Fluor 488-Annexin V(AF488-AV) 및 프로피디움 요오드(PI)로 염색되었다. 아포토시스 세포 퍼센트는 식: % 아포토시스 세포 = 100 - %AF488 - AV/PI-/- 에 의해 검출되었다.

A) 등고성 플롯은 상기한 바와 같이 2㎍/ml IgG 또는 IgG B1과 함께 배양한 후 Annexin V 및 프로피디움 요오드 명백성에 비례한 PC-3 세포의 상대적인 분포를 보여준다.

B) 막대 그래프는 연속 희석된 B11 IgG₁ 또는 20㎍/ml B1 IgG₁과 함께 배양한 후 아포토시스 PC-3 세포의 평균 퍼센트를 보여준다.

C) 막대 그래프는 무항체 컨트롤, 10㎍/ml 네가티브 항체 컨트롤, 연속 희석된 B11 IgG₁, 또는 10㎍/ml Trastuzumb IgG₁과 함께 배양한 후 아포토시스 MDA MB 435 세포의 평균 퍼센트를 보여준다.

D) 막대 그래프는 무항체 컨트롤, 10㎍/ml 네가티브 항체 컨트롤, 연속 희석된 B11 IgG₁, 또는 10㎍/ml Trastuzumb IgG₁과 함께 배양한 후 아포토시스 DU145 세포의 평균 퍼센트를 보여준다.

도 8. B1 IgG ₁ 및 B1 IgG ₄ 는 교차결합제의 부재하에서 Raji B 임파종 세포의 직접적인 세포 독성을 유도한다.

Raji 세포는 B1 IgG₁, B1 IgG₄, Rituximab IgG₁, 또는 컨트롤 CT-17 IgG₁과 함께 20, 6.7 또는 2.2㎍/ml으로 24시간동안 배양되었다. 세포들은 수거되고 생존성은 Annexin V 및 프로피디움 요오드 이중 네가티브 세포의 퍼센트로 검출되었다.

도 9 - B1 항체에 대한 VH 및 VL 서열( 뉴클레오타이드 및 아미노산)

도 10 - B11 항체에 대한 VH 및 VL 서열( 뉴클레오타이드 및 아미노산)

도 11 - C11 항체에 대한 VH 및 VL 서열( 뉴클레오타이드 및 아미노산)

실시예 1 - B 임파종 관련 세포 표면 리셉터에 대한 특이성을 갖는 아포토시 스 유도 항체의 선별 및 스크리닝( 바이오패닝 )

세포 배양

본 연구에 사용된 세포주는 ATCC(Manassas, VA, USA) 또는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultren) GmbH(Braunschweig, Germany)로부터 획득되었으며, 다른 언급이 없는 한 10% FCS, 2mM L-Glutamine, 10mM HEPES 및 1mM Na 피루베이트(모두 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. Jurkat T 백혈병 세포주(클론 E6-1, TIB-152, ATCC), B 임파종 세포주 DOHH-2(ACC47, DSMZ), SC-1(ACC558, DSMZ), WSU-NHL(ACC58, DSMZ), JVM-2(ACC12, DSMZ), Jeko-1(20% FCS에서 성장한 ACC553, DSMZ), Rec-1(ACC 584, DSMZ), SP-53(Daibata et al. Cancer 1989; 64:1248-53), RL(CRL-2261, ATCC), Granta 519(DSMZ), NCEB-1(Saltman et al. Blood 1988; 72:2026-30), BJAB(Menezes et al. Biomedicine 1975; 22:276-84), Ramos(CRL-1596, ATCC), Raji(CCL-86, ATCC), Daudi(CCL-213, ATCC), CL-01(Cerutti et al. J Immunol 1998; 160:2145-57), 프리 B 세포 임파종 KM-3/Reh(CRL-8286, ATCC) 및 다중 골수종 MC/CAR(20% FCS가 보충된 IMDM(Invitrogen)에서 성장된 CRL-8083, ATCC)은 모두 미코플라즈마가 없으며 5% CO₂ 분위기를 이용하여 37℃, 습 분위기에서 배양되었다. 상기 세포들은 2 × 10⁵ - 1 × 10⁶ cells/ml로 유지되었다.

Jurkat 세포막 소포 제조

Jurkat 세포는 300 × g에서 15분간 500ml 버킷(Corning Inc. Life Sciences, New York, USA)에서 원심분리하여 수거되고, Dulbecco의 PBS(Invitrogen)에서 세척되고, 버퍼 A(1mM NaHCO₃, 1.5mM MgAc, pH 7.4)에 재부유하였다. 세포 농도는 약 5 × 10⁷ Jurkat cells/ml(100ml 버퍼 A내에 5 × 10⁹ cells)이었다.

세포 붕괴는 얼음상에서 10-30분간 하이포-삼투압 충격 처리(버퍼 A)를 한 다음 후속적으로 질소 캐비테이션 폭탄(Nitrogen cavitation bomb)(Parr Instrument Company, Moline, IL, USA)으로 질소 캐비테이션에 의해 달성되었다. 세포는 0℃에서 15분간 40bar(4,000kPa)의 일정 압력으로 유지되었다.

붕괴된 세포는 500㎕ 0.5M EDTA를 함유하는 250ml Sarstedt 튜브(Sarstedt AG & Co, Numbrecht, Germany)에 수집하여 2.5mM의 최종 EDTA 농도가 되도록 하였다. EDTA의 첨가는 막 소포의 집합을 억제한다. 균질현탁액(100ml)은 4 × 25ml Beckman 두꺼운 벽 로터 튜브(Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA)사이에 분리되었으며, 이는 깨지지 않은 세포, 핵, 및 무거운 미토콘드리아를 제거하기 위해 4℃에서 10분간 1900 × g(Sorvall SS34에서 4,000rpm)로 원심분리되었다.

상층액을 수집하고 펠렛 물질은 1mM EDTA를 함유하는 1mM NaHCO₃ 버퍼 25ml에 재부유하고, 재원심분리하였다(펠렛 크루드 Jurkat 멤브레인의 추가 회수). Jurkat 멤브레인은 일차 원심분리로부터 얻어진 멤브레인으로 풀링(pool)된다. 크루드 Jurkat 멤브레인 소포를 함유하는 상층액은 Beckman Type 45Ti 로터를 이용하여 40,000rpm(약 200,000 × g)에서 2.5시간동안 4℃에서 초원심분리되었다. 상층액을 부어 제거하고, 잔존하는 버퍼는 티슈(예, Kleenex^TM)에 튜브 모서리를 티핑하여 제거되었다

크루드 멤브레인 펠렛을 금속 막대의 보조로 Dounce 호모게나이저로 옮기고, 상기 호모게나이저에서 여러 회 조심스런 스트로크에 의해 2.5ml HES 버퍼(10mM Hepes, 1mM EDTA, 0.25M 수크로즈, pH 7.4)에서 재부유하였다. 이에 따라 80-100mg 단백질을 함유하는 2 × 10⁹ cells/ml의 멤브레인 서스펜션 농도 당량이 달성되었다.

전 세포/세포막 소포 경합 바이오패닝에 의한 파아지 Abs 의 선별

약 2 × 10¹³ 파아지 파티클을 간헐적인 혼합을 하면서 37℃에서 15분간 예비가열하고, 14,000 × g에서 15분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 새로운 Eppendorf 튜브에 옮겼다. 무지방 드라이 밀크를 2%(w/v)의 최종 농도로 첨가하였다. 2 × 10⁹ 세포(1라운드 선별; 2 × 10⁸ cells 2 및 3라운드 선별)로부터 유도된 Jurkat 멤브레인 소포 제조물을 얼음상에서 녹이고, 블로킹된 파아지 파티클과 혼합하였다. 그 혼합물을 얼음상에서 15분간 배양하였다.

4℃에서 6분간 1,200rpm에서 원심분리하여 5 × 10⁷ (5 × 10⁶2^nd 및 3^rd 라운드) Ramos 세포를 수거하였다. 상층액을 버리고 Ramos 세포를 밀크-파아지-Jurkat 멤브레인 소포 혼합물에서 재부유하였다. 서스펜션을 4시간동안 슬러우 엔드-오버-엔드 로테이션하에서 10℃에서 배양하였다.

세포/세포막 소포/파아지 혼합물을 바닥에 100%(트립판 블루 염색된) Filcoll-Paque PLUS(Amersham biosciences, Uppsala, Sweden) 0.5ml 및 2%(w/v) BSA/PBS(Ficoll-pillar)내에 오버레이된 40%(v/v) Ficoll 9.5ml을 함유하는 15ml Falcon 튜브(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)로 옮겼다. 원심분리기로부터 튜브를 제거하고 튜브캡을 조이고 밀봉하였다.

100% Ficoll을 함유하는 Falcon 튜브의 바닥 "팁"을 시가-쵸퍼를 이용하여 잘라내었다. 이에 따라, 멤브레인 소포 시트 및 세포핵을 포함하는 매우 고밀도 물질이 튜브로부터 제거되었다. 그 다음 튜브캡을 열어 튜브내부의 진공을 빼내고 (차단) 튜브 바닥의 개구부를 통해 액체가 드롭-와이즈로 배출되도록 하였다.

수거된 세포 부유물을 PBS로 1회 세척하여 과도한 Ficoll을 제거하였다. 펠렛을 1ml PBS로 재부유하고(이후 최종 세척은 수행하지 않음) 서스펜션을 새로운 Ficoll-pillar의 상부에 재로딩하고 세척 공정을 반복하였다(2라운드 및 3라운드로 2회).

PBS내에 용해된 76mM 시트르산(pH 2.5) 150㎕를 첨가하고 실온에서 5분간 배양하여 파아지를 용출하였다. 1M Tris-HCl(pH 7.4) 200㎕ 첨가하여 혼합물을 중화하였다. 용출된 파아지를 함유하는 상층액을 얻고, 세포를 300 × g에서 5분간 펠렛팅하였다. 파아지의 추가 용출은 세포 펠렛을 재부유하고 1ml 트립신으로 10분간 RT에서 배양하여 이루어졌다.

1mg/ml 아프로티닌 40㎕로 불활성화한 다음, 세포를 원심분리하고 용출된 파아지를 함유하는 상층액을 얻었다. 용출된 파아지를 에스케리차 콜라이(Escherichia coli) HB101F'를 감염시키는데 사용하였으며 상기 박테리아를 적절한 항생제 및 글루코즈를 함유하는 TB 배지에 플래이트하였다. 박테리아 콜로니를 세고, 플래이트로부터 스크래핑하고 다음 패닝 라운드를 위한 접종물로 사용하였다.

scFv 형태로의 전환, scFv 발현, 정제, 및 세포 바인딩의 분석

하기 3라운드의 선별로부터 얻어진 파지미드 풀을 EagI으로 다이제션하여 유전자 III를 제거하였다. 그 결과물인 벡터를 재결찰시켰다. 재결찰된 비절단 유전자 III를 함유하는 벡터를 EcoRI 효소를 이용한 다이제션으로 선형화하였다. 이에 따라 생성된 scFv 벡터 풀은 본질적으로 앞서 언급한 바와 같이(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000; 18:852-6.) 이. 콜라이(E. coli) TOP10 세포를 형질변환시키는데 사용되었다.

라지 500㎠ 아가 플래이트에 박테리아를 플래이트하고 각 클론들을 피킹하여 96-웰 플래이트에 옮기고, 자동화 시스템(Hallborn Biotechniques 2002; Suppl: 30-7)을 이용하여 37℃, 220rpm으로 밤새 배양하여 TB 배지에서 발현시켰다. 재조합 scFv 프레그먼트는 적절한 항생제를 함유하는 TB 배지에서 생성되었다.

Ramos 세포 및 Jurkat 비표적 세포를 표적하기 위한 scFv 클론 바인딩의 일차 스크리닝을 위해, 3차 라운드의 선별로부터 유도되고 상술한 바와 같이 생성된 960 scFv 클론과 함께 5,000 Ramos 또는 Jurkat 세포를 배양하였다. 세포들은 0.5㎍/ml 항-6xHis mAb(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 0.7㎍/ml Cy5-접합 염소 항마우스제(Amersham Biosciences)와 함께 배양되었다. 세포 바인딩은 8200 Cellular Detection System Fluorescene Macroconfocal High Throughput Screening(FMAT) 기구(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석되었다.

일차 스크리닝 후, 앞서 기술된 바와 같이(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000; 18:852-6)(Soderlind et al., 2000) DNA 시퀀싱을 위해 72개의 박테리아 클론을 무작위로(즉, 일차 스크리닝에서 표적 세포 대 비표적 세포 반응성에 관계없이) 피킹하였다. 플로우-사이토메트리에 의한 세포 표면 바인딩의 평가를 위해, Ramos 및 Jurkat 세포(모두 시험당 2 × 10⁵ cells로 첨가됨)를 각각의 scFv 클론과 함께 0.5% w/v BSA(DPBS-B)를 함유하는 PBS(Invitrogen)에서 2-10㎍/ml의 농도로 1시간동안 배양하였다.

300 × g에서 6분간 원심분리하여 세포들을 세척하였다. 그 다음 세포들을 FITC-접합 CD19 mAb 및 PE-접합 CD3 mAb(BD)와 함께 배양하였으며, 이는 각각 표적 세포와 비표적 세포의 후속적인 확인을 가능케 하였다. scFv 바인딩의 검출은 RPE-Cy5-스트렙타비딘(Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)으로 배양한 다음, 바이오티닐레이티드 항-6xHis mAb로 배양하여 이루어졌다. 세포들을 2차 및 3차 제제로 각각 40분 및 15분간 배양하였다. 모든 배양은 아이스-콜드 용액을 이용하여 얼음상에서 수행되었다.

차등적인 전 세포/세포막 소포 패닝

본 시험은 이들의 니이티브 세포 표면 환경에서 다르게 발현되는 항원을 표 적하는 항체를 분리해내는 새로운 패닝 프로토콜을 사용하였다. 3라운드의 경합 바이오패닝을 한 후, 전(whole) Ramos B 임파종 세포 및 Jurkat T 백혈병 세포로부터 유래된 막 소포를 이용하여 재조합 파아지 scFv가 분리되었다. 이들은 가용성 scFv로 전환되었으며 이. 콜라이(E. coli) TOP10 세포에서 발현되었다.

재조합 scFv는 표적(Ramos) 또는 비표적(Jurkat) 전 세포와 함께 배양되고 세포 바인딩에 대해 조사되었다. 발현된 482 scFv 클론은 약한 범위 내지 매우 강한 범위의 강도에서 Ramos 표적 세포에 선택적으로 바인딩하는 것으로 나타났기때문에(도 1A) 항체 클론의 표적 세포 항원의 특이성은 현저하였다. 단지 두 클론만이 비표적 Jurkat 세포를 약하게 염색한 것으로 확인되었다(도 1A).

그 다음 scFv를 디스플레이하는 분리된 파아지의 유전자형 다양성을 검출하였다. DNA 시퀀싱을 위해 72개의 scFv 클론을 무작위로(즉, 일차 스크리닝에서 검출된 바와 같이 바인딩 트로피즘에 관계없이) 피킹하였다.

클론들은 동시에 재발현되었으며 기술된 바와 같이 FMAT 기술에 의해 표적 세포 특이성(Ramos 대 Jurkat)에 대해 재평가되었다(도 1B). 7개의 다른 항체 유전자형이 이들의 다른 CDRH3 및 CDRL3 서열에 의해 검출된 바와 같이 확인되었다(데이타로 나타내지 않음).

항-Ramos scFv의 고 특이성은 3 칼라 플로우-사이토메트리로 분석한 다음, 동일한 수의 Ramos 및 Jurkat 세포로 배양하고 항-태그 항체에 의해 scFv 바인딩을 검출하여 확인되었다(도 1C).

표적 및 비표적 세포들은 형광색소 접합된 CD 특이적 모노클로날 항체를 이용하여 각각 CD19 및 CD3 발현에 의해 정의되었다. 7개의 유전자형적으로 독특한 scFv 클론들은 네가티브 컨트롤 scFv에 비해, Ramos 세포를 표적하는데 높고 가변적인 바인딩 강도를 나타내었으나, 비표적 Jurkat 세포에 대해서는 바인딩하지 않았다.

아포토시스 어세이

재조합적으로 생산된 scFv 프레그먼트의 리포폴리사카라이드 수준은 제조자(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)의 지시에 따라 데톡시겔 컬럼을 이용하여 감소되었다. 잔존하는 엔도톡신 수준은 LAL-아메보사이트 라이세이트 어세이(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA)에 의해 정량되었다.

모든 scFv 시료들은 0.1 IU/ml미만의 리포폴리사카라이드를 함유하는 것으로 발견되었다. 키메릭 항-CD20 항체 Mabthera^TM(Rituximab)을 Lund University Hospital(Lund, Sweden)로부터 구입하였다. 2 × 10⁵ B 임파종 세포(Raji 또는 Ramos)는 연속 희석되고 독이 제거된 scFv 배지로 얼음상에서 1시간동안 배양되었다.

세포들은 2차 항-6xHis mAb(5㎍/ml) 및 3차 염소 Fab'2 항마우스 Fab'2 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)로 연속 배양되었다. 간헐적인 세척으로 잉여의 바인딩되지 않은 항체 제제를 확실히 제거하였다. 세포들은 5% CO₂의 습 분위기에서 24시간동안 배양되었다.

전 IgGs가 아포토시스 유도를 위해 사용된 경우에 교차결합제는 (내생성 B 임파종 관련 표면 면역글로블린의 비특이적 교차결합을 피하기 위해) 비-IgG 항체 아이소타입과의 최소 교차반응성을 갖는 염소 Fab'2 항인간 Fcγ항체(Jackson ImmunoResearch)로 대체되었으며, 상술한 바와 같이 6시간동안 배양되었다.

달리 언급하지 않는 한, 아포토시스 세포는 Annexin V-AF488(AV) 및 프로피디움 요오드(PI)(모두 Molecular Probes, Invitrogen으로부터 구입함)를 이용한 혼합 염색과 그리고 후속적인 플로우-사이토메트리에 의해 검출되었으며, 세포들은 생존성(AV-/PI-), 초기 아포토시스성(AV+/PI-) 또는 말기 아포토시스/괴저성(AV+/PI+)으로 정의되었다. AV 및 PI 신호는 FACSCalibur 기구(BD Biosciences) 를 이용하여 각각 (텍스트에 나타낸 바와 같이) FL1 및 FL2 또는 FL3 채널로 기록되었다.

분리된 scFv의 기능성을 조사하기 위해 scFv 및 교차결합제를 이용한 세포의 연속적 배양 및 세척에 기초하여 고 처리 아포토시스 스크리닝 어세이를 셋업하였다. 아포토시스 어세이시 scFv 및 농도에 대한 의존성은 도 2 A-C에 나타내었으며, 여기서 선택된 scFv 클론 B1의 아포토시스 영향은 아포토시스의 유도를 보이지 않는 scFv 클론 F1의 아포토시스 영향과 비교되었다. 표적 항원 발현이 결핍된 Jurkat 세포는 검사된 어느 scFv와의 처리 후 아포토시스로부터 사멸하지 않았으며, 이는 아포토시스 유도가 표적 항원에 대한 바인딩에 의존하였음을 나타낸다(데이타로 나타내지 않음).

확립된 scFv-아포토시스 어세이를 이용하여 Ramos 및 Raji B 임파종 세포에 대한 아포토시스를 위해 클론들을 스크리닝하였다. scFv-유도된 아포토시스 영향은 Rituximab 항-CD mAb에 의해 유도된 경우와 비교되었다(도 2D). 3개의 scFv 클론들 - B1, B11 및 C11 - 은 Ramos 및 Raji 세포 모두에 대해 현저한 아포토시스를 유도한 것으로 확인되었다(도 2 D 및 E). Raji 세포에 바인딩하지 못한 scFv 클론들은 아포토시스를 유도하지 못하였기 때문에, Raji 세포에 대한 scFv에 의한 아포토시스의 유도는 이들 세포에 대한 바인딩과 서로 관련되었다(도 2D).

B1, B11 및 C11 클론들은 완전 인간 IgG₁ 항체로 옮겨졌다. 이들의 특이성 및 기능성 모두 리포매이팅후 그대로 유지되었으며, 이는 광범위한 패널의 B 임파종 세포주에 대한 이들의 강한 바인딩 및 강력한 세포독성으로 입증된다(표 1). 특히, 아포토시스 유도는 신속하였으며, 여러 세포주에서 3 내지 6 시간 후에 이미 아넥신 V 파지티브 아포토시스성 세포의 최대 퍼센트에 이르렀다(표 1, 그리고 데이타로 나타내지 않음).

IgG 생성 및 내독소 스크리닝 어세이

scFv 항체 프레그먼트는 변형 pCDNA3 벡터(Norderhaug et al. J Immunol Methods 1997; 204:77-87)내로 클로닝하여 전장 인간 IgG₁λ 형태로 전환되었으며, Lipofectamine 2000 시약을 제조자(Invitrogen)의 지시에 따라 사용하여 HEK293 세포내로 일시적으로 트랜스펙션되었다.

인간 IgG는 MabSelect protein A column(Amersham Biosciences)상에서 소비된 배지로부터 정제되었다. 제조물의 순도는 SDS-PAGE 분석에 의해 검출시 >98%이었다. 항체 제조물은 스크리닝되었으며 본 시험에서 사용된 농도에서 그리고 LAL 변형세포 라이세이트 시험(Cambrex Bioscience)에 의해 검출시 <0.1 IU/ml 내독소를 함유하는 것으로 발견되었다.

실시예 2 - 항체 특이성의 분석

항원 확인

표적 항원의 아이덴티티는 B 임파종 세포 라이세이트의 면역침전에 의해 검출되었다. 세포들(항체 및 세포주에 따라 라이시스 버퍼 ml당 50-600 × 10⁶)을 원심분리에 의해 수거하고, PBS로 2회 세척하고 세제 Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 0.5% v/v로 함유하는 라이시스 버퍼(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 및 컴플리트 EDTA-프리 프로테아제 인히비터 칵테일(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany))에서 15분간 배양하였다.

세포 찌꺼기를 통상적인 테이블탑 원심분리기에서 16,000 × g에서 15분간 스핀 다운시키고, 가용성 단백질을 Protein A Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences)(반응물의 1/10 체적)로 온 로테이션으로 1시간 예비-클리어링하였다. 모든 시료에 대해, 1ml의 예비-클리어링된 세포 라이세이트를 2시간동안 20-100㎍의 어느 인간 항체로 면역침전하였다. Protein A Sepharose 4 Fast Flow를 다시 첨가하고 30분간 배양하였으며, 이후 면역 복합체는 라이시스 버퍼로 광범위하게 세척되었으며, 5분간 가열하고, 최종적으로 시료 버퍼(1X NuPAGE LDS 시료 버퍼, 1X NuPAGE 시료 환원제)에 재부유하고, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel(모두 Invitrogen으로부터 구입)에서 분리하였다.

염색(Simply Blue Safestain, Invitrogen) 후, 관심있는 단백질 밴드를 SDS-PAGE로부터 잘라내고 기재된 바와 같이(Edvardsson et al. Electrophoresis 1999; 20:935-42) 트립신 다이제션 처리하였다.

간략히, 겔 플러그를 교반하에 50% 아세토니트릴(ACN) 200㎕로 3회 세척하여 탈염 및 이퀼리브레이팅하였다. SpeedVac 농축기(Savant, Farmingdale, NY, USA)에서 15분간 건조한 후, 10mM DTT/100mM NH₄HCO₃ 25㎕를 첨가하여 환원시키고, 1시간동안 56℃에서 배양하고, 55mM 요오드아세트아미드/100mM NH₄HCO₃ 25㎕를 첨가하고 실온에서 45분간 배양하여 알킬화하였다.

100mM NH₄HCO₃에서 2회의 추가 10분 세척 단계 후 50% v/v ACN으로 1회 세척한 다음, 겔 조각들을 SpeedVac 농축기에서 건조하고, 재팽창시키고 25mM NH₄HCO₃에 용해된 15ng/㎕ 트립신(Promega Corporation, Madison, WI, USA) 15㎕에서 37℃에서 밤새 다이제션하였다. 50% v/v ACN/ 1% v/v TFA를 첨가하고 실온에서 10분간 배양하여 펩타이드를 추출하였다. 추출물 1㎕를 MALDI 시료 플래이트상에 스포팅하고 건조하였다. 매트릭스 용액 1㎕(75% v/v ACN/1% v/v TFA내에 용해된 5mg/ml 알파- 시아노-4-히드록시 신남산(CHCA))을 펩타이드의 상부에 스포팅하였다.

펩타이드 질량은 Applied Biosystems 4700 MaldiWorkstation을 이용하여 검출되었다. 단백질은 Mascot 서치 기구(Matrixscience, UK)를 이용한 펩타이드 질량 핑거프린트 데이타베이스에 의해 확인되었다. 클론 B10, C10, 및 G12의 항원 특이성은 scFv만 제외하고 유사한 방법을 이용하여 확인되었으며, 항-His 코팅된 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)를 면역침전에 사용하였다.

완전 항체 형태로의 전환 이후, B1, B11 및 C11 IgG가 Raji 및 Ramos B 임파종 세포로부터 항원을 침전시키기 위해 사용되었다. IgG B1은 각각 약 28 및 34kDa의 두 밴드를 침전시켰다(도 3A, 래인 1). 이러한 밴드를 함유하는 겔 슬라이스가 제조되고 트립신으로 다이제션하고 질량 스펙트로메트리에 의해 분석되었으며, 표적 항원으로서 HLADR/DP를 확인하였다.

HLA-DR/DP에 대한 IgG B1의 특이성은 상업적으로 구입가능한 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 및 HLA-DR/DP 단백질의 검출에 의해, 그리고 상업적으로 구입가능한 HLA-DR 특이 모노클로날 항체를 이용한 세포의 예비배양 후 B1 IgG 바인딩의 블로킹에 의해 모두 입증되었다(도 3B).

IgG B11 및 C11 정의된 항원의 확인은 유사한 방법을 이용하여 확립되었다. IgG C11은 B 세포 리셉터 μ 사슬의 멤브레인 바인딩된 형태로서 확인된 68kDa 단백질 밴드를 침전시키는 것으로 확인되었다(도 3A, 래인 3). IgG B11은 90kDa 단백질을 침전시켰으며 이는 세포내 세포 부착 분자-1(ICAM-1)으로 확인되었다(도 3A, 래인 2). ICAM-1에 대한 IgG B11의 특이성 및 IgM에 대한 C11 IgG의 특이성은 상업적으로 구입가능한 항체를 이용한 MS-MS 분석, 항체 블로킹 시험(도 3B), 및 웨스턴 블롯 분석(데이타로 나타내지 않음)에 의해 확인되었다.

클론 B10, C10 및 G12의 특이성은 scFv 및 면역침전용 항-His 코팅된 자기 마이크로비드를 이용하여 검출되었다. 세 개의 scFv 클론은 68kDa의 단백질 밴드를 침전시켰으며, 이들 밴드를 함유하는 트립신 다이제스션된 겔 슬라이스의 MS-분석은 표면 IgM에 대한 이들의 특이성을 나타내었다. 아마도 이러한 항체들은 이들 중 어느 것도 말초 혈액 B 임파종 또는 다른 IgM 파지티브 B 세포주와 교차반응하지 않기때문에 Ramos IgG 유전자형을 인식한다.

실시예 3 - 항체 친화도 분석

B1 및 B11 면역글로블린의 시험관내 ( in vitro ) 요오드화

[¹²⁵I]를 이용한 1mg/ml의 IgG₁ B1 또는 IgG₁ B11 단백질의 요오드화를 요오드겐 예비코팅된 요오드화 튜브(Pierce)를 이용하여 PBS에서 10분간 수행되었다. PD-10 컬럼(Amersham Bioscience)에서 탈염하여 프리 [¹²⁵I] NaI를 제거하였으며, 이는 단백질 ng당 1000-1600 범위내의 특정 방사능을 생성하였다. [¹²⁵I] IgG₁ B1 및 [¹²⁵I] IgG₁ B11이 항체 친화도의 검출을 위해 사용되었다.

IgG B1 및 IgG B11 친화도 상수의 검출

방사성요오드화 IgG B1 또는 IgG B11은 DPBS-B-hIgG(0.2mg/ml 인간 IgG를 함유하는 DPBS-B)에서 간헐적으로 혼합하면서 얼음상에서 2시간동안 B 임파종 세포와 함께 배양되었다. 비특이적 바인딩은 비표지된 IgG B1 또는 IgG B11 단백질 0.2mg/ml의 존재하에서 적절히 검출되었다. 분석은 3회 반복 수행되었다.

각 튜브내에 담긴 40% v/v Ficoll/DPBS-B 쿠션 상부에 적재하고 400 ×g에서 6분간 4℃에서 원심분리하였다. 시료들을 -80℃로 냉동하였다. 세포 펠렛 및 세포 상층액을 분리하고 튜브를 반으로 자른 이후에 각각 감마 카운터에서 ¹²⁵I-IgG 단백질 함량에 대해 분석하였다.

항체 친화도 상수(Kd 값) 및 세포당 에피토프 수는 앞서 기술된 바와 같이(Brix et al. J. Clin. Invest. 1998; 102:283-93), Rosenthal 등(Anal Biochem 1967; 20:525-32), Bylund 및 Yamamura(Methods in Neurotransmitter Analysed. New York: Raven Press Ltd., 1990), 및 Marquardt(J. Soc. Indust. Appl. Math 1963; 11; 431-41)에 따라 스캐챠드 플롯 분석으로부터 검출되었다.

HLA-DR 및 ICAM-1에 대한 IgG B1 및 IgG B11 바인딩은 이에 상응하는 비표지 IgG 단백질 0.2mg/ml의 존재 또는 부재하에서 4℃에서 Raji 또는 Ramos 세포와 함께 방사성요오드화 단백질을 배양함으로써 특성화되었다. [¹²⁵I]IgG의 세포 표면에 대한 특이적 바인딩은 총 바인딩으로부터 비특이적 바인딩(과도한 비표지 IgG의 존재하에서 바인딩)을 감함으로써 계산되었다.

Raji 세포에 대한 특이적 IgG B1 바인딩의 포화는 ~30nM IgG B1에서 도달하였다(도 5). Rosenthal-Scatchard 플롯 분석은 2가 에피토프-IgG 상호작용으로 추정되는 Raji 세포당 400,000 작용성 바인딩 사이트를 갖는 ~3nM의 해리 상수를 나타내었다(도 5). 마찬가지로, IgG B11의 해리 상수는 Ramos 세포당 47,400 리셉터를 갖는 ~0.2nM로 검출되었다.

[표 1]

완전 인간 B1, B11 및 C11 항체는 동적인 바인딩 패턴을 나타내며 다양한 B 임파종 세포주에서 아포토시스를 유도한다.

종양 분류	세포주	항체 클론-특이성
		B1-HLA DR/DP		B11-ICAM-1		C11-IgM		Rituximab-CD20
		MFIb	아포토시스 유도^a	MFI	아포토시스 유도	MFI	아포토시스 유도	MFI	아포토시스 유도
여포형 임파종	DOHH	140	-	100	-	90	-	480	++
	WSU-NHL	280	+	0	-	60	-	790	+
	SC-1	170	+	0	-	50	-	50	-
	RL	50	-	100	-	210	-	200	+
맨틀 세포 임파종	Granta 519	370	++	260	+	60	+	360	+++
	JVM-2	650	+	100	-	10	-	520	+
	Rec-1	0	-	380	-	900	-	580	+
	SP-53	500	++	90	-	360	-	740	++
	NCEB-1	750	+	340	+	10	-	430	+
	Jeko-1	1000	+++	30	+	1040	++	1160	+++
버킷 임파종	Ramos	125	+	100	++	240	+++	300	+++
	Raji	550	+++	420	+	20	+	400	+
	Daudi	200	+	150	+	450	+	480	++
	BJAB	530	+	310	+	510	+	530	++
	CL-01	940	+++	600	++	60	+	970	++
전구 B 세포 임파종	Reh/KM-3	240	+++	20	-	0	-	0	-
다발성 골수종	MC/CAR	290	++	120	+	0	-	110	-

^a아포토시스 유도; 염소 항-인간(감마) Fc 특이 항체와 교차결합된 어느 인간 항체와 함께 6시간 배양 후 생존 세포의 퍼센트로 검출됨; -, 영향받지 않은 생존성; +, 95-80%; ++, 79-60%; +++, 59-40%, 컨트롤(인간 FITC-8 IgG1)과 비교한 생존 세포. 결과는 3회의 독립적인 실험에서 이중 시료에 기초한 것이다.

^bMFI; 2차 RPE-접합 염소 항-인간 IgG 항체의 평균 형광 강도. 컨트롤 인간 FITC-8 IgG 항체의 세포주 의존성 MFI 값은 각 인간 항체의 MFI로부터 감하여졌다.

실시예 4 - ICAM -1은 아포토시스 유도 특성을 갖는 B 임파종 관련 항원이다.

Ramos 세포에 대한 IgG 바인딩의 플로우 - 사이토메트리 분석

Ramos 세포(13 × 10⁶)를 얼음상에서 45분간 배양하여 CD45-PerCp-Cy5.5 mAb로 염색하고, DPBS-B로 세척하고 표지 되지않은 정제된 PBLs과 혼합될 때까지 얼음상에 두었다.

2명의 건강한 지원자의 연막(buffy coats)을 Lund 대학병원으로부터 얻었다. 연막은 PBS에 1:2로 희석되고, 500 × g(1500rpm Beckman Spinchron 원심분리기)에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 완전히 비우고, 1% 열 비활성화 FCS(DPBS-HI)를 함유하는 DPBS에서 재부유하여 세척되었다. 세척은 2회 반복되었다. 적혈구 세포는 실온에서 15분간 적혈구 용해 용액(BD Biosciences)으로 배양하여 용해되었다. 세포들은 60 × g(667rpm Beckman Spinchron 원심분리기)에서 10분간 원심분리하여 세척되었으며, 상층액은 조심스럽게 흡입되었다. 세포들은 트립판 블루 시약(Invitrogen)으로 사멸 세포를 배제하여 염색하고, DPBS-HI로 세척하고, 펠렛팅하고 (Fc 리셉터를 블로킹하는) 200㎍/ml 인간 정제 IgG를 함유하는 DPBS-B로 재부 유하였다.

각 도너 및 시험 조건에 있어서, 약 2.5 × 10⁶ 백혈구가 1.6 × 10⁵ PerCpCy5.5 예비표지된 Ramos 세포와 혼합되었다. 마우스 모노클로날 CD3-FITC, CD56-PE, 및 CD19-PerCpCy5.5 항체(BD Bioscience)가 첨가되고, 그 혼합물을 표지된 인간 IgG를 첨가할 때까지 얼음상에서 배양하였다. n-CoDeR 인간 IgG 항체 및 AF647 Fab 프레그먼트를 갖는 양성 컨트롤 항-CD20 마우스-인간 키메릭 항체 Rituximab(Molecular Probes, Invitrogen)의 표지는 제조자의 지시에 따라 수행되었다.

간략히, 각 4㎍의 IgG B1, B11, C11, 및 Rituximab 항체를 20㎕의 AF647-Fab 표지 시약과 함께 실온에서 5분간 배양하였다. 20㎕ 인간 IgG 블로킹제를 첨가하고 5분간 추가 배양한 다음, AF647-표지된 IgG를 DBPS-B로 3배 연속 희석하였으며, 희석된 IgG 단백질은 혼합된 Ramos/PBL 세포 용액에 첨가되었다.

시료들은 1시간동안 배양되고, DPBS-B로 세척 및 재부유되고, 4-색 분석을 위한 기구의 적절한 보정후 플로우-사이토메트리에 의해 다른 세포 부차집단에 대한 바인딩에 대해 분석되었다. Ramos 세포는 B 림프구 PerCpCy5.5^low 집단과 현저히 다른 PerCpCy5.5^high 집단으로 확인되었다.

면역조직학

미분화 대세포(Anaplastic Large Cell) B 임파종(1명의 환자), 중심모세포/중심세포 B 논-호즈킨 림프종(3명의 환자), 및 B 세포 만성 림프성 백혈병(1명의 환자)을 갖는 환자의 저온보존된 임파절 생체조직을 Lund 대학(Lund, Sweden)의 병리학부로부터 얻었다. 저온보존된 조직의 8마이크로미터 섹션을 아세톤에 10분간 4℃에서 고정하였다. 내생성 바이오틴-바인딩 활성은 Avidin 및 Biotin(Avidin/Biotin 블로킹 키트, Invitrogen)로 각 20분간 연속 처리하여 차단되었다.

조직들은 5㎍/ml 컨트롤 scFv 또는 B11 scFv로 1시간동안 배양되었다. 세척후, 섹션들은 바이오틴-접합된 마우스 항-His mAb(R&D 시스템)과 30분간 배양되었다. scFv 바인딩은 ABC Complex/ HRP 시약(Dako Cytomation)으로 30분간 처리하고 후속적으로 DAB로 5분간 배양하여 검출되었다.

섹션들은 Leica DMR 광/형광 현미경의 상부에 고정된 Leica DC 300F 디지탈 카메라를 이용하여 사진촬영되었다.

인간 조직의 취급은 Lund 대학병원의 지방 윤리 위원회의 권장에 따랐다.

미토콘드리아막 탈분극 어세이

미토콘드리아막 탈분극 어세이는 앞서 기술된 바와 같이(Kim et al. Mol Biol Cell 2004; 15:420-34) 분석되었다. 간략히, 항체-처리된 세포들은 5㎍/ml로 JC-1 시약(Molecular Probes)와 혼합되고 실온에서 30분간 배양되었다. 세포들은 아이스-콜드 PBS로 2회 세척되고 300㎕ PBS로 재부유되고 FACS Aria(BD Biosciences)상에서 분석되었다. 녹색 및 적색 형광은 각각 494/518nm(FL-1) 및 595/615nm(FL-2) 밴드패스 필터를 통해 수집되었다.

ICAM-1은 이방향성 시그널링을 유도할 수 있는 면역글로블린 상과(Marlin et al. Cell 1987; 51:813-9)의 글리코단백질이다(Rothlein et al. J Immunol 1994; 152:2488-95; Vyth-Dreese et al. Blood 1995; 85:2802-12). ICAM-1은 B 임파종 세포에서 프로그램밍된 사멸에 관련되는 것으로 종래에는 입증되지 않았다.

따라서, 본 발명자들은 세포막 포스파티딜 세린 전좌 이외의 수단에 의해 IgG B11 유도 세포 사멸이 활동적인 프로세스이었는지 확인하는 것을 원하였다.

미토콘드리아막 탈분극은 아포토시스의 검증으로서 선택되었다. 왜냐하면, 이는 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴-카보시아닌 요오드(JC-1 시약)를 이용한 세포 염색으로 검출될 수 있는 카스파아제 의존성 및 카 스파아제 독립성 아포토시스의 공통적인 특징이기 때문이다.

본 명세서의 Annexin V/프로피디움 요오드 어세이(도 4A, 상위 패널)에 따라, IgG B11은 JC-1 시약으로 염색한 후 플로우-사이토메트리 분석에 의해 검출된 바와 같이 CL-01 B 임파종 세포에서 미토콘드리아박 탈분극을 유도하는 것으로 발견되었다(도 4A, 하위 패널).

ICAM-1 발현은 세포배양 도중에 일반적인 상향 조절로부터 일어나는 시험관내(in vitro) 인공 산물이었다는 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 다른 B 임파종 종양을 갖는 5명의 다른 환자로부터 얻어진 조직에 대해 IgG B11의 바인딩을 조사하였다.

면역조직화학법에 의해, IgG B11은 항-HLA-DR 항체 IgG B1에 상당하거나 보다 약간 낮은 강도로 상기 5 임파종 조직에 대해 강한 바인딩을 나타내었다(표 2).

본 발명자들은 그 다음 휴면 말초 혈액 백혈구와 비교한 B 임파종에 대한 IgG B11의 바인딩을 조사하였다. Ramos는 저수준의 에피토프 발현을 나타내나 B11 유도된 아포토시스에 대해 여전히 현저한 민감성을 갖는 것에 기초하여 대표적인 B 임파종 세포주로 선택되었다. 예비표지된 Ramos 세포와 전혈 말초 혈액 백혈구 및 그리고 IgG B1, B11 또는 C11 항체의 혼합 배양 후, 플로우-사이토메트리 분석 결 과 IgG B11은 Ramos 세포에 대해 강한 바인딩을 나타내었다.

보다 중요하게, B11은 정상적인 말초 혈액 백혈구와 비교하여 Ramos B 임파종 세포에 대해 상기 3 항체의 가장 차등적인 바인딩(가장 강한 항원 상향 조절)을 나타내었다(도 4C, 데이타로 나타내지 않음). IgG B11 바인딩은 0.1㎍/ml에서 이미 피크를 나타내었으며 모노사이트 세포에 비하여 Ramos에 대해 3.7배 상향 조절되었으며(MFI 654 대 176), 말초 혈액 B 림프구에 비하여 Ramos에 대해 8.3배 상향 조절되었으며(MFI 654 대 78), 그리고 NK 세포에 비교하여 23배 상향 조절되었다. 다른 모니터링된 말초 혈액 백혈구 서브세트에 대한 바인딩은 네가티브이었다.

[표 2]

ICAM -1은 다른 기원의 B 임파종 조직에서 강하게 발현된다.

환자 ID	종양 분류	항체 클론-특이성
환자 ID	종양 분류	B11-ICAM-1	B1-HLA-DR/DP
A	B-CLL^c(저 흑색종 논-호즈킨 임파종)	+	++
B	미분화 대세포 B 세포 임파종	++	+++
C	중심모세포-중심세포 B 논-호즈킨 임파종	++/+++	++
D	B-CLL/B-PLL^d	++	+++
E	중심모세포 B 논-호즈킨 임파종	++/+++	+++
F	중심모세포-중심세포 B 논-호즈킨 임파종	++	+++

^cB-CLL = B- 만성 림프성 백혈병, dB-PLL = B- 프로 림프성 백혈병. +의 증가수는 보다 강한 염색을 표시한다.

실시예 5 - 플로우 사이토메트리에 의해 측정된 여러 기원의 종양 세포주에 대한 B1, B11, C11 IgG ₁ 의 항원 분포.

다른 암종 세포주에서 주로 B11에 대한 인간 항체 표적 항원의 항원 분포가 조사되었다. 세포들(MCF-7 및 MDA MB 435S 유방암, JAR 및 JEG-3 융모상피암, A549 폐암, TCC-SUP 방광암, MDA MB 435 흑색종, HPAC,PANC-1 및 BxPC-3 췌장암, PC-3 및 DU145 전립선암, LS174 T, CaCo2, 및 Lovo 결장암, 및 THP-1 모노사이트 백혈병 세포)은 PBS로 세척되고 완전 배지(200,000cells/50㎕ 시료)로 4 × 10⁶ cells/ml으로 재부유되었다. B1 IgG₁, B11 IgG₁, C11 IgG₁, 네가티브 컨트롤 FITC-8 IgG₁, 및 Rituximab 항-CD20 mAb을 완전 배지(50㎕/시료)로 3-10배 연속 희석하였다(10-0.1pg/ml). 세포들을 얼음상에서 1시간동안 상기 항체들 중 하나와 함께 배양하고, PBS/BSA 0.5%로 재부유하고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 완전 흡입하였다. 세포들을 PBS/BSA 0.5%로 1/50으로 희석된 PE-접합 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Caltag Laborotaries, Cat no: H10104)과 함께 얼음상에서 30분간 배양하였다. 300㎕ PBS/BSA 0.5%로 재부유한 다음, FACScan 기구를 이용하여 세포들을 IgG 바인딩에 대해 분석하였다.

PC-3 전립선암 세포들은 이들 세포에 대한 B11 IgG의 강한 바인딩에 의해 입 증된 바와 같이 ICAM-1의 강한 발현을 나타내었다(도 6). MCF-7 유방암, HPAC 췌장암, 및 LS174 T 결장암 세포들은 또한 전립선암 세포에 비해 낮은 강도이기는 하나 ICAM-1를 발현하는 것으로 발견되었다. 이와 대조적으로, THP-1 모노사이트 백혈병 세포는 ICAM-1을 발현하지 못하였다. 초기에 시험된 모든 암세포주들은 각각 Rituximab IgG, B1 IgG, 및 C11 IgG의 바인딩 결핍에 의해 입증된 바와 같이 CD20, HLA-DR/DP, 및 IgM 발현에 대해 네가티브인 것으로 발견되었다. 추가적인 암세포주들에 대한 추가 시험 결과 조사된 모든 암세포들은 ICAM-1 발현에 파지티브인 것으로 발견되었다(표 3).

[표 3]

ICAM -1은 다른 기원의 암세포주에서 강하게 발현된다.

종양 세포 타입	세포주	MFI
융모상피암	JAR	2000
융모상피암	JEG-3	1600
전립선암	DU145	2200
전립선암	PC-3	1500
췌장암	BxPC-3	2000
췌장암	PANC-1	3800
결장암	CaCo2	800
결장암	Lovo	1600
폐암	A549	800
방광암	TCC-SUP	3200
흑색종	MDA MB 435	4000
유방암	MDA MB 435S	800

실시예 6 - 암세포에서 B11 IgG₁ 아포토시스 유도

B11 IgG₁은 실시예 5에서 암세포에 강하게 바인딩하는 것으로 나타났다. 본 실시예는 암세포들에서 이러한 항체의 아포토시스 유도 특성을 조사하였다.

세포들은 완전 성장 배지가 담긴 6-웰 플래이트에 실험 시작전 3일에 심어졌다. 세포들은 실험 당시 50-75%의 컨플루언시를 나타내었다. 세포들을 아이스-콜드 PBS로 세척하고 표시된 바와 같이 연속 희석된(완전 성장 배지에 도면에 나타낸 바와 같이 20 - 0.02㎍/ml) B11 IgG₁, 20㎍/ml 컨트롤 B1 IgG₁, 10㎍/ml 네가티브 컨트롤 IgG₁ 또는 10㎍/ml Trastuzumab IgG1과 함께 4℃에서 1-2시간 배양하였다. 세포들을 아이스-콜드 PBS로 세척하고 (완전 성장 배지로 1010㎍/ml로 희석된) 2차 F(ab'2) 염소 항-인간 F(ab'2) 항체를 첨가하였다. 세포들을 37℃의 5% CO₂의 습 분위기에서 16-24시간동안 배양하였다. 총 세포는 상층액을 일차 분리한 다음 PBS 세척하고 잔존 부착 세포들을 트립신 처리하여 수집되었다. 효소 반응은 10% 열-비활성화 FCS(fetal calf serum)을 함유하는 PBS에서 재부유하여 종료되었다. 세포들은 아이스-콜드 PBS로 세척하고, Annexin V/프로피디움 요오드 염색하고 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 생존성/아포토시스에 대해 분석하였다.

B11 IgG₁은 특이적으로 그리고 적정가능한 방식으로 암세포주에서 아포토시스를 유도하는 것으로 나타났다(도 7). PC-3 세포에 바인딩하지 않은 컨트롤 IgG B1은 역시 PC-3 세포에서 아포토시스를 유도하지 않았다. 네가티브 컨트롤 IgG₁ 또는 Trastuzumab IgG₁은 DU145 또는 MDA MB435 세포에서 아포토시스를 유도할 수 없었다.

실시예 7 - 약학 배합물 및 투여

본 발명의 다른 견지는 본 발명의 제 1 견지에 따른 화합물을 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 배합물을 제공한다.

바람직하게, 상기 배합물은 활성 성분의 일일 투여 또는 유니트, 일일 서브투여 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 유니트 조제이다.

본 발명의 화합물은 활성 성분을 포함하는 약학 배합물의 형태로, 임의로 무독성 유기 또는 무기 산, 또는 염기, 첨가염의 형태로, 약학적으로 허용되는 투여 형태로 일반적으로 구강 투여되거나 어떠한 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 치료하고자 하는 질병 및 환자에 따라, 조성물은 투여 경로 뿐만 아니라 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.

인간을 치료하는 경우에, 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있으나 의도된 투여 경로 및 표준 약학 실행과 관련되어 선택된 일반적으로 적절한 약학 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 투여될 것이다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 즉시-, 지연- 또는 조절된-방출 적용을 위해 정제, 캡슐, 배주(ovules), 엘릭시르, 용액 또는 서스펜션의 형태로 구강적으로(orally, buccally) 또는 설하 투여될 수 있으며, 이는 향료 또는 착색제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 공동내 주사를 통해 투여될 수 있다.

이러한 정제는 미정질 셀룰로오즈, 락토오즈, 소디움 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 디베이직 칼슘 포스페이트 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 소디움 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로오즈 소디움 및 특정 복합 실리케이트와 같은 붕괴제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오즈(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로오즈(HPC), 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 바인더를 함유할 수 있다.

또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탤크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

유사한 타입의 고형 조성물이 젤라틴 캡슐내 필러로서 또한 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토즈, 전분, 셀룰로오즈, 밀크 슈가 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 서스펜션 및/또는 엘릭시르에 있어서, 본 발명의 화합물은 여러 감미료 또는 향료, 착색물 또는 염료와 혼합될 수 있으며, 유화제 및/또는 서스펜딩제와 혼합될 수 있으며 그리고 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 혼합될 수 있으며, 그리고 이러한 성분들의 혼합물과 혼합될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복막내, 경막내, 심실내, 흉골내, 두개골내, 근육내 또는 피하 주사로 투여될 수 있으며, 또는 이들은 흡입 기술을 통해 투여될 수 있다. 이들은 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 이용되며 이는 예를 들어, 용액이 혈액과 등장성이 되도록 충분한 염 또는 글루코즈와 같은 다른 물질을 함유할 수 있다. 상기 수용액은 필요에 따라, 적절히 (바람직하게 pH 3 - 9로) 완충되어야 한다. 멸균 조건하에서 적절한 비경구 배합물의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약학 기술에 의해 용이하게 수행된다.

비경구 투여에 적절한 배합물은 항산화제, 버퍼, 세균발육저지제 및 배합물이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주입 용액; 및 서스페닝제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 서스펜션을 포함할 수 있다. 상기 배합물은 예를 들어, 밀봉 앰플 및 바이얼과 같은 유니트-투여 또는 다중-투여 용기내에 존재할 수 있으며, 예를 들어, 사 용 직전 주입용 물과 같은 멸균 액상 담체의 첨가만이 요구되는 동결건조(lyophilised) 조건에서 보관될 수 있다. 즉석 주입 용액 및 서스펜션은 종래에 기술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

인간 환자에 대한 경구 및 비경구 투여에 있어서, 본 발명 화합물의 일일 투여 수준은 보통 1-30mg/kg일 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명 화합물의 정제 또는 캡슐은 단독으로 또는 일회에 2회이상의 투여용으로 적절히 활성 화합물의 투여량을 함유할 수 있다. 어느 경우에 의사는 실제 투여량을 결정할 것이며, 이는 어느 개개의 환자에 대해 가장 적절해질 것이며, 특정 환자의 나이, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 상기 투여량은 평균적인 케이스의 예시이다. 물론 보다 높거나 낮은 투여 범위가 있을 수 있으며 이는 본 발명의 범위내에 포함된다.

본 발명의 화합물은 또한 비강내로 투여되거나 흡입에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3)과 같은 하이드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 추진체의 사용으로 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기(nebuliser)로부터 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸 스프레이 제품의 형태로 편리하게 운반될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 유니트는 칭량된 양을 운반하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기(nebuliser)는 예를 들어, 용매로서 에탄올과 추진체의 혼합물을 사용하여 활성 화합물의 용액 또는 서스펜션을 함유할 수 있으며, 이는 부가적으로 예를 들어, 소르비탄 트리올레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 (예를 들어, 젤라틴으로부터 제조된) 캡슐 및 카트리지가 본 발명 화합물과 락토즈나 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 분말 혼합물이 함유되도록 배합될 수 있다.

에어로졸 또는 건조 분말 배합물은 바람직하게 각 칭량된 투여량 또는 "퍼프"가 환자에게 운반되는 본 발명 화합물의 적절한 투여량을 운반되도록 마련된다. 에어로졸인 경우 전체 일일 투여량은 환자마다 달라질 것이며, 단독 투여로 투여될 수 있으며, 보다 일반적으로 하루에 걸쳐 나누어 투여될 수 있는 것이 인식될 것이다.

택일적으로, 본 발명의 화합물은 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있으며, 또는 이들은 로션, 용액, 크림, 연고 또는 더스팅 분말의 형태로 국소적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 예를 들어, 피부 패치의 사용에 의해 경피 투여될 수 있다. 이들은 또한 눈 경로, 특히 안과 질환 치료용으로 눈 경로에 의해 투여될 수 있다.

안과적 사용에 있어서, 본 발명의 화합물은 등장성의 pH 조정된 멸균 염수에 미분화 서스펜션으로 배합될 수 있으며, 또는 바람직하게 등장성의 pH 조정된 멸균 염수에 용액으로, 임의로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 함께 배합될 수 있다. 택일적으로, 이들은 광유와 같은 오인트먼트내에 배합될 수 있다.

피부에 국소 적용하는 경우에, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 미네랄 오일, 액상 광유, 화이트 광유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물 중 하나 이상과의 혼합물내에 서스펜딩되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적절한 오인트먼트로서 배합될 수 있다. 택일적으로, 이들은 적절한 로션 또는 크림으로 배합되거나, 예를 들어, 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액상 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물 중 하나 이상과의 혼합물내에 서스펜딩되거나 용해될 수 있다.

입안에 국소 투여하기에 적절한 배합물은 일반적으로 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 향 베이시스내 활성 성분을 포함하는 로젠즈; 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 비활성 베이시스내 활성 성분을 포함하는 패스틸; 및 적절한 액상 담체내에 활성 성분을 포함하는 구강 세척제를 포함한다.

일반적으로, 인간의 경우 본 발명의 화합물의 구강 또는 국소 투여가 바람직 한 경로이며, 가장 편리하다. 수용자가 삼킴 질환으로 고통받거나 경구 투여 후 약물 흡수 손상으로 고통받는 경우, 약물은 예를 들어, 설하 또는 구강(buccally)과 같이 비경구 투여될 수 있다.

수의학적으로 사용되는 경우에, 본 발명의 화합물은 일반적인 수의학적 실행에 따라 적절히 허용되는 배합물로 투여되며, 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투여 요법 및 투여 경로를 정할 것이다.

<110> BioInvent International AB <120> Biological materials and uses thereof <150> GB 0525214.3 <151> 2005-12-12 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 ctactacccc ttgactactg gggccagggt acactggtca ccgtgagctc a 351 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaggcagctc caacatcgga gggaatgctg taaattggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gaaaataata agcgaccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgcagc tcatatgcgg tcagcaacaa tttcgaggtg 300 ctattcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 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Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tatgataaca acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct cagtgcttgg 300 ctgttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggt 336 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Ala Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcggc agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca 180 gactccgtgg aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacact gccgtgtatt actgtgcgag agatacaaac 300 ccgtactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggta cactggtcac cgtgagctca 360 360 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Asn Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgccag tcctatgaca gcagcctgaa tggtcaagta 300 ttcggcggag gaaccaagct gacagtccta ggt 333 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims

a. 세포 표면 항원 ICAM-1을 디스플레이하는 하나 이상의 표적 세포를 제공하는 단계;

b. 세포 표면 ICAM-1에 선택적으로 바인딩하며, ICAM-1에 바인딩시 상기 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 하나 이상의 항체 분자를 제공하는 단계;

c. (a)의 표적 세포를 (b)의 항체 분자에 노출시켜 상기 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 단계

를 포함하며, 상기 항체 분자는 SEQ ID Nos. 6 및 8의 서열을 포함하는 것인, 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 시험관내(in vitro) 방법.
세포 표면 ICAM-1에 선택적으로 바인딩하며, ICAM-1에 바인딩시 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 항체 분자로서, 상기 항체 분자는 SEQ ID Nos. 6 및 8의 서열을 포함하는 가변부를 포함하는 것인, 항체 분자.
제 2항에 있어서, 상기 항체 분자는 제 1항의 방법에 사용되는, 항체 분자.
제 2항에 있어서, 상기 항체 분자는 세포 표면 ICAM-1에 선택적으로 바인딩하며, ICAM-1에 바인딩시 시험관내(in vitro)에서 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 2항에 있어서, 세포 표면 항원은 ICAM-1인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 2항에 있어서, 상기 표적 세포는 면역 세포 또는 상피 세포인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 6항에 있어서, 상기 면역 세포는 B 림프구인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 2항에 있어서, 상기 표적 세포는 암, 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 질병과 관련된 것임을 특징으로 하는 항체 분자.
삭제
제 8항에 있어서, 상기 질병은 임파종, 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 8항에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 류마티즘성 관절염 또는 SLE인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 8항에 있어서, 상기 감염성 질병은 HIV인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 10항에 있어서, 상기 임파종은 백혈병 또는 골수종인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 2항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항체 분자는 IgG인 것을 특징으로 하는 항체 분자.
제 14항에 있어서, 상기 IgG는 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 분자.
삭제
제 2항 또는 제 4항에 청구된 항체 분자를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
제 17항에 있어서, SEQ ID Nos. 5 및 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 2항에 정의된 항체 분자를 포함하는, 암, 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 표적 세포의 파괴가 요구되는 질병의 진단, 치료 및 예방 중 하나 이상에 사용하는 약학 조성물.
삭제
제 19항에 있어서, 치료하고자 하는 질병은 임파종, 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 19항에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 류마티즘성 관절염 또는 SLE인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 19항에 있어서, 상기 감염성 질병은 HIV인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 21항에 있어서, 상기 임파종은 백혈병 또는 골수종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 19항 및 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 분자는 제 5항 또는 제 2항에 정의된 것이며, 그리고 치료하고자 하는 질병은 제 21항에 정의된 임파종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
a. 하나 이상의 표적 세포를 제공하는 단계;

b. 제 2항 또는 제 4항에 정의된 하나 이상의 항체 분자를 제공하는 단계;

c. 상기 표적 세포에서 아포토시스를 유도하도록 (a)의 표적 세포를 (b)의 항체 분자에 노출시키는 단계

를 포함하는 표적 세포에서 아포토시스를 유도하는 시험관내(in vitro) 방법.
제 26항에 있어서, 단계 (a)에 제공된 표적 세포는 면역 세포 또는 상피 세포인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
제 27항에 있어서, 상기 면역 세포는 B 림프구인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
제 26항에 있어서, 상기 표적 세포는 암, 자가 면역 질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 패혈증 및 감염성 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 질병과 관련된 것임을 특징으로 하는 시험관내 방법.
삭제
제 29항에 있어서, 상기 질병은 임파종, 위암, 유방암, 간암, 폐암, 흑색종, 방광암, 맥락막암, 췌장암, 결장암 및 전립선암으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
제 29항에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 류마티즘성 관절염 또는 SLE인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
제 29항에 있어서, 상기 감염성 질병은 HIV인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
제 31항에 있어서, 상기 임파종은 백혈병 또는 골수종인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
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