NO341192B1

NO341192B1 - Apoptose-induserende anti-ICAM antistoff

Info

Publication number: NO341192B1
Application number: NO20082524A
Authority: NO
Inventors: N Midlertidig N; Björn Frendéus
Original assignee: Bioinvent Int Ab
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2017-09-11
Also published as: CN101360760B; IL191868A; EP1960432B1; RU2008128471A; KR20150023914A; JP2009518052A; KR20140031402A; KR101446508B1; KR20080090393A; NZ569038A; WO2007068485A3; CN101360760A; CA2632983A1; NO20082524L; UA100664C2; US9803013B2; NZ595644A; CA2632983C; HUE028363T2; US20140314793A1

Description

Oppfinnelsen angår en in vitro framgangsmåte ifølge krav 1, et bindingsmolekyl ifølge krav 2, en nukleinsyre ifølge krav 11, en anvendelse av bindingsmolekylet ifølge krav 14, og en farmasøytisk blanding ifølge krav 18.

Bakgrunn

Antistoffer har nylig blitt de foretrukne proteinterapeutiske middel for å rette seg inn mot kreft men også for behandling av andre symptomer (Brekke et al. Nat Rev Drug Discov 2003;2:52-62). Inntreden av antistoffvitenskapen har skaffet verktøy for dannelse av humane antistoff fra syntetiske fagbibliotek, visning av redusert immunogenitet og forbedret spesifisitet og affinitet grunnet deres humane natur og større diversitet (Weiner et al Nat Biotechnol 2005;23:556-7). Naive bibliotek er særlig attraktive, siden de kan brukes til isolering av antistoffer for enhver spesifisitet, inkludert egne antigener (Griffiths et al. Embo J 1993;12:725-34), uavhengig av immuniseringer og rekonstruksjon av nye bibliotek. Celleoverflate-reseptorer utgjør langt på vei den mest vellykkede gruppen antigener som er målrettet av kontemporære terapeutiske medikamenter, inkludert inhibitorer av små molekyler og antistoffer. Av særlig interesse er celleoverflate-reseptorer som uttrykkes unikt eller som viser et økt ekspresjonsnivå på en målcelle og som i tillegg er i stand til å formidle døds- eller overlevelsessignaler til cellen. Slike differensiert uttrykte reseptorer med vesentlige signaleringsegenskaper muliggjør a nti stoff ba sert målretting av mikrobielt infiserte, transformerte, eller på annet vis feilfungerende celler.

For behandling av tumorer, er antistoffer som har evne til å indusere apoptose i en måltumorcelle og samtidig sparer normalt vev av særlig interesse. Flere slike antistoffer er i bruk, har blitt registrert hos US Food og Drug Administrasjon (FDA) og tilbyr alternativer til konvensjonell kreftbehandling for eksempel for lymfom (rituximab som er målrettet CD20) eller for brystkreft (trastuzumab- eller cetuximab målrettet henholdsvis Her-2 og EGFR).

Det finnes for tiden også andre antistoffer med apoptose-induserende effekt innenfor klinisk utvikling. Selv om disse antistoffene oppviser fordelaktige effekter hos pasienter eller i dyreforsøk, eksisterer det imidlertid fremdeles et umettet klinisk behov.

Anti-idiotypisk immunoglobulin B målcelle-tumorer var den første monoklonale antistoffterapien som ble utført i et menneske (Miller et al. N Engl J Med 1982;306:517-22.). Ødeleggelse av tumorceller ved hjelp av passiv antistoffadministrering (Riechmann et al. Nature 1988;332:323-7.), eller aktiv vaksinasjon med pasientens eget tumor-immunoglobulin-protein (Kwak et al. N Engl J Med 1992;327:1209-15.), har siden vist seg å medføre tumorregresjon eller tumordvale hos pasienter med ulike typer av B-cellemalignitet. En nylig rapport beskriver dannelsen av helt humane anti-idiotype antistoffer, ved bruk av transgene mus med mangelfull museantistoffproduksjon og som uttrykker utvalgte humane antistoff-kjede loci (Suarez et al. Mol Immunol 2004;41:519-26.).

I den foreliggende oppfinnelsen har det blitt benyttet en konkurrerende biopanningmetode, hvor målcelle-antigenet i form av hele celler, og overskytende subtraktor celle-antigen i form av membran-vesikler, blir samtidig eksponert for det naive n-CoDeR™ antistoff-fag-biblioteket (WO 2004/023140; Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.), for å oppnå og deretter teste antistoffragmenter med utmerket selektivitet for B-lymfommålceller. Dessuten ble funksjonaliteten i de valgte bindingsmolekylene vist ved evnen de testete antistoffene hadde til å indusere apoptose i målet men ikke i ikke-målceller.

Identifiserte antistoffspesifisiteter inkluderer HLA-DR/DP (Bl-antistoffet i samsvar med oppfinnelsen) og overflate IgM (antistoffet Cll i samsvar med oppfinnelsen), samt ICAM-1 (antistoffet Bli i samsvar med oppfinnelsen), et adhesjonsmolekyl som tidligere ikke er forbundet med induksjon av apoptose. Isolerte antistoffer hadde affiniteter i det sub-nanomolare til nanomolare området, og gjør dem direkte til mulige valg for målrettet antistoff-behandling.

Publikasjonen «Monocyte-derived macrophages prime peripheral T cells of

undergo apoptosis by cell-cell contact via ICAM-l/LFA-l-dependent mechanism»,

IMMUNOBIOLOGY, vol. 195, nr. 3, 1996, s. 323 - 333, ISSN 0171-2985, av ZEN KATSUHIRO et al. beskriver celler som undergår apoptose ved celle-til-cellekontakt via en ICAM-l/LFA-l-avhengig mekanisme.

Oppfinnelsen

Oppfinnelsen angår en in vitro framgangsmåte ifølge krav 1, et bindingsmolekyl ifølge krav 2, en nukleinsyre ifølge krav 11, en anvendelse av bindingsmolekylet ifølge krav 14, og en farmasøytisk blanding ifølge krav 18. Ytterligere fordelaktige trekk framgår av de uselvstendige kravene 2-10, 12-13,15-17 og 19.

I et første aspekt av oppfinnelsen er det framskaffet en in vitro framgangsmåte for å indusere apoptose i en målcelle, omfattende trinnene: a. framskaffing av en eller flere målceller som oppviser celleoverflateantigenet, ICAM-1; b. framskaffing av en eller flere bindingsmolekyl som selektivt bindes til celleoverflate ICAM-1 og som ved binding til ICAM-1 induserer apoptose i målcellen; c. eksponering av målceller fra (a) for bindingsmolekylene fra (b) for å indusere apoptose i målcellene,

hvori bindingsmolekylene er humane antistoffmolekyler, hvori antistoffmolekylene har variable regioner med sekvensene SEQ ID No 6 og SEQ ID No 8.

I et andre aspekt av oppfinnelsen er det framskaffet et bindingsmolekyl som selektivt bindes til celleoverflate ICAM-1 og som, ved binding til ICAM-1, induserer apoptose i målcellen. Alternativt er bindingsmolekylet et antistoffmolekyl som selektivt bindes til celleoverflate HLA-DR/DP og/eller overflate IgM.

ICAM-1 er også designert CD54, men i denne søknaden vil ICAM-1 bli benyttet.

Bindingsmolekyl kan utledes fra antistoff, og basert på antistoff-skaffold (eng. antibody scaffold)

[Clackson T et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8, Marks JD et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97] som har blitt utstrakt brukt i mange bibliotek, men bindingsmolekylet kan også være utledet fra andre molekylære skaffolder så som fibronektinskaffoldet [Weng S et al., Proteomics. 2002 Jan;2(l):48-57] og protein A-skaffoldet [Nord K, et al., Nat Biotechnol 1997 Aug;15(8):772-7, Hogbom M et al., Proe Nati Acad Sei USA. 2003 Mar 18;100(6):3191-6]. Hvert av disse skaffoldene har sine fordeler avhengig av anvendelsen, og antistoffskaffoldet, kan, som et eksempel, benyttes for fordelaktig for å danne variabilitet som ikke kan skilles fra naturlig variabilitet.

Basisstrukturen av antistoffet, det mest brukte skaffoldet, er svært godt forstått. I prinsippet presenterer en rammeverkstruktur omfattende betatråder ordnet i to sjikt et sett av variable løkker, de såkalte Complementary Determining Regions (CDRs) som kan bindes til antigenmolekyl. Selv om antistoffer kan variere i skaffoldstrukturen, er den mest utstrakte variabiliteten sett i CDRene. Den store variabiliteten mellom antistoffer, er basisen for deres evne til å samvirke, på en spesifikk måte, med i prinsippet alle typer molekylære strukturer. På grunn av denne kapasiteten har antistoffer blitt utstrakt benyttet for å danne spesifikke bindere som er egnet innen forskning, diagnostisering/prognose av sykdom og som terapeutiske forbindelser spesifikk for definerte målstrukturer [Borrebaeck CA og Carlsson R, Curr Opin Pharmacol. 2001 Aug; l(4):404-8].

Andre ikke-antistoff-bindende molekyler som er nyttig i denne oppfinnelsen, er de som har skaffoldstrukturer med en høy grad av stabilitet, men som likevel tillater at det introduseres variabilitet ved enkelte posisjoner. Et eksempel på et annet bindingsmolekyl er et fibronektinområde og et 58 aminosyrer stort protein A-område som tolererer variabilitet. Det er også andre molekylære folder som tillater noe grad av variasjon. Slike eksempler inkluderer major histokompabilitetskompleks (MHC) klasse I- og ll-molekyler og nylig er en ny klasse molekyler, de såkalte defensiner, blitt identifisert til å ha lignende basisstruktur, mens de fremdeles innehar utstrakt sekvensvariabilitet mellom genfamiliemedlemmene hvilket antyder at de er egnet som skaffolder for å inneha molekylært mangfold. I tillegg kan naturlige ligander, f.eks. LFA-1 i tilfellet for ICAM-1 som et målmolekyl, eller rekombinante varianter av dem, utgjøre spesifikke bindingsmolekyl som er i stand til å indusere apoptose i målrettede celler.

Dessuten kan bindingsmolekylet være ethvert molekyl som selektivt binder celleoverflate ICAM-1 på en målcelle og som ved binding induserer apoptose i målcellen.

Bindingsmolekylet er fortrinnsvis et antistoffmolekyl.

I en utførelse er celleoverflate-antigenet ICAM-1.

Den foreliggende screeningen fant et antistoff (Bil) spesifikt for ICAM-1, en reseptor som ikke har blitt forbundet med apoptose tidligere, og som ikke tilførte vesentlige negativt signaliserende egenskaper i cellene.

Identifiseringen av ICAM-1 som et apoptoseinduserende molekyl var et direkte resultat av screeningen som var utformet for å isolere spesifisiteter for alle overflatereseptorer differensiert uttrykt mellom mål- og ikke-målceller uavhengig av og uten tidligere kjennskap til deres respektive identitet. ICAM-l-indusert celledød har blitt bekreftet som en aktiv apoptotisk prosess som involverer depolarisasjon av mitokondrien membran depolarisasjon. Mitokondrien membrandepolarisasjon er beskrevet tidligere for både caspaseavhengig og caspaseuavhengig apoptose (Nagy et al. J Mol Med 2003;81:757-65.).

De foreliggende oppdagelsene viser videre at epitopen bundet av Bll-antistoffet er uttrykt i B-lymfomvev av ulik opprinnelse, og er oppregulert i enkelte B-lymfom-celler sammenlignet med hvilende perifere blodleukocytter. I tillegg til B-lymfomceller undergikk også karcinomceller som uttrykker ICAM-1 hovedsakelig apoptose når de ble utsatt for det ICAM-l-spesifikke Bll-antistoffet in vitro (se eksempel 6).

Tidligere studier har vist begrenset ekspresjon av ICAM-1 på normalt humant vev (Smith et al. i Clin Pathol 1990;43:893-900.). ICAM-1 er involvert i celleadhesjon og spiller en viktig rolle i immunresponser og inflammasjon gjennom binding til dens reseptor LFA-1. Antistoffer rettet mot ICAM-1 har blitt brukt for å gripe inn i patologiske immunresponser og inflammasjon. In vivo administrering av et murint anti-ICAM-1 mAb til cymologe aper (Cosimi et al. J Immunol 1990;144:4604-12.), eller bruk i kliniske forsøk hos pasienter med reumatisk artritt eller pasienter som mottok nyretransplantat har heller ikke avslørt noen åpenlys toksisitet (Kavanaugh et al. Arthritis Rheum 1994;37:992-9; Haug et al. Transplantation 1993;55:766-72.).

Den nye oppdagelsen av at ICAM-l-målretting kan føre til apoptose, viser muligheten for å bruke ICAM-l-spesifikt bindende molekyler, så som antistoffer, for behandling av kreft av ulike opprinnelser, forutsatt at de uttrykker antigenet.

Basert på deres ekspresjon av ICAM-1, inkluderer krefttyper som potensielt kan behandles med et apoptoseinduserende anti-ICAM-l-antistoff, så som Bil: B-lymfom, myelom (Huang et al. (1993) Hybridoma 12 p661-75; Huang et al., (1995) kreft Res 55 p610-6; Smallshaw et al., (2004) J Immunother 27 p419-24), gastrisk kreft (Maruo et al., (2002) Int J kreft 100 p486-90), brystkreft (Rosette et al., (2005) Carcinogenesis 26 p943-50), leverkreft (Sun et al., (1999) J kreft Res Clin Oncol 125 p28-34), lungekreft (Grothey et al., (1998) Br J kreft 77 p801-7 ), melanom (Wang et al.,

(2005) Int J kreft 27 p419-24), blærekreft (Roche et al., (2003) Thromb Haemost 89 1089-97) og prostatakreft (Aalinkeel et al., (2004) kreft Res 64 p5311-21). Ekspresjon av ICAM-1 er også identifisert i tumormetastase som vist av (Maruo et al., 2002), (Rosette et al., 2005), (Sun et al., 1999), (Grothey et al., 1998), (Aalinkeel et al., 2004) som påpeker muligheten for å gripe inn i metastaseprosessen ved bruk av et ICAM-l-spesifikt antistoff.

I en ytterligere utførelse er celleoverflateantigenet HLA-DR/DP.

HLA-DR/DP er vanligvis til stede, for eksempel på B-celler og kan finnes oppregulert på B-lymfom-celler.

Til dags dato har tre ulike HLA-DR-spesifikke monoklonale antistoff kommet til forsøk i kliniske fase. Det nyeste tillegget av disse er det fullstendig humane lgG41D09C3, som ble isolert fra et tilsvarende stort naivt fag-bibliotek sammenlignet med n-CoDeR<®>, men ved bruk av fast-fase-panning på renset antigen (Nagyeto/. Nat Med 2002;8:801-7.).

I den foreliggende oppfinnelsen er det blitt identifisert et nytt humant antistoff (Bl) rettet mot HLA-DR/DP som raskt og med høy kraft induserer apoptose i en mengde B-lymfom cellelinjer, og viser dermed at HLA-DR/DP er forbundet til induksjonen av apoptose i en målcelle.

Bl-antistoffet bandt en mengde B-lymfom-cellelinjer av ulik opprinnelse (se eksempel 1 og tabell 1) og ble vist å indusere apoptose i HLA-DR/DP antigen-uttrykkende celler. Dessuten viste Bl antistoffet en høyere kraft enn Rituximab når det ble testet på Raji B-lymfom-cellelinjen. Dette var særlig tydelig når lgG4formatet av Bl-antistoffet ble benyttet (figur 8).

Fra de oppnådde data hadde dette antistoffet egnete egenskaper for behandling med HLA-DR/DP som uttrykker B-lymfomceller. I tillegg kan Bl-antistoffet, i likhet med målretting av Rheumatoid Arthritis og SLE av Rituximab, vise effektivitet i eliminasjon av aktiverte B-celler i sykdommer hvor HLA-DR/DP som uttrykker B-celler, er skadelig.

I nok en annen utførelse er celleoverflateantigenet overflate-lgM.

IgM eksisterer i dens frie form som en stor pentamerisk struktur, hvis høyere molekylvekt har en tendens til å begrense det inne i blodkar.

Monomerisk IgM kan finnes på cellevegger av B-lymfocytter og fungerer som en antistoffreseptor for antigengjenkjenning.

Cll-antistoffet i samsvar med oppfinnelsen, induserer, ved binding til overflate IgM, uttrykt på B lymfomceller, apoptose på en rask og effektiv måte (se eksempel 1 og tabell 1). I motsetning til de idiotype-spesifikke anti-lgM-antistoffene tidligere benyttet i klinikken for behandling av B-lymfom, bindes Cll-antistoffet til en ikke-polymorf epitop uttrykt på B-celler fra ulike donorer og er derfor egnet for behandling av pasienter som lider av B-lymfom uavhengig av B-lymfom-idiotype.

Det skal bemerkes at effektormolekylet, for eksempel anti-lgM-antistoffet også kan være enhver type spesifikt bindingsmolekyl som forårsaker apoptose i IgM-uttrykkende celler av ulike idiotyper.

Kinetikkene av Bl, Bil og Cll IgG-indusert apoptose var hurtig med maksimal effektivitet observert allerede etter 3 timer i noen cellelinjer. Hurtig effektorfunksjon er viktig for terapeutisk effektivitet ettersom dette minimerer risikoen for tumorunnvikelse som et resultat fra for eksempel manglende ekspresjon av tumorantigen (Uyttenhove et al. J. Exp. Med. 1983;157:1040-52; Kennedy et al. Br J Haematol 2002;119:412-6) eller epitopmutasjon (Weiner et al. J Immunol 1989;142:343-51; Bai et al. J. Clin. Invest. 2003;111:1487-96), og begrenser potensielt varighet av behandling og bivirkninger (Robert et al. Lancet Oncol 2005;6:491-500.).

Fortrinnsvis er målcellen en immuncelle eller epitelcelle og fortrinnsvis er immuncellen en B-lymfocytt.

Det er hensiktsmessig at målcellen er forbundet med en sykdom. Fortrinnsvis er sykdommen valgt fra gruppen omfattende kreft; autoimmunsykdommer, inkludert men ikke begrenset til reumatisk artritt og SLE, akutt og kronisk, inflammatorisk, akutte og kroniske inflammatoriske sykdommer, sepsis og infeksiøse sykdommer inkludert, men ikke begrenset til HIV.

Fortrinnsvis er sykdommen en kreft valgt blant lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid kreft, bykspyttkjertelkreft, tarmkreft og prostatakreft.

Som definert i definisjonsseksjonen i foreliggende søknad, blir uttrykket antistoffmolekyl benyttet for hensiktsmessighet, og omfatter blant annet antistoffer, et antistoff fragmenter, og antistoffderivater.

Antistoffmolekylet er hensiktsmessig et IgG. IgG kan være enhver av IgGi, lgG2, lgG3eller lgG4, men fortrinnsvis en av IgGiog lgG4. Antistoffmolekylet er fortrinnsvis humanisert eller humant.

Bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet i samsvar med oppfinnelsen har hensiktsmessig sekvensen av hvilken som helst av de variable regionsekvensene i figur 9 til 11 eller funksjonelt ekvivalente homologer av disse.

I en utførelse av oppfinnelsen har bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet de variable regionsekvensene i figur 9, eller funksjonelt ekvivalente homologer av det.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen har bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet de variable regionsekvensene av figur 10 eller funksjonelt ekvivalente homologer av det.

I nok en ytterligere utførelse av oppfinnelsen har bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet de variable regionsekvensene av figur 11 eller funksjonelt ekvivalente homologer av det.

I et tredje aspekt av oppfinnelsen er det framskaffet en nukleinsyre med en nukleotidsekvens som koder for et bindingsmolekyl eller et antistoffmolekyl som angitt i ethvert tidligere krav.

Nukleinsyren har hensiktsmessig nukleotidsekvensen av hvilken som helst av figurene 9 til 11.

I et fjerde aspekt av oppfinnelsen er det framskaffet bruk av bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet som definert i det første eller andre aspektet av oppfinnelsen i framstilling av et medikament for behandling og/eller forebygging av en sykdom som krever destruksjonen av en målcelle.

I en foretrukket utførelse er bindingsmolekylet et antistoffmolekyl.

Sykdommen som skal behandles er hensiktsmessig valgt fra gruppen omfattende: kreft, autoimmunsykdommer inkludert men ikke begrenset til reumatisk artritt og SLE, akutte og kroniske inflammasjonssykdommer, sepsis og infeksiøs sykdom inkludert men ikke begrenset til

HIV.

Sykdommen som skal behandles er fortrinnsvis valgt blant lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, tarm kreft og prostatakreft.

I en utførelse av oppfinnelsen bindes bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet spesifikt til ICAM-1 og/eller har sekvensen av figur 10 og blir benyttet i forhold til sykdommene opplistet ovenfor.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen bindes antistoffmolekylet spesifikt til HLA-DR/DP og/eller har sekvensen av figur 9 og blir benyttet i forhold til sykdommene lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, tarmkreft og prostatakreft.

I nok en ytterligere utførelse av oppfinnelsen, bindes antistoffmolekylet spesifikt til overflate-lgM og/eller har sekvensen av figur 11 og blir benyttet i forhold til sykdommene lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, tarmkreft og prostatakreft.

I et femte aspekt av oppfinnelsen er det framskaffet en farmasøytisk blanding omfattende bindingsmolekylet eller antistoffmolekylet i samsvar med oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer, bindemiddel eller tynner.

I en foretrukket utførelse er bindingsmolekylet et antistoffmolekyl.

Fortrinnsvis er målcellene framskaffet i trinn (i) immunceller eller epitelceller. Immuncellene er fortrinnsvis B-lymfocytter.

Målcellene er hensiktsmessig forbundet med en sykdom, og hvor sykdommen er valgt fra gruppen av omfattende: kreft; autoimmunsykdommer inkludert, men ikke begrenset til reumatisk artritt og

SLE, akutte og kroniske inflammatoriske sykdommer, sepsis og infeksiøse sykdommer inkludert men ikke begrenset til HIV.

Sykdommen er fortrinnsvis en kreft valgt blant lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, tarmkreft og prostatakreft.

Betydning av brukte begreper

Uttrykket "antistoffmolekyl" skal tolkes til å vise til hvilken som helst av et antistoff, et antistofffragment, eller antistoffderivat. Det er ment å omfatte villtype antistoffer, syntetiske antistoffer, rekombinante antistoffer eller antistoffhybrider, så som, men ikke begrenset til, et enkeltkjedet modifisert antistoffmolekyl produsert ved fagframvisning av immunoglobulin lett og/eller tungkjedete variable og/eller konstante regioner, eller andre immunointeraktive molekyler som kan bindes til et antigen i et immunoanalyseformat som er kjent for fagpersoner.

Uttrykket "antistoffragment" skal tolkes til å vise til hvilken som helst av et antistoff, et antistoffragment, eller antistoffderivat. Det er ment å omfatte villtype-antistoffer (dvs. et molekyl omfattende fire polypeptidkjeder), syntetiske antistoffer, rekombinante antistoffer eller antistoffhybrider, så som, men ikke begrenset til, et enkeltkjedet modifisert antistoffmolekyl produsert ved fag-framvisning av immunoglobulin lett og/eller tungkjedete variable og/eller konstante regioner, eller andre immunointeraktive molekyler som kan bindes til et antigen i et immunoanalyseformat som er kjent for fagpersoner.

Uttrykket "antistoffderivat" viser til ethvert modifisert antistoffmolekyl som kan bindes til et antigen i et immunoanalyseformat som er kjent for fagpersoner, så som et fragment av et antistoff (f.eks. Fab- eller Fv-fragment), eller et modifisert antistoffmolekyl som er modifisert ved tilsats av en eller flere aminosyrer eller andre molekyler for å lette koblingen av antistoffene til et annet peptid eller polypeptid, til et større bærerprotein eller til en fast støtte (for eksempel Aminosyrene tyrosin, lysin, glutaminsyre, aspartinsyre, cysteinsyre og derivater av det, NH2-acetylgrupper eller COOH-terminale amidgrupper, blant annet).

Uttrykket "ScFv-molekyl" viser til ethvert molekyl hvor VH- og VL-partnerområdene er forbundet via et fleksibelt oligopeptid.

Uttrykkene "nukleotidsekvens" eller "nukleinsyre" eller "polynukleotid" eller "oligonukleotid" benyttes om hverandre og viser til en heteropolymer av nukleotider eller sekvensen av disse nukleotidene. Disse uttrykkene viser også til DNA eller RNA av genomisk eller syntetisk opprinnelse som kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet og kan representere sense- eller antisensetråden, til peptidnukleinsyre (PNA) eller til ethvert DNA-lignende eller RNA-lignende materiale. I sekvensene her er A adenin, C cytosin, T thymin, G guanin og N er A, C, G eller T (U). Det er forventet at hvor polynukleotidet er RNA, er T (thymin) i sekvensene framskaffet her, substituert med U (uracil). Vanligvis kan nukleinsyresegmenter framskaffet ved foreliggende oppfinnelse settes sammen fra fragmenter av genomet og korte oligonukleotidlinkere, eller fra en serie av oligonukleotider, eller fra individuelle nukleotider, for å framskaffe en syntetisk nukleinsyre som kan uttrykkes i en rekombinant transkripsjonen enhet omfattende regulerende elementer utledet fra et mikrobiell eller virus-operon, eller et eukaryotisk gen.

Uttrykkene "polypeptid" eller "peptid" eller "aminosyresekvens" viser til et oligopeptid, peptid, polypeptid eller proteinsekvens eller fragment av det og til naturlig forekommende eller syntetiske molekyler. Et polypeptid "-fragment," "-andel," eller "-segment" er en utstrekning av aminosyrerester på i det minste 5 aminosyrer, fortrinnsvis i det minste omtrent 7 aminosyrer, mer foretrukket i det minste omtrent 9 aminosyrer og mest foretrukket i det minste omtrent 17 eller flere aminosyrer. For å være aktiv, må ethvert polypeptid ha en tilstrekkelig lengde for å framvise biologisk og/eller immunologisk aktivitet.

Uttrykkene "renset" eller "hovedsakelig renset" slik det benyttes her, angir at den aktuelle nukleinsyren eller polypeptidet er til stede i betydelig fravær av andre biologiske makromolekyl, f.eks. polynukleotider, proteiner og lignende. I en utførelse er polynukleotidet eller polypeptidet renset slik at det utgjør i det minste 95 vekt%, mer foretrukket i det minste 99 vekt%, av de angitte biologiske makromolekyler som er tilstede (men vann, buffere og andre små molekyler, særlig molekyler med en molekylvekt mindre enn 1000 dalton, kan være tilstede).

Uttrykket "isolert" slik det benyttes her, viser til en nukleinsyre eller polypeptid separert fra i det minste en annen komponent (f.eks. nukleinsyre eller polypeptid) til stede med nukleinsyren eller polypeptidet i dens naturlige kilde. I en utførelse er nukleinsyren eller polypeptidet funnet i nærvær av (om noe) bare et løsningsmiddel, buffer, ion, eller andre komponenter som vanligvis er til stede i en løsning av det samme. Uttrykkene "isolert" og "renset" omfatter ikke nukleinsyrer eller polypeptider til stede i deres naturlige kilde.

Uttrykket "rekombinant" slik det benyttes her, for å referere til et polypeptid eller protein, betyr at et polypeptid eller protein er utledet fra rekombinante (f.eks., mikrobielle, insekt, eller mammalske) ekspresjonssystem. "Mikrobielle" viser til rekombinante polypeptider eller proteiner dannet i bakterielle eller sopp- (f.eks. gjær) ekspresjonssystem. Som et produkt, definerer "rekombinant mikrobiell" et polypeptid eller protein som hovedsakelig er fritt for native endogene substanser og uledsaget av tilhørende nativt glykosylering. Polypeptider eller proteiner uttrykt i de fleste bakterielle kulturer, f.eks. Escherichia coli, vil være fri for glykosyleringsmodifikasjoner; polypeptider eller proteiner uttrykt i gjær vil ha et glykosyleringsmønster hovedsakelig forskjellig fra de som er uttrykt i mammalske celler.

Uttrykkene "selektiv binding" og "bindingsselektivitet" indikerer at de variable regionene i antistoffene i samsvar med oppfinnelsen, eksklusivt gjenkjenner og binder polypeptider i samsvar med oppfinnelsen (dvs. i stand til å skille polypeptidet i samsvar med oppfinnelsen fra andre lignende polypeptider til tross for sekvensidentitet, homologi, eller likhet funnet i polypeptidfamilien), men kan også samvirke med andre proteiner (for eksempel, Staphylococcus aureus protein A eller andre antistoffer i ELISA-teknikker) gjennom interaksjon med sekvenser utenfor den variable regionen av antistoffene, og særlig i den konstante regionen av molekylet. Screeninganalyser for å bestemme bindingsselektivitet av et antistoff i samsvar med oppfinnelsen er velkjent og rutinemessig praktisert innen faget. For en omfattende diskusjon av slike analyser, se Harlow et al. (forfattere), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1988), kapittel 6. Antistoffer som gjenkjenner og binder fragmenter av polypeptidene i samsvar med oppfinnelsen er også vurdert, forutsatt at antistoffene først og fremst er selektive for, som definert ovenfor, full-lengde polypeptider i samsvar med oppfinnelsen. Som for antistoffer som er selektive for full-lengde polypeptider i samsvar med oppfinnelsen, er antistoffer i samsvar med oppfinnelsen som gjenkjenner fragmenter, de som kan skille mellom polypeptider fra den samme familien av polypeptider, til tross for naturlig sekvensidentitet, homologi, eller likheter funnet i proteinfamilien.

Uttrykket "bindingsaffinitet" inkluderer betydningen av bindingsstyrken mellom et antistoffmolekyl og et antigen.

Med uttrykket "immuncelle" er det ment enhver celle som er involvert i en verts-immun- eller inflammatorisk respons, inkludert men ikke begrenset til B-celler og T-celler.

Med uttrykket "epitelceller" er det ment en celle av epitelet. Epitel er et vev satt sammen av et lag av celler. Epitel kan finnes som innside-belegg (f.eks. endotelium, ligger på innsiden av blodkar) eller eksterne (f.eks. hud) frie overflater av kroppen.

Det ytterste laget av huden er satt sammen av skvamøse epitelceller, det samme er slimhinnene som ligger på innsiden av munnen og kroppshulrom. Andre epitelceller belegger innsiden av lungene, mage- og tarmkanalen, de reproduktive og urinale kanalene og utgjør de eksokrine og endokrine kjertlene. Funksjoner av epitelceller inkluderer sekresjon, absorpsjon og beskyttelse. Epitelceller sitter på et basalt lamina.

Foretrukne utførelser

Eksempler på utførelser av enkelte foretrukne aspekter av oppfinnelsen vil nå beskrives med henvisning til de følgende figurer, hvor

Figur 1 - scFv isolert ved differensiert hel celle/ cellemembran vesikkel biopanning viser høy må Icel lespesif isitet.

scFv-kloner isolert ved differensiert biopanning ble uttrykt i E. coli TOPlO-celler og inkubert med Ramos- eller Jurkat-celler og (A) scFv-kloner uttrykt for primær screening eller (B) syttito tilfeldig utvalgte og reuttrykte scFv-kloner. Bundet scFv ble detektert med anti-His MAb, og Cy5-anti-mus polyklonalt Ab. Cellebinding ble detektert i et FMAT Macroconfocal High Throughput Screening instrument. Cellebinding ble avbildet som gjennomsnittlig fluorescensintensitet for å målrette Ramosceller (Y-akse) vs. ikke-målrettede Jurkatceller (X-akse). (C) Binding av sju unike scFv-kloner til Ramosceller (fylte stolper) og Jurkatceller (åpne stolper). En kontroll scFv (ctrl) ble ikke bundet til noen av cellene.

Figur 2. Apoptose-induksjon av anti-Ramos scFv.

Ramos B lymfomceller ble deretter inkubert med anti-Ramos scFv, anti-His mAb, og anti-mus polyklonalt Ab på is (med periodisk vasking for å fjerne overskytende ubundet antistoff), og ble inkubert i en fuktet atmosfære på 5 % C02ved 37 °C i 24 timer. Celler ble deretter høstet og underkastet kombinert farging med Annexin V-AF488 (AV) og propidiumjod (Pl). Celler ble merket som levende (AV- Pl-, fylte sirkler Fig. 2C), tidlig apoptotiske (AV+ Pl-, åpne trekanter fig. 2C), eller sent apoptotiske/nekrotiske (AV+ PI+, åpne ruter fig. 2C), basert på differensiert positivitet for AV-og Pl-farging (definert av kvadratiske veier (eng. square gates) i fig. 2B). Resulter er presentert ved plotting av (A) Forward Scatter (FSC-Height) mot Side Scatter og (B) AV (FL-1) mot Pl (FL-3). Den titrerbare effekten av scFv Bl og Fl er også presentert (C). De sju unike scFv-klonene ble inkubert med (D) Ramos- eller (E) Raji B lymfomceller ved 37 °C i 24 timer ved ulike konsentrasjoner og effekten på apoptoseinduksjon ble studert. Tre scFv; Bl, Bil, og Cll, viser titrerbar aktivitet mot begge cellelinjer, mens apoptoseinduserende evne av scFv B10, CIO, og G12 er begrenset til Ramos B lymfomceller.

Figur 3. Spesifisiteter av isolerte antistoffer inkluderer HLA-DR/DP, IgM, og ICAM-1.

A) 50-600 x IO<6>Raji B lymfomceller ble lysert med den ikke-ioniske detergenten Triton X-100 at 0,5 % v/v og immunoutfelt med 100 u.g av det fulle humane IgGl-formatet av antistoff Bl (bane 1) og Bil (bane 2), etterfulgt av kryssbinding med Protein A Sepharose. Ramos B lymfomcellelysat, fra 50 x IO<6>celler, ble benyttet for utfelling av 20 u.g Cll (bane 3). Antistoffspesifikke bånd ble skåret ut og underkastet tryptisk nedbryting og analysert med MALDI-TOF. B) Bl IgG, Bil IgG, og Cll IgG-binding til B lymfomceller blir spesifikt blokkert med pre-inkubasjon med henholdsvis anti-HLA-DR/DP, anti-ICAM-1 eller anti-lgM antistoffer.

For å bekrefte de oppnådde MALDI-TOF antigenidentitetene av antistoffkloner Bl, Bil, og Cll, ble det utført blokkerende studier med kommersielt tilgjengelige antistoffer, og analysert med flow cytometri. Cellene ble preblokkert med 10 ganger molart overskudd (sammenlignet med det humane antistoffet) av artstilpassete blokkerende antistoffer i 1 time, etterfulgt av tilsats av hvilket som helst av de isolerte humane antistoffklonene. Etter 30 min ble cellene vasket og binding av humant antistoff til cellene ble detektert med PE-konjugert geite-anti-humant IgG (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA). De blokkerende antistoffene benyttet i studien var; for Bl, mus monoklonale anti-HLA DR (Sigma, klon HK14) eller anti-CD40 (Beckton Dickinson, klon 5C3); for Bil, kanin polyklonale anti-ICAM-1 (Abcam, ab7815-250) eller anti-CD22 (Abcam, ab25135-100); for Cll, geit polyklonale anti-lgM (Zymed, South San Francisco, CA, USA, 62-7500) eller anti-IgG (Zymed, 62-8400).

Figur 4. ICAM-1 er en B lymfomforbundet celle-overflatereseptor som kan mediere programmert celle-død.

A. 2 ug/ml Bil eller anti-FITC-8 (kontroll) IgGible satt til 4 x IO<5>CL-01 B lymfomceller, inkubert i 2 timer på is, etterfulgt av tilsats av 10 ug/ml kryssbindende sekundært Fab'2 geite-antihumant Fc antistoff. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 6 timer og effekten av antistoffinkuberingen ble bestemt med to uavhengige apoptoseanalyser. Cellene ble farget enten med AV/PI (øvre panel), lignende med det som er beskrevet ovenfor, eller ved inkubasjon med 5 ug/ml av den mitokondrielle membran-depolariseringsreagensen JC-1 i 30 min ved RT (nedre panel). Induksjon av apoptose er detekterbar ved en nedgang i det rød (y-akse)/grønne (x-akse) fluorescensintensitetsforholdet. (B) Histologiseksjon som viser representativ binding av Bil antistoff til B lymfomvev. Kryogenisk bevart vev oppnådd fra en pasient med Anaplastic Large Cell B Lymphoma ble farget med Bil eller FITC-8 (kontroll) scFv antistoff. Antistoff-binding ble detektert med DAB (brun farge). Det innsatte bildet viser farging med kontroll scFv. (C) CD45-PerCp-Cy5.5 mAb pre-merkete Ramos celler ble blandet med donor-utledete PBMCer og de ulike celle-populasjonene ble farget med fluorkromkonjugerte CD-spesifikke antistoffer og Alexa Flour 647 Zenon forhånds-merket Bil IgGi eller kontroll FITC-8 IgGi. IgG Bll-binding til ulike cellepopulasjoner ble registrert i FL4 kanalen.

Figur 5. Affiniteter av IgG Bl og IgG Bil til B lymfomceller.

Rajiceller (venstre panel, IgG Bl) eller Ramosceller (høyre panel, IgG Bil) ble inkubert medøkende mengder av radiojodinerte IgG Bl eller radiojodinerte IgG Bil protein i nærvær eller fravær av 0,2 mg/ml av det tilsvarende umerkete IgG-proteinet. Spesifikk binding ble bestemt ved å trekke fra binding i nærvær av umerket konkurrerende protein fra den totale bindingen. Mengden bundet IgG Bl eller IgG Bll-proteinøkte medøkende mengder fritt IgG-protein med mettet binding nådd ved henholdsvis~30 nM IgG Bl og~1 nM IgG Bil (øvre panel). Rosenthal-Scatchard plott-analyse (nedre panel) viste en dissosiasjonskonstant på~3 nM med 400 000 funksjonelle bindingsseter per Raji-celle for IgG Bl, og en dissosiasjonskonstant på ~0,3 nM med 47 400 funksjonelle bindingsseter for IgG Bil (Raji-celler).

Figur 6 - Binding av Bl, Bil, Cll IgGi til tumorcellelinjer av ulik opprinnelse.

Antigenfordelingen av antigener målrettede av antistoffene Bl, Bil, og Cll på ulike karcinomcellelinjer ble undersøkt ved flowcytometri. Histogrammer viser binding av Rituximab anti-CD20 Mab (første rad, de fremste toppene), Bl IgGi(andre rad topper), Bil IgGi (tredje rad topper), eller Cll IgGi(fjerde rad, bakerste topper) til MCF-7 bryst-karcinom, HPAC bukspyttkjertel-karcinom, PC-3 prostata-karcinom, LS174 T kolorektal-karcinom, og THP-1 monocytiske leukemiceller, som angitt.

Figur 7 - Bil IgGi apoptoseinduksjon i karcinomceller

Prostatakarcinomcellelinje PC-3 ble dyrket i Complete Growth Medium (RPMI 1640, supplert med 10 % FCS, 10 mM HEPES, og 2 mM L-Glutamin) til 80 % konfluens i en 6-brønnet plate. Prostata-karcinom-cellelinjen DU 145 ble dyrket i MEM med Earl's salter, supplert med 10 % FCS, 1 mM natriumpyruvat, og 1 mM ikke-essensielle aminosyrer og derivatet av en melanomcellelinje MDA MB 435 ble dyrket i DMEM supplert med 10 % FCS.

For apoptoseanalyse, ble celler vasket i PBS og seriefortynnet Bil IgGi (eller Bl IgGi, Trastuzumab eller negative antistoffkontroller for kontroller) ble satt til individuelle brønner og binding ble tillatt i løpet av 1-2 timers inkubering ved 4 °C. Cellene ble høstet og Complete Growth Medium ble tilsatt, inneholdende kryssbindende antistoff, Fab'2 Geit anti-Human Fab'2, ved 10 ug/ml. Cellene ble inkubert i en fuktet atmosfære, med 5 % C02ved 37 °C i 16-24 timer. Celler ble samlet ved trypsinering og farget med Alexa Fluor 488-Annexin V (AF488-AV) og propidium-jod (Pl), i samsvar med produsentens instrukser. Prosentandelen apoptotiske celler ble bestemt med formelen: % apoptotiske celler = 100 - % AF488 - AV/Pl -/-.

A) Konturplott viser den relative fordelingen av PC-3-celler som en funksjon av Annexin V og

Propidium-jodpositivitet etter inkubering som ovenfor med 2 ug/ml IgG Bil eller IgG Bl. B) Stolpediagram viser den gjennomsnittlige prosentandelen apoptotiske PC-3-celler etter inkubering med seriefortynnet Bil IgGi eller 20u.g/ml Bl IgGi. C) Stolpediagram viser den gjennomsnittlige prosentandelen apoptotiske MDA MB 435 celler etterfulgt inkubasjon med uten antistoff-kontroll, 10 ug/ml negativ antistoff kontroll, seriefortynnet Bil IgGi, eller 10 u.g/ml Trastuzumb IgGi. D) Stolpediagram viser den gjennomsnittlige prosentandelen av apoptotiske DU145 celler etter inkubering uten antistoffkontroll, 10 u.g/ml negativ antistoffkontroll, seriefortynnet Bil IgGi, eller 10 u.g/ml Trastuzumb IgGi

Figur 8. Bl IgGi og Bl lgG4 induserer direkte celle-cytotoksisitet pi Raji B lymfomceller i fravær av kryssbindende reagenser.

Raji-celler ble inkubert med Bl IgGi, Bl lgG4, Rituximab IgGi, eller kontroll CT-17 IgGived 20, 6,7 eller 2,2 u.g/ml i 24 timer. Celler ble høstet og levedyktighet ble bestemt som prosentandel av Annexin V og Propidiumjod doble negative celler.

Figur 9 - VH- og VL-sekvenser (nukleotid- og aminosyre-) sekvenser for Bl-antistoff

Figur 10 - VH- og VL-sekvenser (nukleotid- og aminosyre-) sekvenser for Bll-antistoff

Figur 11 - VH- og VL-sekvenser (nukleotid- og aminosyre-) sekvenser for Cll-antistoff

Eksempel 1 - Seleksjon og Screening ( Biopanning) for apoptose- induserende antistoffer med spesifisitet for B- lymfomforbundete celleoverflatereseptorer

Cellekultur

Cellelinjene benyttet i denne studien ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA) eller Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH (Braunschweig, Germany) og ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES og 1 mM Na pyruvat (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med mindre annet er oppgitt. Jurkat T leukemi-cellelinjen (klone E6-1, TIB-152, ATCC), B lymfom-celle-linjene DOHH-2 (ACC47, DSMZ), SC-1 (ACC558, DSMZ), WSU-NHL (ACC58, DSMZ), JVM-2 (ACC12, DSMZ), Jeko-1 (ACC553, DSMZ dyrket i 20 % FCS), Rec-1 (ACC 584, DSMZ), SP-53 (Daibata et al. kreft 1989; 64:1248-53), RL (CRL-2261, ATCC), Granta 519 (DSMZ), NCEB-1 (Saltman et al. Blood 1988;72:2026-30), BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975;22:276-84), Ramos (CRL-1596, ATCC), Raji (CCL-86, ATCC), Daudi (CCL-213, ATCC), CL-01 (Cerutti et al. J Immunol 1998;160:2145-57), pre B celle-lymfom KM-3/Reh (CRL-8286, ATCC) og multippel myelom MC/CAR (CRL-8083, ATCC, dyrket i IMDM (Invitrogen) supplert med 20 % FCS) var alle fri for mykoplasma og ble dyrket i en fuktet atmosfære ved 37 °C, ved bruk av en 5 % C02-atmosfære. Cellene ble vedlikeholdt ved 2 x 10<5->1 x IO<6>celler/ml.

Jurkat celle- membran vesikkel- utfelling

Jurkat celler ble høstet ved sentrifugering ved 300 x g i 15 min i 500 ml store beholdere (Corning Inc. Life Sciences, New York, USA), vasket i Dulbecco's PBS (Invitrogen), og resuspendert i buffer A (1 mM NaHC03,1,5 mM MgAc, pH 7,4). Cellekonsentrasjonen var omtrent 5 x IO<7>Jurkat celler/ml (5 x IO<9>celler i 100 ml Buffer A).

Celle-sprenging ble oppnådd ved hypo-osmotisk sjokkbehandling (Buffer A) på is i 10-30 min og påfølgende nitrogen-kavitasjon i en nitrogen-kavitasjons-bombe (Parr Instrument Company, Moline, IL, USA). Celler ble holdt ved et konstant trykk på 40 bar (4 000 kPa) i 15 min ved 0 °C.

Sprengte celler ble samlet i et 250 ml Sarstedtrør (Sarstedt AG & Co, Niimbrecht, Tyskland) inneholdende 500 u.1 0,5 M EDTA for å gi en endelig EDTA-konsentrasjon på 2,5 mM. Tilsats av EDTA forhindrer aggregering av membranvesikler. Homogenatet (100 ml) ble delt mellom 4 x 25 ml Beckman tykkveggete rotorrør Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA), som ble sentrifugert i 10 min ved 1900 x g (4 000 opm i en Sorvall SS34-rotor) ved 4 °C for å fjerne ubrutte celler, kjerner og tunge mitokondrier.

Supernatanten ble samlet og pelletert materiale ble resuspendert i 25 ml 1 mM NaHC03buffer inneholdende 1 mM EDTA og ble resentrifugert (ytterligere gjenvinning av pelleterte ubehandlete Jurkat-membraner). Jurkat-membraner ble samlet med membraner fra den første sentrifugeringen. Supernatanter inneholdende ubehandlete Jurkat-membran- vesikler ble ultra-sentrifugert ved bruk av en Beckman Type 45Ti rotor ved 40,000 opm (omtrent 200, 000 x g) i 2,5 h ved 4 °C. Supernatanter ble tømt av og gjenværende buffer ble fjernet ved å tippe kanten av røret mot et lommetørkle (f.eks. Kleenex™).

Den ubehandlete membranpelleten ble overført til en Dounce homogenisator ved hjelp av en metallstang, og ble resuspendert i 2,5 ml HES-buffer (10 mM Hepes, 1 mM EDTA, 0,25 M sukrose, pH 7,4) ved flere forsiktige slag i homogenisatoren. En membran-suspensjonskonsentrasjon tilsvarende 2 x IO<9>celler/ml inneholdende 80 -100 mg protein ble dermed oppnådd.

Seleksjon av fag Abs ved hel- celle/ celle- membranvesikkel konkurranse- biopanning

Omtrent 2 x IO<13>fag-partikler ble forhandsvarmet ved 37°C i 15 min med periodisk blanding, sentrifugert i 15 min ved 14 000 x g for å fjerne bunnfall, og supernatanten ble overført til et ferskt Eppendorf-rør. Skummet tørrmelk ble satt til en endelig konsentrasjon på 2 % (w/v). Jurkat-membran-vesikkel-bunnfall utledet fra 2 x IO<9>celler (runde 1 seleksjon; 2 x IO<8>celler runde 2 og 3 seleksjoner) ble tinet på is, og ble blandet med de blokkerte fag-partiklene. Blandingen ble inkubert i 15 min på is. 5 x IO<7>(5 x IO<6>andre og tredje runde) Ramos-celler ble høstet ved sentrifugering ved 1 200 opm i 6 min ved 4 °C. Supernatant ble fjernet og Ramos-celler ble resuspendert i melk-fag-Jurkat-membran-vesikkel-blandingen. Suspensjonen ble inkubert ved 10°C under sakte ende-over-enderotasjon i 4 timer.

Cellen/celle-membran vesikkel/fag blandingen ble overført til et 15 ml Falcon-rør (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), inneholdende 0,5 ml 100 % (trypan blå farget) Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) i bunnen, og 9,5 ml dekket 40 % (v/v) Ficoll in 2 % (w/v) BSA/PBS (Ficoll-pillar). Rørene ble sentrifugert ved 1 500 opm i 10 min ved 4 °C. Røret bel fjernet fra sentrifugen og lokket på røret ble skrudd på og forseglet lufttett.

"Tuppen" i bunnen av Falcon røret inneholdende 100 % Ficoll ble kuttet av ved bruk av en sigarkutter. Materiale med høy tetthet, inkludert membran-vesikkelflak og cellekjerner, ble på denne måten eliminert fra røret. Lokket på røret ble deretter forsiktig åpnet,ødeleggende for vakuumet inne i røret, hvilket tillot at væsken kunne drives ut dråpevis gjennom åpningen i den avkuttete rørbunnen.

Den høstete cellesuspensjonen ble vasket én gang i PBS for å fjerne overskytende Ficoll. Pelleten ble resuspendert i 1 ml PBS (ikke utført etter den siste vasken) og suspensjonen ble igjen påført på toppen av en fersk Ficoll-pillar og vaskeprosedyren ble gjentatt (to ganger i runde 2 og 3).

Fag ble eluert fra celler ved tilsats av 150 u.1 76 mM sitronsyre (pH 2,5) i PBS etterfulgt av inkubasjon ved romtemperatur i 5 min. Blandingen ble nøytralisert ved tilsats av 200 u.1 1 M Tris-HCI, pH 7,4. Supernatanter inneholdende eluerte fag ble lagret etter pelletering av celler ved 300 x g i 5 min. Ytterligere eluering av fag var ved resuspensjon og inkubasjon av cellepelleten i 1 ml trypsin ved RT i 10 min.

Etter inaktivering med 40 u.1 1 mg/ml aprotinin, ble celler sentrifugert og supernatant inneholdende eluert fag ble lagret. Eluert fag ble benyttet for å infisere Escherichia coli HB101F' og bakteriene ble platet ut på TB medium inneholdende egnete antibiotika og glukose. Bakteriekolonier ble opptelt, skrapet fra platene og benyttet som inokulum for den neste runden panning.

Omdanning til scFv- format, scFv- ekspresjon, rensing og analyse av cellebinding.

Fagmid-poolen oppnådd etter tre runders seleksjon, ble brutt ned med Eag\ for å fjerne genet III. Den resulterende vektoren ble re-ligert. Vektorer inneholdende re-ligert ukuttet gen lll-fragmenter ble linearisert ved nedbrytning med fcoRI-enzym. scFv-vektor-poolen dannet på denne måten, ble benyttet for å transformere E. coli TOPlO-celler hovedsakelig som beskrevet tidligere (Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.).

Bakterier ble lagt ut på store 500 cm<2>agarplater og individuelle kloner ble plukket, overført til 96-brønnsplater, og uttrykt i TB-medium ved dyrking over natta ved 37 °C, 220 opm ved bruk av et automatisert system (Hallborn Biotechniques 2002; Suppl:30-7.). Rekombinante scFv-fragmenter ble produsert i TB-medium inneholdende egnete antibiotikum.

For primær screening av scFv-klonbinding til Ramos målceller og Jurkat ikke-målceller, ble 5 000 Ramos- eller Jurkatceller inkubert med hver av 960 scFv-kloner, utledet fra den tredje seleksjonsrunden og produsert som nevnt ovenfor. Cellene ble inkubert med 0,5 u.g/ml anti-6xHis mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) og 0,7 u.g/ml Cy5-konjugert geit anti-musreagens (Amersham Biosciences). Cellebinding ble analysert i et 8200 Cellular Detection System Fluorescence Macroconfocal High Throughput Screening (FMAT) -instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Etter primær screening, ble syttito bakterielle kloner tilfeldig plukket (dvs. uten hensyn til målcelle-vs. ikke-målcellereaktivitet i den primære screening) for DNA-sekvensering som beskrevet tidligere (Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.) (Soderlind et al., 2000). For vurdering av celleoverflatebinding ved flow-cytometri, ble Ramos- og Jurkat-celler (begge tilsatt ved 2 x IO<5>celler per test) inkubert med individuelle scFv-kloner ved en konsentrasjon på 2-10 ug/ml i PBS (Invitrogen) inneholdende 0,5 % w/v BSA (DPBS-B) i 1 time.

Celler ble vasket ved sentrifugering ved 300 x g i 6 min. Celler ble deretter inkubert med FITC-konjugert CD19 mAb og PE-konjugert CD3 mAb (BD) hvilket muliggjør påfølgende identifisering av henholdsvis mål- og ikke-målceller. Deteksjon av scFv-binding ble oppnådd ved inkubering med RPE-Cy5-streptavidin (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) etterfølgende inkubering med biotinylert anti-6xHis mAb. Celler ble inkubert med sekundære og tertiære reagenser i henholdsvis 40 min og 15 min. Alle inkuberingene ble utført på is ved bruk av iskalde løsninger.

Differensiert hel celle/ celle- membran- vesikkel- panning

Den foreliggende studien benyttet en ny panningprotokoll for å isolere antistoffer som målretter differensiert uttrykte antigener i deres native celleoverflate konfigurasjon. Etter tre runder med konkurrerende biopanning ved bruk av hele Ramos B lymfom-celler og membran-vesikler utledet fra Jurkat T leukemi-celler, ble rekombinant fag scFv isolert. Disse ble konvertert til løselig scFv og uttrykt i E. coliTOPlO-celler.

Rekombinant scFv ble inkubert med mål- (Ramos) eller ikke-mål (Jurkat) hele celler og vurdert for cellebinding. Spesifisiteten for målcelle-antigener av antistoffklonene var påfallende ettersom 482 scFv-uttrykte kloner viste seg å bindes selektivt til Ramos-målceller ved intensiteter fra svak til svært sterk (fig IA). Det ble bare identifisert to kloner som farget ikke-mål Jurkat-celler svakt (fig

IA).

Deretter ble genotype-mangfoldet av den isolerte fagframviste scFv bestemt. Syttito kloner ble tilfeldig utplukket (dvs. uavhengig av bindings-tropismen som bestemt i den primære screeningen) for DNA-sekvensering.

Klonene ble samtidig re-uttrykt og re-evaluert for målcelle-spesifisitet (Ramos vs. Jurkat) ved FMAT-teknologi, som beskrevet (fig IB). Det ble identifisert sju ulike antistoff-genotyper, som bestemt ved deres ulike CDRH3- og CDRL3-sekvenser (data ikke vist).

Den høye spesifisiteten av anti-Ramos scFv ble bekreftet ved trefarget flow-cytometriske analyser, etterfulgt av inkubasjon med et likt antall Ramos- og Jurkat-celler og deteksjon av scFv-binding ved hjelp av anti-tag-antistoff (fig. 1C).

Mål- og ikke-målceller ble definert ved henholdsvis CD19- og CD3-ekspresjon ved bruk av fluorkromkonjugerte CD-spesifikke monoklonale antistoffer. De sju genotypiske unike scFv-klonene viste høye og variable bindingsintensiteter for å målrette Ramos-celler, men ingen binding til ikke-mål-Jurkatcellene, i forhold til den negative kontroll scFv.

Apoptose- analyse

Lipopolysakkarid-nivå av rekombinantproduserte scFv-fragmenter ble redusert ved bruk av Detoxigel-kolonner i samsvar med produsentens instruksjoner (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA ). Gjenværende endotoxinnivå ble kvantifisert ved LAL-amebocytt-lysat-analysen (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA).

Det ble funnet at alle scFv-prøvene inneholdt mindre enn 0,1 IU/ml lipopolysakkarid. Det kimære anti-CD20-antistoffet Mabthera™ (Rituximab) ble kjøpt fra Lund University Hospital (Lund, Sverige). 2 x IO5 B lymfomceller (Raji eller Ramos) eller Jurkat T-celler ble inkubert med seriefortynnet og detoksifisert scFv's i dyrkningsmedium i 1 time på is.

Celler ble sekvensielt inkubert med sekundært anti-6xHis mAb (5 p.g/ml), og tertiært Geit Fab'2 anti-mus Fab'2 antistoff (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Periodiske vaskinger sikret fjerning av overskytende ubundet antistoff-reagens. Celler ble inkubert ved 37 °C i en fuktet atmosfære på 5 % C02i 24 timer.

Når hele IgGer ble benyttet for apoptoseinduksjon, ble kryss-bindende reagens erstattet av geit Fab'2 anti-human Fc y antistoff (Jackson ImmunoResearch) med minimal kryss-reaktivitet med ikke-IgG antistoff-isotyper (for å unngå uspesifikk kryssbinding med endogene B-lymfomforbundete overflateimmunoglobuliner) og inkubert som beskrevet ovenfor i 6 timer.

Apoptotiske celler ble, med mindre annet er oppgitt, detektert ved kombinert farging med Annexin V Alexa Fluor 488 (AV) og Propidiumjod (Pl) (begge fra Molecular Probes, Invitrogen) og påfølgende flow-cytometriske analyser. Celler ble definert som levende (AV-/PI-), tidlig apoptotiske (AV+/ PI-) eller sent apoptotiske/nekrotiske (AV+/PI+)- AV- og Pl-signaler ble henholdsvis notert i FLI- og FL2- eller FL3-kanalene (som antydet i teksten), ved bruk av et FACSCalibur-instrument (BD Biosciences).

For å kunne undersøke funksjonaliteten av det isolerte scFv, ble det satt opp en høy gjennomstrømningsapoptose screeninganalyse basert på sekvensiell inkubering og vasking av celler med scFv og kryssbindende reagens. Avhengigheten av scFv klonen og konsentrasjonen i apoptose analysen er vist i fig. 2 A-C, hvor den apoptotiske effekten av valgt scFv-klon Bl sammenlignes med effekten av scFv-klon Fl som ikke viser noen induksjon av apoptose. Jurkatceller som mangler mål-antigenekspresjon døde ikke av apoptose etter behandling med hvilket som helst av de vurderte scFv hvilket viste at apoptoseinduksjon avhenger av binding til målrettet antigen (data er ikke vist).

Ved bruk av den etablerte scFv-apoptoseanalysen, ble det screenet kloner for apoptose på Ramos-og Raji B lymfom-celler. scFv-induserte apoptotiske effekter ble sammenlignet med den indusert ved Rituximab anti-CD20 mAb (fig. 2D). Det ble identifisert tre scFv-kloner - Bl, Bil og Cll - som induserte signifikant apoptose på både Ramos- og Raji-celler (fig. 2 D og E). Indusering av apoptose ved scFv på Raji-celler samsvarer med binding til disse cellene (fig. 2D), ettersom scFv-kloner som ikke ble bundet til Raji-celler ikke induserte apoptose.

Klonene Bl, Bil og Cll ble overført til fullstendig humane IgGl-antistoffer. Både deres spesifisitet og funksjonalitet forble intakt etter reformatering, som vist ved deres sterke binding og kraftige cytotoksisitet mot et bredt panel B lymfomcellelinjer (tabell 1). Det skal bemerkes at apoptose-indusering var hurtig med maksimal prosentandel annexin V positive apoptotiske celler, oppnådd allerede etter tre til seks timer i flere cellelinjer (tabell 1 og data ikke vist).

IgG- produksjon og endotoksin screeninganalyser

scFv antistoff-fragmenter ble konvertert til full-lengde humant IgGl^-format via kloning inn i en modifisert pCDNA3-vektor (Norderhaug et al. J Immunol Methods 1997;204:77-87.), og forbigående transfektert inn i HEK293 celler ved bruk av Lipofectamine 2000 -reagens i samsvar med produsentens instruksjoner (Invitrogen).

Humant IgG ble renset fra brukt dyrkningsmedium på en MabSelect protein A-kolonne (Amersham Biosciences). Renheten av preparater var >98 % bestemt ved SDS-PAGE analyse. Antistoffpreparater ble screenet og funnet å inneholde < 0,1 IU/ml endotoksin ved konsentrasjoner benyttet i den foreliggende studien, og som bestemt ved LAL amoebocytt lysat-testen (Cambrex Bioscience).

Eksempel 2 - Analyse av antistoffspesifisitet

Antigen- identifisering

Identiteten av de målrettede antigenene ble bestemt ved immunutfelling av B lymfomcellelysater. Celler (50-600 x IO<6>per ml lysatbuffer, avhengig av antistoff og cellelinje) ble høstet ved sentrifugering, vasket to ganger i PBS og inkubert i 15 min i Lysis Buffer (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, og Complete EDTA-free Protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland)) inneholdende detergenten Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 0,5 % v/v.

Cellerester ble spunnet ned ved 16,000 x g i 15 min i en konvensjonell benkesentrifuge og de løselige proteinene ble forhånds-klarnet med Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) (1/10 reaksjonsvolum) i 1 time ved rotasjon. For hver prøve ble 1 ml av det forhånds-klarnede cellelysatet immunoutfelt i 2 timer med 20-100 ug av hvilket som helst av de humane antistoffene. Protein A Sepharose 4 Fast Flow ble igjen tilsatt, og inkubert i 30 min, hvoretter immun-kompleksene ble vasket i stor utstrekning i lysatbuffer, kokt i 5 minutter og endelig resuspendert i prøvebuffer (IX NuPAGE LDS Sample Buffer, IX NuPAGE Sample Reducing Agent) og adskilt i en NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel (alle fra Invitrogen).

Etter farging (Simply Blue Safestain, Invitrogen), ble de aktuelle proteinbåndene kuttet ut fra SDS-PAGEet og underkastet tryptisk nedbrytning, som beskrevet (Edvardsson et al. Elektroforese 1999; 20:935-42.).

I korte trekk ble gelbitene avfarget og utbalansert ved vasking tre ganger med 200 ul 50 % acetonitril (ACN) under kraftig røring. Etter tørking i en SpeedVac-konsentrator (Savant, Farmingdale, NY, USA) i 15 min, ble prøver redusert ved tilsats av 25 u.1 10 mM DTT / 100 mM NH4HCO3og inkubert ved 56 °C i 1 time og alkylert ved tilsats av 25 ul 55 mM iodacetamid /100 mM NH4HCO3etterfulgt av inkubasjon i 45 min ved romtemperatur.

Etter to ytterligere 10 min vasketrinn i 100 mM NH4HCO3etterfulgt av en vask i 50 % v/v ACN, ble gel-bitene tørket i en SpeedVac-konsentrator og re-svellet og nedbrutt i 15 ul 15 ng/u.1 trypsin (Promega Corporation, Madison, Wl, USA) i 25 mM NH4HCO3ved 37 °C over natta. Peptider ble ekstrahert ved tilsats av 50 % v/v ACN / 1 % v/v TFA og 10 min inkubasjon ved RT. 1 ul av ekstraktet ble spottet på MALDI-prøveplater og satt til tørk. 1 ul matrix løsning (5 mg/ml alfa-cyano-4-hydroksy-kanelsyre (CHCA) i 75 % v/v ACN / 1 % v/v TFA) ble spottet på toppen av peptidene.

Peptid-massene ble bestemt ved bruk av en Applied Biosystems 4700 Maldi Workstation. Proteinene ble identifisert ved peptid-masse-fingerprint-databasesøk ved bruk av Mascot search tools (Matrixscience, UK). Antigen-spesifisiteter av kloner B10, CIO, og G12 ble identifisert ved bruk av lignende metologi, bortsett fra at scFv^er og anti-His belagte magnetiske mikrokuler (Miltenyi Biotec GmbH, Bergi sch Gladbach, Tyskland) ble benyttet for immunoutfellinger.

Etter omdanning til det fulle antistoff-formatet Bl, Bil og Cll, ble IgG benyttet for å utfelle antigener fra Raji og Ramos B lymfomceller. IgG Bl utfelte to bånd på henholdsvis omtrent 28 og 34 kDa (fig. 3A, bane 1). Gelbiter inneholdende disse båndene ble framstilt og brutt ned med trypsin og analysert ved massespektrometri ved å identifisere HLADR/DP som målantigenet.

Spesifisiteten av IgG Bl for HLA-DR/DP ble bekreftet både ved western blotting og deteksjon av HLA-DR/DP-protein, ved bruk av et kommersielt tilgjengelig monoklonalt antistoff, og ved blokkering av Bl IgG-binding etter pre-inkubering av celler med et kommersielt tilgjengelig HLA-DR-spesifikt monoklonalt antistoff (fig. 3B).

Identitetene av IgG Bil- og Cll-definerte antigener ble etablert ved bruk av lignende metologi. Det ble funnet at IgG Cll utfelte et 68 kDa proteinbånd identifisert som den membranbundete formen av B-celle-reseptor u.-kjeden (fig. 3A, bane 3). IgG Bil utfelte et 90 kDa proteinbånd som ble identifisert som det intercellulære celle-adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) (fig. 3A, bane 2). Spesifisitetene av IgG Bil for ICAM-1, og Cll IgG for IgM ble bekreftet ved MS-MS-analyse, antistoffblokkerende studier (fig. 3B), og western blot-analyse (data er ikke vist) ved bruk av kommersielt tilgjengelige antistoffer.

Spesifisiteter av kloner B10, CIO, og G12 ble bestemt ved bruk av scFv og anti-His- belagte magnetiske mikrokuler for immunoutfelling. De tre scFv-klonene utfelte et proteinbånd på 68 kDa, og MS-analyse av trypsinnedbrutte gelbiter inneholdende disse båndene avslørte deres spesifisitet for overflate-lgM. Trolig gjenkjenner disse antistoffene Ramos IgM-idiotypen ettersom ingen av dem kryssreagerer med perifere blod B-lymfocytter eller andre IgM-positive B-cellelinjer.

Eksempel 3 - Analyse av antistoffaffiniteter

In vitro jodinering av Bl og Bil Immunoglobuliner

Jodinering av 1 mg/ml IgGi Bl- eller IgGiBll-proteiner med [<125>l] Nal ble utført i PBS i 10 min ved bruk av forhåndsbelagte jodineringsrør (Pierce). Fritt [<125>l] Nal ble fjernet ved avsalting på PD-10-kolonner (Amersham Biosciences), hvilket ga spesifikke radioaktiviteter i området 1000-1600 cpm per ng protein.[125l] IgGiBl og [<125>l] IgGiBil ble benyttet for bestemmelse av antistoffaffiniteter.

Bestemmelse av IgG Bl og IgG Bil affinitetskonstanter

Radiojodinert IgG Bl eller IgG Bli ble inkubert med B lymfomceller i DPBS-B-hlgG (DPBS-B inneholdende 0,2 mg/ml humant IgG) i 2 timer på is med periodisk blanding. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 0,2 mg/ml umerket IgG Bl- eller IgG Bll-protein etter behov. Analyser ble utført i triplikat.

Celler ble lastet på toppen av 40 % v/v Ficoll/DPBS-B puter i individuelle rør og ble sentrifugert ved 400 x g i 6 min ved 4 °C. Prøver ble frosset ved -80 °C. Celle-pelleter og celle-supernatanter ble isolert og analysert separat for<125>l-lgG protein-innhold i en gammateller, etterfulgt av kutting av rørene i to like deler.

Antistoff-affinitetes-konstanter (Kd verdier) og epitopnummer per celle ble bestemt fra Scatchard plot-analyse i samsvar med Rosenthal et al. (Anal Biochem 1967;20:525-32), Bylund og Yamamura (Methods in Neurotransmitter Analysed. New York: Raven Press Ltd., 1990), og Marquardt (J. Soc. Indust. Appl. Math 1963;11:431-41), som tidligere beskrevet (Brix et al. J. Clin. Invest. 1998;102:283-93).

IgG Bl- og IgG Bll-binding til HLA-DR og ICAM-1 blekarakterisert vedinkubering av de radiojodinerte proteinene med Raji- eller Ramos-celler i nærvær eller fravær av 0,2 mg/ml av det tilsvarende umerkete IgG-proteinet ved 4 °C. Den spesifikke bindingen av [<125>l]lgG til celleoverflaten ble beregnet ved å trekke fra ikke-spesifikk binding (binding i nærvær av overskytende umerket IgG) fra den totale bindingen.

Metning av spesifikk IgG Bl-binding til Raji-celler ble oppnådd ved~30 nM IgG Bl (fig. 5). Rosenthal-Scatchard plott-analyse avslørte en dissosiasjonskonstant på~3 nM med 400 000 funksjonelle bindingsseter per Raji-celle, hvilket forutsetter en bivalent epitop-lgG-interaksjon (fig.

5). På lignende måte ble dissosiasjonskonstanten av IgG Bil bestemt til~0,2 nM med 47 400 reseptorer per Ramoscelle.

"Apoptoseinduksjon; bestemt ved prosentvis levedyktige celler etter 6 timers inkubering med hvilket som helst av de humane antistoffene, kryssbundet med geit anti-humant (gamma) Fc spesifikt antistoff; -, levedyktighet ikke påvirket; +, 95-80 %; ++, 79-60 %; +++, 59-40 % levedyktige celler sammenlignet med kontroll (humant FITC-8 IgGi). Resultatene ble basert på duplikate prøver i tre uavhengige eksperiment.

<b>MFI; Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av sekundært RPE-konjugert geit anti-humant IgG antistoff. Den cellelinjeavhengige MFl-verdien av kontroll humant antistoff FITC-8 IgG ble trukket fra MFI for hvert humant antistoff

Eksempel 4 - ICAM- 1 er et B lymfom- forbundet antigen med apoptoseinduserende egenskaper Flow- cytometrisk analyse av IgG- binding til Ramosceller

Ramosceller (13 x IO<6>) ble vasket med CD45-PerCp-Cy5.5 mAb ved inkubasjon på is i 45 min, vasket i DPBS-B, og holdt på is inntil blanding med umerkete rensete PBLer.

Fibrinlag fra to friske frivillige ble oppnådd fra Lund University Hospital. Fibrinlagene ble fortynnet 1:2 i PBS og vasket ved sentrifugering ved 500 x g (1500 opm Beckman Spinchron-sentrifuge) i 10 min, fullstendig oppsuging av supernatanten og resuspendering i DPBS inneholdende 1 % varmeinaktivert FCS (DPBS-HI). Vasking ble gjentatt to ganger. Røde blodceller ble lysert ved inkubering med rødblodcelle-lyseringsløsning (BD Biosciences) i 15 min ved RT. Celler ble vasket ved sentrifugering ved 60 x g (667 opm Beckman spinchron-sentrifuge) i 10 min og supernatanten ble forsiktig sugd opp. Celler ble telt i et Burker-kammer, etter farging med trypan blue-reagens (Invitrogen) og ekskludering av døde celler, vasket i DPBS-HI, pelletert, og resuspendert i DPBS-B inneholdende 200 ug/ml humant renset IgG (blokkerende Fc-reseptorer).

For hver donor og testbetingelse ble omtrent 2,5 x IO<6>leukocytter blandet med 1,6 x IO<5>PerCpCy5.5 forhåndsmerkete Ramosceller. Mus monoklonale CD3-FITC, CD56-PE, og CD19-PerCpCy5.5-antistoffer (BD Biosciences) ble tilsatt og blandingene ble inkubert på is inntil tilsats av merket humant IgG. Merking av n-CoDeR humane IgG antistoffer og positiv kontroll anti-CD20 mus-humant kimerisk antistoff Rituximab med AF647 Fab-fragmenter (Molecular Probes, Invitrogen) ble utført i samsvar med produsentens instruksjoner.

I korte trekk ble 4 ug av hver av IgG Bl, Bil, Cll og Rituximab-antistoffer inkubert med 20 ul AF647-Fab-merkende reagens i 5 min ved RT. Etter tilsats av 20 u.1 humant IgG-blokkerende reagens og en ytterligere inkubering i 5 min, ble AF647-merket IgG tre ganger seriefortynnet i DBPS-B, ogfortynnete IgG-proteiner ble tilsatt til de blandete Ramos/PBL-celleløsningene.

Prøver ble inkubert i 1 time, vasket, resuspendert i DPBS-B, og binding til ulike celle-subpopulasjoner ble analysert ved flow-cytometri etter egnet kalibrering og kompensering av instrumentet for fire-fargers analyse. Ramosceller ble identifisert som PerCpCy5.5<h>'<8h->populasjonen, forskjellig fra B lymfocytt PerCpCy5.5<low->populasjonen.

Immunohistokjemi

Kryogenisk bevarte lymfe-nodebiopsier fra pasienter med anaplastisk storcellet B-lymfom (én pasient), Centroblastisk/Centrocytisk B ikke-Hodgkins lymfom (tre pasienter), og B-celle kronisk lymfocytisk leukemi (én pasient) ble oppnådd fra Department of Pathology ved Lund University (Lund, Sverige). Åtte mikrometer store biter av kryogenisk bevart vev ble fiksert i aceton i 10 min ved 4 °C. Endogen biotinbindende aktivitet ble blokkert ved sekvensiell behandling med Avidin og Biotin (Avidin/Biotin-blokkerende sett, Invitrogen) i 20 min hver.

Vev ble inkubert med 5 ug/ml kontroll scFv eller Bil scFv i 1 time. Etter vasking ble seksjoner inkubert med biotin-konjugert mus anti-His mAb (R&D Systems) i 30 min. scFv-binding ble detektert etter behandling med ABC Complex/ HRP-reagens (Dako Cytomation) i 30 min og påfølgende inkubasjon med DAB i 5 min.

Seksjoner ble fotografert ved bruk av et Leica DC 300F digitalt kamera montert på toppen av et Leica DMR lys/fluorescensmikroskop.

Behandling av humant vev fulgte anbefalinger fra den lokale etikkkomiteen ved Lund universitetssykehus.

Mitokondrie!! membrandepolariseringsanalyse

Mitokondrien membran-depolarisering ble analysert som tidligere beskrevet (Kim et al. Mol Biol Cell 2004;15:420-34). I korte trekk ble antistoffbehandlete celler blandet med JC-l-reagens (Molecular Probes) ved 5 u.g/ml og inkubert i 30 min ved RT. Celler ble høstet to ganger i iskald PBS og resuspendert i 300 ul PBS og analysert på et FACS Aria (BD Biosciences). Den grønne og røde fluorescensen ble henholdsvis samlet gjennom 494/518 nm (FL-1) og 595/615 nm (FL-2) båndpasseringsfilter.

ICAM-1 er et glykoprotein av immunoglobulin-superfamilien (Marlin et al. Cell 1987;51:813-9) som kan indusere bi-retningsbestemt signalering (Rothlein et al. J Immunol 1994;152:2488-95; Vyth-Dreese et al. Blood 1995;85:2802-12). ICAM-1 har ikke tidligere vist seg å være involvert i programmert død i B-lymfomceller.

Det var derforønskelig å bekrefte at IgG Bll-indusert celledød var en aktiv prosess, ved andre midler enn cellemembran fosfatidyl-serin-translokasjon.

Mitokondrien membran-depolarisering ble valgt som en validering av apoptose, ettersom dette er et vanlig trekk av kaspase avhengig og kaspaseuavhengig apoptose som kan overvåkes ved cellefarging med 5,5',6,6'-tetraklor-l,l',3,3'-tetraetylbenzimidazolyl-karbocyanin jod (JC-1-reagens).

I samsvar med vår Annexin V/propidium jodanalyse (fig. 4A, øvre panel), ble IgG Bil funnet å indusere mitokondrien membrandepolarisering i CL-01 B lymfomceller, som bestemt ved flow-cytometrisk analyse etter farging med JC-1 reagent (fig. 4A, nedre panel).

For å ekskludere muligheten for at ICAM-l-ekspresjon var en in vitro artefakt, som et resultat av en generell oppregulering under celledyrkning, ble bindingen av IgG Bil til vev oppnådd fra fem forskjellige pasienter med ulike B-lymfomtumorer undersøkt.

Ved immunohistokjemi viste IgG Bil sterk binding til de fem lymfomvevene (fig. 4B), ved intensiteter som er sammenlignbare med eller litt lavere enn anti-HLA-DR/DP-antistoffet IgG Bl (tabell 2).

Deretter ble bindingen av IgG Bil til B-lymfom versus hvilende perifere blodleukocytter undersøkt. Ramos ble valgt som en representativ B lymfomcellelinje basert på dens nedre ende epitopekspresjon men likevel signifikant sensitivitet for Bll-indusert apopotose. Flow-cytometrianalyse, etter blandet inkubering av pre-merkete Ramosceller med hele blod-perifere blod-leukocytter og hvilken som helst av IgG Bl, Bil eller Cll-antistoffer, avslørte at IgG Bil viste sterk binding til Ramosceller.

Enda viktigere, Bil viste den største differensielle bindingen (sterkest antigenoppregulering) av de tre antistoffene til Ramos B lymfom-celler versus normale perifere blodleukocytter (fig. 4C, og data ikke vist). IgG Bll-binding toppet allerede ved 0,1 ug/ml og var 3,7- ganger oppregulert på Ramos versus monocyttceller (MFI 654 versus 176), 8,3 ganger oppregulert på Ramos- versus perifere blod B-lymfocytter (MFI 654 versus 78), og 23 ganger oppregulert sammenlignet med NK-celler. Binding til andre kontrollerte perifere blodleukocyttdelmengder var negative.

Eksempel 5 - Antigenfordeling av Bl, Bli, Cll IgGi på tumorcellelinjer av ulik opprinnelse, som bestemt ved flow- cytometri.

Antigenfordelingen av humane antistoff-målrettede antigener, hovedsakelig for Bil på ulike karsinom-cellelinjer ble undersøkt. Celler (MCF-7 og MDA MB 435S bryst-karsinom, JAR og JEG-3 chorio-karsinom, A549 lunge-karsinom, TCC-SUP urinblære-karsinom, MDA MB 435 melanom, HPAC, PANC-1 og BxPC-3 bukspyttkjertel-karsinom, PC-3 og DU145 prostata-karsinom, LS174 T, CaCo2, og Lovo kolorektal-karsinom, og THP-1 monocytiske leukemiceller), ble vasket i PBS, og resuspendert ved 4 x IO<6>celler/ml i Complete Medium (200,000 celler/50 u.1 prøve). Bl IgGi, Bil IgGi, Cll IgGi, negativ kontroll FITC-8 IgGi, og Rituximab anti-CD20 mAb ble 3-10-ganger seriefortynnet (10- 0,1 pg/ml) i Complete Medium (50 ul/prøve). Celler ble inkubert med hvert av antistoffene i 1 time på is, vasket ved resuspensjon i PBS/BSA 0,5 %, sentrifugert ved 1200 opm for 5 min, og fullstendig utsuging av supernatantene ble utført. Celler ble inkubert med PE-konjugert geit F(ab')2 anti-Human IgG (Caltag Laboratories, Cat no: H10104), fortynnet 1/50 i PBS/BSA 0,5 %, i 30 min, på is. Etter resuspendering i 300 ul PBS/BSA 0,5 %, ble celler analysert for IgG-binding ved bruk av et FACScan-instrument.

PC-3 prostata-karsinom-celler viste en sterk ekspresjon av ICAM-1 som vist ved den sterke bindingen av Bil IgG til disse cellene (Fig. 6). Det ble også funnet at MCF-7 brystkarsinom-, HPAC bukspyttkjertel-karsinom- og LS174T kolorektal-karsinom-celler uttrykte ICAM-1 skjønt ved lavere intensitet sammenlignet med prostatakreftceller. I motsetning til dette uttrykte ikke THP-1 monocytt leukemi-celler ICAM-1. Alle karsinomcellelinjer som initialt ble testet ble funnet negative for CD20, HLA-DR/DP, og IgM-ekspresjon som vist ved manglende binding av henholdsvis Rituximab IgG, Bl IgG, og Cll IgG. Videre studier av ytterligere karsinomcellelinjer indikerte at alle de vurderte karsinomcellene var positive for ICAM-l-ekspresjon (tabell 3).

Eksempel 6 - Bil IgGi apoptoseinduksjon i karsinomceller

I eksempel 5 ble det vist at Bil IgGi bindes sterkt til karsinomceller. Dette eksemplet vurderte de apoptoseinduserende egenskapene av dette antistoffet på karsinomceller.

Celler ble plantet i 6 brønnplater med Complete Growth Medium tre dager før igangsetting av eksperimentet. Celler var mellom 50-75 % konfluent ved tiden for eksperimentet. Celler ble vasket med iskald PBS og inkubert med seriefortynnet (20- 0,02 u.g/ml som angitt i figurene, i 1 ml Complete Growth Medium) Bil IgGi, 20 ug/ml kontroll Bl IgGi, 10u.g/ml negativ kontroll IgGi eller 10 ug/ml Trastuzumab IgGisom antydet ved 4 °C i 1-2 timer. Celler ble høstet med iskald PBS og sekundært F(ab'2) geit anti-Humant F(ab'2) antistoff (fortynnet i Complete Growth Medium til 10 ug/ml) ble tilsatt. Celler ble inkubert ved 37 °C i en fuktet atmosfære på 5 % C02i 16-24 timer. Totale celler ble samlet ved først å isolere supernatanten etterfulgt av PBS-vask og trypsinering av gjenværende adherende celler. Den enzymatiske reaksjonen ble terminert ved resuspendering i PBS inneholdende 10 % varmeinaktivert fosterkalveserum. Celler ble vasket i iskald PBS, underkastet Annexin V / propidium-jodfarging og analysert for levedyktighet/apoptose som beskrevet i eksempel 5 ovenfor.

Bil IgGi ble vist å indusere apoptose i karsinomcellelinjene på en spesifikk og titrerbar måte (figur 7). Kontroll IgG Bl, som ikke ble bundet til PC-3-celler (se eksempel 5), induserte ikke apoptose i PC-3-celler. Negativ kontroll IgGieller Trastuzumab IgGivar ikke i stand til å indusere apoptose i DU 145- eller MDA MB435-celler.

Eksempel 7- Farmasøytiske utforminger og administrering.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen framskaffer en farmasøytisk formulering omfattende en forbindelse i samsvar med det første aspektet av oppfinnelsen i en blanding med en farmasøytisk eller veterinær medisinsk akseptabel adjuvans, fortynner eller bærer.

Utformingen er fortrinnsvis en del-dose inneholdende en daglig dose eller del, daglig deldose eller en egnet fraksjon av den aktive ingrediensen.

Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen vil vanligvis framskaffes for administrering oralt eller ved enhver parenteral rute, i form av en farmasøytisk utforming omfattende den aktive ingrediensen, eventuelt i form av en ikke-toksisk organisk eller uorganisk syre eller base, tilsetningssalt i en farmasøytisk akseptabel doseringsform.

Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan framskaffes for administrering alene, men vil vanligvis bli framskaffet i blanding med et egnet farmasøytisk bindemiddel, fortynningsmiddel eller bærer valgt med hensyn til den tiltenkte administreringsvei og standardisert farmasøytisk praksis.

For eksempel kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen framskaffes for administrering oralt, bukalt eller sublingualt i form av tabletter, kapsler, frøemner, eliksirer, løsninger eller suspensjoner, som kan inneholde smaksstoffer eller fargeforbindelser, for umiddelbare, forsinkete eller kontrollerte frigivelsesanvendelser. Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan også framskaffes for administrering via intrakavernøs injeksjon.

Slike tabletter kan inneholde bindemidler så som mikrokrystallinsk cellulose, laktose, natriumsitrat, kalsiumkarbonat, dibasisk kalsiumfosfat og glysin, disintegranter så som stivelse (fortrinnsvis mais-, potet- eller tapiokastivelse), natrium-stivelse-glykollat, krysskaramellose-natrium og visse sammensatte silikater, og granuleringsindemiddel så som polyvinylpyrrolidon, hydroksypropylmetylcellulose (HPMC), hydroksypropylcellulose (HPC), sukrose, gelatin og akasie. I tillegg kan smøremidler så som magnesiumstearat, stearinsyre, glyseryl-behenat og talk være inkludert.

Faste forbindelser av lignende type kan også benyttes som fyllmasse i gelatinkapsler. Foretrukne bindemidler i denne forbindelsen inkluderer laktose, stivelse, en cellulose, melkesukker eller høymolekylære polyetylenglykoler. For vandige suspensjoner og/eller eliksirer, kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kombineres med ulike søtende eller smakssettende forbindelser, fargende materialer eller farger, med emulgerende og/eller suspenderende forbindelser og med tynnere så som vann, etanol, propylenglykol og glyserin, og kombinasjoner av disse.

Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan også framskaffes for parenteral administrering, for eksempel intravenøs, intra-arterial, intraperitoneal, intratekal, intraventrikulær, intrasternal, intrakraniær, intramuskulær eller subkutan, eller de kan framskaffes for administrering via infusjonsteknikker. De blir best framskaffet i form av en steril vandig løsning som kan inneholde andre substanser, for eksempel nok salter eller glukose til å gjøre løsningen isoton med blod. Det er hensiktsmessig å bufre de vandige løsningene (fortrinnsvis til en pH fra 3 til 9), om nødvendig. Framstillingen av egnete parenterale utforminger under sterile forhold blir lett utført med standardiserte farmasøytiske teknikker som er velkjent for fagpersoner.

Utforminger som er egnet for parenteral administrering inkluderer vandige og ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatisk middel og løsninger som gjør utformingen isoton med blodet hos den tiltenkte mottakeren; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende forbindelser og fortykningsmidler. Utformingene kan presenteres i del-dose- eller multi-dosebeholdere, for eksempel forseglete ampuller og medisinglass og kan lagres i en frysetørket tilstand (lyofilisert), som bare krever tilsats av den sterile væskebæreren, for eksempel vann for injeksjoner, umiddelbart før bruk. Magistrelle injeksjonsløsninger og suspensjoner kan framstilles fra sterilt pulver, granulat og tabletter av den typen som tidligere er beskrevet.

For framstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen tiltenkt oral og parenteral administrering til menneske-pasienter, vil den daglige dosen vanligvis være fra 1 mg/kg til 30 mg/kg. Derfor kan for eksempel tablettene eller kapslene av forbindelsen i samsvar med oppfinnelsen inneholde en dose av aktiv forbindelse for singel administrering eller for to eller flere samtidig, ettersom hva som er hensiktsmessig. Legen vil uansett bestemme den aktuelle dosen som vil være mest egnet for enhver individuell pasient og vil variere med alder, vekt og responsen hos den enkelte pasient. Doseringene gitt ovenfor er bare eksempel på et gjennomsnittlig tilfelle. Det kan selvfølgelig være individuelle tilfeller hvor høyere eller lavere doseintervaller er en fordel.

Forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen kan også framskaffes for intranasal administrering eller inhalering, og blir hensiktsmessig framskaffet i form av en tørrpulverinhalator eller en aerosolspray-presentasjon fra en trykksatt beholder, pumpe, spray eller forstøver med bruk av et egnet drivstoff, f.eks. diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, et hydrofluoralkan så som 1,1,1,2-tetrafluoretan (HFA 134A3 eller 1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropan

(HFA 227EA3), karbondioksid eller annen egnet gass. I tilfellet for en trykksatt aerosol, kan dose-delen bestemmes ved å framskaffe en ventil for å levere en oppmålt mengde. Den trykksatte beholderen, pumpen, sprayen eller forstøveren kan inneholde en løsning eller suspensjon av den aktive forbindelsen f.eks. ved bruk av en blanding av etanol og drivstoffet som løsningsmidlet, som i tillegg kan inneholde et smøremiddel, f.eks. sorbitantrioleat. Kapsler og patroner (for eksempel dannet av gelatin) for bruk i en inhalator eller insufflator kan utformes for å inneholde en pulverblanding av en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse.

Aerosol- eller tørrpulverutforminger er fortrinnsvis arrangert slik at hver oppmålte dose eller "puff" kan levere en egnet dose av en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen til pasienten.

Alternativt kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen framskaffes for administrering i form av en stikkpille eller pessar, eller de kan framskaffes for lokal påføring i form av en lotion, løsning, krem, salve eller pudder.

For bruk påøyet, kan forbindelser i samsvar med oppfinnelsen utformes som mikroniserte suspensjoner i isotonisk pH-justert steril saltoppløsning, eller fortrinnsvis som løsninger i isoton, pH-justert, steril saltoppløsning, eventuelt i kombinasjon med et konserveringsmiddel så som benzylalkoniumklorid. Alternativt kan de være utformet som en salve, så som vaselin.

For påføring lokalt på huden, kan forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen utformes som en egnet salve inneholdende den aktive forbindelsen suspendert eller løst i, for eksempel, en blanding med en eller av de følgende: mineralolje, flytende vaselin, hvit vaselin, propylenglykol, polyoksyetylen-polyoksypropylenforbindelse, emulgerende voks og vann. Alternativt kan de utformes som en egnet hudkrem eller krem, suspendert eller løst i, for eksempel en blanding av en eller flere av de følgende: mineralolje, sorbitan-monostearat, en polyetylenglykol, flytende parafin, polysorbat 60, cetylestervoks, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

Utforminger egnet for topisk administrering i munnen inkluderer sugepastiller omfattende den aktive ingrediensen i en smakssatt basis, vanligvis sukrose og akasie eller tragant; pastiller omfattende den aktive ingrediensen i en inert basis så som gelatin og glyserin, eller sukrose og akasie; og munnvasker omfattende den aktive ingrediensen i en egnet bærervæske.

Claims

1. Framgangsmåte for in vitro indusering av apoptose i en målcelle omfatter trinnene med: a. å framskaffe en eller flere målceller som oppviser celle-overflateantigenet, ICAM-1; b. å framskaffe ett eller flere bindingsmolekyler som selektivt bindes til celleoverflate-ICAM-1 og som, ved binding ICAM-1, induserer apoptose i målcellen; c. å eksponere målcellene i (a) for bindingsmolekylene i (b) for å indusere apoptose i målcellene hvori bindingsmolekylene er antistoff-molekyler, hvori antistoffmolekylene har variable regioner med sekvensene SEQ ID No 6 og SEQ ID No 8.

2. Bindingsmolekyl som selektivt bindes til celle-overflate-ICAM-1, som ved binding av ICAM-1 induserer apoptose i en målcelle, hvori bindingsmolekylet er et humant antistoffmolekyl, hvori antistoffmolekylet har variable regioner med sekvensene SEQ ID No 6 og SEQ ID No 8.

3. Bindingsmolekyl ifølge krav 2 for anvendelse i framgangsmåte ifølge krav 1.

4. Bindingsmolekyl ifølge krav 2 eller 3, hvori målcellen er en immuncelle eller en epitelcelle.

5. Bindingsmolekyl ifølge krav 4, hvori immuncellen er en B-lymfocytt.

6. Bindingsmolekyl ifølge et av kravene 2 til 5, hvori målcellen er forbundet med en sykdom.

7. Bindingsmolekyl ifølge krav 6, hvori sykdommen er valgt fra gruppen bestående av: kreft; autoimmunsykdommer inkludert men ikke begrenset til reumatisk artritt og SLE, akutte og kroniske betennelsessykdommer, sepsis og infeksjonssykdommer inkludert men ikke begrenset til HIV.

8. Bindingsmolekyl ifølge krav 7, hvori sykdommen er en kreft valgt fra lymfom (leukemi, myelom), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, kolonkreft og prostatakreft.

9. Bindingsmolekyl ifølge et av kravene 2 til 8, hvori antistoffmolekylet er en IgG.

10. Bindingsmolekyl ifølge krav 9, hvori nevnte IgG er valgt fra gruppen IgGi, lgG2, lgG3eller lgG4.

11. Nukleinsyre med en nukleotidsekvens som koder for et antistoffmolekyl i ifølge et av kravene 2 til 10.

12. Nukleinsyre ifølge krav 11 med en nukleotidsekvens med sekvensene SEQ ID No 5 og SEQ ID No 7.

13. Bindingsmolekyl ifølge et av kravene 2 til 10 for anvendelse i diagnostisering og/eller behandling og/eller forebygging av en sykdom, hvori diagnostiseringen og/eller behandlingen og/eller forebyggingen krever destruksjon av en målcelle.

14. Anvendelse av bindingsmolekylet ifølge et av kravene 2 til 10 i framstillingen av et medikament for behandling og/eller forebygging av en sykdom, hvori diagnostiseringen og/eller behandlingen og/eller forebyggingen krever destruksjon av en målcelle.

15. Bindingsmolekyl for anvendelse ifølge krav 13 eller for anvendelse ifølge krav 14, hvori sykdommen som skal behandles er valgt fra gruppen omfattende: kreft; autoimmunsykdommer inkludert men ikke begrenset til reumatisk artritt og SLE, akutte og kroniske betennelsessykdommer, sepsis og infeksjonssykdom inkludert men ikke begrenset til HIV.

16. Bindingsmolekyl for anvendelse ifølge krav 15, hvori sykdommen som skal behandles er kreft valgt fra lymfom (leukemi, myeloma), gastrisk kreft, brystkreft, leverkreft, lungekreft, melanom, blærekreft, chorioid-kreft, bukspyttkjertel kreft, tarmkreft og prostatakreft.

17. Bindingsmolekyl for anvendelse ifølge et av kravene 13 til 16, hvori bindingsmolekylet eller antistoff-molekylet er som definert i enten krav 1, 2 eller 3 og hvori sykdommen som skal behandles er lymfom som definert i krav 16.

18. Farmasøytisk blanding omfatter bindingsmolekylet ifølge et av kravene 2 til 10 og en farmasøytisk akseptabel bærer, bindemiddel eller tynner.

19. Bindingsmolekyl, bindingsmolemyl for anvendelse, nukleinsyre, anvendelse eller farmasøytisk blanding ifølge et av kravene 2 til 18, hvori bindingsmolekylet bindes selektivt til celleocerflate-ICAM-1 og, som ved binding av ICAM-1 induserer apoptose i en målcelle in vitro.