PT1960432T - Anticorpo anti-icam indutor de apoptose - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPO ANTI-ICAM INDUTOR DE APOPTOSE A invenção refere-se a moléculas envolvidas na indução da apoptose, métodos e composições farmacêuticas para a indução da apoptose e utilizações dos mesmos.

Os anticorpos tornaram-se recentemente os agentes terapêuticos proteicos de eleição para direcionamento contra cancro mas também para o tratamento de outras indicações (Brekke et ai. Nat Rev Drug Discov 2003;2:52-62) . O surgimento da manipulação de anticorpos proporcionou as ferramentas para gerar anticorpos humanos a partir cie bibliotecas cie fagos sintéticos, exibindo uma imunogenicidade diminuída e especificidade e afinidade melhoradas devido à sua natureza humana e maior diversidade (Weiner et ai. Nat Biotechnol 2005;23:556-7). As bibliotecas naif são particularmente atrativas, já que podem ser utilizadas para isolamento de anticorpos para qualquer especificidade, incluindo auto-antigénios (Griffiths et ai. Embo J 1993;12:725-34), independentes de imunizações e reconstrução de novas bibliotecas. Os recetores da superfície celular constituem, de longe, o grupo rnais bem-sucedido de antigénios alvejados por fármacos terapêuticos contemporâneos, incluindo inibidores de moléculas pequenas e anticorpos. De interesse particular são os recetores de superfície celular que são unicamente expressos ou que exibem um nível de expressão aumentado sobre uma célula alvo e são adicionalmente capazes de retransmitir sinais de morte ou sobrevivência à célula. Tais recetores expressos diferencialmente com propriedades de sinalização intrínsecas permitem o direcionamento baseado em anticorpos de células infetadas com micróbios, transformadas ou, de outra forma, anormais.

Para o tratamento de tumores, os anticorpos que têm a capacidade de induzir a apoptose numa célula tumoral alvo enquanto não afetam o tecido normal são de interesse particular. Vários tais anticorpos encontram-se em utilização, foram registados na Food and Drug Administration (FDA) dos E .U. e proporcionam alternativas aos tratamentos de cancro convencionais, por exemplo, para linfoma (rituximab tendo como alvo CD20) ou para o cancro da mama (trastuzumab ou cetuximab tendo como alvo Her-2 e EGFR respetivamente),

Também existem outros anticorpos com efeitos indutores da apoptose atualmente em desenvolvimento clinico. Contudo, mesmo que estes anticorpos demonstrem efeitos benéficos nos pacientes ou em testes animais, ainda continua a existir uma necessidade clinica não satisfeita. 0 direcionamento de imunoglobulinas anti-idiotipicas contra tumores de células B foi a primeira terapêutica de anticorpos monoclonais realizada no homem (Miller et ai. N Engl J Med 1982; 30 6: 517-22.) . Tem sido demonstrado que a destruição de células tumorais por tais meios de administração passiva de anticorpos (Riechmann et ai. Nature (1988) 332:323-7; ou vacinação ativa com a própria proteína de imunoglobulina tumoral dos pacientes (Kwak et ai. N Engl J Med 1992;327:1209-15.), confere regressão tumoral ou dormência tumoral nos pacientes com diferentes tipos de neoplasias malignas de células B. Um relatório mais recente descreve a geração de anticorpos anti-idiotipo completamente humanos utilizando ratinhos transgénicos deficientes em produção de anticorpos de ratinho e expressando loci de cadeia de anticorpo humano selecionado (Suarez et ai. Mol Immunol 2004;41:519-26.).

Na presente invenção foi utilizado um método de seleção biológica (biopanníng) de competição, onde o antigénio de células alvo sob a forma de células inteiras, e antigénio celular subtrator em excesso sob a forma de vesículas de membrana, são expostos ao mesmo tempo à biblioteca cie fagos de anticorpos n-CoDeR® naif (documento WO 2004/023140; Soderlind et ai. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.), para recuperar e subsequentemente testar os fragmentos de anticorpos com seletividade excelente para células alvo de linfoma B. Além disso, a funcionalidade nas moléculas de ligação selecionadas foi demonstrada através da capacidade dos anticorpos testados para induzir a apoptose em células alvo mas não em células não alvo.

As especificidades dos anticorpos identificadas incluem HLA-DR (o anticorpo Bl da invenção) e IgM de superfície (o anticorpo Cll da invenção), bem como ICAM-1 (o anticorpo Bll da invenção), uma molécula de adesão não associada, anteriormente, com a indução da apoptose. Os anticorpos isolados tinham afinidades no intervalo subnanomolar a nanomolar, tornando-os diretamente em opções possíveis para a terapêutica de anticorpos direcionados. λ Ha TyNfmtt riL ·-*-· qg _t- j, j, y Jl XwQlw

Num primeiro aspeto da invenção, é proporcionado um método para a indução da apoptose numa célula alvo que compreende as etapas: a. proporcionar: uma ou mais células alvo que exibem o antigénio de superfície celular, ICAM-1; b. proporcionar uma ou mais moléculas de ligação que se ligam seletivamente a ICAM-1 da superfície celular e, aquando da ligação a ICAM-1, induzem a apoptose da célula alvo; c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação de (b) para induzir: a apoptose nas células alvo.

Em que a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo tendo regiões variáveis que tem as sequências das figuras 10.

Na divulgação é proporcionado um método para indução da apoptose numa célula alvo que compreende as etapas: a. proporcionar uma ou mais células alvo que exibem o antigénio de superfície celular, HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície;

b. proporcionar uma ou mais moléculas de anticorpo qiae se ligam seletivamente a HLA-DR/DP de superfície celular e/ou IgM de superfície e, aquando da ligação a HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície, induzem a apoptose da célula alvo; c. expor as células alvo de (a) às moléculas de anticorpo de (b) para induzir a apoptose nas células alvo.

Num aspeto adicional da invenção é proporcionada uma molécula de ligação que se liga seletivamente a ICAM-1 de superfície celular e, aquando da ligação a ICAM-1, induz a apoptose da célula alvo e é um anticorpo humano que tem as regiões variáveis tendo as sequências da figura 10. ICAM-1 é também, designada CD54, mas para a finalidade deste pedido será utilizado ICAM-1.

As moléculas de ligação podem ser derivadas a partir de anticorpos e baseadas na armação de anticorpo [Clackson T et ai., Nature. 15 de agosto de 19 91; 352(633 6) :624-8, Marks JD et al. , J Mol Biol. 5 de dezembro de 19 91; 222 (3) : 581-97 ] que foi utilizada extensivamente em muitas bibliotecas, mas as moléculas de ligação também podem ser derivadas a partir de outras armações moleculares tais como a armação de fibronectina [Weng S et ai., Proteomics. janeiro de 2002; 2 (1): 48-57] e a armação de proteína A [Nord K, et aí., Nat Biotechnol agosto de 1997,-15(8) :772-7, Hogbom M et ai., Proc Natal Acad Sei EUA, 18 de março de 2003;100(6):3191-6]. Cada uma destas armações pode ter as suas vantagens dependendo da aplicação e a armação do anticorpo, como um exemplo, pode ser utilizada de forma vantajosa para criar uma variabilidade indistinguível da variabilidade natural. A estrutura básica cio anticorpo, a armação rnais comumente utilizada, é muito bem compreendida. Em princípio, uma estrutura de região estrutural que compreende cadeias beta ordenada em duas folhas apresenta um conjunto de ansas variáveis, as denominadas Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) que têm a capacidade de se ligar a moléculas de antigénio. Embora os anticorpos possam variar na estrutura da armação, a variabilidade mais extensa é observada nas CDRs. A grande variabilidade entre os anticorpos, é a base para a sua capacidade de interagir, de um modo especifico, em princípio, com todos os tipos de estruturas moleculares. Devido a esta capacidade, os anticorpos foram utilizados extensivamente para a geração de ligant.es específicos com aplicabilidade dentro da investigação, diagnóstico/prognóstico de doença e como agentes terapêuticos específicos para estruturas alvo definidas [Borrebaeck CA e Carlsson R, Curr Opin Pharmacol, agosto de 2011; 1(4):404-8].

Outras moléculas de ligação não anticorpos são aquelas que têm estruturas de armação com um. elevado grau de estabilidade mas que mesmo assim permitem que variabilidade seja introduzida em determinadas posições. Um exemplo de outra molécula de ligação é um domínio de fibronectina e um domínio de proteína A com tamanho de 58 aminoácidos qiae toleram a variabilidade. Existem também outras dobras moleculares que permitem algum grau de variação. Tais exemplos incluem moléculas de classe I e classe IT do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) e recentemente uma nova classe de moléculas as denominadas defensinas foram identificadas como sendo semelhantes na estrutura básica enquanto albergam urna extensiva variabilidade de sequência dentro dos membros da família génica indicando que são adequadas como armações para albergar diversidade molecular. Adicionalmente, ligando (s) natural, (ais) , por exemplo, LFA-1 no caso de ICAM-1 como uma molécula alvo, ou variantes recombinantes dos mesmos, podem constituir moléculas de ligação específica capazes de induzir a apoptose nas células alvo,

Além disso, a molécula de ligação pode ser qualquer molécula que se liga seletivamente a ICAM-1 da superfície celular de uma célula alvo e, aquando da ligação, induz a apoptose da célula alvo. O presente rastreio recuperou um anticorpo (Bll) específico para ICAM-1 - um recetor: não anteriormente associado com a apoptose e ao qual não foram atribuídas propriedades de sinalização negativas intrínsecas nas células. A identificação de ICAM-1 como uma molécula indutora de apoptose foi um resultado direto do facto do rastreio ser concebido para isolar especificidades para todos os recetores de superfície diferencialmente expressos entre células alvo e não alvo, independentemente de, e sem conhecimento prévio da sua respetiva identidade. A morte celular induzida por ICAM-1 foi verificada como um processo apoptótico ativo envolvendo a despolarização da membrana mitocondrial. A despolarização da membrana mitocondrial foi previamente descrita para ambas a apoptose dependente de caspase e independente de caspase (Nagy et al. J Mol Med 2003;81:757-65.).

As presentes verificações mostram adicionalmente que o epítopo ligado pelo anticorpo Bll é expresso em tecido de linfoma B de diferente origem, e é regulado positivamente em determinadas células de linfoma B comparadas com o resto de leucócitos do sangue periférico. De maneira importante, em adição às células de linfoma B, as células de carcinoma que expressam ICAM-1 passaram por apoptose quando submetidas in vitro ao anticorpo Bll especifico de ICAM-1 (veja-se o Exemplo 6) .

Estudos anteriores demonstraram uma expressão restrita de ICAM-1 em tecidos humanos normais (Smith et al. J Clin Pathol 19 90; 43:893-900.) . A ICAM-1 está envolvida na adesão célula a célula e desempenha um papel importante nas respostas imunitárias e inflamação através da ligação ao seu recetor LFA-1. Os anticorpos dirigidos a ICAM-1 foram utilizados para interferir com as respostas imunitárias patológicas e inflamação. A administração in vivo de um mAb murino anti-ICAM-1 em macacos cinomolgos (Cosimi et al. J Immunol 1990;144:4604-12.), ou a utilização em ensaios clínicos em pacientes humanos com artrite reumatoide ou pacientes que recebem transplantes renais também revelou a ausência de toxicidade evidente (Kavanaugh et al. Arthritis Rheum 1994;37:992-9; Haug et al. Transplantation 1993;55:766-72.). A nova descoberta de que o direcionamento contra ICAM-1 pode conduzir a apoptose demonstra a possibilidade de utilizar moléculas de ligação especifica a ICAM-1, tais como anticorpos para o tratamento de cancros de diferentes origens desde que expressem, o a n t i gé n i o .

Com base na sua expressão de ICAM-1, os tipos de cancro que podem ser potencialmente tratados com um anticorpo anti-ICAM-1 indutor da apoptose tal como Bll incluem: linfoma B, mieloma (Huang et ai. (1993) Hybridoma 12 p661-75; Huang et ai., (1995) Cancer Res 55 p610-6; Smallshaw et ai., (2004) J Immunother 27 p419-24), cancro gástrico (Maruo et ai., (2002) Int J Cancer 100 p486-90), cancro da mama (Rosette et ai., (2005) Carcinogenesis 26 p943-50) , cancro hepático (Sun et ai,, (1999) J Cancer Res Clin Oncol 125 p28-34) , cancro pulmonar (Sun et ai., (1998) Br J Cancer 77 p801-7 ), melanoma (Wang et ai., (2005) Int J Cancer 27 p419-24) , cancro de bexiga (Roche et ai., (2003) Thromb Haemost 89 1089-97) e cancro da próstata (Aalinkeel et ai., (2004) Cancer Res 64 p5311-21). A expressão de ICAM-1 também foi identificada em metástases tumorais conforme demonstrado por (Maruo et ai. , 2 0 02) , (Rosette et ai. , 2005), (Sun et ai., 1999), (Grothey et ai., 1998), (Aalinkeel et ai., 2004) apontando para a possibilidade para intervir nos processos de metástases utilizando um anticorpo específico para ICAM-1.

Numa divulgação adicional, o antigénio de superfície celular é HLA-DR/DP. HLA-DR/DP está normalmente presente em, por exemplo, células B e pode ser encontrado submetido a regulação positiva em células de linfoma B.

Até à data, três anticorpos monoclonais diferentes específicos para HLA-DR entraram em ensaios de fase clínica. Sendo a adição mais recente dos mesmos a IgC4 completamente humana 1D09C3, que foi isolada a partir de uma biblioteca de fagos naif de tamanho semelhante em. comparação com n-CoDeR®, mas utilizando seleção por afinidade (panning) de fase sólida no antigénio purificado (Nagy et al. Nat Med 2002;8:801-7.).

Foi identificado um novo anticorpo humano (Bl) direcionado contra HLA-DR/DP que induz a apoptose rapidamente e com elevada potência numa multitude de linhas celulares de linfoma B, demonstrando assim que HLA-DR/DP está ligado à indução da apoptose numa célula alvo. 0 anticorpo Bl ligou-se a uma multitude de linhas celulares de linfoma B de diferente origem, {veja-se, o Exemplo 1 e Quadro 1} e demonstrou-se que induz a apoptose em células que expressam antigénio HLA-DR/DP. Além disso, o anticorpo Bl mostrou uma potência mais elevada do que o Rituxirnab quando testado na linha celular de linfoma B Raji. Isto foi particularmente evidente, quando foi utilizado o formato de IgG4 do anticorpo Bl (Figura 8}. A partir dos dados obtidos, este anticorpo tem características adequadas para o tratamento de células de linfoma B que expressam HLA-DR/DP. Adicionalmente, de forma semelhante ao direcionamento contra Artrite Reumatoide e LES pelo Rituxirnab, o anticorpo Bl pode provar ser eficaz na eliminação de células B ativadas em distúrbios onde as células B que expressam. HLA-DR/DP são prejudiciais.

Numa divulgação ainda adicional, o antigénio de superfície celular é IgM. A IgM na sua forma livre existe como uma estrutura pentamérica de grande tamanho, cuja massa molecular mais elevada tende a confiná-la dentro dos vasos sanguíneos. A IgM monomérica pode ser encontrada nas paredes celulares de linfócitos B e funciona como um recetor de anticorpo para o reconhecimento antigénico.

0 anticorpo Cll, aquando da ligação a IgM de superfície, expressa sobre as células B, induz a apoptose de uma forma rápida e eficaz (veja-se o Exemplo 1 e Quadro 1) . Em contraste com os anticorpos anti-IgM específicos de idiotipo previamente utilizados na clínica para tratamento de linfoma B, o anticorpo Cll liga-se a um epítopo não polimórfico expresso nas células B a partir de diferentes dados e é, portanto, adequado para o tratamento de pacientes que sofrem de linfoma B independentemente do idiotipo de linfoma B.

De forma notável, a molécula efetora, por exemplo, o anticorpo anti-IgM poderia também ser qualquer tipo de molécula de ligação especifica que causa apoptose em células que expressam IgM de diferentes idiotipos.

As cinéticas da apoptose induzida por IgG Bl, Bll e Cll foram rápidas, sendo observada uma eficácia máxima logo depois de 3 horas em algumas linhas celulares. Uma rápida função efetora é importante para a eficácia terapêutica já que minimiza o risco cie evasão tumoral resultante de, por exemplo, a falta de expressão de antigénio tumoral (Uyttenhove et al. J. Exp. Med. 1983;157:1040-52; Kennedy et al. Br J Haematol 2002;119:412-6) ou mutação de epitopo (Weiner et al. J Immunol 198 9; 142:343-51; Bai et al. J. Clin. Invest. 2003;111:1487-96), e limita, potencialmente, a duração do tratamento e efeitos secundários (Robert, et al. Lancet Oncol 2005;6:491-500.).

Preferentemente, a célula alvo é uma célula imunitária ou célula epitelial e, vantajosamente, essa célula imunitária é um linfócito B.

Convenientemente, a célula alvo está associada com uma doença. Preferent.em.ente, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: cancro, doenças autoimunes incluindo, mas não restringidas a, artrite reumatoide e LES, distúrbios inflamatórios agudos e crónicos, sépsis e doenças infeciosas incluindo mas não restringidas a VIH.

Vantajosamente, a doença é um cancro selecionado a partir de linfoma (leucemia, mieloma) , cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro cia bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.

Convenientemente, a molécula de anticorpo é uma IgG. A IgG pode ser qualquer de IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG 4, mas preferentemente qualquer de IgGi e IgG4. A molécula de anticorpo é prefe.rentem.ente humana.

Convenientemente, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo da invenção tem uma sequência de qualquer uma das sequências de região variável da Figura 10.

Numa forma de realização da divulgação, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo tem as sequências de região variável da Figura 9 ou homólogos funcionalmente equivalentes das mesmas.

Numa forma de realização ainda adicional da divulgação, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo tem as sequências de região variável da Figura 11 ou homólogos funcionalmente equivalentes das mesmas.

Convenientemente, o ácido nucleico tem a sequência de nucleótidos de qualquer uma das figuras 9 a 11.

Num aspeto adicional da invenção, é proporcionada a utilização da molécula de anticorpo da invenção no diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção de uma doença que requer a destruição de uma célula alvo. Também é proporcionada a utilização da molécula de anticorpo da invenção na molécula da invenção no fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que requer a destruição de uma célula alvo.

Convenientemente, a doença a ser tratada é selecionada a partir do grupo que consiste em: cancro, doenças autoimunes incluindo, mas não restringidas a, artrite reumatoide e LES, distúrbios inflamatórios agudos e crónicos, sépsis e doenças infeciosas incluindo mas não restringidas a VIH.

Vantajosamente, a doença a ser tratada é cancro selecionado a partir de linfoma (leucemia, mieloma), cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro da bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.

Numa forma de realização da invenção, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo liga-se especificamente a ICAM-1 e/ou tem uma sequência da figura 10 e é utilizada rel.ativam.ente às doenças listadas acima.

Numa forma de realização adicional da divulgação, a molécula de anticorpo liga-se especificamente a HLA-DR/DP e/ou tem a sequência da figura 9 e é utilizada relativamente às doenças de linfoma (leucemia, mieloma), cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro da bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.

Numa forma de realização ainda adicional da divulgação, a molécula de anticorpo liga-se especificamente a IgM de superfície e/ou tem a sequência da figura 11 e é utilizada relativamente às doenças de linfoma (leucemia, mieloma), cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro da bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.

Num aspeto adicional da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende a molécula de anticorpo da invenção e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Significados dos termos utilizados 0 termo "molécula de anticorpo" deverá ser tomado como referindo-se a qualquer um de um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo. Destina-se a englobar anticorpos cie tipo selvagem, anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpos, tais como, mas não limitados a, uma molécula cie anticorpo modificada de cadeia simples produzida pela exibição em fagos de regiões constantes e/ou variáveis de cadeia leve e/ou pesada, ou outras moléculas imunointerativas capazes de ligação a um antigénio num formato de imunoensaio que é conhecido para os peritos na especialidade. 0 termo "fragmento de anticorpo" deverá ser tomado como referindo-se a qualquer um de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou derivado de anticorpo. Destina-se a englobar anticorpos de tipo selvagem (ou seja, uma molécula que compreende quatro cadeia polipeptídicas), anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpos, tais como, mas não limitados a, uma molécula de anticorpo modificada de cadeia simples produzida pela exibição em fagos de regiões constantes e./ou variáveis de cadeia leve e/ou pesada, ou outras moléculas imunointerativas capazes de ligação a um antigénio num formato de imunoensaio que é conhecido para os peritos na especialidade. 0 termo "derivado de anticorpo" refere-se a qualquer molécula de anticorpo modificada que é capaz de ligação a um antigénio num formato de imunoensaio que é conhecido para os peritos na especialidade, tal como um fragmento de um anticorpo (por exemplo, fragmento Fab ou Fv) , ou uma molécula de anticorpo modificada que é modificada pela adição de um ou mais aminoácidos ou outras moléculas para facilitar o acoplamento dos anticorpos a outro péptido ou polipéptido, a uma proteína portadora maior ou a um suporte sólido (por exemplo, os aminoácidos tirosina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína e derivados dos mesmos, grupos NH2-acetilo ou grupos amido terminais COOH, entre outros) . 0 termo "molécula ScFv" refere-se a quaisquer moléculas em que os domínios parceiros VH e VL estão ligados através de um oligopéptido flexível.

Os termos "sequência de nucleótidos" ou "ácido nucleico" ou "polinucleótido" ou "oligonucleótido" são utilizados indistintamente e referem-se a um heteropolímero de nucleótidos ou à sequência destes nucleótidos. Estas frases também se referem a ADN ou ARN de origem genómica ou sintética que podem ser de cadeia simples ou cadeia dupla e podem representar a cadeia sentido ou antissentido, a ácido nucleico peptídico (PNA) ou a qualquer material idêntico a ADN ou a ARN. Nas sequências do presente documento A é adenina, C é citosina, T é timina, G é guanina e N é A, C, G ou T (U) . Está contemplado que quando o polinucleótido seja ARN, o T (timina) nas sequências proporcionadas no presente documento é substituído com U (uracilo). Geralmente, os segmentos de ácidos nucleicos proporcionados por esta invenção podem ser montados a partir de fragmentos do genoma e ligantes oligonucleotidicos curtos, ou a partir de uma série de oligonucleótidos, ou a partir de oligonucleotides individuais, para proporcionar um ácido nucleico sintético que é capaz de ser expresso numa unidade trans c r i c i ona 1 r e c omb i n a n t. e c orrip reendendo e 1 eme n t. o s reguladores derivados a partir de um operão microbiano ou virai, ou um gene eucariótico.

Os termos "polipéptido" ou "péptido" ou "sequência de aminoácidos"-referem-se a uma sequência de oligopéptido, péptido, polipéptido ou proteína ou fragmento das mesmas e a moléculas sintéticas ou de ocorrência natural. Um "fragmento", "porção" ou "segmento" de polipéptido é uma extensão de resíduos de aminoácidos de pelo menos cerca de 5 aminoácidos, preferentemente pelo menos cerca de 7 aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 9 aminoácidos e ainda mais preferentemente cerca de 17 ou mais aminoácidos. Para ser ativo, o polipéptido tem de ter um comprimento suficiente para e x i b i r a t i v i da de b i o1ó gi ca e/o u i mu η o1ó g i c a.

Os termos "purificado" ou "substancialmente purificado", conforme utilizados no presente documento, indicam que o ácido nucleico ou polipéptido indicado está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas, por exemplo, polinucleótidos, proteínas e semelhantes. Numa forma de realização, o polinucleótido ou polipéptido é purificado de modo que constitui pelo menos 95 % em peso, mais preferentemente pelo menos 99 % em peso, das macromoléculas biológicas indicadas presentes (mas água, tampões e outras moléculas pequenas, especialmente moléculas tendo uma massa molecular inferior a 100 daltons, podem estar presentes). O termo "isolado" conforme utilizado no presente documento refere-se a um ácido nucleico ou polipéptido separado de pelo menos um outro componente (por exemplo, ácido nucleico ou polipéptido) presente com o ácido nucleico ou polipéptido na sua fonte natural. Numa forma de realização, o ácido nucleico ou polipéptido é encontrado na presença de (se existir algo) apenas um solvente, tampão, ião, ou outro componente normalmente presente numa solução dos mesmos. Os termos "isolado" e "purificado" não englobam ácidos nucleicos ou polipéptidos presentes na sua fonte natural. 0 termo "recombinante", quanto utilizado no presente documento para referir-se a um polipéptido ou proteína, significa que um polipéptido ou proteína é derivada a partir de sistemas de expressão recombinant.es (por exemplo, microbianos, de insetos ou mamíferos), "Microbiano" refere-se a polipéptidos ou proteínas recombinantes que se produzem em sistemas de expressão bacterianos ou fúngicos (por exemplo, leveduras). Como um produto, "microbiano recombinante" define um polipéptido ou proteína essencialmente livre de substâncias endógenas nativas e não acompanhada por glicosilação nativa associada. Os polipéptidos ou proteínas expressos na maioria das culturas bacterianas, por exemplo, Escherichia coli, estarão livres de modificações de glicosilação; os polipéptidos ou proteínas expressas em leveduras terão um padrão de glicosilação em geral diferente dos expressos em células mamíferas.

Os termos "ligação seletiva" e "seletividade de ligação" indicam que as regiões variáveis dos anticorpos da invenção reconhecem e ligam-se, exclusivamente, a polipéptidos da invenção (ou seja, são capazes de distinguir o polipéptido da invenção de outros polipéptidos semelhantes apesar da identidade de sequência, homologia, ou semelhança encontrada na família de polipéptidos), mas também podem interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de Staphylococcus aureus ou outros anticorpos nas técnicas de ELISA) através de interações com sequências fora da região variável dos anticorpos, e em particular, na região constante da molécula. Os ensaios de rastreio para determinar a seletividade de ligação de um anticorpo da invenção são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão compreensiva de tais ensaios, veja-se Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.I. (1988), Capitulo 6. Os anticorpos que reconhecem e se ligam a fragmentos dos polipéptidos da invenção também são contemplados, desde que os anticorpos sejam primeiramente e antes de mais, seletivos para, conforme definido acima, polipéptidos de comprimento completo da invenção. Tal como com os anticorpos que são seletivos para polipéptidos de comprimento completo da invenção, os anticorpos da invenção que reconhecem fragmentos são aqueles que podem distinguir polipéptidos da mesma família de polipéptidos independentemente da identidade, homologia, ou semelhança de sequências inerente encontrada na família de proteínas. 0 termo "afinidade de ligação" inclui o significando da força de ligação entre uma molécula de anticorpo e um antigénio.

Pelo termo "célula imunitária" entende-se qualquer célula que está envolvida numa resposta imunitária ou inflamatória do hospedeiro, incluindo, mas não limitada, a células B e células T.

Pelo termo "célula epitelial" entende-se uma célula do epitélio. 0 epitélio é um tecido composto por uma camada de células. 0 epitélio pode ser encontrado revestindo superfícies livres do corpo internas (por exemplo, endotélio, que reveste o interior dos vasos sanguíneos} ou externas (por exemplo, pele). A camada mais externa da nossa pele é composta por células epiteliais escamosas, tal como o são as membranas mucosas que revestem o interior da boca e cavidades corporais. Outras células epiteliais revestem o interior dos pulmões, do trato gastrointestinal, dos tratos reprodutor e urinário, e constituem as glândulas exócrinas e endócrinas. As funções das células epiteliais incluem secreção, absorção e proteção. As células epiteliais assentam sobre uma lâmina basal.

Formas de realização preferidas

Exemplos que incorporam determinados aspetos preferidos da invenção serão agora descritos com referência às seguintes figuras, nas quais: -

Figura 1 - scFv isolados por biopannlng diferencial de vesículas de membrana celular/células inteiras mostram uma elevada especificidade para células alvo.

Os clones de scFv isolados por biopannlng diferencial foram expressos em células TOP 10 de E. coli e incubados com células Ramos ou Jurkat e (A) clones de scFv expressos para rastreio primário ou (B) setenta e dois clones de scFv escolhidos e re-expressos de forma aleatória. scFv ligado foi detetado com mAb anti-His e Ab policlonal anti-ratinho-Cy5. A ligação celular foi detetada num instrumento de Rastreio de Alto Desempenho Macroconfocal FMAT. A ligação celular está ilustrada como a intensidade de fluorescência média para células Ramos alvo (eixo Y) frente a células Jurkat não alvo (eixo X) . (C) Ligação de sete clones de scFv únicos a células Ramos (barras preenchidas) e células Jurkat (barras em branco). Um scFv de controlo (Ctrl) não se ligou a qualquer uma das células.

Figura 2. Indução de apoptose de scFv anti-Ramos. Células de linfoma B Ramos foram sequencialmente incubadas com scFv anti-Ramos, mAb anti-His, e Ab policlonal anti-ratinho em gelo (com lavagem intermitente para remover o excesso de anticorpo não ligado), e foram incubadas numa atmosfera humidificada de 5 % de CCç a 37 °C durante 24 horas. As células foram depois colhidas e submetidas a coloração combinada com Anexina V-AF4 8 8 (AV) e iodeto de propídio (PI) . As células foram pontuadas como viáveis (AV- PI-, círculos preenchidos Fig. 2C), apoptóticas precoces (AV+ PI-, triângulos em branco Fig. 2C) , ou apoptóticas tardias/necróticas (AV+ PI + , losangos em branco Fig. 2C) , com base na positividade para a coloração com AV e PI (definida por janelas quadradas na Fig. 2B) . Os resultados são apresentados traçando (A) Dispersão direta (FSC-altura) frente a Dispersão lateral e (B) AB (FL-1) frente a PI (FL-3). 0 efeito titulável de scFv Bl e Fl também está apresentado em (C). Os sete clones de scFv únicos foram incubados com células de linfoma B (D) Ramos ou (E) Raji a 37 °C durante 24 horas a várias concentrações e o efeito da indução da apoptose foi estudado. Três scFv; Bl, Bll e Cll, mostram uma atividade titulável no sentido de ambas as linhas celulares, enquanto a capacidade de indução da apoptose de scFv B10, CIO e G12 se encontra restringida a células de linfoma B Ramos. Figura 3. Especificidades de anticorpos isolados incluem HLA-DR/DP, IgM e ICAM-1. A) 50-600 x 10° células de linfoma B Raj i foram lisadas com o detergente não iónico Triton X-100 a 0,5 % v/v e imunoprecipitadas com 100 yg do formato de IgGl completamente humano do anticorpo Bl (pista 1) e Bll (pista 2), seguido por reticulação com Proteína A Sepharose. Os lisados de células de linfoma B Ramos, a partir de 5 0 x 106 células, foram utilizados para a precipitação de 20 pg cie Cll (pista 3). As bandas específicas dos anticorpos foram excisadas e submetidas a digestão tríptica e analisadas por MALDI-TOF. B) A ligação de IgG Bl, IgG Bll e IgG Cll às células de linfoma B é especificamente bloqueada através da pré-incubação com anticorpos anti-HLA-DR/DP, anti-ICAM-1 ou anti-IgM, respetivamente.

Para confirmar as identidades antigénicas de MALDI-TOF recuperadas dos clones de anticorpos Bl, Bll e Cll, foram levados a cabo estudos de bloqueio com anticorpos comercialmente disponíveis e analisados através de citometria de fluxo. As células foram pré-bloqueadas com um excesso molar de 10 vezes (em comparação com o anticorpo humano) de anticorpos de bloqueio correspondidos por espécie durante 1 hora, seguido pela adição de qualquer dos clones de ant.ic.orpo humano isolados. .Após 30 min, as células foram lavadas e a ligação do anticorpo humano às células foi detetada mediante anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com PE (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, EUA) . Os anticorpos de bloqueio utilizados no estudo foram; para Bl, monoclonais de ratinho anti-HLA DR (Sigma, clone HK14) ou anti-CD40 (Beckton Dickinson, clone 5C3); para Bll, policlonais cie coelho anti-ICAM-1 (Abeam, ab7815-250) ou anti- CD22 (Abeam, ab25135-100); para Cll, policlonais de cabra anti-IgM (Zymed, South San Francisco, CA, EUA, 62-7500) ou anti-IgG (Zymed, 62-8400).

Figura 4. ICAM-1 é um recetor de superfície celular associado a linfoma B capaz de mediação da morte celular programada. A. 2 yg/ml de Bll ou IgGi anti-FITC-8 (controlo) foram adicionados a 4 x IO''1 células de linfoma B CL-01, incubados durante 2 horas em gelo, seguido pela adição de 10 yg/ml de anticorpo secundário Fab'2 de cabra anti-Fc humano de reticulação. As células foram incubadas a 37 °C durante 6 horas e o efeito da incubação do anticorpo foi determinado por dois ensaios de apoptose independentes. As células foram coradas por AV/PI (painel superior), de forma semelhante à descrita acima, ou através de incubação com 5 yg/rril do reagente de despolarização da membrana mitocondrial JC-1 durante 30 min à TA (painel inferior). A indução da apoptose é detetável através de uma diminuição na razão de intensidade de fluorescência vermelha (eixo y)/verde (eixo x). (B) Secção de histologia mostrando a ligação representativa do anticorpo Bll ao tecido de linfoma B. Tecido criopreservado obtido a partir de um paciente com linfoma B de células grandes anaplásico foi corado com anticorpo scFV Bll ou FITC-8 (controlo) . A ligação dos anticorpos foi detetada com DAB (cor castanha) . A fotografia inserida mostra a coloração com scFv de controlo. (C) Células Ramos pré-marcadas com rnAb CD45-PerCp-Cy5.5 foram misturadas com PBMCs derivadas de dadores e as diferentes populações celulares foram coradas com anticorpos específicos de CD conjugados com fluorocromo e IgGl Bll pré-marcada com Alexa Flour 647 Zenon ou IgGl FITC-8 de controlo. A ligação de IgG Bll às diferentes populações celulares foi registada no canal FL4 .

Figura 5. Afinidades de IgG BI e IgG Bll para células de linfoma. Células Raji (painéis da esquerda, IgG Bl) ou células Ramos (painéis da direita, IgG Bll) foram incubados com quantidades crescentes de proteína de IgG Bl radioiodada ou de IgG Bll radioiodada na presença ou ausência de 0,2 mg/ml da proteína de IgG não marcada correspondente. A ligação específica foi determinada através da subtração da ligação na presença de proteína competidora não marcada da ligação total. A quantidade de proteína de IgG Bl ou IgG Bll ligada aumentou com quantidades crescentes de proteína de IgG livre, atingindo-se uma ligação saturável a -30 nM de IgG Bl e ~1 nM de IgG Bll, respetivamente (painéis superiores). As análises de traçado de Rosenthal-Scatchard (painéis inferiores) demonstraram uma constante de dissociação de ~3 nM com 400.000 sítios de ligação funcionais por célula Raji para IgG Bl, e uma constante de dissociação de ~0,3 nM com 47.400 sítios de ligação funcional para IgG Bll (células Raj i) .

Figura 6 - Ligação de IgGi Bl, Bll e Cll a linhas de células tumorais de diferente origem. A distribuição antigénica dos antigénios alvo dos anticorpos Bl, Bll e Cll em diferentes linhas celulares de carcinoma foi investigada por citometria cie fluxo. Os histogramas mostram a ligação do mAb anti-CD2 0 Rituximab (maioria dos picos frontais da primeira linha), IgGi Bl (picos da segunda fila) , IgGi Bll (picos da terceira fila), ou IgGi Cll (maioria dos picos da parte posterior da quarta linha) para carcinoma da mama MCF-7, carcinoma pancreático HPAC, carcinoma da próstata PC-3, carcinoma colorretal LS174 T e células de leucemia monocítica THP-1, conforme indicado.

Figura 7 - Indução da apoptose por IgGi Bll em células de carcinoma A linha celular de carcinoma da próstata PC-3 foi cultivada em Meio de Crescimento Completo (RPMI 1640, suplementado com FCS a 10 %, HEPES a 10 mM, e L-Glutamina a 2 rriM) até 8 0 % de confluência rruma placa de 6 poços. A linha celular de carcinoma da próstata DU145 foi cultivada em MEM com sais de Earl, suplementado com. FCS a 10 %, piruvato de sódio a 1 mM, e aminoácidos não essenciais a 1 mM e o derivado de uma linha celular de melanoma MDA MB 435 foi cultivado em DMEM suplementado com FCS a 10 %.

Para os ensaios de apoptose, as células foram lavadas em PBS e IgGi Bll (ou IgGi Bl, Trastuzumab ou controlo de anticorpo negativos para controlos) diluído em série foi adicionado a poços individuais e a ligação foi permitida durante uma incubação de 1-2 horas a 4 °C. As células foram lavadas e foi adicionado Meio de Crescimento Completo, contendo anticorpo Fab'S de cabra anti-Fab'2 humano de reticulação, a 10 pg/ml. As células foram incubadas numa atmosfera humidificada, com 5 % de CO2 a 37 °C, durante 16-24 horas. As células foram recolhidas por tripsinação e coradas com Alexa Fluor 488-Anexina V (AF488-AV) e iodeto de propídio (PI), de acordo com as instruções do fabricante. A percentagem de células apoptóticas foi determinada através da fórmula: % de células apoptóticas = 100 - % AF488 - AV/PI -/-. A) Gráficos de contorno mostram a distribuição relativa de células PC-3 como uma função da positividade de Anexina V e Iodeto de propídio após incubação como acima com IgG Bll ou IgG Bl a 2 yg/ml. B) O gráfico de barras mostra a percentagem média de células PC-3 apoptóticas após incubação com igGi Bll diluída em série ou IgGi Bl a 20 pg/ml. C) O gráfico de barras mostra a percentagem média de células MDA MB 435 apoptóticas após incubação sem anticorpos de controlo, anticorpo de controlo negativo a 10 yg/ml, IgGi Bll diluída em série, ou IgGi Trastuzumab a 10 yg/ml. D) O gráfico de barras mostra a percentagem, média de células DU145 apoptóticas após incubação sem anticorpos de controlo, anticorpo de controlo negativo a 10 yg/ml, IgGj Bll diluída em série, ou IgGi Trastuzumab a 10 yg/ml. Figura 8. IgGi BI e IgG4 BI induzem citotoxicidade celular direta sobre células de linfoma B Raji na ausência de reagentes de reticulação. Células Raji foram incubadas com IgGi Bl, IgG4 Bl, IgGi Rituximab, ou IgC4 CT-17 de controlo a 20, 6,7 ou 2,2 yg/ml durante 24 horas. As células foram colhidas e a viabilidade foi determinada como a percentagem de células duplamente negativas para Anexina V e lodeto de propídio.

Figura 9 - Sequências VHeVL (nucleó tidos e aminoácidos) para o anticorpo Bl

Figura 10 - Sequências VH e VL (nucleótidos e aminoácidos) para o anticorpo Bll

Figura 11 - Sequências VH e VL (nucleótidos e aminoácidos) para o anticorpo Cll

Exemplo 1 - Seleção e Rastreio (Biopanning) para anticorpos indutores de apoptose, com especificidade para recetores de superfície celular associados a linfoma Cultura celular

As linhas celulares utilizadas neste estudo foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) ou Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH (Braunschweig, Alemanha) e foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10 %, L-glutamina a 2 mM, HEPES a 10 mM e piruvato de Na a 1 mM (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a menos que indicado o contrário. A linha celular de leucemia T Jurkat (clone E6-1, TIB-152, ATCC), as linhas celulares de linfoma B DOHH-2 (ACC47, DSMZ), SC-1 (ACC558, DSMZ), WSU-NHL (ACC58, DSMZ), JVM-2 (ACC12, DSMZ), Jeko-1 (ACC553, DSMZ cultivada em FCS a 20 %) , Rec-1 (ACC 584, DSMZ), Sup-53 (Daibata et ai.

Cancer 1989;64:1248-53), RL (CRL-2261, ATCC), Granta 519 (DSMZ), NCEB-1 (Saltman et. al. Blood 1988; 72:2026-30), BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975;22:276-84), Ramos (RL-1596, ATCC), Rail (CCL-86, ATCC), Daudi (CCL-213, ATCC), CL-01 (Cerutti et al. J Immunol 1998;160:2145-57), o linfoma de células B precursoras KM-3/Reh (CRL-5286, ATCC) e o mieloma múltiplo MC/CAR (CRL-8083, ATCC, cultivados em IMDM (Invitrogen) suplementados com FCS a 2 0 %) estavam todos isentos de micoplasma e foram cultivados numa atmosfera humidificada a 37 °C, utilizando uma atmosfera de 5 % de C02. As células foram mantidas a 2 x 105-1 x 106 células/ml. Preparação de vesículas de membrana de células Jurkat

As células Jurkat foram colhidas através de centrifugação a 300 x g durante 15 min em cubetas de 500 ml (Corning Inc. Life Sciences, Nova Iorque, EUA), lavadas em PBS de Dulbecco (Invitrogen), e ressupendidas em tampão A (NaHCOa a 1 mM, MgAc a 1,5 mM, pH 7,4) . A concentração celular foi de aproximadamente 5 x 107 células Jurkat/ml (5 x 109 células em 100 ml de Tampão A) . A rutura celular foi alcançada por tratamento de choque hipo-osmótico (Tampão A) em gelo durante 10-30 min e subsequente cavitação em azoto numa bomba de cavitação de azoto (Parr Instrument Company, Moline, IL, EUA). As células foram mantidas a uma pressão constante de 40 bar (4.000 kPa) durante 15 minutos a 0 °C.

As células ruturadas foram recolhidas num tubo Sarstedt de 250 ml (Sarstedt AG & Co, Numbrecht, Alemanha) contendo 500 ml de EDTA a 0,5 M para dar uma concentração final de EDTA de 2,5 mM. A adição de EDTA impede a agregação de vesículas de membrana. O homogeneizado (100 ml) foi dividido entre tubos de rotor de parede espessa Beckman 4 x 25 ml (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA), que foram centrifugados durante 10 min a 1900 x g (4.000 rpm num rotor Sorvall SS34) a 4 °C para remover células não ruturadas, núcleos e mitocôndrias pesadas. O sobrenadante foi recolhido e o material sedimentado foi ressupendido em 25 ml de tampão de KaHCOs a 1 mM contendo EDTA a 1 mM e foi re-centrifugado (recuperação adicional de membranas de Jurkat brutas sedimentadas). As membranas de Jurkat foram agrupadas com membranas a partir da primeira centrifugação. Os sobrenadant.es contendo vesículas de membranas de Jurkat brutas foram ultracentrifugados utilizando um rotor Beckman Tipo 45Ti a 40.000 rpm (aprox. 200.000 x g) durante 2,5 horas a 4 °C. Os sobrenadantes foram vertidos para fora e o tampão remanescente foi removido inclinando o bordo do tubo contra um lenço de papel (por exemplo, Kleenex'1'”) . O sedimento de membranas brutas foi transferido piara um homogeneizador Bounce com o auxilio de uma barra de metal e foi ressuspendido em 2,5 ml de tampão HES (Hepes a IQ mM, EDTA a 1 mM, sacarose a 0,25 M, pH 7,4) através de várias batidas cuidadosas no homogeneizador. Uma concentração de suspensão de membranas equivalente de 2 x 109 células/ml contendo 80-100 mg de proteína foi, assim, alcançada.

Seleção de Abs em fagos através de biopanning de competição de vesícula de célula inteira/membrana celular

Aproximadamente 2 x 101° partículas de fago foram pré-aquecidas a 37 °C durante 15 min com mistura intermitente, centrifugados durante 15 min a 14.000 x g para remover precipitados, e o sobrenadante foi transferido para um tubo Eppendorf novo. Leite em pó desnatado foi adicionado até uma concentração final de 2 % (p/v). As preparações de vesículas de membrana de células Jurkat derivadas a partir cie 2 x 109 células (seleção do ciclo 1; 2 x 108 células das seleções dos ciclos 2 e 3) foram descongeladas em gelo, e foram misturadas com as partículas de fago bloqueadas. A mistura foi incubada durante 15 min em gelo. 5 x 107 células Ramos (5 x 10b dos 2o e 3o ciclos) foram colhidas por centrifugação a 1.200 rpm durante 6 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e as células Ramos foram ressupendidas na mistura de leite-fago-vesícuia de membrana Jurkat. A suspensão foi incubada a 10 °C sob rotação em plano vertical lenta durante 4 horas. A mistura de células/vesículas de membranas celulares/fago foi transferida para um tubo Falcon de 15 ml (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA), contendo 0,5 ml de Ficoll-Paque PLUS (corado com azul tripano) a 100 % (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia} no fundo, e 9,5 ml sobrepostos de 40 % (v/v) de Ficoll em 2 % (p/v) de BSA/PBS (Ficoll-pillar) . O tubo foi centrifugado a 1.500 rpm durante 10 min a 4 °C. O tubo foi removido da centrífuga e a tampa do tubo foi enroscada e selada hermeticamente. A "ponta" inferior do tubo Falcon contendo Ficoll a 100 % foi cortada utilizando um corta-charutos. Assim, o material de densidade muito elevada incluindo lâminas de vesículas de membrana e núcleos celulares foi eliminado do tubo. A tampa do tubo foi depois cuidadosamente aberta interrompendo o vácuo dentro do tubo e permitindo que o liquido seja expelido gota a gota através da abertura no fundo (cortado) do tubo. A suspensão celular recolhida foi lavada uma vez em PBS para remover o excesso de Ficoll. O sedimento foi ressupendido em 1 ml de PBS (não realizado depois da lavagem final) e a suspensão foi recarregada sobre Ficoll-pillar novo e o procedimento de lavagem foi repetido (duas vezes nos ciclos 2 e 3) .

Os fagos foram eluídos das células através da adição de 150 ui de ácido cítrico a 76 mM (pH 2,5) e PBS seguido por incubação à temperatura ambiente durante 5 min. A mistura foi neutralizada através da adição de 200 μΐ de Tris-HCl a 1 M, pH 7,4. Os sobrenadant.es contendo fago eluído foram guardados após a sedimentação das células a 300 x g durante 5 min. A eluição adicional dos fagos foi feita através de ressuspensão e incubação do sedimento celular em 1 ml de tripsina à TA durante 10 min.

Após a inativação com 4 0 μΐ de aprotinina a 1 mg/rnl, as células foram centrifugadas e o sobrenadante contendo fagos eluídos foi guardado. Os fagos eluídos foram utilizados para infetar Escherichia coli HB101F' e as bactérias foram colocadas em placas em meio TB contendo antibióticos apropriados e glicose. As colónias bacterianas foram contadas, raspadas das placas, e utilizadas como inóculos para o seguinte ciclo de panning.

Conversão para o formato scFv, expressão de scFv, purificação e analise da ugaçao celular 0 agrupamento de fagemideos obtido depois de três ciclos de seleção foi digerido com EagI para remover o gene III. 0 vetor resultante foi religado. Os vetores contendo fragmentos de gene III não cortados religados foram linearizados através de digestão com enzima EcoRI. 0 agrupamento de vetor scFv assim gerado foi utilizado para transformar células TOPIO de E. coli essencialmente como descrito anteriormente (Soderlind et ai. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.).

As bactérias foram colocadas em placas de ágar grandes de 500 cm2 e os clones individuais foram colhidos, transferidos para placas de 9 6 poços e expressos em meio TB através de cultura durante a noite a 37 °C, 220 rpm utilizando um sistema automatizado (Hallborn Biotechniques 2002;Suppl:30-7.). Os fragmentos scFv recombinantes foram produzidos em meio TB contendo antibióticos apropriados.

Para o rastreio primário da ligação dos clones de scFv a células Ramos alvo e células Jurkat não alvo, 5.000 células Ramos ou Jurkat foram incubadas com qualquer um de 960 clones de scFv, derivados a partir do 3o ciclo de seleção e produzidos como descrito acima. As células foram incubadas com mAb anti-6xHis a 0,5 yg/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) e reagente de anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com Cy5 (Amersham Biosciences) a 0,7 yg/ml. A ligação celular foi analisada num instrumento de Rastreio de Alto Desempenho Macroconfocal de Fluorescência (FMAT) , 5200 Cellular Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Após o rastreio primário, setenta e dois clones bacterianos foram. colhidos aleatoriamente (ou seja, independentemente da reatividade de célula alvo frente a célula não alvo no rastreio primário) para a sequenciação de ADN conforme descrito anteriormente (Soderlind et ai. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.) (Soderlind et ai., 2000). Para a avaliação da ligação de superfície celular por citometria de fluxo, células Ramos e Jurkat (ambas adicionadas a 2 x 10° células por teste) foram incubadas com clones de scFv individuais a uma concentração de 2-10 yg/ml em PBS (Invitrogen) contendo 0,5 tp/v de BSA (DPBS-B) durante 1 hora.

As células foram lavadas por centrifugação a 300 x g durante 6 min. As células foram depois incubadas com mAb CD 19 conjugado com FITC e mAb CD3 (BD) conjugado com PE permitindo a identificação subsequente de células alvo e não alvo, respetivamente. A deteção da ligação de scFv foi alcançada por incubação com RPE-Cy5-estreptavidina (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) depois de incubação com mAb anti-6xHis biotinilado. As células foram incubadas com reagentes secundários e terciários durante 4 0 min e 15 min respetivamente. Todas as incubações foram realizadas em gelo utilizando soluções geladas.

Panning diferencial de célula inteira/vesícula de membrana celular O presente estudo utilizou um novo protocolo de panning para isolar anticorpos que têm como alvo antigénios diferencialmente expressos na sua configuração de superfície celular nativa. Após três ciclos de biopannig de competição, utilizando células de linfoma B Ramos e vesículas de membrana derivadas a partir de células de leucemia T Jurkat, foram isolados scFv de fagos recombinantes. Estes foram convertidos em scFv solúvel e expressos em células TOP10 de E. coli.

Os scFv recombinantes foram incubados com células inteiras alvo (Ramos) ou não alvo (Jurkat) e examinados quanto à ligação celular, A especificidade para os antigénios de células alvo dos clones de anticorpo foi marcante, uma vez que 482 clones de scFv expressos mostraram ligar-se seletivamente a células alvo Ramos em intensidades que variam desde fraco a muito forte (Fig. IA). Apenas foram identificados dois clones que coraram levemente células Jurkat não alvo (Fig. IA) .

Determinou-se, em seguida, a diversidade genotípica dos scFv exibidos em fagos isolados. Setenta e dois clones de scFv foram colhidos aleatoriamente (ou seja, independentemente do tropismo de ligação como determinado no rastreio primário) para a sequenciação de ADN.

Os clones foram. re-expressos simultaneamente e reavaliados quanto à especificidade para as células alvo (Ramos frente a Jurkat) por tecnologia FMAT, como descrito (Fig. 1B) . Foram identificados sete genótipos de anticorpo diferentes, conforme determinado pelas suas sequências cie CDRH3 e CDRL3 diferentes (dados não mostrados). A elevada especificidade de scFv anti-Ramos foi confirmada através de análises de citometria de fluxo de três cores, após incubação com números iguais de células Ramos e Jurkat e deteção da ligação de scFv mediante anticorpo anti-etiqueta (Fig. 1C). Célula alvo e não alvo foram definidos pela expressão cie CD19 e CD3, respetivamente, utilizando anticorpos monoclonais específicos de CD conjugados com fluorocromo. Os sete clones de scFv genotipicamente únicos mostraram intensidades de ligação altas e variáveis para células Ramos alvo, mas nenhuma ligação às células Jurkat não alvo, em comparação com scFv cie controlo negativo.

Ensaio de apoptose

Os níveis de polissacarídeo de fragmentos scFv produzidos de forma recombinante foram reduzidos utilizando colunas de Detoxigel de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) . Os níveis de endotoxina remanescentes foram, quantificados pelo ensaio de lisado LAL-amebócito (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, EUA).

Verific.ou-se que todas as amostras de scFv contêm menos do que 0,1 Ul/ml. de 1 ipopolissacarídeo. O anticorpo anti-CD20 quimérico Mabthera™ (Rituximab) foi adquirido a partir do Lund University Hospital (Lund, Suécia). 2 x 105 células de linfoma B (Raji ou Ramos) ou células T Jurkat, foram incubadas com scFvs diluídos em série e destoxifiçados em meio de cultura durante 1 hora em gelo.

As células foram subsequent.em.ente incubadas com mAb secundário anti-6xHis (5 yg/rnl), e anticorpo terciário Fat/2 de cabra anti-Fab'2 de ratinho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West. Grove, PA, EUA). Lavagens intermitentes asseguraram a remoção do excesso de reagente de anticorpo não ligado. As células foram incubadas a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5 % de CCf? durante 24 horas.

Quando foram utilizadas IgGs inteiras para a indução de apoptose, o reagente de reticulação foi substituído por anticorpo Fab'2 de cabra anti-Fc y humano (Jackson ImmunoResearch) com. uma reativida.de cruzada com isotipos de anticorpo não IgG (para evitar a ligação cruzada não específica de imunoglobulinas de superfície associadas com linfoma B) e incubado, conforme descrito anteriormente, durante 6 horas.

As células apoptóticas foram, a menos que indicado o contrário, detetadas por coloração combinada com Anexina V Alexa Fluor 488 (AV) e lodeto de propídio (PI) (ambos de Molecular Probes, Invitrogen) e subsequente análise de citometria de fluxo. As células foram definidas como viáveis (AV-/PI-), apoptóticas precoces (AV+/PI-) ou apoptóticas tardias/necróticas (AV+/PI + ) . Os sinais de AV e PI foram registados nos canais FLl e FL2 ou FL3 (como indicado no texto) , respetivamente, utilizando um instrumento FACSCalibur (BD Biosciences).

De modo a investigar a funcionalidade dos scFv isolados, estabeleceu-se um ensaio de rastreio de apoptose de alto desempenho, com. base na incubação e lavagem, sequencial das células com scFv e reagente de reticulação. A dependência do clone de scFv e concentração no ensaio de apoptose é demonstrada na Fig. 2A-C, onde o efeito apoptótico do clone de scFv Bl selecionado é comparado com o efeito - do clone de scFv Fl que não mostra qualquer indução da apoptose. As células Jurkat que carecem de expressão de antigénio alvo não morreram de apoptose depois do tratamento com qualquer dos scFv examinados demonstrando que a indução da apoptose dependeu da ligação ao antigénio alvo {dados não mostrados).

Utilizando o ensaio de apoptose por scFv estabelecido, foram rastreados clones quantio à apoptose sobre células de linfoma B Ramos e Raji. Os efeitos apoptóticos induzidos por scFv foram comparados com aqueles induzidos pelo mAb anti-CD20 Rituximab (Fig. 2D). Foi identificado que três clones de scFv - Bl, Bll e Cll - induziram apoptose significativa em ambas células Ramos e Raji (Fig. 2D e E). A indução da apoptose por scFv em células Raji correlacionou-se com a ligação a estas células (Fig. 2D), uma vez que os clones de scFv que não foram capazes de se ligar a células Raji não induziram a apoptose.

Os clones Bl, Bll e Cll foram transferidos para anticorpos IgGl completamente humanos. Ambas a sua especificidade e funcionalidade permaneceram intactas depois da reformatação, conforme pela sua ligação forte e citotoxicidade potente em relação a um amplo painel de linhas celulares de linfoma B (Quadro 1). De forma notável, a indução da apoptose foi rápida com uma percentagem máxima de células apoptóticas positivas a anexina V sendo alcançada já depois de três a seis horas em várias linhas celulares (Quadro 1 e dados não mostrados). Ensaios de produção de IgG e rastreio de endotoxina

Fragmentos de anticorpo scFv foram convertidos no formato de IgGlX humana de comprimento completo através de clonagem num vetor pCDNA3 modificado (Norderhaug et ai. J Immunol Methods 1997;204:77-87.), e transientemente infetados em células HEK293 utilizando reagente Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

IgG humana foi purificada a partir de um meio de cultivo esgotado numa coluna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences). A pureza das preparações foi >98 % conforme determinado por análise de SDS-PAGE. As preparações de anticorpo foram rastreadas e verificou-se que continham <0,1 Ul/ml de endotoxina a concentrações utilizadas no presente estudo, E como determinado pelo teste de lisado LAL amebócito (Cambrex Bioscience).

Exemplo 2 — Análise da especificid3.de dos anticorpos

Identificação antigénica A identidade dos antigénios alvo foi determinada através de imunoprecipitação de lisados de células de linfoma B. As células (50-600 x 106 por ml cie tampão de lise, dependendo do anticorpo e linha celular) foram colhidas através de centrifugação, lavadas duas vezes em PBS e incubadas durante 15 min em tampão de lise (Tris-HCl a 25 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, EDTA a 5 mM, e Cocktail inibidor de protease isento de EDTA completo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha)) contendo o detergente Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 0,5 % v/v.

Os detritos celulares foram depositados por centrifugação a 16.000 x g durante 15 min numa centrífuga de mesa convencional e as proteínas solúveis foram pré-extraídas com Proteína A Sepharose 4 Fast. Flow (Amersham Bioscienc.es) (1/10 volume de reação) durante 1 h em rotação. Para cada amostra, 1 ml de lisado celular pré-extraido foi imunoprecipitado durante 2 h por 20-100 pg de qualquer dos anticorpos humanos. Proteína A Sepharose 4 Fast. Flow foi adicionada novamente e incubada durante 30 min, depois do que os imunocomplexos foram lavados extensivamente no tampão de lise, levados à ebulição durante 5 min, e finalmente ressuspendidos em Tampão de amostra (Tampão de amostra IX NuPAGE LDS, Agente de redução de amostra IX NuPAGE) e separados num gel Bis-Tros 4-12 % NuPAGE Novex (todos de Invitrogen).

Depois da coloração (Simply Blue Safestain, Invitrogen) , as bandas proteicas de interesse foram excisadas do SDS-PAGE e submetidas a digestão tríptica, conforme descrito (Edvardsson et al. Electrophoresis 1999;20:935-42.).

Resumidamente, os tampões de gel foram descorados e equilibrados através de lavagem três vezes com 200 yl de acetonitrilo (ACN) a 50 % sob agitação. Depois de secagem, num concentrador SpeedVac (Savant, Farmingdale, NI, EUA) durante 15 min, as amostras foram reduzidas através da adição de 25 μΐ de DTT a 10 IÍ1M/NH4HCO3 a 100 mM e incubadas a 5 6 °C durante 1 hora e alquiladas através da adição de 25 μΐ de iodoacetamida a 55 mM/NrbHCCU a 100 mM seguido por incubação durante 4 5 min à temperatura ambiente.

Depois de duas etapas de lavagem adicionais de 10 min em NH4HCO3 a 100 mM seguidas por uma lavagem em 50 % v/v de ACN, os pedaços de gel foram secos num concentrador SpeedVac e inchados novamente e digeridos em 15 μΐ de tripsina a 15 ng/μΐ (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) em NH4HCO3 a 25 mM a 37 °C. durante a noite. Os péptidos foram extraídos através da adição de 50 % v/v de ACN/ 1 % v/v de TEA e incubação de 10 min à TA. 1 μΐ do extrato foi manchado sobre placas de amostra MALDI e deixado a secar. 1 μΐ de solução de matriz (ácido alfa-ciano-4-hidroxi cinâmico (CHCA) a 5 mg/ml em 75 % v/v de ACN/1 % v/v de TFA) foi manchado em cima dos péptidos.

As massas de péptidos foram determinadas utilizando uma Applied Biosystems 4700 Maldi Workstation. As proteínas foram identificadas através de pesquisa numa base de dados de impressões digitais de massa de péptidos utilizando ferramentas de pesquisa Mascot (Matrixscience, RU) . As especificidades antigénicas dos clones B10, CIO e G12 foram identificadas utilizando uma metodologia semelhante, exceto que scFvs e microesferas magnéticas revestidas anti-His (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha) foram utilizadas para imunoprecipitações.

Após a conversão para o formato de anticorpo completo, IgG Bl, Bll e Cll foram, utilizadas para precipitar antigénios a de células de linfoma B Raji e Ramos, A IgG Bl precipitou duas bandas de aproximadamente 28 e 34 kDa, respetivamente (Fig. 3A, pista 1) . Fatias de gel. contendo estas bandas foram preparadas e digeridas com tripsina e analisadas por espectrometria de massa identificando HLADR/DP como o antigénio alvo. A especificidade de IgG Bl para HLA-DR/DP foi verificada tanto por western blotting como deteção de proteína HLA-DR/DP, utilizando um anticorpo monoclonal comercialmente disponível, e através do bloqueio da ligação de IgG Bl após a pré-incubação das células com um anticorpo monoclonal específico de HLA-DR comercialmente disponível (Fig. 3B).

As identidades dos antigénios definidos por IgG Bll e Cll foram estabelecidas utilizando uma metodologia semelhante, verificou-se que IgG Cll precipita uma banda de proteína de 68 kDa identificada como a forma ligada à membrana da cadeia m do recetor de células B (Fig. 3A, pista 3). A IgG Bll precipitou uma banda de proteína que foi identificada como a molécula 1 de adesão intracelular (ICAM-1) (Fig. 3A, pista 2} . As especificidades de IgG Bll para ICAM-1, e de IgG Cll para IgM, foram confirmadas por análise de MS-MS, estudos de bloqueio de anticorpos (Fig. 3D) e análise de western blot (dados não mostrados) utilizando anticorpos comercialmente disponíveis.

As especificidades dos clones BIO, CIO e G12 foram determinadas, utilizando scFv e microesferas magnéticas revestidas anti-His para imunoprecipitação. Os três clones de scFv precipitaram uma banda de proteína de 68 kDa, e a análise de MS de fatias de gel digeridas com tripsina contendo estas bandas revelaram a sua especificidade para IgM de superfície. Presumivelmente, estes anticorpos reconhecem o idiotipo IgM de Ramos, já que nenhum deles reagiu de forma cruzada com os linfócitos B do sangue periférico ou outras linhas celulares B positivas para IgM.

Exemplo 3 - Análise das afinidades dos anticorpos

Iodação in vitro das imunoglobulinas Bl e Bll A iodação de 1 mg/ml das proteínas IgG4 Bl ou IgG4 Bll com [lzbI] Nal foi realizada em PBS durante 10 min utilizando tubos de iodação pré-revestidos Iodogen (Pierce) . [12oI] Nal livre foi removido por dessalinização em. colunas PD-10 (Amersham

Biosciences), dando radioatividades especificas no intervalo de 1000-1600 cpm por ng de proteína. [12oI] IgGi Bl e [12jI] igGi Bll foram utilizadas para determinação de afinidades dos anticorpos.

Determinação das constantes de afinidade de IgG Bi e IgG Bll

IgG Bl ou IgG Bll radioiodada foi incubada com células de linfoma B em DPBS-B-hlgG (DPBS-B contendo IgG humana a 0,2 mg/ml) durante 2 horas em gelo com mistura intermitente. A ligação não especifica foi determinada na presença de proteína IgG Bl ou IgG Bll a 0,2 mg/ml não marcada, conforme apropriado. A análise foi realizada em triplicados.

As células foram carregadas sobre almofadas de 40 % v/v de Ficoll/DPBS-B em tubos individuais e foram centrifugadas a 400 x g durante 6 min a 4 °C. As amostras foram congeladas a -80 °C. Os sedimentos celulares e sobrenadantes celulares foram isolados e analisados separadamente quanto ao teor em 12°I-proteína IgG num contador gama, após corte dos tubos ao me i o.

As constantes de afinidade dos anticorpos (valores Kd) e os números de epítopos por célula foram determinados a partir da análise de traçado de Scatchard de acordo com Rosenthal et aí, (Anal Biochem 1967;20:525-32), Bylund and Yamamura (Methods in Neurotransmitter Analysed. Nova Iorque: Raven Press Ltd., 1990), e Marquardt (J. Soc. Indust. Appl. Math 1963;11:431-41), conforme descrito anteriormente (Brix et al. J. Clin. Invest. 1998;102:283-93). A ligação de IgG Bl e IgG Bll a HLA-DR e ICAM-1 foi caracterizada através da incubação das proteínas radioiodadas com células Raji ou Ramos na presença ou ausência de 0,2 mg/ml da proteína IgG não marcada correspondente a 4 °C. A ligação específica de [lzilI]IgG à superfície celular foi calculada através da subtração da ligação não específica (ligação na presença de excesso de IgG não marcada) da ligação total. A saturação da ligação especifica de IgG Bl a células Raji foi alcançada a ~30 nM de IgG Bl (Fig. 5) . A análise de traçado de Rosenthal-Scatchard revelou uma constante de dissociação de -3 nM com 400.000 sítios de ligação funcionais por célula Raji, assumindo uma interação de epítopo-IgG bivalente (Fig. 5) . De forma semelhante, a constante de dissociação de IgG Bll foi determinada para -0,2 nM com 47.400 recetores por célula Ramos. η

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Exemplo 4 - JCâM-2 é um antigénio associado a linfoma B com propriedades de indução da apoptose

Análise de citometria de fluxo de ligação de IgG a células Ramos Células Ramos (13 x 10fa) foram coradas com mAb CD45-PerCp-Cy5.5 através de incubação em gelo durante 45 min, lavadas com DPBS-B, e mantidas em gelo até mistura com PBLs purificados não marcados.

As camadas leucocitárias de dois voluntários saudáveis foram obtidas a partir: do Lund University Hospital. As camadas leucocitárias foram diluídas a 1:2 em PBS e lavadas por centrifugação a 500 x g (centrífuga Beckman Spinchron 1500 rpm) durante 10 min, a aspiração completa do sobrenadante e ressuspensão em DPBS contendo FCS inativado por calor a 1 % (DPBS-HI). A lavagem foi repetida duas vezes. Os glóbulos vermelhos foram lisados por incubação com solução de lise de glóbulos vermelhos (BD Biosciences) durante 15 min à TA. As células foram lavadas por centrifugação a 60 x g (centrífuga Beckman Spinchron 6 67 rpm) durante 10 min e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado. As células foram contadas numa câmara de Burker após coloração com reagente de azul de tripano (Invitrogen) e exclusão de células mortas, lavadas em DPBS-HI, sedimentadas e ressupendidas em DPBS-B contendo IgG purificada humana a 200 mg/ml (bloqueio de recetores Fc) .

Para cada dador e condição de ensaio, foram misturados aproximadamente 2,5 x 10° leucócitos com 1, 6 x 105 células Ramos pré-marcadas com PerCpCy5,5. Anticorpo monoclonais de ratinho CD3-FITC, CD56-PE e CDl9-PerCpCy5.5 (BD Biosciences) foram adicionados e as misturas foram incubadas em gelo até à adição da IgG humana marcada. A marcação de anticorpos de IgG humana n-CoDeR e anticorpo quimérico murino-humano anti-CD20 (Rituximab) de controlo com fragmentos Fab AF647 (Molecular Probes, Invitrogen) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

Resumidamente, 4 ug de cada dos anticorpos IgG Bl, Bll, Cll e Rituximab foram incubados com 2 0 ul de reagente de marcação Fab Af647 durante 5 min à TA. Depois da adição de 20 μΐ de reagente de bloqueio de IgG humana e uma incubação adicional durante 5 min, IgG marcada com AF647 foi diluídas em série três vezes em DBPS-B e proteínas de IgG diluídas foram adicionadas às soluções de células Ramos/PBL misturadas.

As amostras foram incubadas durante 1 h, lavadas, ressuspendidas em DPBS-B e analisadas quanto à ligação a diferentes subpopulações celulares através de citometria de fluxo, após calibração e compensação apropriada do instrumento para análise de quatro cores. As células Ramos foram identificadas como a população PerCpCyS. 5dlLo diferente da população PerCpCyS . 5bdlxo de linfócitos B.

Imunohistoquimica

Biópsias de gânglios linfáticos criopreservados de pacientes com linfoma B de células grandes anaplásico (um paciente), linfoma não Hodgkin centroblástico/centrocítico (três pacientes), e leucemia linfocítica crónica de células B (um paciente) foram obtidas a partir do Departamento de Patologia na Lund University (Lund, Suécia). Secções de oito micrómetros de tecido criopreservado foram fixadas em acetona durante 10 min a 4 °C. A atividade de ligação de biotina endógena foi bloqueada por tratamento sequencial com. Avidina e Biotina (kit de bloqueio de avidina/biotina, Invitrogen) durante 2 0 min cada.

Os tecidos foram incubados com. scFv de controlo ou scFv Bll a 5 pg/ml durante 1 hora. Depois de lavagem, as secções foram incubadas com mAb de ratinho anti-His conjugado com biotina (R&amp;D Systems) durante 30 minutos. A ligação de scFv foi detetada após tratamento com Complexo ABC/reagente HRP (Dako Cytomation) durante 30 min, e subsequente incubação com DAB durante 5 min.

As secções foram fotografadas utilizando uma câmara digital Leica DC 3Q0F montada sobre um microscópio de luz/fluorescência Leica DMR. A manipulação do tecido humano seguiu a recomendação do comité de ética local no Lund University Hospital.

Ensaio de despolarização da membrana mítocondrial A despolarização da membrana mítocondrial foi analisada conforme descrito anteriormente (Kim et ai., Mol Biol Cell 2004;15:420-34}. Resumidamente, células tratadas com anticorpo foram, misturadas com reagente JC-1 (Molecular Probes) a 5 mg/ml e incubadas durante 30 min à TA. As células foram lavadas duas vezes em PBS gelado e ressuspendidas em 300 μΐ de PBS e analisadas num FACS Aria (BD Biosciences) . A fluorescência verde e vermelha foi recolhida através de filtros passa-banda de 494/518 nm (FL-1) e 595/615 nm (FL-2), respetivamente. ICAM-1 é uma glicoproteína da superfamília das imunoglobulinas (Marlin et ai. Cell 1987;51:813-9) capaz de induzir uma sinalização bidirecional (Rothlein et ai. J Immunol 1994;152:2488-95; Vyth-Dreese et ai. Blood 1995;85:2802-12). Não foi anteriormente demonstrado que a ICAM-1 esteja envolvida na morte programada de células de linfoma B.

Portanto, os inventores quiseram confirmar que a morte celular induzida por IgG Bll era um processo ativo, através de meios além da translocação de fosfatidil serina da membrana celular. A despolarização da membrana mítocondrial foi escolhida como uma validação da apoptose, uma vez que esta é uma caracterí stica. comum da apoptose dependente de caspase e independente de caspase qiae pode ser monitorizada pela coloração celular com iodeto de 5,5',6,6'-tetra-cloro-1,1' , 3,3' -tetraetilbenzimidazolil-carbocianina (reagente JC-1).

De acordo com o ensaio dos inventores de Anexina V/iodeto de propídio (Fig. 4A, painel superior), verificou-se que IgG Bll induz a despolarização da membrana mítocondrial em células CL-01 de linfoma B, conforme determinado por análise de citometria de fluxo após coloração com reagente JC-1 (Fig. 4A, painel inferior).

De modo a excluir a possibilidade da expressão de ICAM-1 ser um artefacto in vitro, resultante de uma regulação positiva geral durante a cultura celular, examinamos a ligação de IgG BI 1 ao tecido obtido a partir de cinco pacientes diferentes com diferentes tumores de linfoma B.

Por imunohistoquímica, IgG Bll mostrou uma forte ligação aos cinco tecidos de linfoma (Fig. 4B) , a intensidades comparáveis a, ou ligeiramente inferiores que, o anticorpo IgG Bi anti-HLA-DR/DP (Quadro 2).

Examinamos em seguida a ligação de IgG Bll a linfoma B frente aos restantes leucócitos do sangue periférico. Ramos foi escolhida como uma linha celular de linfoma B representativa, com base na sua expressão de epitopos no limite inferior mas sensibilidade significativa para a apoptose induzida por Bll. A análise de citometria de fluxo, após incubação mista de células Ramos pré-marcadas com leucócitos do sangue periférico de sangue total e anticorpos IgG Bl, Bll ou Cll, revelou que IgG Bll mostrou uma forte ligação a células Ramos.

Ainda de forma mais importante, Bll demonstrou a maior ligação diferencial (regulação positiva de antigénio mais forte) dos três anticorpos para células de linfoma B Ramos frente a leucócitos do sangue periférico (Fig. 4C e dados não mostrados) . A ligação de IgG Bll atingiu o pico a 0,1 rng/ml e foi regulada positivamente 3,7 vezes em células Ramos frente a monócitos (MFI 654 frente a 176), regulada positivamente 8,3 vezes em células Ramos frente a linfócitos B do sangue periférico (MFI 654 frente a 78) e regulada positivamente 23 vezes em comparação com células NK. A ligação a outros subconjuntos de leucócitos cio sangue periférico monitorizados foi negativa.

Quadro 2 I CAM·· 1 é fortemente expressa em tecido de linfoma B de diferente origem

Exemplo 5 - Distribuição antigénica de IgGi Bl, Bll e Cll sobre linhas celulares tumorais de várias origens, como de terminado por citometria de fluxo.

Foi investigada a distribuição antigénica dos antigénios alvo dos anticorpos humanos, principalmente para Bll, em diferentes linhas celulares de carcinoma. As células (células MCF-7 e MD A MB 4 35S de carcinoma da mama, JAR e JEG-3 de coriocarcinoma, A549 de carcinoma pulmonar, TCC-SUP de carcinoma da bexiga, MDA MB 435 de melanoma, HPAC, PANC-1 e BxPC-3 de carcinoma pancreático, PC-3 e DU145 de carcinoma prostático, LS174 T, CaCo2 e Lovo de carcinoma colorretal, e THP-1 de leucemia monocítica), foram lavadas em PBS, e ressuspendidas a 4 x 10° células/ml em Meio Completo (200.000 células/50 ul de amostra) . IgGi Bl, IgGi Bll, IgGi Cll, IgGi FITC-8 de controlo negativo e mAb anti-CD20 Rituximab foram diluídos em série 3-10 vezes (10-0,1 pg/ml) em Meio Completo (50 ml/amostra) , As células foram incubadas com qualquer um dos anticorpos durante 1 hora em gelo, lavadas por ressuspensão em PBS/BSA 0,5 %, centrifugadas a 1200 rpm durante 5 min e foi realizada a aspiração completa dos sobrenadantes. As células foram incubadas com F(ab')2 de cabra anti-IgG humana conjugado com PE (Caltag Laboratories, N.° de Cat.: H10104), diluído a 1/50 em PBS/BSA 0,5 %, durante 30 min, em gelo. Após a ressuspensão de em 300 ml PBS/BSA 0,5 %, as células foram analisadas quanto à ligação de IgG utilizando um instrumento FACScan.

As células de carcinoma da próstata PC-3 mostraram uma forte expressão de ICAM-1 conforme demonstrado pela forte ligação de IgG Bll a estas células (Fig. 6) . Também se verificou que as células MCF-7 de carcinoma de mama, HPAC de carcinoma pancreático e LS174 T de carcinoma colorretal expressam ICAM-1 embora com uma menor intensidade em comparação com as células de cancro da próstata. Em contraste, as células THP-1 de leucemia monocítica não expressaram ICAM-1. Verificou-se que todas as linhas celulares de carcinoma testadas eram negativas para a expressão de CD20, HLA-DR/DP e IgM conforme demonstrado pela ausência de ligação de IgG Rituximab, IgG Bl e IgG Cll, respetivamente. Outros estudos em linhas celulares de carcinoma adicionais indicaram que todas as células de carcinoma examinadas eram positivas para a expressão de ICAM-1 (Quadro 3).

Quadro 3 I CAM·· 1 é fortemente expressa em linhas celulares de carcinoma de diferente origem

Exemplo 6 - Indução da apoptose por IgGx Bll em células de carcinoma

Foi mostrado no exemplo 5 que IgGi Bl se liga fortemente a células de carcinoma. 0 presente exemplo examinou as propriedades de indução da apoptose deste anticorpo sobre células de carcinoma.

As células foram semeadas em placas de 6 poços com Meio de Crescimento Completo, três dias antes do inicio da experiência. As células encontravam-se em 50-75 % de confluência no momento da experiência. As células foram lavadas com PBS gelado e incubadas com igGi Bl diluída em série (20-0,02 yg/ml como indicado nas figuras, em 1 ml de Meio de Crescimento Completo), IgGi Bl de controlo a 20 yg/ml, IgGi de controlo negativo a 10 ug/ml ou IgGi Trastuzumab a 10 yg/ml conforme indicado a 4 °C durante 1-2 noras. As células foram lavadas com PBS gelado e anticorpo secundário F(ab'2) de cabra anti-F (abf 2) humano (diluído em Meio de Crescimento Completo a 10 yg/ml) foi adicionado. As células foram incubadas a 37 °C, numa atmosfera humidificada de 5 % de CO2 durante 16-24 horas. Células totais foram recolhidas primeiramente isolando o sobrenadante, seguido por lavagem com PBS e tripsinização das restantes células aderentes. A reação enzimática foi terminada através de ressuspensão em PBS contendo soro bovino fetal inativado por calor a 10 %. As células foram lavadas em PBS gelado, submetidas a coloração com Anexina V/iodeto de propídio, e analisadas quanto à viabilidade/apoptose conforme descrito no exemplo 5 acima.

Verificou-se que IgGi Bll induz a apoptose nas linhas celulares de carcinoma de uma maneira especifica e titulável (Figura 7) . IgG Bl de controlo, que não se ligou às células PC-3 (veja-se o exemplo 5), também não induziu apoptose em células PC-3. IgGi cie controlo negativo ou IgGi Trastuzumab não foram capazes de induzir a apoptose em células DU145 ou MDA MB435. Exemplo 7 - Formulações farmacêuticas e administração

Um aspeto adicional da invenção proporciona uma formulação farmacêutica que compreende um composto de acordo com o primeiro aspeto da invenção em mistura com um adjuvante, diluente ou 'veiculo farmaceuticamente aceitável ou aceitável do ponto de vista veterinário.

Preferentemente, a formulação é uma unidade de dosagem contendo uma dose ou unidade diária, subdose diária ou uma fração apropriada das mesmas, do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção serão, normalmente, administrados oralmente ou através de qualquer via parentérica, sob a forma de uma formulação farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo, opcionalmente sob a forma de um sal de adição de ácido ou base, orgânico ou inorgânico, não tóxico, numa forma farmacêutica farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio e paciente a serem tratados, bem como da via de administração, as composições podem ser administradas em doses variáveis.

Na terapêutica cie seres humanos, os compostos da invenção podem ser administrados isoladamente mas serão, geralmente, administrados em mistura com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis selecionados relativamente à via de administração e prática farmacêutica padrão.

Por exemplo, os compostos da invenção podem ser administrados por via oral, bucal ou sublingual sob a forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizant.es ou corantes, para aplicações de libertação imediata, retardada ou controlada. Os compostos da invenção também podem ser administrados através de injeção intracavernosa.

Tais comprimidos podem conter excipientes tais como celulose macrocristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes como amido (preferentemente de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e determinados silicatoscomplexos, e aglutinantes de granulação t. a i s c o m o p o 1 i v i n i 1 p i rro 1 i d o n a, h i d r o x i p r o p i 1 m e t i 1 celulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, podem estar incluídos agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerilo e talco.

Composições sólidas de um tipo semelhante também podem se empregues como cargas em cápsulas de gelatina. Excipientes preferidos a este respeito incluem lactose, amido, celulose, açúcar de leite ou polietilenoglicóis de elevada massa molecular. Para as suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados com vários agentes edulcorantes ou aromatizantes, matéria de coloração ou corantes, com agentes emulsionant.es e/ou de suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propilenoglicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

Os compostos da invenção podem também ser administrados por via parentérica, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraniana, intramuscular ou subcutânea, ou podem ser administrados através de técnicas de infusão. Eles são utilizados de melhor modo sob a forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, suficientes sais ou glicose para tornar a solução isotónica com o sangue. As soluções aquosas deveriam ser adequadamente tamponadas (preferentemente até um pH de desde 3 a 9} , se necessário. A preparação de formulações parentéricas adequadas sob condições estéreis é prontamente conseguida através de técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas para os peritos na e specia1i dade.

Formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção aquosas e não aquosas estéreis que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recetor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas numa condição seca por congelamento (liofilizado) que requer somente a adição do portador liquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamente antes da utilização. Podem ser preparadas soluções e suspensões de injeção extemporâneas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.

Para a administração oral e parentérica a pacientes humanos, o nível de dosagem diário dos compostos da invenção será normalmente desde 1 mg/kg a 30 mg/kg. Assim, por exemplo, os comprimidos ou cápsulas do composto da invenção podem conter uma dose de um composto ativo para administração isoladamente ou dois ou mais ao mesmo tempo, conforme apropriado. Em qualquer caso, o médico determinará a dosagem atual, que será a mais adequada para qualquer paciente individual, e variará com a idade, peso e resposta do paciente particular. As dosagens anteriores são exemplificativas do caso médio. Podem, naturalmente, existir casos individuais onde se justificam intervalos de dosagem mais elevados ou mais baixos e tais encontram-se dentro do âmbito desta invenção.

Os compostos da invenção também podem ser administrados por via intranasal ou através de inalação e são convenientemente administrados sob a forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização em aerossol a partir de um recipiente, bomba, pulverizador ou nebulizador pressurizado com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, d ic1o r odi f1uo romet aηo, t r i c1o rof1uorometano, diclorotetrafiuoroetano, um hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 ou 1, 1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono e/ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma quantidade calibrada. 0 recipiente, bomba, pulverizador ou nebulizador pressurizado pode conter uma solução ou suspensão do composto ativo, por exemplo, utilizando uma mistura de etanol e o propulsor como o solvente, que pode conter adicionalmente um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas ou cartuchos (feitos, por exemplo, a partir de gelatina} para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura de pó de um composto da invenção e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

As formulações de aerossol ou pó seco são preferentemente dispostas de modo a que cada dose ou "sopro" calibrado distribui uma dose apropriada de um composto da invenção para administração ao paciente. Será apreciado que a dose diária global com um aerossol variará de paciente para paciente, e pode ser administrada numa dose única ou, mais comumente, em doses divididas ao longo do dia.

Alternativamente, os compostos da invenção podem ser administrados sob a forma de um supositório ou pessário, ou podem ser aplicados topicamente sob a forma de uma loção, solução, creme, pomada ou pó para polvilhar. Os compostos da invenção podem também ser administrados por via transdérmica, por exemplo, através da utilização de um penso transdérmico. Eles podem também ser administrados pela via ocular, particularmente para o tratamento de doenças dos olhos.

Para utilização oftálmica, os compostos da invenção podem ser formulados como suspensões micronizadas em solução salina isotónica, com pH ajustado, ou, preferentemente, como soluções em solução salina isotónica, com pH ajustado opcionalmente em combinação com. um conservante tal como um cloreto de benzilalcónio. Alternativamente, podem ser formulados rruma pomada tal como petrolato.

Para aplicação por via tópica na pele, os compostos da invenção podem ser formulados como uma pomada adequada contendo o composto ativo suspenso ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um ou mais dos seguintes: óleo mineral, petrolato liquido, petrolato branco, propilenoglicol, composto de polioxietileno-polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, eles podem ser formulados como uma loção ou creme adequado, suspensos ou dissolvidos em., por exemplo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietilenoglicol, parafina liquida, polissorbato 60, cera de ésteres de cetilo, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas que compreendem o ingrediente ativo numa base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas que compreendem o ingrediente ativo numa base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e colutórios que compreendem o ingrediente ativo rrum veiculo liquido adequado.

Geralmente, nos seres humanos, a administração oral ou tópica dos compostos da invenção é a via preferida, sendo a mais conveniente. Em circunstâncias onde o recetor sofre de um distúrbio da deglutição ou de uma deficiência da absorção de fármacos depois da administração orai, o fármaco pode ser administrado por via parentérica, por exemplo, por via sublingual ou bucal.

Para utilização 'veterinária, um composto da invenção é administrado como uma formulação aceitável adequada de acordo com a prática veterinária normal e o médico veterinário irá determinar o regime de dosagem e 'via de administração, que serão os miais apropriados para um animal particular.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2004023140 A [0006]

Documentos de não patente citados na descrição • BREKKE et al. Nat Rev Drug Discov, 2003, vol. 2, 52-62 [0002] • WEINER et al. Na t Biotechnol, 2005, vol. 23, 55 6-7 [0002] • GRIFFITHS et al. Embo J, 1993, vol. 12, 725-34 [0002] • MILLER et al. N Engl J Med, 1982, vol. 306, 517-22 [0005] • RIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-7 [0005] • KWAK et al. N Engl J Med, 19 92, vol. 327, 1209-15 [0005] • SUAREZ et al. Mol Immunol, 2004, vol. 41, 519-2 6 [0005] • SODERLIND et al. Nat Biotechnol, 2000, vol. 18, 852-6 [0006] [0078] [0081] • CLACKSON T et al. Nature, 15 August 1991, vol. 352 ( 6336) , 624-8 [0013] ® MARKS JD et al. J Mol Biol., 05 December 1991, vol. 222 (3), 581-97 [0013] • WENG S et al. Proteomics, January 2 0 02, vol. 2 (1), 48-57 [0013] • NORD K et al. Nat Biotechnol, August 1997, vol. 15 (8), 772-7 [0013] ® HOGBOM M et al. Proc Natal Acad Sei USA, 18 March 2003, vol. 100 (6), 3191-6 [0013] • BORREBAECK CA ; CARLSSON R. Curr Opin Pharmacol., August 2001, vol. 1 (4), 404-8 [0014] • NAGY et al. J Mol Med, 2003, vol. 81, 757-65 [0018] • SMITH et al. J Clin Pathol, 1990, vol. 43, 893-900 [0020] • COSIMI et al. J Immunol, 1990, vol. 144, 4604-12 [0020] • KAVANAUGH et al. Arthritis Rheum, 1994, vol. 37, 992-9 [0020] • HAUG et al. Transplantation, 1993, vol. 55, 766-72 [0020] • HUANG et al. Hybridoma, 1993, vol. 12, 661-75 [0022] • HUANG et al. Cancer Res, 19 95, vol. 55, 610-6 [0022] ® SMALLSHAW et al. J Immunother, 2004, vol. 27, 419-24 [0022] • MARUO et al. Int J Cancer, 2002, vol. 100, 486-90 [0022] ® ROSETTE et al. Carcinogenesis, 2005, vol. 26, 943-50 [0022] • SUN et al. J Cancer Res Clin Oncol, 19 9 9, vol. 125, 28-34 [0022] • GROTHEY et al. Br J Cancer, 1998, vol. 77, 801-7 [0022] • WANG et al. Int J Cancer, 2005, vol. 27, 419-24 [0022] • ROCHE et al. Thromb Haemost, 2003, vol. 8 9, 10 8 9-97 [0022] • AALINKEEL et al. Cancer Res, 2004, vol. 64, 5311-21 [0022] • NAGY et al. Nat Med, 2002, vol. 8, 801-7 [0025] • UYTTENHOVE et al. J. Exp. Med., 1983, vol. 157, 1040-52 [0034] • KENNEDY et al. Br J Haematol, 2002, vol. 119, 412-6 [0034] • WEINER et al. J Immunol, 1989, vol. 142, 34 3-51 [0034] • BAI et al. J. Clin. Invest., 2003, vol. 111, 1487-96 [0034] • ROBERT et al. Lancet Oncol, 2 0 0 5, vol. 6, 491-500 [0034] • DAIBATA et al. Cancer, 1989, vol. 64, 1248-53 [0065] • SALTMAN. Blood, 1988, vol. 72, 2026-30 [0065] • MENEZES et al. Biomedicine, 1975, vol. 22, 27 6-84 [0065] • CERUTTI et al. J Immunol, 1998, vol. 160, 2145-57 [0065] ® NORDERHAUG et al. J Immunol Methods, 1997, vol. 204, 77-87 [0097] • EDVARDSSON et al. Electrophoresis, 19 9 9, vol. 2 0, 935-42 [0101] ® ROSENTHAL et al. Anal Biochem, 1967, vol. 20, 525-32 [0112] • BYLUND; YAMAMURA. Methods in Neurotransmitter Analysed. New York. Raven Press Ltd, 1990 [0112] • MARQUARDT. J. Soc. Indust. Appl. Math, 1963, vol. 11, 431-41 [0112] ® BRIX et al. J. Clin. Invest., 1998, vol. 102, 283-93 [0112] • KIM et al. Mol Biol Cell, 2004, vol. 15, 420-34 [0124] • MARLIN et al. Cell, 19 8 7, vol. 51, 813-9 [0125] • ROTHLEIN et al. J Immunol, 19 94, vol. 152, 2488-95 [0125] • VYTH-DREESE et al. Blood, 1995, vol. 85, 2802-12 [0125]

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método in vitro para indução da apoptose numa célula alvo que compreende as etapas: a. proporcionar uma ou mais células alvo que exibem o antigénio de superfície celular, ICAM-I; b. proporcionar uma ou mais moléculas de ligação que se ligam seletivamente a ICAM-I da superfície celular e, aquando da ligação a ICAM- I, induzem a apoptose da célula alvo; c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação de (b) para induzir a apoptose nas células alvo, em que as moléculas de ligação são moléculas de anticorpo humanos, as ditas moléculas de anticorpo tendo regiões variáveis tendo as sequências da figura 10.
2. 2. Uma molécula de ligação que se liga seletivamente a ICAM-I da superfície celular e, aquando da ligação a ICAM-I, induz a apoptose de uma célula alvo, em que a molécula de ligação é urna molécula de anticorpo humano, a dita molécula cie anticorpo tendo regiões variáveis tendo as sequências da figura 10.
3. 3. Uma molécula de ligação conforme reivindicada na reivindicação 2 para utilização no método da reivindicação 1.
4. 4. Uma molécula de ligação conforme reivindicada em qualquer das reivindicações 2 ou 3 em que a célula alvo é uma célula imunitária ou uma célula epitelial.
5. 5. Uma molécula de ligação conforme reivindicada na reivindicação 4 em que a célula imunitária é um linfócito B.
6. 6. Uma molécula cie ligação conforme reivindicada em qualquer uma das reivindicações 2 a 5 em que a célula alvo está associada com urna doença.
7. 7. Uma molécula de ligação conforme reivindicada na reivindicação 6 em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: cancro, doenças autoimunes incluindo, mas não restritas a, artrite reumatoide e LES, distúrbios inflamatórios agudos e crónicos, sépsis e doenças infeciosas incluindo mas não restringidas a VIH.
8. 8. Uma molécula de ligação conforme reivindicada na reivindicação 7 em que a doença é um cancro selecionado a partir de linfoma (leucemia, mieloma), cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro da bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.
9. 9. A molécula de ligação conforme reivindicada em qualquer uma das reivindicações 2 a 8 em que a molécula de anticorpo é uma IgG.
10. 10. A molécula de ligação conforme reivindicada na Reivindicação 9 em que a IgG é selecionada a partir do grupo de uma IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4.
11. 11. Um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma molécula de anticorpo conforme reivindicada em qualquer uma das reivindicações 2 a 10.
12. 12. Um ácido nucleico conforme reivindicado na reivindicação 11 tendo as sequências de nucleótidos da figura 10.
13. 13. Uma molécula de ligação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 10 para utilização no diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção de uma doença, o diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção exigindo a destruição de uma célula alvo.
14. 14. Utilização da molécula de ligação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 10 no fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, o diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção exigindo a destruição de uma célula alvo.
15. 15. Ά molécula de ligação para utilização de acordo com a reivindicação 13 ou utilização de acordo com a reivindicação 14 em que a doença a ser tratada é selecionada a partir do grupo que consiste em: cancro, doenças autoimunes incluindo, mas não restringidas a, artrite reumatoide e LES, distúrbios inflamatórios agudos e crónicos, sépsis e doenças infeciosas incluindo mas não restringidas a VIH,
16. 16. A molécula de ligação para utilização ou utilização de acordo com a reivindicação 15 em que a doença a ser tratada é cancro selecionado a partir de linfoma (leucemia, mieloma), cancro gástrico, cancro da mama, cancro do fígado, cancro pulmonar, melanoma, cancro da bexiga, cancro de corioide, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro da próstata.
17. 17. A molécula de ligação para utilização ou utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16 em que a molécula de ligação ou molécula de anticorpo é conforme definida em qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3 e a doença a ser tratada é um linfoma conforme definido na reivindicação 16.
18. 18. Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 10 e um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
19. 19. Uma molécula de ligação, molécula de ligação para utilização, ácido nucleico, utilização ou composição farmacêutica conforme definida em qualquer das reivindicações 2 a 18 em que a molécula de ligação se liga seletivamente a ICAM-1 da superfície celular e, aquando da ligação a ICAM-1, induz a apoptose de uma célula alvo in vitro.