KR101407566B1

KR101407566B1 - 핵산의 증폭 검출 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101407566B1
Application number: KR1020120075491A
Authority: KR
Inventors: 도시야 호소미; 미츠하루 히라이
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-06-13
Also published as: JP2013017426A; JP5830286B2; CN102876661A; EP2546362A1; CN102876661B; US20130017543A1; EP2546362B1; US9045797B2; KR20130008475A

Abstract

시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동(相同)한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.

Description

핵산의 증폭 검출 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR AMPLIFYING AND DETECTING POLYNUCLEOTIDE}

본 발명은 핵산을 증폭하고, 증폭한 핵산을 검출하기 위한 방법, 및 키트에 관한 것이다.

PCR을 사용하여 DNA를 증폭하기 위해서는, 표적이 되는 핵산을 그 한 쌍 사이의 영역으로 하는 프라이머 핵산, 폴리머라제, 그 폴리머라제의 기질이 되어 증폭 후의 핵산을 형성하는 뉴클레오티드3인산이 필요로 된다. 증폭 후는, 임의의 방법, 예를 들면 표적 서열과 상보적인 서열을 갖는 특이적인 프로브 핵산을 사용하여, 표적이 되는 핵산을 검출할 수 있다.

또한, 역전사(RT) PCR을 사용하여 cDNA를 증폭하는 방법도 있지만, 그러한 경우에는, 역전사 활성을 갖는 폴리머라제를 이용할 수 있다.

또한, 증폭 산물의 컨태미네이션 방지를 위해, 비(非)천연형 뉴클레오티드3인산인 디옥시우리딘3인산을 사용하는, 우라실DNA글리코실라제(UNG)법도 알려져 있다(일본국 특허 제3392863호).

그러나, 이와 같은 선행 기술에는, 일반적으로, (1) 역전사 활성을 갖는 폴리머라제는 종류가 한정되어 있고, (2) 일반적인 폴리머라제는, 증폭시의 기질이 되는 디옥시우리딘3인산을 취입(取入)하지 않는 경우가 많아, UNG법에서의 우라실N글리코실라제로는 분해할 수 없어, 컨태미네이션을 방지할 수 없는 경우가 있고, (3) 증폭의 속도는 빠른 편이 바람직하다,는 과제가 존재하고 있었다.

이와 같이, 역전사가 가능하며, 디옥시우리딘3인산을 사용할 수 있는, 장쇄(長鎖)의 표적 핵산을 신속히 증폭 및 검출하는 방법이 요구되고 있었다.

본 발명은 역전사가 가능하며, 디옥시우리딘3인산을 사용할 수 있고, 합성한 핵산쇄의 분해를 방지할 수 있는, 장쇄의 표적 핵산을 신속히 증폭 및 검출하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, 서열 번호 1에 있어서의 제651 위치의 아르기닌을 글루타민산으로 치환한 Taq 폴리머라제가 역전사 활성을 갖고, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있는 것, 그리고, 또한, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산을 결실시킴으로써, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 저하할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,

(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고

(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,

당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동(相同)한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.

(2) 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,

(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정,

(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고,

(c) 당해 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고,

당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.

(3) 상기 (c)를 검출하는 공정이, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 (2)에 기재된 방법.

(4) 상기 증폭하는 핵산이 DNA 혹은 RNA인 (1)∼(3) 중 어느 1항에 기재된 방법.

(5) 상기 (b)의 증폭하는 공정이 PCR 혹은 RT-PCR인 (4)에 기재된 방법.

(6) 상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 (1)∼(5) 중 어느 1항에 기재된 방법.

(7) 상기 폴리머라제가, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시키기 위해서, N 말단측의 아미노산을 결실시킨 개변 Taq 폴리머라제인 (1)∼(6) 중 어느 1항에 기재된 방법.

(8) 상기 폴리머라제가, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산이 결실된 개변 Taq 폴리머라제인 (7)에 기재된 방법.

(9) 상기 (b)의 공정이 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭하는 공정인 (1)∼(8) 중 어느 1항에 기재된 방법.

(10) 상기 (b)의 공정이 600염기 이상의 염기 길이를 증폭하는 공정인 (9)에 기재된 방법.

(11) 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,

당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.

(12) 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,

(13) 상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 (11) 또는 (12)에 기재된 키트.

본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 역전사 활성을 갖기 때문에, DNA 혹은 RNA 중 어느 핵산도 증폭할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있으므로, UNG법을 바람직하게 실시하여, 증폭 산물의 컨태미네이션을 방지할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭할 수 있으며, 증폭 스피드를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 방법은, 특히, 600염기 이상의 장쇄 염기 길이를 증폭할 때에 매우 유효하다.

본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 또한, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산을 결실시킴으로써, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 그에 따라, 반응액 중의 핵산 프로브를 분해하지 않게 되어, 증폭 중의 프로브 검출 행위나 증폭 후의 융해 곡선 분석이 가능해진다.

도 1은 실시예 1의, 기질 dNTPmix 및 Taq를 사용할 경우(도 1a), 기질 dNTPmix 및 개변 Taq를 사용할 경우(도 1b), 기질 dAUGCmix 및 Taq를 사용할 경우(도 1c), 기질 dAUGCmix 및 개변 Taq를 사용할 경우(도 1d)의 NAT2 유전자에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 2는 실시예 2의, 기질 dAUGCmix 및 Taq를 사용할 경우(도 2a), 기질 dAUGCmix 및 개변 Taq를 사용할 경우(도 2b)의 RNA(SWlnfH1 영역)에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 3은 실시예 3의, 기질 dAUGCmix 및 Taq(도 3a) 또는 개변 Taq(도 3b)를 사용하는 CYP2D6 유전자에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.

<1> 본 발명의 증폭 및 검출 방법

본 발명의 방법은, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,

당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은, 상기 공정 (a) 및 (b) 후에, (c) 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고 있어도 된다.

즉, 본 발명의 방법은, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,

(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고

상기 (c)를 검출하는 공정은, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은, 상기 공정 (a), 공정 (b), 필요에 따라 공정 (c)에 의해 행해지지만, 폴리머라제로서, 특정한 폴리머라제를 사용하는 것 이외는, 종래의 방법과 같이 하여, 공정 (a)∼(c)를 행할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 호열균(好熱菌) Thermus aquaticus가 생산하는 폴리머라제(EC.2.7.7.7)(즉, Taq 폴리머라제)인 서열 번호 1의 아미노산 서열의 제651 위치의 아르기닌이 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 사용되는 서열 번호 1의 제651 위치의 아르기닌(서열 번호 1의 제651 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부(下線部)가 651 위치의 아르기닌을 나타내고 있음)이 글루타민산(서열 번호 1의 제651 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 치환된 651 위치의 글루타민산을 나타내고 있음)으로 치환된 개변 Taq 폴리머라제는, 제651 위치의 아르기닌이 글루타민산으로 치환되어 있지 않은 야생 Taq 폴리머라제와 비교하여, 폴리머라제 활성이 증가하고 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 서열 번호 1의 제651 위치의 아르기닌이 글루타민산으로 치환되어 있는 것에 더하여, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산이 결실하고, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결실 혹은 저하해 있는 폴리머라제여도 된다.

본 발명에 있어서 사용되는 야생 폴리머라제를 코드하는 염기 서열로서는, 예를 들면 GenBank Acc. No. J04639로서 등록되어 있는 염기 서열을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 폴리머라제는, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 방법에 있어서는, 상기와 같은 Taq 폴리머라제가 사용되지만, 서열 번호 1의 제651 위치의 아르기닌이 글루타민산으로 치환되며, 또한, 폴리머라제 활성이 없어지지 않는 한, 예를 들면 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산이 결실한 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수, 2∼10개, 또는 2∼5개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 된다.

상기 아미노산 치환 변이의 위치는, 서열 번호 1의 Taq 폴리머라제의 아미노산 서열에 있어서의 위치이지만, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정한 변이 이외에, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 Taq 폴리머라제의 호몰로그(homologue) 또는 배리언트(variant)에 있어서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과의 얼라인먼트에 있어서, 상기 아미노산 치환의 위치에 상당하는 위치를 나타낸다. 예를 들면, 1∼650 위치의 영역에서 1개의 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Taq 폴리머라제의 보존적 배리언트에 있어서는, 651 위치란, 상기 배리언트의 650 위치를 나타낸다. 또한, 제1∼235번째의 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Taq 폴리머라제의 보존적 배리언트에 있어서는, 651 위치란, 상기 배리언트의 416 위치를 나타낸다.

마찬가지로, 본 발명의 Taq 폴리머라제는, 서열 번호 1의 제651 위치의 아르기닌(서열 번호 1의 제651 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 651 위치의 아르기닌을 나타내고 있음)이 글루타민산(서열 번호 1의 제651 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 치환된 651 위치를 나타내고 있음)으로 치환되며, 또한, 폴리머라제 활성이 소실되지 않는 한, 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산이 결실한 아미노산 서열에 대하여, 적어도 80％, 85％, 90％, 또는 95％의 아미노산 동일성을 갖는 단백질이어도 된다.

또한, 본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 역전사 활성을 갖고 있기 때문에, DNA 및 RNA 중 어느 것을 주형(鑄型)으로서도 증폭하는 것이 가능하며, RT-PCR도 가능하다. 역전사 효소와 DNA 폴리머라제를 혼합하여 사용할 경우에는, 효소 반응의 적절한 조정이 필요하게 될 경우가 있지만, 본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제이면 세밀한 조정을 하지 않고 사용하는 것이 가능하다. 또한, 역전사 반응과 PCR을 단일의 효소를 사용하여 실시할 수 있기 때문에, 역전사 반응과 PCR을 별개의 튜브 내에서 행하는 투 스텝(two step) 조작이 불필요해지며, 원 스텝(one step) 조작으로 RT-PCR을 실시하는 것이 가능해진다.

본 발명에 있어서 사용되는 프라이머는, 목적의 영역을 증폭하도록 설계되는 한, 특별히 제한되지 않고, 통상의 방법을 사용하여 설계하면 된다.

본 발명에 있어서 사용되는, 바람직한 디옥시리보뉴클레오티드의 조합은, 디옥시아데노신3인산(dATP), 디옥시구아노신3인산(dGTP), 디옥시시티딘3인산(dCTP), 및 티미딘3인산(dTTP)의 조합, 또는, 디옥시아데노신3인산(dATP), 디옥시구아노신3인산(dGTP), 디옥시시티딘3인산(dCTP), 및 디옥시우리딘3인산(dUTP)의 조합이지만, ddNTP나 수식 뉴클레오티드 등을 사용해도 된다.

본 발명의 폴리머라제는, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있으므로, 본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, UNG법을 실시하여, 증폭 산물의 컨태미네이션을 방지할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서 사용되는, 증폭된 핵산을 검출하기 위한 핵산 프로브는, 예를 들면 일본국 특개2001-286300호 공보 및 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재되는 바와 같은, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광 프로브를 사용할 수 있다. 핵산 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이제이션하지 않을 때와 비교하여, 표적 서열에 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 감소 또는 증가하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 핵산 프로브는, 바람직하게는, 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광 색소의 형광이 발광하고, 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 소광하는 소광 프로브이다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산을 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전(前)처리한 후에 사용할 수 있다.

또한, 일반적으로, 시료 중의 핵산은, DNA 또는 RNA이며, 단일쇄 또는 이중쇄 중 어느 것이어도 된다.

본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (a)는, 상기 폴리머라제, 프라이머, 및 기질 뉴클레오티드, 필요에 따라 핵산 프로브를, 핵산을 포함하는 시료와 함께, 반응액에 소정량 첨가하고, 혼합함으로써 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (b)는, 통상의 핵산 증폭 방법, 예를 들면 PCR, RT-PCR 등에 의해 행할 수 있다. 또한, ICAN법에 의해, DNA-RNA 키메라 프라이머, RNase H, 상기 폴리머라제를 사용하여 표적 유전자를 증폭할 수 있다. 또한, LAMP법에 의해, 인너 프라이머, 아우터 프라이머, 루프 프라이머, 상기 폴리머라제를 사용하여 표적 유전자를 증폭할 수도 있다.

증폭 핵산의 검출을 행할 경우에는, 핵산 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 공정 (c)를 행할 경우에는, 공정 (a)에서 프로브를 추가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (b)는, 본 발명의 폴리머라제를 사용함으로써, 바람직하게는, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (c)는, 바람직하게는, 상기 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하여, 증폭 영역을 검출하는 공정이다. 본 발명의 방법에 있어서는, 본 발명의 폴리머라제를 사용하는 것 외는, 통상의 핵산 증폭 및 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법에 따라서 행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 공정 (c)는, 증폭된 핵산에 대해서, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여, 형광 색소의 형광을 측정함으로써 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 증폭 영역을 검출하는 공정이다. 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 통상의 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법에 따라서 행할 수 있다.

혹은, 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출에 의해 행해져도 된다. 구체적으로는, 공정 (c)는, 증폭 산물의 양에 의존하여 형광이 변화하는 계(系)를 사용하여, 형광의 측정에 의해 PCR에 있어서의 증폭 산물의 정량을 리얼 타임으로 행하고, 그 결과에 의거하여 샘플 중의 DNA를 정량하는 정량적 PCR이어도 되고, 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다. 이와 같은 방법의 예로서는, 증폭 산물에 하이브리다이제이션하는, 형광 표지한 프로브를 사용하는 방법을 들 수 있고, 형광 표지한 프로브로서는, 상기 프로브를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 상기 프로브를 사용하는 것 외는, 형광 색소의 형광을 측정하는 것에 의한 리얼 타임 PCR법에 따라서 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 공정 (c)는, 상기 공정 (b)와 동시에 행해져도 된다.

본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm을 해석하거나 또는 PCR 산물의 양을 형광값으로서 검출하는 것뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 그러므로, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 동일한 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다.

<2> 본 발명 키트

본 발명 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다.

즉, 본 발명의 키트는, 임의인 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,

또한, 본 발명의 키트는, 핵산의 증폭만에 사용할 수도 있다.

즉, 본 발명의 키트는, 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,

프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 및 프로브에 대해서는, 본 발명 의 방법에 관한 것으로서, 상기에 설명한 대로이다. 본 발명의 키트에서는, 기질 뉴클레오티드는, 바람직하게는 디옥시우리딘3인산을 함유한다.

본 발명의 키트는, 프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 및 프로브 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하기 위해 필요해지는 시약류를 더 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 키트에 있어서, 프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 프로브 및 그 밖의 시약류는 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

이하에, 본 발명을 실시예에 보다 구체적으로 설명한다.

[실시예]

실시예 1(NAT2 유전자를 검출할 경우)

N-acetyltransferase 2(NAT2)의 NAT2*5의 유전자를 포함하는 부위(640bp)를 증폭할 수 있도록, 표 1에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는 WO2008／066161에 기재되어 있다.

[표 1]

인간 정제 게놈을 10³ 카피 함유하고, 이하의 표 2의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기의 표 3과 같다. Tm 해석은 Optics를 Ch1로 설정했다.

기질(※1)은 dNTPmix 또는 dAUGCmix였다. dAUGCmix는 dUTP만 최종 농도 600nM으로 했다. dNTPmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP이며, dAUGCmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dUTP였다.

효소(※2)는 Taq 혹은 개변 Taq이며, Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 야생형 Taq 폴리머라제를 나타내고, 개변 Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 R651E 변이 도입 Taq 폴리머라제를 나타낸다. Taq는 대장균에 의해 제작한 리컴비넌트 효소로서 생산했다. 개변 Taq는 부위 특이적 변이 도입에 의해 651 위치의 아르기닌을 글루타민산으로 치환했다.

[표 2]

[표 3]

PCR 및 Tm 해석 조건

95℃, 60sec

↓

(95℃,1sec, 65℃, 6sec 혹은 10sec)×50

↓

95℃, 10sec

↓

40℃, 60sec

↓

Tm(40℃→75℃, 1℃／sec)

dNTPmix를 기질로 사용하여 반응 시간을 6초로 했을 경우, Taq에서는 Tm 해석에 의한 검출이 불가능(도 1a)했지만, 개변 Taq에서는 Tm 해석의 검출이 가능(도 1b)했다. 640bp를 6초로 증폭할 수 있었으므로 106bp／초로 핵산의 증폭이 가능함을 알 수 있다.

dAUGCmix를 기질로 사용하여 반응 시간을 10초로 했을 경우, Taq에서는 Tm 해석에 의한 검출이 불가능(도 1c)했지만, 개변 Taq에서는 Tm 해석의 검출이 가능(도 1d)했다. 640bp를 10초로 증폭할 수 있었으므로 64bp／초로 핵산의 증폭이 가능함을 알 수 있다.

실시예 2(RNA(SWlnfH1 영역)를 검출할 경우)

SWlnfH1 영역을 증폭할 수 있도록, 표 4에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는, WHO가 발행하고 있는 인플루엔자 바이러스 증폭용 프로토콜(CDC realtimeRT-PCR protocol for influenza A (H1N1) 28 April 2009)에 기재된 서열을 참고로 제작했다.

[표 4]

RNA(SWlnfH1 영역)를 10⁴ 카피 포함하고, 이하의 표 5의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 RT-PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기와 같다. Tm 해석에는 Optics를 Ch1로 설정했다.

효소(※1)는 Taq 혹은 개변 Taq이며, Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 야생형 Taq 폴리머라제를 나타내고, 개변 Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 R651E 변이 도입 Taq 폴리머라제를 나타낸다.

기질(※2)은 dAUGCmix였다. dAUGCmix는, dUTP만 최종 농도 600nM으로 했다. dAUGCmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dUTP였다.

[표 5]

[표 6]

PCR 및 Tm 해석 조건

42℃, 30min

↓

95℃, 5min

↓

(95℃, 1sec, 60℃, 30sec)×50

↓

95℃, 10sec

↓

40℃, 60sec

↓

Tm(40℃→75℃, 1℃／sec)

Taq에서는 RT-PCR 증폭 후의 검출 피크를 확인할 수 없었지만(도 2a), 개변 Taq에서는 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 2b).

실시예 3(CYP2D6 유전자를 검출할 경우)

CYP2D6 유전자를 포함하는 부위(5.1kbp)를 증폭할 수 있도록, 표 7에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는 Clinical Chemistry 46, No.8, 2000 p.p.1072-1077이나 일본국 특허 제4437207호에 기재되어 있다.

[표 7]

인간 정제 게놈을 4.8×10³ 카피 함유하고, 이하의 표 8의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기의 표 9와 같다. Tm 해석은 Optics를 Ch1로 설정했다.

기질(※1)은 dAUGCmix였다. dAUGCmix는 dUTP만 최종 농도 600nM으로 했다. dAUGCmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dUTP였다.

효소(※2)는 Taq 혹은 개변 Taq이며, Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 야생형 Taq 폴리머라제를 나타내고, 개변 Taq는 아미노산 제1∼235 위치가 결실한 R651E 변이 도입 Taq 폴리머라제를 나타낸다.

[표 8]

[표 9]

PCR 및 Tm 해석 조건

95℃, 60sec

↓

(95℃, 5sec, 68℃, 420sec)×35

↓

68℃, 420sec

↓

95℃, 10sec

↓

40℃, 60sec

↓

Tm(40℃→85℃, 1℃／sec)

Taq에서는 5.1kbp의 장쇄 증폭 후의 검출 피크가 약했지만(도 3a), 개변 Taq에서는 강한 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 3b). 5.1kbp를 420초로 증폭할 수 있었으므로 약 12bp／초로 핵산의 증폭이 가능함을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> METHOD AND KIT FOR AMPLIFYING AND DETECTING POLYNUCLEOTIDE <130> OP-12030 <150> JP2011-153454 <151> 2011-07-12 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 832 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 1 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 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Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 gccgtcagtg gtcac 15 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccagttaac aaatacagca ctggcatgg 29 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgataattag tgagttgggt gatacataca caaggg 36 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 cagaatatac atccrgtcac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtgctataaa caccagccty cca 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgggatattc cttaatcctg trgc 24 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 cacgctaccc accaggcc 18 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 gttatcccag aaggctttgc aggcttca 28 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 gccgactgag ccctgggagg taggta 26

Claims

시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정,
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고
(c) 당해 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 (c)를 검출하는 공정이, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 증폭하는 핵산이 DNA 혹은 RNA인 방법.
제4항에 있어서,
상기 (b)의 증폭하는 공정이 PCR 혹은 RT-PCR인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 폴리머라제가, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시키기 위해서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 제1∼235번째의 아미노산이 결실된 개변 Taq 폴리머라제인 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 (b)의 공정이, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭하는 공정인 방법.
제9항에 있어서,
상기 (b)의 공정이, 600염기 이상의 염기 길이를 증폭하는 공정인 방법.
임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는, 키트.
임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 651 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 키트.