KR101407563B1 - 핵산의 증폭 검출 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동(相同)한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.

Description

핵산의 증폭 검출 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR AMPLIFYING AND DETECTING POLYNUCLEOTIDE}
본 발명은 핵산을 증폭하고, 증폭한 핵산을 검출하기 위한 방법, 및 키트에 관한 것이다.
PCR을 사용하여 DNA를 증폭하기 위해서는, 표적이 되는 핵산을 그 한 쌍간의 영역으로 하는 프라이머 핵산, 폴리머라제, 그 폴리머라제의 기질이 되어 증폭 후의 핵산을 형성하는 뉴클레오티드3인산이 필요해진다. 증폭 후는, 임의의 방법, 예를 들면 표적 서열과 상보적인 서열을 갖는 특이적인 프로브 핵산을 사용하여, 표적이 되는 핵산을 검출할 수 있다.
또한, 역전사(RT) PCR을 사용하여 cDNA를 증폭하는 방법도 있지만, 그러한 경우에는, 역전사 활성을 갖는 폴리머라제를 이용할 수 있다.
또한, 증폭 산물의 컨태미네이션 방지를 위해, 비(非)천연형 뉴클레오티드3인산인 디옥시우리딘3인산을 사용하는, 우라실 DNA 글리코실라제(UNG)법도 알려져 있다(일본국 특허 제3392863호).
그러나, 이와 같은 선행 기술에는, 일반적으로, (1) 역전사 활성을 갖는 폴리머라제는 종류가 한정되어 있다, (2) 일반적인 폴리머라제는, 증폭시의 기질이 되는 디옥시우리딘3인산을 취입(取入)하지 않는 경우가 많아, UNG법에서의 우라실N글리코실라제로는 분해할 수 없어, 컨태미네이션을 방지할 수 없는 경우가 있다, (3) 증폭의 속도는 빠른 편이 바람직하다,는 과제가 존재하고 있었다.
이와 같이, 역전사가 가능하며, 디옥시우리딘3인산을 사용할 수 있는, 장쇄(長鎖)의 표적 핵산을 신속히 증폭 및 검출하는 방법이 요구되고 있었다.
본 발명은 역전사가 가능하며, 디옥시우리딘3인산을 사용할 수 있고, 합성한 핵산쇄의 분해를 방지할 수 있는, 장쇄의 표적 핵산을 신속히 증폭 및 검출하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, 서열 번호 1에 있어서의 제653 위치의 프롤린을 글루타민산으로 치환한 Tth 폴리머라제가 역전사 활성을 갖고, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있는 것, 그리고, 또한, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼77번째 또는 제1∼291번째의 아미노산을 결실시킴으로써, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 저하할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동(相同)한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
(2) 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정,
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고
(c) 당해 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
(3) 상기 (c)를 검출하는 공정이, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 (2)에 기재된 방법.
(4) 상기 증폭하는 핵산이 DNA 혹은 RNA인 (1)∼(3) 중 어느 1항에 기재된 방법.
(5) 상기 (b)의 증폭하는 공정이 PCR 혹은 RT-PCR인 (4)에 기재된 방법.
(6) 상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 (1)∼(5) 중 어느 1항에 기재된 방법.
(7) 상기 폴리머라제가 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시키기 위해서, N 말단측의 아미노산을 결실시킨 개변 Tth 폴리머라제인 (1)∼(6) 중 어느 1항에 기재된 방법.
(8) 상기 폴리머라제가, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 제1∼77번째의 아미노산이 결실된 개변 Tth 폴리머라제인 (7)에 기재된 방법.
(9) 상기 폴리머라제가, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 제1∼291번째의 아미노산이 결실된 개변 Tth 폴리머라제인 (7)에 기재된 방법.
(10) 상기 (b)의 공정이, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭하는 공정인 (1)∼(9) 중 어느 1항에 기재된 방법.
(11) 상기 (b)의 공정이, 600염기 이상의 염기 길이를 증폭하는 공정인 (10)에 기재된 방법.
(12) 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.
(13) 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.
(14) 상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 (12) 또는 (13)에 기재된 키트.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 역전사 활성을 갖기 때문에, DNA 혹은 RNA 중 어느 핵산도 증폭할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있으므로, UNG법을 바람직하게 실시하여, 증폭 산물의 컨태미네이션을 방지할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭할 수 있으며, 증폭 스피드를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 방법은, 특히, 600염기 이상의 장쇄 염기 길이를 증폭할 때에 매우 유효하다.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 또한, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼77 위치 또는 제1∼291 위치의 아미노산을 결실시킴으로써, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 그에 따라, 반응액 중의 핵산 프로브를 분해하지 않게 되어, 증폭 중의 프로브 검출 행위나 증폭 후의 융해 곡선 분석이 가능해진다.
도 1은 실시예 1의, 기질 dNTPmix 및 Tth를 사용할 경우(도 1a), 기질 dNTPmix 및 개변 Tth를 사용할 경우(도 1b), 기질 dAUGCmix 및 Tth를 사용할 경우(도 1c), 기질 dAUGCmix 및 개변 Tth를 사용할 경우(도 1d)의 NAT2 유전자에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 2는 실시예 2의, 기질 dAUGCmix 및 Tth(도 2a) 또는 개변 Tth(도 2b)를 사용하는 RNA(SWlnfH1 영역)에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 3은 실시예 3의, 기질 dNTPmix 및 Tth(도 3a) 또는 개변 Tth(도 3b)를 사용하는 CYP2D6 유전자에 대한 Tm 해석에 있어서의 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(-d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
<1> 본 발명의 증폭 및 검출 방법
본 발명의 방법은, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법은, 상기 공정 (a) 및 (b) 후에, (c) 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고 있어도 된다.
즉, 본 발명의 방법은, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,
(a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정,
(b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고
(c) 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 (c)를 검출하는 공정은, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은, 상기 공정 (a), 공정 (b), 필요에 따라 공정 (c)에 의해 행해지지만, 폴리머라제로서, 특정한 폴리머라제를 사용하는 것 이외는, 종래의 방법과 같이 하여, 공정 (a)∼(c)를 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 호열성(好熱性) 진정 세균 Thermus thermophilus HB8로부터 단리(單離)된 폴리머라제(즉, Tth 폴리머라제)인 서열 번호 1의 아미노산 서열의 제653 위치의 프롤린이 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 사용되는 서열 번호 1의 제653 위치의 프롤린(서열 번호 1의 제653 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부(下線部)가 653 위치의 프롤린을 나타내고 있음)이 글루타민산(서열 번호 1의 제653 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 치환된 653 위치의 글루타민산을 나타내고 있음)으로 치환된 개변 Tth 폴리머라제는, 제653 위치의 프롤린이 글루타민산으로 치환되어 있지 않은 야생 Tth 폴리머라제와 비교하여, 폴리머라제 활성이 증가하고 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 서열 번호 1의 제653 위치의 프롤린이 글루타민산으로 치환되어 있는 것에 더하여, 서열 번호 1에 있어서의 제1∼77 위치 또는 제1∼291 위치의 아미노산이 결실하고, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결실 혹은 저하해 있는 폴리머라제여도 된다.
본 발명에 있어서 사용되는 야생 폴리머라제를 코드하는 염기 서열로서는, 예를 들면 GenBank Acc. No. D28878로서 등록되어 있는 염기 서열을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리머라제는, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 방법에 있어서는, 상기와 같은 Tth 폴리머라제가 사용되지만, 서열 번호 1의 제653 위치의 프롤린이 글루타민산으로 치환되며, 또한, 폴리머라제 활성이 없어지지 않는 한, 예를 들면 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에 있어서의 제1∼77 위치 또는 제1∼291 위치의 아미노산이 결실한 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수, 2∼10개, 또는 2∼5개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 된다.
상기 아미노산 치환 변이의 위치는, 서열 번호 1의 Tth 폴리머라제의 아미노산 서열에 있어서의 위치이지만, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 상기 특정한 변이 이외에, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 Tth 폴리머라제의 호몰로그(homologue) 또는 배리언트(variant)에 있어서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과의 얼라인먼트에 있어서, 상기 아미노산 치환의 위치에 상당하는 위치를 나타낸다. 예를 들면 1∼652 위치의 영역에서 1개의 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Tth 폴리머라제의 보존적 배리언트에 있어서는, 653 위치란, 상기 배리언트의 652 위치를 나타낸다. 또한, 제1∼77번째의 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Tth 폴리머라제의 보존적 배리언트에 있어서는, 653 위치란, 상기 배리언트의 576 위치를 나타낸다. 또한, 제1∼291번째의 아미노산 잔기의 결실을 갖는 Tth 폴리머라제의 보존적 배리언트에 있어서는, 653 위치란, 상기 배리언트의 362 위치를 나타낸다.
마찬가지로, 본 발명의 Tth 폴리머라제는, 서열 번호 1의 제653 위치의 프롤린 (서열 번호 1의 제653 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 653 위치의 프롤린을 나타내고 있음)이 글루타민산(서열 번호 1의 제653 위치 주변의 아미노산 서열은, -Phe Gly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-로 나타나며, 하선부가 치환된 653 위치의 글루타민산을 나타내고 있음)으로 치환되며, 또한, 폴리머라제 활성이 없어지지 않는 한, 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1에 있어서의 제1∼77 위치 또는 제1∼291 위치의 아미노산이 결실한 아미노산 서열에 대하여, 적어도 80％, 85％, 90％, 또는 95％의 아미노산 동일성을 갖는 단백질이어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제는, 역전사 활성을 갖고 있기 때문에, DNA 및 RNA 중 어느 것을 주형(鑄型)으로서도 증폭하는 것이 가능하며, RT-PCR도 가능하다. 역전사 효소와 DNA 폴리머라제를 혼합하여 사용할 경우에는, 효소 반응의 적절한 조정이 필요해질 경우가 있지만, 본 발명에 있어서 사용되는 폴리머라제이면 세밀한 조정을 하지 않고 사용하는 것이 가능하다. 또한, 역전사 반응과 PCR을 단일의 효소를 사용하여 실시할 수 있기 때문에, 역전사 반응과 PCR을 별개의 튜브 내에서 행하는 투 스텝(two step) 조작이 불필요해지며, 원 스텝(one step) 조작으로 RT-PCR을 실시하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서 사용되는 프라이머는, 목적의 영역을 증폭하도록 설계되는 한, 특별히 제한되지 않고, 통상의 방법을 사용하여 설계하면 된다.
본 발명에 있어서 사용되는 바람직한 디옥시리보뉴클레오티드의 조합은, 디옥시아데노신3인산(dATP), 디옥시구아노신3인산(dGTP), 디옥시시티딘3인산(dCTP), 및 티미딘3인산(dTTP)의 조합, 또는, 디옥시아데노신3인산(dATP), 디옥시구아노신3인산(dGTP), 디옥시시티딘3인산(dCTP), 및 디옥시우리딘3인산(dUTP)의 조합이지만, ddNTP나 수식 뉴클레오티드 등을 사용해도 된다.
본 발명의 폴리머라제는, 디옥시우리딘3인산을 취입할 수 있으므로, 본 발명 의 방법에 있어서, 바람직하게는, UNG법을 실시하여, 증폭 산물의 컨태미네이션을 방지할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 증폭된 핵산을 검출하기 위한 핵산 프로브는, 예를 들면 일본국 특개2001-286300호 공보 및 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재되는 바와 같은, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광 프로브를 사용할 수 있다. 핵산 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이제이션하지 않을 때와 비교하여, 표적 서열에 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 감소 또는 증가하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 핵산 프로브는, 바람직하게는, 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광 색소의 형광이 발광하고, 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 소광하는 소광 프로브이다.
핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산을 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전(前)처리한 후에 사용할 수 있다.
또한, 일반적으로, 시료 중의 핵산은, DNA 또는 RNA이며, 1본쇄 또는 2본쇄 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (a)는, 상기 폴리머라제, 프라이머, 및 기질 뉴클레오티드, 필요에 따라 핵산 프로브를, 핵산을 포함하는 시료와 함께, 반응액에 소정량 첨가하고, 혼합함으로써 행할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (b)는, 통상의 핵산 증폭 방법, 예를 들면 PCR, RT-PCR 등에 의해 행할 수 있다. 또한, ICAN법에 의해, DNA-RNA 키메라 프라이머, RNase H, 상기 폴리머라제를 사용하여 표적 유전자를 증폭할 수 있다. 또한, LAMP법에 의해, 이너 프라이머, 아우터 프라이머, 루프 프라이머, 상기 폴리머라제를 사용하여 표적 유전자를 증폭할 수도 있다.
증폭 핵산의 검출을 행할 경우에는, 핵산 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 공정 (c)를 행할 경우에는, 공정 (a)에서 프로브를 추가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (b)는, 본 발명의 폴리머라제를 사용함으로써, 바람직하게는, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서의 상기 공정 (c)는, 바람직하게는, 상기 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하여, 증폭 영역을 검출하는 공정이다. 본 발명의 방법에 있어서는, 본 발명의 폴리머라제를 사용하는 것 외는, 통상의 핵산 증폭 및 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법에 따라서 행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 공정 (c)는, 증폭된 핵산에 대해서, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여, 형광 색소의 형광을 측정함으로써 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 증폭 영역을 검출하는 공정이다. 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 통상의 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법에 따라서 행할 수 있다.
혹은, 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출에 의해 행해져도 된다. 구체적으로는, 공정 (c)는, 증폭 산물의 양에 의존하여 형광이 변화하는 계(系)를 사용하여, 형광의 측정에 의해 PCR에 있어서의 증폭 산물의 정량을 리얼 타임으로 행하고, 그 결과에 의거하여 샘플 중의 DNA를 정량하는 정량적 PCR이어도 되고, 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다. 이와 같은 방법의 예로서는, 증폭 산물에 하이브리다이제이션하는 형광 표지한 프로브를 사용하는 방법을 들 수 있고, 형광 표지한 프로브로서는, 상기 프로브를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 상기 프로브를 사용하는 것 외는, 형광 색소의 형광을 측정하는 것에 의한 리얼 타임 PCR법에 따라서 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 공정 (c)는, 상기 공정 (b)와 동시에 행해져도 된다.
본 발명의 방법에 있어서의 공정 (c)는, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm을 해석하거나 또는 PCR 산물의 양을 형광값으로서 검출하는 것뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 그러므로, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 동일한 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다.
<2> 본 발명 키트
본 발명 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다.
즉, 본 발명의 키트는, 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 키트는, 핵산의 증폭만에 사용할 수도 있다.
즉, 본 발명의 키트는, 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,
당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열 또는 서열 번호 1과 상동한 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 및 프로브에 대해서는, 본 발명 의 방법에 관한 것으로서, 상기에 설명한 대로이다. 본 발명의 키트에서는, 기질 뉴클레오티드는, 바람직하게는 디옥시우리딘3인산을 함유한다.
본 발명의 키트는, 프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 및 프로브 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하기 위해 필요해지는 시약류를 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 키트에 있어서, 프라이머, 폴리머라제, 기질 뉴클레오티드, 프로브 및 그 밖의 시약류는 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.
[실시예]
실시예 1(NAT2 유전자를 검출할 경우)
N-acetyltransferase 2(NAT2)의 NAT2*5의 유전자를 포함하는 부위(640bp)를 증폭할 수 있도록, 표 1에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는 WO2008／066161에 기재되어 있다.
[표 1]
Figure 112012055399479-pat00001
인간 정제 게놈을 103 카피 함유하고, 이하의 표 2의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기의 표 3과 같다. Tm 해석은 Optics를 Ch1로 설정했다.
기질(※1)은 dNTPmix 또는 dAUGCmix였다. dAUGCmix는 dUTP만 최종 농도 600nM으로 했다. dNTPmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP이며, dAUGCmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dUTP였다.
효소(※2)는 Tth 혹은 개변 Tth이며, Tth는 아미노산 제1∼77 위치가 결실한 야생형 Tth 폴리머라제를 나타내고, 개변 Tth는 아미노산 제1∼77 위치가 결실한 P653E 변이 도입 Tth 폴리머라제를 나타낸다. Tth는 대장균에 의해 제작한 리컴비넌트 효소로서 생산했다. 개변 Tth는 부위 특이적 변이 도입에 의해 653 위치의 프롤린을 글루타민산으로 치환했다.
[표 2]
Figure 112012055399479-pat00002
[표 3]
PCR 및 Tm 해석 조건
95℃, 60sec
↓
(95℃, 1sec, 65℃, 30sec)×50
↓
95℃, 10sec
↓
40℃, 60sec
↓
Tm(40℃→75℃, 1℃／sec)
dNTPmix를 사용했을 경우에 Tth에서는 Tm 해석에 의한 검출은 확인할 수 없었지만(도 1a), 개변 Tth에서는 검출이 가능했다(도 1b). 640bp를 30초로 증폭할 수 있었으므로 21bp／초로 핵산의 증폭이 가능했다.
dAUGCmix를 사용했을 경우에 Tth에서는 Tm 해석에 의한 검출은 확인할 수 없었지만(도 1c), 개변 Tth에서는 검출이 약하나마 가능했다(도 1d).
실시예 2(RNA(SWlnfH1 영역)를 검출할 경우)
SWlnfH1 영역을 증폭할 수 있도록, 표 4에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는, WHO가 발행하고 있는 인플루엔자 바이러스 증폭용 프로토콜(CDC realtimeRT-PCR protocol for influenza A (H1N1) 28 April 2009))에 기재된 서열을 참고로 제작했다.
[표 4]
Figure 112012055399479-pat00003
RNA(SWlnfH1 영역)를 104 카피 포함하고, 이하의 표 5의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 RT-PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기와 같다. Tm 해석은 Optics를 Ch1로 설정했다.
효소(※1)는 Tth 혹은 개변 Tth이며, Tth는 아미노산 제1∼291 위치가 결실한 야생형 Tth 폴리머라제를 나타내고, 개변 Tth는 아미노산 제1∼291 위치가 결실한 P653E 변이 도입 Tth 폴리머라제를 나타낸다.
기질(※2)은 dAUGCmix였다. dAUGCmix는 dUTP만 최종 농도 600nM으로 했다. dAUGCmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dUTP였다.
[표 5]
Figure 112012055399479-pat00004
[표 6]
RT - PCR 및 Tm 해석 조건
42℃, 30min
↓
95℃, 5min
↓
(95℃, 1sec, 60℃, 30sec)×50
↓
95℃, 10sec
↓
40℃, 60sec
↓
Tm(40℃→75℃, 1℃／sec)
Tth에서는 RT-PCR 증폭 후의 검출 피크를 확인할 수 없었지만(도 2a), 개변 Tth에서는 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 2b).
실시예 3(CYP2D6 유전자를 검출할 경우)
CYP2D6 유전자를 포함하는 부위(5.1kbp)를 증폭할 수 있도록, 표 7에 나타내는 프라이머 및 프로브를 사용했다. 이와 같은 프라이머 및 프로브는 Clinical Chemistry 46, No.8, 2000 p.p.1072-1077이나 일본국 특허 제4437207호에 기재되어 있다.
[표 7]
Figure 112012055399479-pat00005
인간 정제 게놈을 4.8×103 카피 함유하고, 이하의 표 8의 농도가 되도록 각 성분을 혼합한 25μl를, Smart Cycler(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은 하기의 표 9와 같다. Tm 해석은 Optics를 Ch1로 설정했다.
기질(※1)은 dNTPmix였다. dNTPmix의 조성은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP였다.
효소(※2)는 Tth 혹은 개변 Tth이며, Tth는 아미노산 제1∼291 위치가 결실한 야생형 Tth 폴리머라제를 나타내고, 개변 Tth는 아미노산 제1∼291 위치가 결실한 P653E 변이 도입 Tth 폴리머라제를 나타낸다.
[표 8]
Figure 112012055399479-pat00006
[표 9]
PCR 및 Tm 해석 조건
95℃, 60sec
↓
(95℃, 5sec, 68℃, 420sec)×35
↓
68℃, 420sec
↓
95℃, 10sec
↓
40℃, 60sec
↓
Tm(40℃→85℃, 1℃／sec)
Tth에서는 5.1kbp의 장쇄 증폭 후의 검출 피크를 확인할 수 없었지만(도 3a), 개변 Tth에서는 검출 피크를 확인할 수 있었다(도 3b). 5.1kbp를 420초로 증폭할 수 있었으므로 약 12bp／초로 핵산의 증폭이 가능함을 알 수 있다.
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160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg 405 410 415 Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 ccgtcaatgg tcac 14 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccagttaac aaatacagca ctggcatgg 29 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgataattag tgagttgggt gatacataca caaggg 36 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 cagaatatac atccrgtcac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtgctataaa caccagccty cca 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgggatattc cttaatcctg trgc 24 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 ggctgcacgc tactcac 17 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttatcccag aaggctttgc aggcttca 28 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gccgactgag ccctgggagg taggta 26

Claims (14)

  1. 시료에 포함되는 핵산을 증폭하는 방법으로서,
    (a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정, 그리고
    (b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정을 포함하고,
    당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
  2. 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하는 방법으로서,
    (a) 당해 핵산의 임의의 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브와, 당해 핵산을 포함하는 시료를 혼합하는 공정,
    (b) 당해 영역을 폴리머라제 반응에 의해 증폭하는 공정, 그리고
    (c) 당해 프로브를 사용하여 당해 영역을 검출하는 공정을 포함하고,
    당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (c)를 검출하는 공정이, 증폭 반응 중에 축적되는 PCR 산물의 검출 또는 융해 곡선 분석에 의해 행해지는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 증폭하는 핵산이 DNA 혹은 RNA인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (b)의 증폭하는 공정이 PCR 혹은 RT-PCR인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머라제가, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결실 혹은 저하시키기 위해서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 제1∼77번째 또는 제1∼291번째의 아미노산이 결실된 개변 Tth 폴리머라제인 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (b)의 공정이, 20염기 이상／초의 조건으로 핵산을 증폭하는 공정인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (b)의 공정이, 600염기 이상의 염기 길이를 증폭하는 공정인 방법.
  12. 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 및 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,
    당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.
  13. 임의의 핵산 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 폴리머라제, 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드, 및 증폭된 핵산을 검출하기 위한 프로브를 포함하는, 시료에 포함되는 핵산을 증폭하여 검출하기 위한 키트로서,
    당해 폴리머라제가, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 당해 아미노산 서열의 653 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환되어 있는 키트.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 기질인 뉴클레오티드가, 디옥시우리딘3인산을 함유하는 키트.
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