KR101352931B1 - 수용해도 및 수분산성이 향상된 α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어／페노티아진 복합체, 및 이의 제조방법 - Google Patents

수용해도 및 수분산성이 향상된 α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어／페노티아진 복합체, 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용해도 및 수분산성이 향상된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs), 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 광민감제 또는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는, 단일 분자에서 광열학 및 광역학의 이중적 양상 발휘하므로 다기능 분자 시스템 개발에 매우 유리하며, 우수한 광치료 효과를 가지므로, 암의 광치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 그 자체가 형광을 나타낼 수 있어 이미징 시스템의 도입을 용이하게 함으로써 하나의 물질로 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있다.

Description

수용해도 및 수분산성이 향상된 α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어／페노티아진 복합체, 및 이의 제조방법{α-Form of zinc-phthalocyanine nanowire with improved water solubility and water dispersity, and α-form of zinc-phthalocyanine nanowire／phenothiazine complex, and method for preparing the same}
본 발명은 수용해도 및 수분산성이 향상된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs), α-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 광민감제 또는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
광역학적 요법(photodynamic therapy, PDT)은 임상적 암 치료법으로서 광범위하게 사용되기 때문에, 악성 종양의 치료를 위한 보다 진보된 방법이다. 이러한 광역학적 요법은 광민감제의 광활성으로 인하여 생성되는 세포 독성의 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)을 사용하여 종양 부위(neoplastic lesion)만을 선택적으로 파괴한다. 광역학적 요법 효과를 결정하는 결정적인 요인 중 하나는 광민감제의 광화학(photochemical) 및 광물리학적(photophysical) 성질이다.
최근, 광민감제는 다음과 같은 4개의 주요 부류로 분류된다: 포르피린 유도체, 클로린(chlorins), 포르피센(porphycenes), 및 프탈로시아닌(phthalicyanines, Pcs). 이들 중에서, 메탈로프탈로시아닌(metallo-phthalocyanine, MPc)은 프탈로시아닌(Pc) 고리 치환체로서, 도입될 수 있는 관능기 및 중심 금속 이온의 종류에 따라서 광역학적 특성이 용이하게 조절될 수 있다는 점에서 중요성이 대두되고 있다. ZnPc는 닫힌 d 쉘 구조와 반자성의 중심 금속 이온으로서 Zn(II) 이온을 가짐으로써, 활성산소종 생성에 필수적인 연장된 수명을 갖는 3중 전자 상태(triplet electrical state)의 수율이 우수하기 때문에, 우수한 광역학적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 더욱이, ZnPc는 650 - 900 nm의 조직 투과 스펙트럼 범위에서 광 흡수 단면적이 넓다.
광역학적 요법에 있어서의 ZnPc를 함유하는 대부분의 광민감제의 가장 큰 문제점은 생흡수율이 낮다는 것인데, 이는 주로 이들이 매우 소수성이어서 혈액에 대한 가용성이 낮아서 발생하는 문제점이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 테트라설포네이티드 ZnPc (ZnPcS4), [1,2,3,4-테트라키스(α/β-D-갈락토피라노스-6-일)-프탈로시아니나토]아연 ([1,2,3,4-tetrakis(α/β-D-galactopyranos-6-yl)-phthalocyaninato]zinc), 테트라- 및 옥타-트리에틸렌옥시설포닐 치환된 ZnPc (tetra and octa-triethyleneoxysulfonyl substituted ZnPc)와 같은 ZnPc 유도체들이 수용성 증진을 위하여 설계되었다. 또한, 난용성 광민감제를 표적에 수송하기 위하여 리포좀, 에멀젼, 및 나노입자와 같은 다양한 운반체들이 개발되었다.
그러나, 이러한 접근은 다단계의 복잡한 화학적 기능화 단계를 필요로 하고, 이러한 기능화 과정은 광민감제 원래의 강력하게 접합된 전자 시스템을 파괴할 가능성이 있어서, 기능화 동안에 광민감제의 광활성이 현저하게 감소될 수 있다. 또한, 광역학적 및 광열학적 효과를 동시에 나타내어 이중 상조적인 광치료가 가능한 광민감제의 실현이 또 다른 중요한 연구개발 과제인데, 이는 기존에 알려진 개별적 광민감제에서는 실현되기 어렵다는 문제가 있다.
또한, 광역학 치료에서 형광 이미징 시스템은 치료물질인 광민감제의 체내에서 존재하는 위치와 표적물질에 축적된 농도 등을 정확하게 파악할 수 있게 도와주기 때문에 국부영역의 암세포를 정확하게 치료할 수 있다. 여러 광민감제 중에서 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 경우는 장파장에서의 빛을 흡수할 수 있고, 아연 원자의 존재로 인해 더 많은 활성화 산소를 생성할 수 있다는 장점을 가지고 있지만, 형광을 가지지 못하기 때문에 이미징 시스템의 도입이 어렵다는 단점이 있다.
따라서, 이러한 단점을 극복하기 위해 형광을 나타내는 물질을 도입한 복합체의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 ZnPc가 1차원 나노와이어(NW) 구조로 성장하는 경우 어떠한 특별한 관능기의 도입 없이도 수용해도 및 수분산성이 현저하게 증진됨을 확인하고, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어가 근적외선 (irradiation of near infrared, NIR, λ=808 nm) 조사시 광역학적 특성을 나타내고 기존의 ZnPc 분말에는 없는 광열학적 특성도 나타내며, 이러한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에 형광을 나타내는 페노티아진 분자를 도입하여 복합체를 제조하는 경우 복합체 자체가 형광을 나타내어 이미징 시스템 도입이 용이함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 수용해도 및 수분산성이 향상된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs), 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체, 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs) 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 포함하는 광민감제(photosensitizer)를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs) 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 수용해도 및 수분산성이 향상된, 하기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어를 제공한다.
[화학식1]
Figure 112012069950411-pat00001
본 발명에 따른 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어는 아연-프탈로시아닌을 증기-응축-재결정화 (vapor-condensation-recrystallization, VCR)하여 얻어진 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어는 원료 아연-프탈로시아닌 (예컨대, 분말 상태)을 500℃ 이상, 바람직하게는 550℃ 이상, 예컨대, 500 내지 1000℃, 바람직하게는 550 내지 800℃, 더욱 바람직하게는 550 내지 650℃로 가열하여 증발된 증기를 상기 가열 온도보다 낮은 온도, 예컨대 300℃ 이하, 바람직하게는 200℃ 이하, 더욱 바람직하게는 180℃ 이하, 예컨대 상온 내지 300℃, 상온 내지 200℃, 또는 상온 내지 180℃의 기판 상에서 응축 및 재결정화시킴으로써, 아연-프탈로시아닌이 기판상에서 나노와이어 형태로 성장하여 얻어질 수 있다. 이렇게 얻어진 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 지름은 약 50 내지 100 nm 정도이고, 길이는 약 1 내지 10 μm 정도일 수 있다.
또한, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어는, 기존의 아연-프탈로시아닌 분말과 달리, 물에서의 용해도 및 분산성이 매우 우수하여, 수용액 상태에서의 안정성이 현저하게 증진된 것을 특징으로 한다 (수용액 상태에서 3개월 이상 안정성 유지). 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 수용해도는 초음파처리와 같은 교반을 통하여 더욱 증진될 수 있다. 이와 같이 얻어진 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 물에서의 용해도 및 분산성은 상온에서 140 mg/L까지 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 제공한다.
상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 형광을 나타내는 페노티아진 분자를 도입함으로써 복합체 자체가 형광을 나타내어 이미징 시스템 도입을 용이하게 함으로써 하나의 물질로 진단과 치료가 동시에 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 불활성 기체 분위기 하에 아연-프탈로시아닌(Zinc phthalocyanine, ZnPc)을 500 내지 1000℃로 가열하여 증발시켜 ZnPc 증기를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 생성된 아연-프탈로시아닌 증기를 불활성 기제 분위기 하에서 상온 내지 300℃로 응축하고 재결정화하여 상기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어를 얻는 단계;
를 포함하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a') 불활성 기체 분위기 하에 아연-프탈로시아닌(Zinc phthalocyanine, ZnPc) 및 페노티아진을 500 내지 1000℃로 가열하여 증발시켜 ZnPc 및 페노티아진 증기를 생성하는 단계; 및
(b') 상기 (a')단계에서 생성된 아연-프탈로시아닌 및 페노티아진 증기를 불활성 기체 분위기 하에서 상온 내지 300℃로 응축하고 재결정화하여 상기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 얻는 단계;
를 포함하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명한다.
상기 (a) 및 (a')단계는 ZnPc 증기 및/또는 페노티아진 증기를 생성하는 단계로, 불활성 기체 분위기 하에서 분말 상태의 아연-프탈로시아닌 및/또는 페노티아진을 500℃ 이상, 바람직하게는 550℃ 이상, 예컨대, 500 내지 1000℃, 바람직하게는 550 내지 800℃, 더욱 바람직하게는 550 내지 650℃로 가열하여 증류시켜 ZnPc 증기 및/또는 페노티아진 증기를 생성한다.
상기 (b) 및 (b')단계는 ZnPc 증기 및/또는 페노티아진 증기를 응축 및 재결정하는 단계로, 불활성 기체 분위기 하에서 ZnPc 증기 및/또는 페노티아진 증기를 기판 상에서 응축시키고 재결정화한다. 이 때, 사용되는 기판의 온도는 상기 (a) 또는 (a')단계에서 생성된 아연-프탈로시아닌 증기 및/또는 페노티아진 증기를 수집하여 응축 및 재결정화시킬 수 있는 범위로, 상기 가열온도보다 낮은 범위여야 하며, 예컨대 300℃ 이하, 바람직하게는 200℃ 이하, 더욱 바람직하게는 180℃ 이하, 예컨대 상온 내지 300℃, 상온 내지 200℃, 또는 상온 내지 180℃일 수 있다.
상기 (a), (a'), (b) 및 (b')단계에서 사용된 불활성 기체는 질소, 아르곤 또는 헬륨일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 본 발명에서는 아르곤을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (b) 및 (b')단계에서 기판은 아연-프탈로시아닌 증기와 접촉하여 나노와이어를 성장시킬 수 있는 모든 종류가 사용 가능하며, 예컨대, 실리콘, 석영 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs) 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 포함하는 광민감제(photosensitizer)를 제공한다.
상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 함유하는 광민감제는 650 내지 900nm의 근적외선 범위의 광을 흡수하여 활성산소종과 열을 발생시키는 것을 특징으로 한다.
광요법(phototherapy)은, 부작용이 적고, 비침습적이며, 특정 파장의 광에 특이적이기 때문에, 암치료에 널리 사용되는 임상 방법 중 하나이다.
광역학적 요법 (photodynamic therapy, PDT) 및 광열학적 요법 (photothermal therapy, PTT)에서와 같이, 광요법에서 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 열에너지 발생을 위하여 각각 빛과 광민감제(photosensitizer)가 필요하며, 세포 사멸을 유도한다.
일반적으로, 아연-프탈로시아닌 (Zinc phthalocyanine, ZnPc)은 650 내지 900 nm의 스펙트럼 범위에서 강력한 흡수 단면적(absorption cross-section)을 갖고, 최대의 조직 투과력을 담보할 수 있기 때문에 효과적인 광민감제 중 하나로 대두되고 있다. ZnPc를 함유하는 프탈로시아닌(Pc) 분자 사용에 있어서 주요한 문제점 중 하나는 ZnPc의 수용해도가 낮다는 것이다. 따라서, ZnPc의 수용해도를 증진시키기 위하여, ZnPc 골격에 다양한 화학적 관능기를 도입하여 친수성을 유도하는 다양한 화학적 변형이 시도되어 왔다.
본 발명자들은 증기-응축-재결정화 (vapor-condensation-recrystallization, VCR)에 의하여 ZnPc로부터 직접적으로 성장된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 (NWs)가 다른 어떤 특정 관능기의 도입 없이도 수용해도 및 수분산성이 증진됨을 확인하였다. 이와 같은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액은 유통기간이 3개월 이상 연장된다.
또한, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액은 근적외선 (NIR, λ=808 nm) 조사시에 매우 우수한 광역학적 및 광열학적 이중 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 이와 같은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 이중 치료 효과는 KB 암세포에 대한 세포독성 효과를 증진시키는 것으로 생체외 및 생체내 시험을 통하여 입증하였다.
중심 금속의 전자배열(electronic configuration)에 따라서, 메탈로-프탈로시아닌(MPc)은 근적외선 영역에서의 광조사에 따라서 열에너지 또는 활성산소종을 발생시킨다. 중심 금속이 d0 또는 d10 (Zn(II)와 같이 닫힌 쉘) 전자 배열을 가질 때, 3중 여기 상태 (triplet excited state)는 활성산소종 (광역학(PD) 효과) 생성에 수반되기에 충분히 긴 수명을 갖는다. 한편, d 오비탈이 완전히 채워지지 않은 중심 금속 (Ni(II), Co(II), 등과 같은 열린 쉘)을 갖는 MPc는 낮은 PD 효과를 나타내지만, 오히려 여기 전자 에너지를 진동 모드로 신속하게 전환시켜 PT(광열학) 효과를 발생시킨다.
PD 효과와 PT 효과를 위한 광민감제의 전자 에너지 상태는 상호 충돌하기 때문에 (즉, 광민감제의 수명이 긴 3중 여기 상태는 PD 효과에는 유리하지만, PT 효과에는 불리함), 두 가지 광효과를 모두 나타내는 광민감제를 실현하는 것은 쉽지 않다.
본 발명에 따른 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 그 자체가 근적외선 조사에 따라서 PD 효과와 PT 효과를 나타낸다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 PD 활성은 근적외선(λ=808 nm) 레이저광을 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에 조사시 생성되는 활성산소종을 측정함으로써 확인하였다.
따라서, 본 발명의 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 광민감제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어(ZnPc NWs) 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 적외선 (특히 근적외선) 조사시의 활성산소종 생성 및 열 발생 특성을 이용하여, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어를 종양 부위에 투여하고 적외선 (특히 근적외선)을 조사하면 활성산소종 및 열이 발생하여 종양 세포 또는 조직을 사멸(괴사)시킬 수 있으므로, 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 광민감제 또는 암 예방 또는 치료용 조성물에 유효성분으로 사용되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 물에 용해된 수용액 상태일 수 있다. 상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체 용액 내의 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 농도는, 상기 활성산소종 생성 및 열 발생 효과를 고려할 때, 농도가 높을수록 유리하며, 예컨대, 60 mg/L 이상, 바람직하게는 80 mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 100 mg/L 이상일 수 있고, 예컨대, 60 내지 140 mg/L, 80 내지 140 mg/L, 100 내지 140 mg/L, 또는 110 내지 130 mg/L일 수 있다.
본 발명의 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체에 의하여 치료 가능한 암 종류는 모든 종류의 고형암일 수 있으며, 특히, 피부, 점막 등의 상피의 변형에 따른 상피성 암 종류, 예컨대, 구강편평세포암, 피부암, 유방암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 전립선암, 신장암, 갑상선암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암일 수 있다.
본 발명의 조성물은 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체와 함께 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 종양내, 혈관내, 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소에 투여)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 일일 투여량은 0.00001 내지 1 mg/mm3 (종양부피), 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 mg/mm3 (종양부피) 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는, 단일 분자에서 광열학 및 광역학의 이중적 양상 발휘하므로 다기능 분자 시스템 개발에 매우 유리하며, 우수한 광치료 효과를 가지므로, 암의 광치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 그 자체가 형광을 나타낼 수 있어 이미징 시스템의 도입을 용이하게 함으로써 하나의 물질로 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어를 성장시키는 VCR 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 1b는 VCR 과정을 통하여 얻어진 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 대표적인 SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 1c 및 1d는 Si(100) 기판으로부터 수집된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 (α-형태) (1c) 와 ZnPc 분말 (β-형태) (1d)의 XRD 패턴을 각각 나타낸 도이다.
도 2는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(붉은 색)와 β-ZnPc 분말(검은 색)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 열중량분석(TGA) 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 A는 [010] 방향을 따라서 성장한 분리된 단독 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 고해상도 TEM 이미지이고 (삽입된 이미지는 [100] 방향으로 성장한 ZnPc 나노와이어의 SAED 패턴을 보여주는 것임), B는 A의 노란색 박스 부분의 확대된 모습이고 (격자 이미지의 interplanar 간격: 1.14 nm), C는 a-축 투시시의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 결정 구조를 개략적으로 보여주는 것으로서, 왼쪽에서는 알파(α)-형태의 나노와이어의 Zn(II) 이온 배열에 대응하여 아연 평면이 붉은 색으로 강조되어 있고, 오른쪽은 ZnPc의 분자 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 Si(100) 기판상에서 성장된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 XRD 패턴을 나타낸 도이다.
도 6은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(A)와 ZnPc 분말(B)의 질량 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 (A)와 ZnPc 분말 (B)의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 8은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 물에서의 용해성과 초음파 처리(sonication) 효과를 보여주는 것으로, 상단은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액의 사진이고, 중간은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 TEM 사진이고, 하단은 초음파처리 시간이 길어짐에 따른 물과 ZnPc 단위체 간의 증가된 수소 상호작용 빈도를 개략적으로 보여주는 것으로, 파란색 선은 물의 수소 원자와 ZnPc의 질소 원자 간의 수소 결합을 나타낸 도이다.
도 9는 물에서의 ZnPc 분말과 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 안정성을 나타낸 도이다.
도 10은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(붉은 색)과 ZnPc 분말(검은 색)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다. 3600 내지 3300 cm-1에서의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 밴드는 물분자의 O-H 스트레칭 진동을 나타낸다.
도 11은 공기 노출된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(왼쪽)와 진공 어닐링된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(오른쪽)의 XPS 스펙트럼(XPS survey spectra)을 나타낸 도이다. 흡착된 H2O 때문에 O1s 피크가 533 eV 부근에서 관찰된다.
도 12는 DMF와 물이 상이한 비율로 혼합된 혼합용매에 용해된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. 물 함량이 증가함에 따라 피크는 343 nm에서 330 nm로 청색편이 되는 것으로 나타나고, 삽입 이미지는 DMF/물 비율에 따른 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액의 사진을 나타낸다.
도 13은 α-형 및 β-형 ZnPc의 다형 구조(Polymorphic structure)를 나타낸 도이다.
도 14a는 Pc 나노와이어(붉은색)와 Pc 분말(검은색)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다. 3600 내지 3300 cm- 1 에서의 O-H 스트레칭 밴드는 Pc 나노와이어에서는 관찰되는 반면, Pc 분말에서는 관찰되지 않았으며, 이는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 ZnPc 분말에서의 거동과 유사한 것을 나타낸다.
도 14b는 Pc 나노와이어 용액의 UV-vis 스펙트럼을 나타낸 도이다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액과 유사한 well-resolved Soret 및 Q 밴드를 보여주며, 삽입 이미지는 Pc 나노와이어 수용액 사진을 나타낸다.
도 15는 Image-iTTM LIVE Reactive Oxygen Species (ROS) Kit를 사용하여 산화 스트레스를 측정하기 위한 구강암 세포(KB cell)의 형광현미경 (Fluorescence microscopy) 이미지를 나타낸 도이다. 좌측 상단은 미처리 KB 세포, 우측 상단은 근적외선(NIR, 808 nm, 3 W/cm2) 조사된 KB 세포, 좌측 하단은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (120 mg/L) 처리된 KB 세포, 우측 하단은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (120 mg/L) 처리 후 근적외선(808 nm, 3 W/cm2) 조사된 KB 세포를 나타내며, 여기서 녹색 형광을 나타내는 세포들은 ROS에 의하여 산화 스트레스 받은 세포를 나타낸다.
도 16은 각 실험군의 상대적 형광 세기를 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준편차(n = 3, triplicate)로 나타낸다.
도 17은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (붉은 선)과 ZnPcS4 용액 (파란 선)의 UV-vis 스펙트럼을 나타낸 도이다. 근적외선 영역에서의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (at 600 내지 800nm, 특히 at 600, 800 nm) 및 ZnPcS4 용액 (at 630 nm)의 고흡광도 특성이 관찰되며, 삽입 이미지는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (파란색, 왼쪽)과 ZnPcS4 용액 (아쿠아 그린, 오른쪽) 사진을 나타낸다.
도 18 및 도 19는 3분간 근적외선 조사(660 nm, 3W/cm2)시의 다양한 농도에서의 시간에 따른 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액 및 ZnPcS4 수용액의 온도 변화를 각각 나타낸 도이다.
도 20은 3분간 근적외선 조사 (660 nm 및 808 nm, 3W/cm2)시의 순수한 물의 온도 변화를 나타낸 도이다.
도 21 및 도 22는 3분간 근적외선 조사(808 nm, 3W/cm2)시의 다양한 농도에서의 시간에 따른 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액 및 ZnPcS4 수용액의 온도 변화를 각각 나타낸 도이다. (Data are shown as mean ± SE (n = 3, triplicate)).
도 23는 Si 기판 상에서 성장한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(검은 선)와 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액(붉은 선)의 라만 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 24는 원래의 KB 세포(검은 선)와 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 처리된 KB 세포(붉은 선)로부터 얻어진 라만 스펙트럼을 나타낸 도이다. ZnPc의 피롤 스트레칭 모드(pyrrole stretching mode)에 해당하는 특징적인 라만 피크가 1336 cm- 1(a)와 1506 cm-1(b)에서 나타났으며, 삽입 이미지는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 처리된 KB 세포가 놓여 있는 유리판의 광학 현미경 사진(scale bar: 4 μm)을 나타낸다.
도 25는 상기 도 5b의 a와 b의 피크 강도로 맵핑된 공초점 스펙트럼 이미지 (Confocal spectral images)를 나타낸 도이다. 수직 스캔 스텝 (깊이)는 2 μm이고, 색 밝기는 피크 강도에 따라 표현되어 있으며, scale bar는 4 μm를 나타낸다.
도 26은 KB 세포의 명시야상 현미경(Bright-field microscopy) 이미지를 나타낸 도이다. 좌측 상단은 미처리 세포, 우측 상단은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (120 mg/L)으로 처리된 세포, 좌측 하단은 근적외선 조사(808 nm, 3 W/cm2)된 세포, 우측 하단은 광처리 24시간 후의 모습을 나타내며, 상기 세포들은 트리판 블루(trypan blue)로 염색되어 사멸 세포는 파란색으로 관찰되고, scale bar는 4 μm를 나타낸다.
도 27은 다양한 실험군에서의 KB 세포 생존률을 정량화한 결과를 나타낸 도이다(결과는 평균 ± 표준편차로 나타냄(n=3, triplicate)).
도 28은 생체내(in vivo) 광치료 실험 사진을 나타낸 도이다. 상단은 KB 종양 세포(tumor size: ca. 70 mm3)로 이종 이식된 마우스, 중간은 종양 부위에 ZnPc 용액 (120 mg/L, 200 μL)을 종양내 주입한 후 근적외선(808 nm, 3 W/cm2) 조사된 마우스, 하단은 광치료 20일 후의 마우스(건강하고 어떠한 비정상적 행동도 보이지 않음)를 나타낸다.
도 29는 시간에 따른 평균 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 종양 부피는 1주일에 3번씩 기록되었고(결과는 평균 ± 표준편차로 나타냄(n=4, quadruplicate)), 미처리군, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 처리군, 및 PBS + 근적외선 처리군과 비교하여, ZnPc 나노와이어와 근적외선이 함께 처리된 실험군에서만 현저한 종양 성장 억제 효과를 나타낸다(n=4, p < 0.05, two-way ANOVA).
도 30은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 처리 및 근적외선 조사된 종양의 대표적인 조직학적 이미지를 나타낸 도이다. A 내지 D는 H & E 염색된 조양 조직을 나타내는 것으로, 가장 분홍색이 진하게 염색된 세포가 사멸된 세포를 나타내며 (분홍색: 세포질, 보라색: 핵), E 내지 H는 특이적 자멸 세포(apoptotic cells)를 검출하기 위한 Deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick-end labeling (TUNEL) 에세이 결과를 보여주는 것으로, 자멸세포는 갈색으로 염색되며 비자멸 세포는 hematoxylin으로 대비염색(scale bar: 50 μm) 되는 것을 나타낸다.
도 31은 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 사진을 나타낸 도이다[(a)페노티아진 분자구조; (b)실리콘 기판 위에 VCR 방법으로 제조된 페노티아진 나노와이어 사진과 나노와이어 구조체의 광학현미경 이미지 및 형광현미경 이미지; (c)VCR 합성 방법의 개요 및 실리콘 기판 위에 합성된 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체 사진].
도 32는 실리콘 기판 위치에 따라 다르게 제조된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체의 SEM이미지를 나타낸 도이다.
도 33의 (a)는 365nm 파장의 빛을 쬐었을 때 나타나는 페노티아진 나노와이어, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, 및 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체 나노와이어 용액의 형광 사진을; (b)는 340nm 파장에서의 페노티아진 나노와이어, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, 및 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체 나노와이어 용액의 형광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 알파(α)-형태의 아연- 프탈로시아닌 나노와이어의 제조
ZnPc 분말을 전구체로 사용하여 증기-응축-재결정법(vaporization-condensation-recrystallization, VCR)이라고 불리는 고체-증기 이송(solid-vapor transport) 반응을 통하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어를 제조하였다.
구체적으로는, ZnPc 분말 (0.05g, Sigma-Aldrich)을 전기 가열로 시스템에 있는 석영관(quartz tube)의 중심에 위치하는 세라믹 보트(ceramic boat)에 로딩시켰다. 반응 전에, Ar 가스를 유속 800 sccm로 5분간 적용하여 석영관을 세척하여 막혀있는 주위의 공기를 제거하였다. 지속적으로 Ar 가스를 흘리면서 550℃까지 가열하여 증류시켰다. Si(100) 기판(웨이퍼) (WRS materials)을 상기 가열로의 끝부분(하류)에 위치시켰다.
반응 동안, 가열로 중심의 튜브에 위치하는 ZnPc 분말을 550 ℃에서 증류시키고, Ar 가스를 이용하여 ZnPc 증기를 상기 Si 웨이퍼가 위치하는 하류쪽으로 이동시켰다. 기판의 온도가 자연적으로 180 ℃보다 낮기 때문에, ZnPc 증기는 Si 웨이퍼 상에서 응축되고, 이로부터 1차원 ZnPc 나노와이어가 성장된다. ZnPc 나노와이어를 성장시키기 위하여 40분간 반응을 지속시킨 후, Ar 가스를 흘려주면서 얻어진 샘플을 실온으로 냉각시켰다. 이와 같은 VCR 과정을 도 1a에 개략적으로 나타내었다.
실험예 1: 알파(α)-형태의 아연- 프탈로시아닌 나노와이어의 특징 분석
상기 실시예 1에서 제조된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 형태, 화학적 구성요소, 및 회절 패턴을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. SEM 측정
주사전자현미경(SEM, JSM-7410F, JEOL) 측정을 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 상에 Au를 스퍼팅하였다. 이와 같이 얻어진 SEM 이미지를 도 1b에 나타내었다.
도1b에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 지름은 약 50 내지 100 nm 정도이고, 길이는 약 1 내지 10 μm 정도임을 확인하였다.
2. XRD 측정
상기 실시예 1에서 제조된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 결정 구조를 선별된 영역의 회절 데이터 (selected area electron diffraction, SAED)를 이용하여 X-선 분말 회절 (X-ray powder diffraction, XRD, D/MAX-2500/PC, RIGAKU) 및 고해상도 투과전자현미경 (high-resolution transmission electron microscopy, HR-TEM, JEM 2100F, JEOL)을 이용하여 측정하였다.
Si(100) 기판으로부터 수집된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 (α-형태) (1c) 와 ZnPc 분말 (β-형태) (1d)의 XRD 패턴을 각각 도 1c 및 도 1d에 나타내었다.
도 1c 및 도 1d에 나타난 바와 같이, JC-PDS cards No. 21-1986 및 39-1882에 따르면, XRD 결과는 ZnPc 나노와이어가 α-형태를 갖는 반면, 본래의 ZnPc 분말은 β-형태를 가짐을 보여준다. ZnPc의 특징적인 XRD 피크 중 하나는 (200) 평면으로부터 얻어지며, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 d(200) = 12.6 Å(at 2θ=7.01°)는 이 전에 보고된 알파(α)-형태의 ZnPc 결정 및 박막 결과와 잘 부합하는 반면, 베타(β)-형태의 ZnPc는 d(200) = 7.24Å(at 2θ=12.22°)를 나타낸다.
3. FT - IR 측정
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 베타(β)-형태의 ZnPc 분말을 FT-IR (Fourier-transformed infrared) 분광 시험하였다. 구체적으로는, FT-IR 분광을 위하여, ZnPc 분말과 ZnPc 나노와이어의 KBr 펠렛을 제조하고, FT-IR 분광광도계(VERTEX 70, Bruker Optics)를 이용하여 FT-IR 스펙트럼을 얻었다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(붉은색)가 773 cm-1에서 중심고리에서 진동 모드와 함께 724 cm- 1 에서 핑거프린트 벤딩(bending) 모드를 나타내어, ZnPc 나노와이어가 실제 α-형태를 가짐이 추가적으로 확인되었다. 분말 XRD를 위한 다중 반응 배치로부터 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어를 대량으로 수집할 수 있다.
4. 열중량 분석
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 열중량분석(thermogravimetric analysis, TGA)을 열중량 분석기(thermogravimetry analyzer (TG-2171, Cahn Instrument Inc.)를 사용하여 측정하였다. ZnPc 분말 (Sigma-Aldrich) 5 mg을 로딩하고, Ar 분위기 하에서 실온에서 1000 ℃까지 4 ℃/min 승온속도로 가열하였다. 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, ZnPc의 열증발(Thermal vaporization)이 550℃에서 시작됨을 알 수 있다.
5. HR - TEM 측정
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액을 탄소필름으로 코팅된 Cu 그리드(TED PELLIA Inc. USA) 상에 적가하여 제작된 샘플을 이용하여 HR-TEM 측정을 수행하였다. HR-TEM 측정 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, HR-TEM 이미지는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어가 성장 방향과 평행한 명확한 결정형 격자를 가짐을 보여준다. 단독 결정화도(crystallinity)는 개별적인 회절 스팟을 보이는 SAED 패턴으로부터 확인하였다(A의 삽입 이미지). 1.14 nm 간격의 (002) 격자(B)는 XRD 결과 (d(002) = 11.5 Å at 2θ= 7.66°)와 잘 부합한다. 각각의 격자선 ([100] 방향을 따라 생성된 (200) 평면)은 붉은색 선에 의하여 표시된 선형 Zn 금속 이온 배열에 상응한다 (C). 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어는 π-π 스태킹을 통하여 ZnPc 분자의 자가조립 방향을 따라 성장하여, (200) 평면이 성장 방향과 평행하게 된다.
6. Si 기판상에서 성장된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 XRD 측정
Si(100) 기판상에서 성장된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 XRD 패턴을 D/MAX-2500/PC (RIGAKU) 사용하여 측정하였으며, 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실제로, Si 기판상에 성장한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 시험시, 대부분의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어는 기판과 평행한 (200) 평면과 함께 기판 상에 lay down하는 경향이 강하므로, (200) 평면으로부터 오직 하나의 XRD 피크만이 발생한다. 본 발명의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 구조는 이전에 보고된 CuPc 나노와이어와 가까운 구조를 갖는다.
7. 질량 및 NMR 스펙트럼 측정
질량분광(mass spectroscopy) 및 핵자기공명(NMR)에 의하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 내에서 ZnPc가 증기-응축-재결정화(VCR) 과정 동안에 어떠한 골격 파괴도 없이 분자 구조를 유지함을 확인하였다. 구체적으로, 고속 원자 충격 질량 분석(FAB-MS, JMS 700 high-resolution mass spectrometer equipped with FAB ionization, JEOL)과 1H 핵자기공명 (NMR, DMSO-d6, FT-300 MHz Bruker Aspect 3000)에 의하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 보존성(integrity) 특성을 시험하였다.
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(A)와 ZnPc 분말(B)의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼은 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 질량분광에 의하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 분말 모두에서 ZnPc의 정확한 질량(576.079 m/z)에 해당하는 576.2 m/z에서 강한 피크가 얻어지는 것으로 나타났으며, 이는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 분말이 기본적으로 동일한 화학 조성을 가짐을 확인시켜주는 것이다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 양자 (1H) NMR 스펙트럼은 어떠한 구조적 변화 없이 순수한 ZnPc를 함유함을 추가로 입증해준다.
질량분석과 1H-NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같다.
MS (m/z calculated, 576.079 [M+]; found, 576.2 [M+]),
1H NMR [ZnPc 분말: δ 9.445-9.473 (dd, J1=5.6, J2=3, 8H ArH); δ 8.274-8.302 (dd, J1=5.6, J2=3, 8H ArH); ZnPc 나노와이어: δ 9.445-9.474 (dd, J1=5.7, J2=3, 8H ArH); δ 8.285-8.314 (dd, J1=5.7, J2=3, 8H ArH)].
실험예 2: 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 수용성 시험
1. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액의 형태 TEM 및 안정성 관찰
Si 기판으로부터 모은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 1mg을 물 5mL에 첨가한 후, 초음파 세척기(bath sonicator; UC-10, JEIOTECH)에서 다양한 시간(5분, 40분)으로 초음파 처리하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액을 제조하였다. 최종적으로 얻어진 용액을 UV-vis 분광 광도계(Agilent 8453 spectrophotometer)를 사용하여 흡광도(optical absorbance) 측정을 위하여 옮겼다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액의 농도는 219 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 측정 곡선은 연속적으로 희석된 용액의 흡광도를 219 nm에서 측정하여 작성하였다.
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액의 형태 관찰 결과 및 TEM 사진을 도 8에 나타내었으며, 안정성 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
도 8의 상단에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어는 초음파 처리에 의한 짧은 기계적 교반에 의해서도 물에 잘 녹는 것을 확인하였다. 반면 ZnPc 분말에는 유사한 처리를 하여도 수용해도가 증가되지 않음을 확인하였다.
또한, 도 8의 중간에 나타난 바와 같이, 초음파 처리 시간이 길어질수록 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 물에 대한 용해도는 점점 높아져서, 용액의 색깔이 투명한 파란색에서 진한 파란색으로 변하게 되고, 이는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 물의 ZnPc 단위체에 대한 상호작용이 증가되는 결과를 보여주는 것이다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액은 실온에서도 매우 안정하여 적어도 3개월 이상 응집 없이 유지될 수 있으나, 물에서 초음파 처리된 ZnPc 분말은 단기간 내에 침전이 형성됨을 확인하였다.
2. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 FT - IR 및 XPS 측정
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 물에서의 용해성은 물 분자의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어로의 우선적 흡착을 수반하여야 한다. ZnPc 분말에 비하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에 대한 물의 상호작용이 우선적임을 FT-IR 분광(VERTEX 70, Bruker Optics)과 X-선 광전자 분광(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS, 포항 가속기 의뢰하여 제작)에 의하여 확인하였다. X-ray 광전자 스펙트럼(X-ray photoelectron spectra, XPS)은 'Pohang Accelerator Laboratory, POSTECH'의 신크로트론(synchrotron) 설비의 8A1 beamline으로부터 측정하였다. 광자 에너지는 630 eV로 하였다. 얻어진 결과를 각각 도 10(FT-IR 분광)과 도 11(XPS)에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 두 샘플(나노와이어/분말)을 모두 공기(습도: 30%) 중에 2시간 동안 노출시킨 후, ZnPc 나노와이어는 3600 - 3300 cm-1에서 나타나는 물 분자에 특이적인 O-H 진동 밴드를 나타내는 반면, ZnPc 분말에는 나타나지 않았다.
또한, 도 11의 XPS 데이터는 물 분자가 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 상으로 용이하게 흡착됨을 확인시켜준다 (알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 XPS 스펙트럼은 물의 O에 해당하는 O1s 피크를 533 eV에서 나타냄). 이러한 O1s 피크는 샘플을 진공상태에서 어닐링시키면 사라진다.
3. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 물과의 결합력 측정
물의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어로의 우선적 흡착은 수소결합과 ZnPc 단위체 내의 Zn(II) 이온과 물의 배위결합을 통하여 일어난다. 물과 ZnPc 내의 N 원자와의 수소결합은 쉽게 인정되지만, ZnPc 내의 Zn(II) 이온과 물과의 배위결합은 확인이 필요하다. 따라서, 물을 디메틸포름아마이드(DMF) 용액에 다양한 부피비로 첨가하면서, 물 분자의 중심 Zn(II) 이온과의 배위력(coordination power)을 측정하였다.
구체적으로는, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 0.5mg을 디메틸포름아마이드(dimethylformamide, DMF)에 용해시킨 후, 물에 첨가하여 다양한 비율의 혼합 용액을 제조하였다 (DMF:H2O = 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0). UV-vis 분광 광도계(Agilent 8453 spectrophotometer)로 상기 혼합 용액에서의 soret 밴드의 이동을 시험하였다.
DMF와 물이 상이한 비율로 혼합된 혼합용매에 용해된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 도12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 순수한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어/DMF 용액의 UV-vis 스펙트럼(Agilent 8453 spectrophotometer)은 343 nm과 669 nm에서 각각 특징적인 Soret 밴드와 Q 밴드를 나타내었다. 물 분획이 증가하면서, Soret 밴드가 점진적으로 고 에너지(up to 330 nm)로 이동하고, 용액 색깔은 녹색에서 청색으로 변하였다. Soret 밴드의 청색편이는 Zn(II) 이온과 전-배위된(pre-coordinated) DMF 분자가 보다 강한 배위력(coordination power)을 가진 물 분자로 치환되었음을 의미한다.
물의 Zn(II) 이온과의 배위결합과 수소결합은 이론적으로는 모두 ZnPc 분말과 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 모두에 동등하게 적용될 수 있으나, ZnPc 나노와이어의 물에 대한 용해성의 실질적 증가와 관련된 주요 요인은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 경우에 물과 ZnPc의 N 원자와의 수소 결합과 물 분자의 Zn(II) 이온과의 배위 모두일 가능성이 훨씬 높다는 것이다.
4. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 구조 측정
도 13은 알파(α)-형태 및 베타(β)-형태 ZnPc의 다형 구조(polymorphic structure)를 보여준다. 물과 Zn(II) 이온과의 배위와 수소결합 모두가 가능한 부위가 ZnPc 분말 (β-형태)의 경우보다 ZnPc 나노와이어 (α-형태)의 경우가 보다 넓다. 그 이유는 베타(β)-형태 분말 내의 모든 Zn(II) 이온이 이웃하는 ZnPc의 질소 원자의 골격에 전-배위(pre-coordinated)되어 있어서(도 13), Zn(II)와 N의 상호작용 부위 모두에 있어서 손실이 있기 때문이다. 이것이 베타(β)-형태의 ZnPc 분말의 높은 안정성의 주요 이유이다. 반면, 모든 수소결합 및 물 배위 부위는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에서 자유롭게 이용 가능하다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 중에서, 보다 짧은 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어가 표면적이 넓기 때문에 보다 높은 가용성을 나타낸다 (도 8 참조).
5. 금속 무함유 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 FT - IR 및 UV - Vis 스펙트럼 측정
한편, 도 14a와 14b는 금속 무함유 프탈로시아닌(metal-free phthalocyanine, Pc) 나노와이어 용액의 FT-IR 스펙트럼(VERTEX 70, Bruker Optics)과 UV-vis 스펙트럼(Agilent 8453 spectrophotometer)을 나타낸 것으로, 금속 무함유 프탈로시아닌 나노와이어 또한 수용성이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있으며, 이를 근거로 수소결합은 Zn(II)과의 물 배위 상호작용과 더불어 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 가용성 증가에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
실험예 3: ZnPc 나노와이어의 이중 광효과 ( dual photoeffect ) 측정
중심 금속의 전자배열(electronic configuration)에 따라서, 메탈로-프탈로시아닌(MPc)은 근적외선 영역에서의 광조사에 따라서 열에너지 또는 활성산소종을 발생시킨다. 중심 금속이 d0 또는 d10 (Zn(II)와 같이 닫힌 쉘) 전자 배열을 가질 때, 3중 여기 상태 (triplet excited state)는 활성산소종 (PD 효과) 생성에 수반되기에 충분히 긴 수명을 갖는다. 한편, d 오비탈이 완전히 채워지지 않은 중심 금속 (Ni(II), Co(II), 등과 같은 열린 쉘)을 갖는 MPc는 낮은 PD 효과를 나타내지만, 오히려 여기 전자 에너지를 진동 모드로 신속하게 전환시켜 PT 효과를 발생시킨다.
PD 효과와 PT 효과를 위한 광민감제의 전자 에너지 상태는 상호 충돌하기 때문에 (즉, 광민감제의 수명이 긴 3중 여기 상태는 PD 효과에는 유리하지만, PT 효과에는 불리함), 두 가지 광효과를 모두 나타내는 광민감제를 실현하는 것은 쉽지 않다. 이러한 이중 광효과를 가능하게 하기 위하여, PD 특성과 PT 특성을 갖는 두 가지 성분을 포함하는 조성물이 제안되어 왔다. carbon nanohorn으로 인캡슐레이션된 ZnPc, 인도시아닌 그린 컨쥬게이트된 금 나노로드 등이 그 예이다.
1. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 PD활성 측정
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 자체는 근적외선 조사에 따라서 PD 효과와 PT 효과를 나타낸다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 PD 활성은 근적외선(λ=808 nm) 레이저광을 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에 조사시 생성되는 활성산소종을 측정함으로써 확인하였다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어를 포함하는 근적외선-활성화된 KB 세포로부터의 활성산소종 생성은 Image-iTTM LIVE Reactive Oxygen Species Kit를 사용하여 측정하였다.
본 실험은 ROS 투과 생존 세포 (ROS permeated viable cell)에 대한 fluorogenic 마커로서 5-(and-6)-carboxy-2'7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA)에 기초한다. ROS 존재하에서, 상기 환원된 carboxy-H2DCFDA는 산화되어 밝은 녹색 형광을 발광할 것으로 추정된다. 따라서, ROS에 의하여 산화 스트레스가 가해진 세포들은 녹색 형광으로 표식될 수 있다.
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어(ZnPc 나노와이어)의 효과를 비교하기 위하여, 수용성을 증진시키기 위하여 특별히 고안된 ZnPcS4를 상업적으로 구입하여 시험에 사용하였다.
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성은 H2DCFDA (Molecular Probes/Invitrogen)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 모니터링하였다. 미리 접종된 구강 표피양암종세포(KB cell)를 ZnPc 나노와이어 용액(120 mg/L)과 함께 5% CO2 및 37 ℃조건 하에서 18시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 완전히 세척하고, 808 nm 레이저를 조사하였다. H2DCFDA (10 μM)를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 30분동안 배양하였다. H2DCFDA는 살아있는 세포를 투과하고 세포내 에스터라제에 의하여 디아세틸화된 ROS의 fluorogenic 마커이다. ROS 존재 하에서, 상기 환원된 플루오레세인(fluorescein) 화합물은 산화되고, 밝은 녹색 형광을 발광한다. 플루오레세인 강도는 형광 분광 광도계(fluorescence spectrometer, Cary Eclipse, Varian)를 사용하여 529 nm에서 측정하였다.
결과는 도 15 및 16에 나타내었다.
도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 미처리 세포, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 처리된 세포, ZnPcS4 처리된 세포, 및 근적외선 처리된 세포들은 ROS 생산량이 미미하였다. 그러나, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 근적외선이 함께 처리된 세포는 강한 녹색 형광 강도를 나타내었다. 이러한 결과는 근적외선에 의하여 여기된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어가 ROS 생산의 주요 요인임을 명확하게 보여주는 것이다.
2. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 PT 특성 측정
가장 흡광도가 높은 파장인 660nm와 대부분의 생물학적 시스템이 투과성이 되는 파장인 808 nm의 상이한 두 개의 파장(λ)에서 3 W/cm2에서 광 조사(light illumination) 시의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액 (60, 80, 120 mg/L)의 온도변화를 모니터링함으로써 PT 특성을 시험하였다.
다양한 농도(60, 80, 120 mg/L)의 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액과 아연 프탈로시아닌 테트라설포네이트(ZnPcS4) 용액에 660/808 nm 레이저를 3 W/cm2로 조사하였다 (diode laser, JENOPTIK unique-mode GmbH, Germany). 각각의 용액의 온도는 thermocouple connected temperature controller (Hanyoung, Korea)를 이용하여 20초마다 총 3분간 측정하였다. 각 용액당 3번씩 측정하였다.
알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 및 ZnPcS4 용액의 UV-Vis 스펙트럼은 도 17에 나타내었으며, 근적외선(660nm 및 808nm) 조사 후 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 수용액, ZnPcS4 수용액 및 물의 온도 변화는 각각 도 18 내지 도 22에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어로부터 이전에 보고된 바 없는 PT 특성의 발현은 ZnPc의 π-π 스태킹 (π-π stacking)을 통한 자가조립시의 ZnPc의 전자 에너지 상태의 변화에 기여할 것으로 보인다. 약술하면, ZnPc 단량체는 그의 오래 지속되는 삼중항 상태(long-lived triplet states)에 기인하는 PD 활성을 갖는다. 그러나, π-π 상호작용을 통한 ZnPc 분자의 스태킹은 삼중항 여기 에너지 (triplet excitation energy)를 전달하여, 열에너지 방출을 야기하는 비-방사성 완화(non-radiative relaxation)의 가능성을 증가시킴과 함께 삼중항 상태 수명을 감소시키는 결과를 가져온다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어에서 확장된 Q-밴드는 Pc 고리들 간의 π-π 상호작용에 기인한다.
또한, 도 18 내지 도 22에 나타난 바와 같이, 파장 660 nm인 레이저 조사 시, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액의 온도는 실온에서 약 40 ℃까지 상승하였으며, 온도 상승 정도는 ZnPcS4 용액과 비슷하였으며, 농도에 비례하였다 (도 18 및 도 19). 파장 808 nm인 레이저를 조사하는 경우, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (120 mg/L)만이 46 ℃까지 온도 상승을 보이는 반면, ZnPcS4 용액은 온도 변화가 거의 없었다 (도 21 및 도 22).
실험예 4: 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어를 이용한 암의 상승적 광치료
1. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 암 치료에 있어서의 광요법 실험
세포 흡수(cellular uptake) 및 암 치료에 있어서의 상승된 광요법에 대하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액을 시험하였다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액을 인간 구강 표피 양 암종 세포(epidermoid mouth carcinoma, KB cell)로 처리하고 세포 흡수를 시험하였다. 분광 및 영상화 모드에서 세포에서의 ZnPc 나노와이어를 추적하기 위하여 공초점 라만 분광기(confocal Raman spectroscopy)를 사용하였다.
ZnPc 피롤 스트레치 모드에 해당하는 1336, 1506 cm-1에서 특징적인 라만 밴드를 나타내기 때문에, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 세포내 내재화(intracellular internalization) 여부는 공초점 라만 분광기에 의하여 직접 확인할 수 있다. 인간 구강 표피 양 암종 세포(KB cell, 한국세포주은행)를 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS)과 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(Hyclone)에서 37 ℃ 및 5% CO2의 가습 환경에서 배양하였다. 상기 KB 세포를 배지 1mL의 각 웰마다 1×105cells의 밀도로 24-웰 플레이트의 글래스커버 상에 18시간 동안 접종하였다. 새로운 배지로 교체한 후, 50 mg/L ZnPc 나노와이어(실시예 1에서 제조)와 함께 5% CO2 분위기 및 37 ℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 인산염 완충액(PBS)으로 완전하게 씻어내고, 세포 접종된 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위에 놓고 측정하였다. 라만 분광기(laser excitation wavelength of 532 nm, 3 mW power, 100× objective, 0.3 s integration time, confocal mode, Alpha 300R, Witec)를 사용하여 측정하였으며, 측정 결과 피롤 스트레칭 밴드가 측정되었다. 라만 맵핑 이미지는 2 μm 간격으로 수집하였다.
얻어진 결과는 도 23 내지 도 25에 나타내었다.
도 23 내지 도 25에 나타난 바와 같이, 성장된 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 그 수용액의 특징적인 Raman 스펙트럼을 보여주며, 양쪽 Raman 스펙트럼 모두 1336 cm-1 및 1506 cm-1에서 구분되는 피롤 스트레칭 밴드를 나타내었다(도 23). KB 세포를 ZnPc 나노와이어 용액 (50 mg/L)에서 12시간 동안 배양한 후, 상기 세포는 두 가지 피롤 스트레칭 밴드를 모두 나타낸 반면, 미처리 세포는 전혀 두 밴드 모두를 나타내지 않았다(도 24). 양 피롤 스테레칭 모드에 해당하는 밴드(a 및 b, 도 25)로 맵핑된 공초점 스펙트럼 이미지를 통하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어가 세포 표면에 흡착하는 것이 아니고 세포 내부로 완전하게 흡수되는 것을 확인할 수 있다(도 25).
2. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 광치료 효과 측정
KB 세포를 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액과 함께 배양하고 colorimetric MTS assay를 이용하여 세포 생존률을 측정함으로써, 암세포 파괴에 대한 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 상승적 광치료 효과를 시험하였다.
미리 배양된 인간 KB 세포(0.5×105 cells/mL)를 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액 (120 mg/L)과 함께 5% CO2 및 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 씻어내고, 808 nm 레이저를 3 W/cm2로 5분간 조사하였다. Trypan blue를 사용하여 사멸 세포를 염색하였다. 세포 생존률은 CellTiter A96 (Promega) 분석에 의하여 측정하였다. 각 세포 샘플을 테트라졸륨 화합물(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS)와 전자 커플링 시약(phenazine methosulfate; PMS) 으로 처리하고, 5% CO2 및 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 490 nm에서의 흡광도를 측정하여 대사 활성 있고, 생존하는 세포에 의하여 MTS로부터 생환원된(bioreduced) 포르마잔(formazan)의 농도를 측정하였다.
얻어진 결과를 도 26 및 도 27에 나타내었다.
도 26 및 도 27에 나타난 바와 같이, 미처리 세포 및 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어만 처리된 세포는 높은 생존률을 보이는 반면(도 26 상단), 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 처리 후 근적외선 (λ= 808 nm) 처리된 세포는 trypan blue로 염색되었으며, 이는 세포 파괴를 의미한다(도 26 좌측 하단). 처리 24시간 후, 상기 세포 파괴는 더욱 명확해졌다(도 26 우측 하단). 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 근적외선 처리된 세포는 초기에 세포 표면 주위에 약간의 거품을 형성시킨다 (도 26 좌측 하단). 이러한 현상은 상기 세포들이 산화적 손상되었음을 의미하는 것이며, 세포를 H2O2로 처리한 경우와 유사한 현상이다. 통계 자료는 ZnPc 나노와이어와 근적외선 처리한 세포의 생존률이 미처리 세포와 비교하여 50% 이상 감소함을 보이며, 이는 ZnPcS4와 근적외선 처리한 세포를 포함하는 대조군보다 낮은 수준이다 (도 27).
3. 종양 마우스 모델을 이용한 광치료 효율 측정
상기 시험 결과에 기초하여, 종양 마우스 모델 (tumor-bearing mouse model)을 이용하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 광치료 효율을 in vivo에서 시험하였다.
구체적으로는, KB 세포(1×107 cells)를 수컷 BALB/c 마우스(n = 4, 5 내지 6주령)의 등에 접종하였다. 종양 부피가 약 70 mm3에 도달했을 때, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액(100 μL, 120 mg/L)을 마우스의 종양 내에 주입하고, 즉시 에테르 마취 하에서 808 nm 레이저(3 W/cm2, 3 min)를 조사하였다. 종양 크기는 3일마다 측정하였다. 생체내(in vivo) 실험의 모든 과정은 포항공과대학교의 동물 실험 윤리 가이드라인을 따라서 수행하였다.
상기 실험 구성을 도 28에 나타내었다. 종양 크기가 약 70 mm3에 달하는 경우(도 28 상단), 종양내 주입을 통하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어 용액을 종양 부위로 도입시킨 후 즉시 동일한 근적외선 레이저(808nm)를 출력밀도 3 W/cm2에서 3분간 조사하였다(도 28 중간).
서로 다른 처리군에서 측정된 종양 성장률은 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 근적외선이 모두 처리된 마우스에서는 고형 종양이 완전히 제거되었으나(도 28 하단 및 도 29 삼각형), 다른 대조군에서는 모두 종양이 지속적으로 성장하는 것으로 나타났다. 4번의 다른 시험으로부터 (four different batches) 유사한 결과가 반복재현됨을 관찰함으로써 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 광치료 효과의 신뢰성을 확인하였다.
또한, 조직학적 분석을 통하여 종양 조직에 대한 손상 효과를 추가로 확인하였다. 모든 처치 후 12시간 후에 마우스를 안락사시키고, 각 군의 종양 조직을 적출하고, 4%(w/v) 파라포름알데하이드 용액에서 밤새도록 고정하였다. 그 후, 종양 조직을 가공한 후 파라핀에 함몰시켰다. 파라핀 섹션을 글라스 슬라이드 위에 올려 놓고 H & E(hematoxylin and eosin) 염색하여 조직학적으로 분석하고, TUNEL 에세이(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick-end labeling, calbiochem)를 수행하여 자멸 또는 괴사 세포를 탐지하였다.
얻어진 결과를 도 30에 나타내었다.
또한, 도 30에 나타난 바와 같이, H & E(hematoxylin and eosin) 염색 결과로부터 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 근적외선이 함께 처리된 종양조직에서의 세포 수축 (cell shrinkages), 핵소실, 상당한 핵융해 등과 같은 사멸세포 특성을 확인할 수 있었다 (도 30의 A). 또한, 괴사성(necrotic) 및 자멸(apoptotic) 세포를 확인하는 TUNEL assay 결과, 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어와 근적외선이 함께 처리된 세포의 대부분에서 갈색이 관찰되었으며, 이는 광범위한 세포 사멸을 의미하는 것이다(도 30). 한편, 다른 대조군에서는 생존 종양세포가 남아있었다.
실시예2 : 알파(α)-형태의 아연- 프탈로시아닌 나노와이어 /페노티아진 복합체의 제조
ZnPc 분말 및 페노티아진을 전구체로 사용하여 증기-응축-재결정법(vaporization-condensation-recrystallization, VCR)이라고 불리는 고체-증기 이송(solid-vapor transport) 반응을 통하여 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어/페노티아진 복합체를 제조하였다.
구체적으로는, ZnPc 분말 (0.05g, Sigma-Aldrich) 및 페노티아진(0.03g, Sigma-Aldrich)을 전기 가열로 시스템에 있는 석영관(quartz tube)의 중심에 위치하는 세라믹 보트(ceramic boat)에 로딩시켰다. 반응 전에, Ar 가스를 유속 800 sccm로 5분간 적용하여 석영관을 세척하여 막혀있는 주위의 공기를 제거하였다. 지속적으로 Ar 가스를 흘리면서 550℃까지 가열하여 증류시켰다. Si(100) 기판(웨이퍼) (WRS materials)을 상기 가열로의 끝부분(하류)에 위치시켰다.
반응 동안, 가열로 중심의 튜브에 위치하는 ZnPc 분말 및 페노티아진을 550 ℃에서 증류시키고, Ar 가스를 이용하여 ZnPc 증기 및 페노티아진 증기를 상기 Si 웨이퍼가 위치하는 하류쪽으로 이동시켰다. 기판의 온도가 자연적으로 180 ℃보다 낮기 때문에, ZnPc 증기는 Si 웨이퍼 상에서 응축되고, 이로부터 1차원 ZnPc 나노와이어/페노티아진 복합체가 성장된다. ZnPc 나노와이어/페노티아진 복합체를 성장시키기 위하여 40분간 반응을 지속시킨 후, Ar 가스를 흘려주면서 얻어진 샘플을 실온으로 냉각시켰다.
도 31에 페노티아진의 분자구조(a); 실리콘 기판 위에 증기-응축-재결정법(VCR)으로 제조된 페노티아진 나노와이어 사진, 나노와이어 구조체의 광학현미경 이미지 및 형광현미경 이미지(b); 증기-응축-재결정 합성 방법의 개요 및 실리콘 기판 위에 합성된 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체 사진(c)을 나타내었다.
도31에 나타난 바와 같이, 도 31(c)에서는 합성된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체가 파란색을 나타내었으며, 도 31(b)에서는 페노티아진 나노와이어가 흰색으로 나타나 서로 다른 색을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 5: 알파(α)-형태의 아연- 프탈로시아닌 나노와이어 /페노티아진 복합체의 구조 변화 분석
기판 위에서 위치에 따라 색이 다르게 나타나는 복합체의 구조 변화 여부의 확인을 위해 SEM(scanning electron microscope)을 이용하였다. SEM의 결과는 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타난 바와 같이, 아연-프탈로시아닌/페노티아진 복합체는 나노와이어의 형태를 가진 것을 확인하였으며, C위치에서만 나노와이어와 이차원 형태의 구조체가 동시에 생성되었음을 확인하였다.
실험예 6: 알파(α)-형태의 아연- 프탈로시아닌 나노와이어 /페노티아진 복합체의 형광 확인
상기 실시예 2에서 제조된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체에서 나노와이어를 가지는 부분만을 증류수에 넣고 초음파 처리하여 용액을 제조하였다. 또한, 페노티아진에서 확인된 형광을 복합체에서도 확인할 수 있는지에 대해, 페노티아진 나노와이어, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, 및 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체 용액에 자외선을 조사하여 실험하였다. 365nm 파장의 빛을 쬐었을 때 나타나는 각 용액의 형광사진(a)과 340nm 파장에서의 페노티아진 나노와이어, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어, 및 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체 용액의 형광 스펙트럼(b)을 도 33에 나타내었다.
도 33(a)에 나타난 바와 같이, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체 용액에서는 형광이 나타난 반면, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어에서는 형광이 관찰되지 않음을 확인하였다.
또한, 도 33(b)에 나타난 바와 같이, 340nm의 파장을 세 용액에 조사하였을 때 나타나는 형광 스펙트럼을 통해 페노티아진과 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 경우만 450nm에서 형광 피크를 확인하였다.
상기한 바와 같이, VCR 과정에 의하여 ZnPc 분말로부터 성장한 1차원 ZnPc 나노와이어는 α-형 결정 구조를 가지며 증진된 수용해도를 나타낸다. 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 증진된 수용해도는 수소 결합 (물의 H와 N과의 결합)과 물과 Zn(II)와의 배위결합을 통하여 베타(β)-형태의 ZnPc 분말보다 증진된 물과 ZnPc 간의 상호작용 기회를 제공하는 알파(α)-형태의 ZnPc 나노와이어의 결정 구조에 기여한다. 기존의 ZnPc 광민감제는 PD 물성만 갖는 반면, KB 암세포에 대한 in vitro 및 in vivo 광치료 실험 결과 암세포의 성공적인 제거를 보여준 ZnPc 나노와이어는 PD 물성 이외에도 PT 물성도 함께 나타낸다.
이로써, ZnPc 광민감제 분말이 나노와이어로 구조화됨으로써 수용해도가 낮다는 본질적인 문제를 해결할 수 있고, PD 및 PT 이중 효과를 위한 물성을 증진시킬 수 있음을 입증하였다.
또한, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 제조함으로써, 형광을 가지지 못하여 이미징 시스템의 도입이 어려운 단점을 극복하여, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 광역학 치료제로 이용하여 하나의 물질로 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있을 것이다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 제시한다.
제제예 1: 산제의 제조
알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 또는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체 200mg
유당 100mg
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충전하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 200mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아르산 마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캡슐제의 제조
알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 200mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아르산 마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어 200mg
만니톨 100mg
Na2HPO4ㆍ12H2O 2mg
주사용 멸균 증류수 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분을 혼합하여 주사제를 제조하였다.

Claims (13)

  1. (a) 불활성 기체 분위기 하에 아연-프탈로시아닌(Zinc phthalocyanine, ZnPc)을 500 내지 1000℃로 가열하여 증발시켜 ZnPc 증기를 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계에서 생성된 아연-프탈로시아닌 증기를 불활성 기체 분위기 하에서 상온 내지 115℃로 Si(100) 기판 상에서 응축하고 재결정화하여 하기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어를 얻는 단계;
    를 포함하며, 지름이 50 내지 100nm이고, 길이가 1 내지 10μm인 것을 특징으로 하는 수용해도 및 수분산성이 향상된 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 제조 방법.
    [화학식1]
    Figure 112013068895228-pat00002
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 재결정 이후 초음파 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어의 제조 방법.
  3. 수용해도 및 수분산성이 향상된, 하기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체.
    [화학식1]
    Figure 112013068895228-pat00003
  4. (a') 불활성 기체 분위기 하에 아연-프탈로시아닌(Zinc phthalocyanine, ZnPc) 및 페노티아진을 500 내지 1000℃로 가열하여 증발시켜 ZnPc 및 페노티아진 증기를 생성하는 단계; 및
    (b') 상기 (a')단계에서 생성된 아연-프탈로시아닌 및 페노티아진 증기를 불활성 기체 분위기 하에서 상온 내지 300℃로 응축하고 재결정화하여 하기 화학식 1로 표시되는 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 얻는 단계;
    를 포함하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 제조 방법.
    [화학식1]
    Figure 112013068895228-pat00004
  5. 제4항에 있어서, 상기 (b')단계에서 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 기판 상에서 응축 및 재결정화된 것을 특징으로 하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 기판의 온도는 상온 내지 180℃인 것을 특징으로 하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 불활성 기체는 질소, 아르곤 또는 헬륨인 것을 특징으로 하는, 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제3항의 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 포함하는 광민감제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 물에 100 내지 140mg/L의 농도로 용해된 수용액 상태인 것을 특징으로 하는, 광민감제.
  11. 제3항의 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 구강편평세포암, 피부암, 유방암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 전립선암, 신장암, 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 알파(α)-형태의 아연-프탈로시아닌 나노와이어/페노티아진 복합체는 물에 100 내지 140mg/L의 농도로 용해된 수용액 상태인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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