KR101352823B1 - 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법 및 이를 함유한 피부노화 치료 및 예방 및 피부 보호용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법 및 이를 함유한 피부노화 치료 및 예방 및 피부 보호용 조성물에 관한 것이다.

Description

강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법 및 이를 함유한 피부노화 치료 및 예방 및 피부 보호용 조성물 {A Method for Preparing functional of Extract Morinda citrifolia, Noni and the composition comprising the same having potent skin-protecting activity and showing potent treating or preventing skin aging}

본 발명은 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법 및 이를 함유한 피부노화 치료 및 예방 및 피부 보호용 조성물에 관한 것이다.

1) Singh, Y., Ikahihifo, T., Panuve, M., Slatter, C., Folk medicine in Tonga. A study on the use of herbal medicines for obsteric and gynacological conditions and disoders. J. Ethnopharm 1984, 12, 305-325

2) Bruggnecate, J.T., Native plants can heal your wounds. Honolulu Star - Bulletin Local News 1992, Feb.2

3) Saleem, Muhammad; Kim, Hyoung Ja; Ali, Muhammad Shaiq; Lee, Yong Sup (2005). "An update on bioactive plant lignans". Natural Product Reports 22 (6): 696.

4) Deng, Shixin; Palu, ‘Afa K.; West, Brett J.; Su, Chen X.; Zhou, Bing-Nan; Jensen, Jarakae C. (2007). "Lipoxygenase Inhibitory Constituents of the Fruits of Noni (Morindacitrifolia) Collected in Tahiti". Journal of Natural Products 70 (5): 85962.

5) Lin, Chwan Fwu; Ni, Ching Li; Huang, Yu Ling; Sheu, Shuenn Jyi; Chen, Chien Chih (2007). "Lignans and anthraquinones from the fruits ofMorinda citrifolia". Natural Product Research 21 (13): 1199204.

6) Levand, Oscar; Larson, Harold (2009). "Some Chemical Constituents of Morinda citrifolia". Planta Medica 36 (06): 1867.

7) Mohd Zin, Z.; Abdul Hamid, A.; Osman, A.; Saari, N.; Misran, A. (2007). "Isolation and Identification of Antioxidative Compound from Fruit of Mengkudu (Morinda citrifoliaL.)". International Journal of Food Properties 10 (2): 36373.

8) Ichihashi, M., M. Ueda, A., Budiyanto, T., Bito, M., Oka, M., Fukunaga, K., Tsuru and T, Horikawa, UV-induced skin damage, Toxicology , 2003, 189, 21-39

9) Matsumura Y., Toxic effects of ultraviolet radiation on the skin, Toxicol Appl Pharmacol , 2004, 195, 298-308

10) Jemal, A., F.Bray, M.M.Center, J, Ferlay, E., Ward and D.Forman, Global cancer statistics, CA Cancer J. Clin ., 2011, 61, 69-90

11) Kulms D., Zeise E., Poppelmann B et al., DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way, Oncogene , 2002, 21, 5844-5851

12) H.C. Bae, H.J. Ryu, S.H. Jeong, E.Y. Lee, Y.H. Park, K.G. Lee, B.H. Choi, E.H. Maeng, M.K. Kim and S.W. Son, Oxidative stress and apoptosis induced by ZnO nanoparticles in HaCaT cells, Mol . Cell Toxicol . 2011, 7, 333-337

13) Chen H.Y., Lin Y.C., Hsieh C.L., Evaluation of antioxidant activity of aqueous extract of some selected nutraceutical herbs, Food Chem., 2007, 104, 1418-1424

14) R. Wilson, R.E. Spier, Biochemistry of hybridoma technology, Dev Biol Stand , 1987, 66, 161-167

15) A. Balogh, G. Paragh, A. Juhasz, T. Kobling, E. Remenyik, Reference genes for quantitiative real time PCR in UVB irradiated keratinocytes, J Photochem . and Photobiol . B: Biology, 2008, 93(3), 133-139

16) R. Wilson, R.E. Spier, Biochemistry of hybridoma technology, Dev Biol Stand , 1987, 66, 161-167

17) C.P. LeBel, H. Ischiropoulos, S.C. Bondy, Evaluation of the probe 2′,7′-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress, Chem Res Toxicol, 1992, 5, 227-231

18) Kang-Beonm K., Su-Jin Y., Do-Gon R., Byung-Hyun P., Induction of apoptosis by diallyl disulfide through activation of caspase-3 in human leukemia HL-60 cells, Biochem Pharmacol ., 2002, 63(1), 41-47

19) Mrinal K., Sarkar, Parames C., Prevention of teriary butyl hydroperoxide induced oxidative impairment and cell death by a novel antioxidant protein molecule isolated from the herb, Phyllanthus niruri, Toxicol . in vitro , 2010, 24(6), 1711-1719

20) M. Motomura, Kyung Min K., Seok-Jong S., Young-Choon L., Cheorl-Ho K., Propolis induces cell cycle arrest and apoptosis in human leukemic U937 cells through Bcl-2/Bax regulation, Environmental Toxicol and Pharmacol ., 2008, 26(1), 61-67

21)F. Thayyullathil, S. Chathoth, A. Hago, M. Patel, S. Galadari, Rapid reactive oxygen species (ROS) generation induced by curcumin leads to caspase-dependent and -independent apoptosis in L929 cells, Free Radic . Biol . (2008), pp. 1403-1412

22) H. Takahashi, N. Aoki, S. Nakamura, H. Iizuka, Cornified cell envelope formation is distinct from apoptosis in epidermal keratincytes, J Dermatol . Sci ., 2000, 23(3), 161-169

23) K. Nys, H. Maes, G. Andrei, R. Snoeck, M. Garmyn, P. Agostinis, Skin mild hypoxia enhances killing of UVB-damaged keratinocytes through reactive oxygen species-mediated apoptosis requiring Noxa and Bim, Free radical Biol . and Medicine, 2012, 52(6), 1111-1120

24) S. Lombardi Borgia, M. Regehly, R. Sivaramakrishnan, W. Mehnert, M. Schafer-Korting, Lipid nanoparticles for skin penetration enhancement-correlation to drug localization within the particle matrix as determined by fluorescence and parelectric spectroscopy, J controlled release, 2005, 110, 151-163

25) F. Afaq, N. Ahmad, H. Mukhtar, Suppression of UVB-induced phosphorylation of mitogen-activated protein kinases and nuclear factor kappa B by green tea polyphenol in SKH-1 hairless mice, Oncogene , 2003, 22, 9254-9264

모든 문화권의 민간요법에 나온 천연물들은 한 세기 동안 전 세계 도처에서 오랫동안 사용되어져 왔다. 많은 과학자들은 많은 나라에서 인정한 이런 치료약의 건강상의 이익과 같은 분야에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 폴리네시안의 조상에 의해 밝혀진 많은 약용식물 중 노니 (Morinda citrifolia, Noni)는 지난 2000년 이상 폴리네시아에서 사용되어져 온 민간요법에 나온 약용식물중 하나이다. 노니는 치료적인 측면과 영양적인 측면을 가지는 식물로 다양하고 넓은 범위로 보고되었다.(Singh, Y., Ikahihifo, T., Panuve, M., Slatter, C., Folk medicine in Tonga. A study on the use of herbal medicines for obsteric and gynacological conditions and disoders. J. Ethnopharm 1984, 12, 305-325)

식용과 치료적 기능을 가진 열대식물인 노니 폴리네시안의 조상들이 노니를 음식과 치료제로써 믿고 2000년 전 동남아시아로부터 이주해올 때 노니를 함께 가지고 왔다. 노니의 원산지는 동남아시아에서 호주로 이동하였으며, 이후 폴리네시아, 인도의 카리브해 지역, 남아메리카의 북부지방과 중부지방에서 재배되었다. 노니는 항산화효과, 항염증효과, 암, 전염병, 천식, 당뇨병, 천식, 고혈압과 통증과 같이 다양한 범위에서 건강상의 이익가진 것으로 보고되었다. 폴리네시안들은 노니를 치료제와 전통의상의 염료로 활용하였다. 노니식물의 뿌리, 줄기, 나무껍질, 잎, 꽃 그리고 열매는 한방치료제로써 40 가지 이상의 다양한 조합을 가지고 있다.(Bruggnecate, J.T., Native plants can heal your wounds. Honolulu Star-Bulletin Local News 1992, Feb.2)

음식으로써의 노니열매 사용은 열대지방에서 오랜 역사를 가지고 있다. 또한 노니열매의 소비량에 대한 공식적인 문서에서는 노니열매가 20세기를 이끄는 음식으로 보고되었다. 런던에서 1866년 발행된 출판물에서는 노니열매가 피지제도에서 음식으로 소비되어진다고 설명되었다. 이후 이 출판물은 태평양제도, 동남아시아, 호주 그리고 인도에서 음식으로써의 노니열매에 대한 사용에 대해 기술하였다. 사모아 제도에서는 적정한 가격, 버마지역에서는 카레와 함께 요리하였고 태평양제도의 먹을수 있는 식물과 독이 있는 식물에 관한 기술적 매뉴얼에서 노니열매는 식용가능한 식물로 설명되어져 있으며 잎과 열매는 비상식으로 사용되어 질 수 있다고 설명되었다. 또한 Abbott는 노니가 음식과 음료, 치료제, 염료로 사용되어져 왔다고 보고하였다. 배당체(Glycosides), 다당류(polysaccharides), 이리도이드(iridoids), 알칼로이드(alkaloids), 리그난(lignans), 트리사카리드 지방산에스테르(trisaccharide fatty acid esters), 안쓰라퀴논(anthraquinones), 스코폴레틴(scopoletin), 모린딘(morindin), 비타민(vitamins) 그리고 미네랄(mineral)과 같은 생물학적 복합물은 노니 열매, 뿌리 그리고 잎으로부터 분리되어진다.(Saleem, Muhammad; Kim, Hyoung Ja; Ali, Muhammad Shaiq; Lee, Yong Sup (2005). "An update on bioactive plant lignans". Natural Product Reports 22 (6): 696; Deng, Shixin; Palu, ‘Afa K.; West, Brett J.; Su, Chen X.; Zhou, Bing-Nan; Jensen, Jarakae C. (2007). "Lipoxygenase Inhibitory Constituents of the Fruits of Noni (Morindacitrifolia) Collected in Tahiti". Journal of Natural Products 70 (5): 85962; Lin, Chwan Fwu; Ni, Ching Li; Huang, Yu Ling; Sheu, Shuenn Jyi; Chen, Chien Chih (2007). "Lignans and anthraquinones from the fruits ofMorinda citrifolia". Natural Product Research 21 (13): 1199204; Levand, Oscar; Larson, Harold (2009). "Some Chemical Constituents of Morinda citrifolia". Planta Medica 36 (06): 1867; Mohd Zin, Z.; Abdul Hamid, A.; Osman, A.; Saari, N.; Misran, A. (2007). "Isolation and Identification of Antioxidative Compound from Fruit of Mengkudu (Morinda citrifoliaL.)". International Journal of Food Properties 10 (2): 36373).

노니쥬스와 열매의 주요성분은 안전하게 수백년 동안 전세계에서 소비되어진다. 치료와 관련된 역사와 과학적인 연구는 노니의 건강상의 이익을 가져온다는 폴리네시아의 주장을 확인시켜주는데 원동력이 되었다.

대부분의 사람의 몸은 피부로 덮혀 있으며, 이것은 UV 조사와 같은 외부로부터 오는 스트레스로부터 내부장기를 보호한다. 태양의 자외선 복사는 사람에서 종양의 상태로 자주 진단되는 비흑색종피부 발달의 원인을 밝히는 중요한 요소이다. 지구의 태양의 자외선 스펙트럼은 UVA (320-400nm), UVB (280-320nm), UVC (200-280nm)로 구분되어 질 수 있다. UVB 구역대의 파장대는 피부의 표피 속으로 흡수되며 세포의 화상(sunburn), apoptosis (세포자살) 그리고 피부암과 같은 피부질병을 야기시킨다.(Ichihashi, M., M. Ueda, A., Budiyanto, T., Bito, M., Oka, M., Fukunaga, K., Tsuru and T, Horikawa, UV-induced skin damage, Toxicology , 2003, 189, 21-39).

UVB로 유도된 세포자살은 염색사 응축, 핵의 분열, 세포질의 수축 그리고 무손상 세포기관을 포함하는 세포자멸사체의 배출과 같은 형태학적인 변화를 나타낸다.(Matsumura Y., Toxic effects of ultraviolet radiation on the skin, Toxicol Appl Pharmacol , 2004, 195, 298-308; Jemal, A., F.Bray, M.M.Center, J, Ferlay, E., Ward and D.Forman, Global cancer statistics, CA Cancer J. Clin ., 2011, 61, 69-90)

카스파제(Caspase) 활성을 통한 세포 사멸에는 두 가지 경로가 있다. 외재적 경로는 세포막의 사멸 수용체의 삼량체가 fas-associated death domain과 procaspase-8을 끌고 옴으로써 death-inducing signaling complex (DISC)를 형성하고, DISC에 의한 procaspase-8의 활성화는 뒤이은 procaspaseemf의 활성을 유도한다. 내부적 경로는 미토콘드리아로부터 세포질로 cytochrome c의 발산에 의한 세포사멸 신호에 의해 유도된다. Procaspase-8의 활성은 세포질의 cytochrome c, Apaf-1, dATP, procaspase-9이 결합된 apoptosome에 의해 일어난다. 두 가지 경로를 통한 이러한 초기 caspase들 (caspase-8, caspase-9)은 다양한 세포 사멸 기질을 자르고 최종적으로 세포사멸을 유도하는 caspase-3와 같은 작동체 caspase들을 활성화 시킨다. 13개의 aspartate 특이적인 cysteine 단백질분해효소들은 세포사멸 프로그램을 실행시키는데 있어 중추적 역할을 하고 있으며 caspase-3는 이 그룹에 속해있다. 이러한 caspase-3는 세포사멸동안 PARP를 자르는데 주된 역할을 한다. Caspase-3가 PARP를 자르는 단백질 서열은 다양한 종의 PARP들 안에서 보존되어 있고, 이는 세포사멸에서 PARP 절단의 중요성을 시사한다. UVB에 의한 세포사멸은 DNA 손상, 세포사멸 수용체의 활성화, 그리고 활성산소(ROS)의 생산에 의해 매개된다고 알려져 있다 (Kulms D., Zeise E., Poppelmann B et al., DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way, Oncogene , 2002, 21, 5844-5851).

자외선은 피부에서 일중항산소와 과산화물 음이온과 같은 활성산소의 형성을 유도한다. 특히, 효소가 관여 혹은 관여하지 않는 항산화제들에의 노출이 UVB에 의해 유도되는 케라티노사이트의 세포사멸을 감소시킨다는 많은 증거들에 있고, 이에 UVB 신호 전달 경로에서 ROS가 중요하다는 것을 알 수 있다. ROS는 DNA와 단백질 둘 다 분해하는 작용을 가지고 있다. ROS에 의한 미토콘드리아 다공의 산화는 미토콘드리아 막의 포텐셜 붕괴로 인해 cytochrome c가 방출되는 하나의 원인이 될 수 있다. 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c는 직접 또는 간접적으로 ROS 활성에 영향을 미친다.(H.C. Bae, H.J. Ryu, S.H. Jeong, E.Y. Lee, Y.H. Park, K.G. Lee, B.H. Choi, E.H. Maeng, M.K. Kim and S.W. Son, Oxidative stress and apoptosis induced by ZnO nanoparticles in HaCaT cells, Mol . Cell Toxicol . 2011, 7, 333-337).

본 연구에서는 폐기될 수 있는 노니 잔사를 재활용하고자 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법을 개발하고 이 추출물이 UVB 유도 세포 사멸 저해효과실험을 통한 높은 세포생존율을 나타냈으며 (실험예 1), UVB에 의한 손상(damage) 회복 및 높은 세포 증식효과, UVB 조사로 생성되는 ROS량을 감소효과를 나타냈으며(실험예 2); 세포사멸 최종 신호(apoptosis final signal)인 잘라진(cleaved) caspase-3의 발현 및 잘라진 PARP 발현 감소효과를 통한 세포사멸 억제효과, 초기 세포사멸체의 양 감소효과, UVB에 유도된 HaCaT cells 내에 발생하는 세포사멸의 발생률 억제 효과, 세포사멸(Apoptosis)의 한 과정인 DNA 단편화 발생이 감소효과, (실험예 3); 추출물 시료를 함유한 화장료 조성물에 대한 동물실험 모델에서의 피부침투 효과(실험예 4) 및 이 조성물의 잘라진(cleaved) caspase-3의 발현 및 잘라진 PARP 발현 감소효과를 통한 세포사멸 억제효과 등을 (실험예 5), 통하여 본 발명의 노니잔사 추출물이 사람각질형성세포가 받는 손상보호 활성, 세포증식효과, 및 UVB로 인한 세포사 발생 억제, 세포사멸체 발생 저해 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세척한 노니열매를 배럴(barrel)에 포장하여 아미노산의 양을 증가시키기 위해 1 내지 12개월, 바람직하게는 2 내지 6개월 동안 상온에서 숙성시켜 숙성된 노니 열매를 제조하는 제 1단계; 제 1단계의 숙성된 노니 열매를 압착 추출하고 여과하여 수용성 노니쥬스 및 남은 노니 잔사를 수득하는 제 2단계; 제 2단계의 노니 잔사를 추출용매로 추출하여 노니 잔사 추출물을 수득하는 제 3단계 공정을 포함하는 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 제조하는 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법의 제 1단계에서, 상기 노니는 미국산, 필리핀산, 인도산(India), 바르바도스산(Barbados), 인도네시아산(Indonesia), 말레이시아산(Malaysia), 발리산(Bali), 자바산(Java) 등, 바람직하게는 필리핀산의 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia, Noni), nunaakai (Tamil Nadu, India), dog dumpling (Barbados), mengkudu (Indonesia 및 Malaysia), apatot (Philippines), kumudu (Bali), pace (Java), beach mulberry, cheese fruit 또는 noni (하와이산). 바람직하게는 필리핀산의 모린다 시트리폴리아(Morinda citrifolia, Noni)을 포함함을 특징으로 한다.

상기 제조방법의 제 3단계에서, 상기 추출은 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법, 속슬렛(Soxhlet) 추출법 또는 초음파 추출법 등의 추출방법, 바람직하게는 초음파 추출법, 보다 바람직하게는, 실온 및 암실 상태에서 초음파추출법으로 1 내지 72시간, 바람직하게는, 12시간 내지 48시간 동안 침지 및 추출함을 특징으로 한다.

상기 제조방법의 제 3단계에서, 상기 추출용매는 시료 중량의 0.5 내지 100배(v/w), 바람직하게는 1 내지 40배 부피(v/w)의 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 핵산, 에칠에테르, 에틸아세테이트, 시클로헥산, 디메틸설폭사이드(DMSO), 클로로포름, 또는 메틸렌 클로라이드로부터 선택된 단독용매 또는 하나 이상의 혼합용매, 바람직하게는 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올로부터 선택된 단독용매 또는 하나 이상의 혼합용매, 보다 바람직하게는, 물 및 에탄올의 혼합용매, 보다 더 바람직하게는, 50 내지 90% 물 및 에탄올의 혼합용매를 사용함을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 치료 또는 예방 및 피부 보호용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 "피부노화"는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 피부암, 건조 피부염, 소양증, 감염성 피부질환, 또는 피부궤양, 바람직하게는, 자외선에 의한 피부 손상을 포함한다.

상기 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 개선 또는 예방 용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

또한, 본 발명의 노니는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 식품으로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 피부 보호 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

상기 제조방법으로 제조된 노니잔사 추출물이 UVB 유도 세포 사멸 저해효과실험을 통한 높은 세포생존율을 나타냈으며 (실험예 1), UVB에 의한 손상(damage) 회복 및 높은 세포 증식효과, UVB 조사로 생성되는 ROS량을 감소효과를 나타냈으며(실험예 2); 세포사멸 최종 신호(apoptosis final signal)인 잘라진(cleaved) caspase-3의 발현 및 잘라진 PARP 발현 감소효과를 통한 세포사멸 억제효과, 초기 세포사멸체의 양 감소효과, UVB에 유도된 HaCaT cells 내에 발생하는 세포사멸의 발생률 억제 효과, 세포사멸(Apoptosis)의 한 과정인 DNA 단편화 발생이 감소효과, (실험예 3); 추출물 시료를 함유한 화장료 조성물에 대한 동물실험 모델에서의 피부침투 효과(실험예 4) 및 이 조성물의 잘라진(cleaved) caspase-3의 발현 및 잘라진 PARP 발현 감소효과를 통한 세포사멸 억제효과 등을 (실험예 5) 확인하여, 본 발명의 노니잔산 추출물이 사람각질형성세포가 받는 손상보호 활성, 세포증식효과, 및 UVB로 인한 세포사 발생 억제, 세포사멸체 발생 저해 활성을 나타냄을 확인하는 바, 피부노화 치료 또는 예방 및 피부보호용 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본 발명의 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 피부보호 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 폐기될 수 있는 노니 잔사를 재활용이 가능하며, 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 제공하며, 상기 추출물은 사람각질형성세포가 받는 손상보호 활성, 세포증식효과, 및 UVB로 인한 세포사가 발생 억제, 세포사멸체 발생 저해 활성을 나타냄을 확인하여, 피부노화 및 피부보호용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 노니 잔사 추출물(NP)을 분리하는 과정을 나타낸 도이며;
도 2은 HaCaT (인간 각질형성세포: human keratinocyte) 세포 생존율에 NP의 미치는 영향을 나타낸 도이며(MTT 어세이를 다양한 농도의 NP (100, 500 μg/㎖)로 처치한 HaCaT cells의 세포 생존율을 측정하기 위하여 수행하고, 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: Residues of Noni Juice extracts), "*" 는 P < 0.05 이고 "NS" 는 비처치 대조군재비 통계적으로 유의적이지 않음을 의미함);
도 3은 HaCaT (인간 각질형성세포: human keratinocyte) 세포 생존율에 UVB조사의 미치는 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 6시간 배양후, 쉠 조사(sham irradiated) 또는 서로 다른 시간, 즉, 10, 30, 60 sec 동안 UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 24시간 후에 부유(floating) 및 부착(adherent)세포를 회수하고 MTT 어세이를 UVB로 처치한 HaCaT cells의 세포 생존율을 측정하기 위하여 수행하고, 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: Residues of Noni Juice extracts이며, "**"는 P < 0.001 을 의미함);
도 4은 UVB조사된 HaCaT (인간 각질형성세포: human keratinocyte) 세포 생존율에 NP의 미치는 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 30초간 쉠 조사(sham irradiated) 또는 UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, HaCaT세포를 여러 농도로 처치한 후에 6시간 배양하고 24시간 후에, 부유(floating) 및 부착(adherent)세포를 회수하고 MTT 어세이를 UVB로 처치한 HaCaT cells의 세포 생존율을 측정하기 위하여 수행하고, 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: Residues of Noni Juice extracts), "**"는 P < 0.001 을 의미함);
도 5은 NP 처치된 HaCaT (인간 각질형성세포: human keratinocyte)에서 UVB-유도 ROS의 DCFH-DA 탐지를 나타낸 도이며 (모든 화살은 ROS 형성의 핵 국소화를 의미하고 발광 현미경에서 x100배로 확대하고 A: 대조군으로 UVB 비처치, B: 30초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군, C: NP 50 μg/㎖와 같이 UVB처치군, D: NP 100 μg/㎖와 같이 UVB처치군, E: NP 250 μg/㎖와 같이 UVB처치군, F: NP 500 μg/㎖와 같이 UVB처치군, (NP: Residues of Noni Juice extracts이며, DCFH-DA: 2,7-dichlorofluorescin diacetate을 의미함);
도 6은 NP 처치된 HaCaT (인간 각질형성세포: human keratinocyte)에서 UVB-유도 ROS의 DCFH-DA 탐지%를 나타낸 도이며 (6 웰 플레이트에서 배양한 HaCaT 세포를 60초간 UVB (200mJ/cm²) 로 조사하고 다양한 농도의 NP((50, 100, 250, 500 μg/㎖)로 처치하고 6시간 배양후에, ROS 형성을 발광 현미경으로 측정하고 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: (Residues of Noni Juice extracts)이고, DCFH-DA: 2,7-dichlorofluorescin diacetate이며, "**"는 P < 0.001 을 의미함);
도 7은 HaCaT 세포에서 Caspase-3 단백질 깨짐(protein cleavage)에 대한 UVB의 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 동안 (10, 30, 60 sec) UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 조사후 6시간 동안 배양하고 용해물을 얻고 웨스턴 블롯법을 잘라진 카스파제-3에 사용하고 β-액틴의 발현을 적재된 대조군으로 표기함);
도 8은 HaCaT 세포에서 PARP 단백질 깨짐(protein cleavage)에 대한 UVB의 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 동안 (10, 30, 60 sec) UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 조사후 6시간 동안 배양하고 용해물을 얻고 웨스턴 블롯법을 잘라진 PARP에 사용하고 β-액틴의 발현을 적재된 대조군으로 표기하고, PARP: Poly (ADP-ribose) polymerase를 의미함);
도 9은 HaCaT 세포에서 Caspase-3 단백질 깨짐(protein cleavage)에 대한 NP의 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 30초간 UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 조사후 6시간 동안 배양하고 용해물을 얻고 웨스턴 블롯법을 다양한 농도 (100, 250, 500 μg/㎖) NP로 처치한 HaCaT 세포에 의하여 잘라진 카스파제-3에 사용하고 β-액틴의 발현을 적재된 대조군으로 표기함);
도 10은 UVB조사된 HaCaT 세포에서의 FACS 분석법 결과를 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 동안 (10, 30, 60 sec) UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 조사후 6시간 동안 배양하고 UVB 유도 세포사멸을 Annexin V 및 요오드 프로피딘(propidine iodine; PI) 염색후 FACS 분석으로 정량하고 생존세포는 Annexin V-/PI-이고 상기 Annexin V+/PI- 세포는 초기 세포사멸 과정이며, 상기 Annexin V+/PI+ 세포는 후기 세포사멸을 의미하며, Annexin V-/PI+ 는 괴사 세포를 의미하고 A: 대조군으로서 정상 HaCaT 세포, B: 10초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군, C: 30초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군, D: 60초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군으로 표기함);
도 11은 UVB조사에 유도된 세포사멸 세포의 %를 나타낸 도이며 (개개 처치군의 세포사멸 세포의 %를 나타내고, HaCaT 세포를 3쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 동안 (10, 30, 60 sec) UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 6시간 배양하고, 부유(floating) 및 부착(adherent)세포를 정해진 시간에 회수하고 유세포 분석기로 측정하고 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: (Residues of Noni Juice extracts)이고, "**"는 P < 0.001 을 의미하며, "NS" 는 비처치 대조군재비 통계적으로 유의적이지 않음을 의미함);
도 12은 UVB- 유도 세포사멸에 대한 NP의 영향을 나타낸 도이며 (HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 30초간 UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, 조사후 6시간 동안 배양하고 UVB 유도 세포사멸을 Annexin V 및 요오드 프로피딘(propidine iodine; PI) 염색후 FACS 분석으로 정량하고 생존세포는 Annexin V-/PI-이고 상기 Annexin V+/PI- 세포는 초기 세포사멸 과정이며, 상기 Annexin V+/PI+ 세포는 후기 세포사멸을 의미하며, Annexin V-/PI+ 는 괴사 세포를 의미하고 A: 30초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군, B: NP 100 μg/㎖ 처치 UVB 군, C: NP 250 μg/㎖ 처치 UVB군, D: NP 500 μg/㎖ 처치 UVB 군으로 표기함);
도 13은 NP 처치된 UVB조사에 유도된 세포사멸 세포의 %를 나타낸 도이며 (개개 처치군의 세포사멸 세포의 %를 나타내고, HaCaT 세포를 쉠 조사(sham irradiated) 또는 30초간 UVB (200mJ/cm²)로 조사하고, HaCaT 세포를 다양한 농도의 NP (100, 250, 500 μg/㎖)로 처치하고, 6시간 배양하고, 부유(floating) 및 부착(adherent)세포를 정해진 시간에 회수하고 유세포 분석기로 측정하고 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: (Residues of Noni Juice extracts)이고, "**"는 P < 0.001 을 의미함);
도 14은 UVB 조사(200mJ/cm², 30sec)하고 다양한 농도의 NP (100, 250, 500 μg/㎖)로 처치한 HaCaT 세포중 응집되고 절단된 밝은 세포사멸 세포물 및 세포의 현격한 감소를 나타내고 모든 이미지는 발광 현미경에 의하여 x100 확대한 것으로서 A: 대조군으로 비처치 UVB, B : 30초간 UVB (200mJ/cm²) 처치군, C : NP 50 μg/㎖ 처치 UVB 처치군, D : NP 100 μg/㎖ 처치 UVB 처치군, E : NP 250 μg/㎖ 처치 UVB 처치군, F : NP 500 μg/㎖ 처치 UVB 처치군을 의미함);
도 15은 다양한 농도의 NP (100, 250, 500 μg/㎖)로 처치한 UVB 유도 HaCaT 세포사멸을 나타낸 도이며 (DAPI로 염색된 세포 형상 및 크로마틴 응집을 형광 현미경으로 관찰하고 비처치 NP배양물은 대조군으로 지정하였으며, 데이터는 대표 실험의 3중치의 평균 표준 편차로 표시하고 NP: (Residues of Noni Juice extracts)이고, "*" 는 P < 0.05이고 "**"는 P < 0.001 을 의미함);
도 16은 UVB 유도 DNA 단편화에 대한 NP의 영향을 나타낸 도이며 (여기에서 추출된 DNA를 2% 아가로스 겔에 적재하고 호환적 브롬화 에티듐(alternative ethidium bromide)으로 염색하고 레인(Lanes) 1, 2, 3, 4 및 5 은 NP 0, 100, 250 및 500 μg/㎖이며 M: DNA Marker, NP : Residues of Noni Juice extracts을 의미함);
도 17은 무모 마우스 피부에서 절단된 카스파제-3의 영향을 나타낸 도이며 (군당 3마리로 구성된 각 군은 쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 (1, 2, 3 hr) 동안 UVB (360 mJ/cm²) 조사하고 동물들을 치사시키고 표피 단백질 용해물을 얻고 웹스턴 블롯법을 절단된 카스파제-3에 대해 수행하고 β-actin을 적재된 대조군으로 표시함);
도 18은 무모 마우스 피부에서 절단된 PARP의 영향을 나타낸 도이며 (군당 3마리로 구성된 각 군은 쉠 조사(sham irradiated) 또는 다양한 시간 (1, 2, 3 hr) 동안 UVB (360 mJ/cm²) 조사하고 동물들을 치사시키고 표피 단백질 용해물을 얻고 웹스턴 블롯법을 절단된 PARP에 대해 수행하고 β-actin을 적재된 대조군으로 표시함);
도 19은 무모 마우스 피부에서 절단된 카스파제-3 발현에 대한 MENP의 영향을 나타낸 도이며 (군당 3마리로 구성된 각 군은 쉠 조사(sham irradiated) 또는 3시간 동안 UVB (360 mJ/cm²) 조사하고 MENP를 처치하고, 동물들을 치사시키고 표피 단백질 용해물을 얻고 웹스턴 블롯법을 절단된 카스파제-3에 대해 수행하고 β-actin을 적재된 대조군으로 표시함);
도 20은 무모 마우스 피부에서 절단된 PARP 발현에 대한 MENP의 영향을 나타낸 도이다 (군당 3마리로 구성된 각 군은 쉠 조사(sham irradiated) 또는 3시간 동안 UVB (360 mJ/cm²) 조사하고 MENP를 처치하고, 동물들을 치사시키고 표피 단백질 용해물을 얻고 웹스턴 블롯법을 절단된 카스파제-3에 대해 수행하고 β-actin을 적재된 대조군으로 표시함).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 노니 쥬스 잔사 추출물의 제조(도 1 참조)

1-1. 노니 쥬스의 제조

본 연구에서 사용한 노니 (Morinda citrifolia , Noni) 재료는 회사(Direct Response 회사; 일본, 오키나와)로부터 제공받아 사용하였다. 노니열매는 필리핀의 다바오지역에서 수확 및 세척되었으며, 노니열매 하나하나 개별 선별작업을 통해 세척하였다. 이후 배럴에 포장되어 아미노산의 양을 증가시키기 위해 3개월 동안 상온에서 숙성시켰다.

숙성작업 이후 노니열매 1kg을 압착하여 노니 쥬스를 추출하여 약 500ml의 과즙 및 약 500g의 과즙의 잔사를 얻고 상기 과즙을 60mm 지름 mesh 여과기를 통해 여과한 후에, 과즙에 고형분과 같은 양의 덱스트린을 첨가한 쥬스를 스프레이 드라이 제법으로 분말화하여 수용성 분말 형태의 수용성 노니쥬스 분말 65g를 얻었으며 (이하, NE라 함) 이 수용성인 노니쥬스 파우더(NE)의 경우 물에 녹여 실험에 사용하였다.

1-2. 노니 쥬스 잔사추출물(1)의 제조

노니쥬스를 짜고 남은 잔여물은 도 1과 같은 순서로 추출하였다. 상기 1-1에서 얻은 노니쥬스 잔여물 500g을 담은 병에 1:10(v/v) 비율로 70% 에탄올을 채워 준비하였다. 추출물과 에탄올 혼합물은 실온 및 암실 상태에서 ultrasonic chamber (JAC, ultrasonic 4020, 한국)을 사용하여 24시간동안 침지 및 추출하였다. 이러한 과정을 3회 반복하였다. 3번의 추출을 통한 각 추출물은 하나로 합쳐 여과시키고 에탄올은 10L 갑압농축기 (EYELA, N-3000, 일본)와 진공펌프 사용하여 농축하였다. 농축하고 나온 노니쥬스 잔여물 90g(이하, NP라 함) 은 -80℃ 이하에서 동결건조기(Ilshin, 한국)를 통해 얻은 분체를 사용하고 이를 하기 실험예에 사용하였다.

실시예 2. 수율 측정

실험재료를 위해 노니쥬스 잔여물을 에탄올 70%으로 실온에서 3회에 걸쳐 추출하였다. 노니쥬스 잔여물의 추출을 통해 나온 추출물(NP)는 농축과 동결건조를 통해 파우더 상태로 만들어 사용하였으며, 노니쥬스 파우더(NE)는 바로 물에 용해시켜 본 실험에 사용하였다. 추출물의 수율은 추출물의 총 건조무게(g)를 시료로 사용한 건조무게(g)로 나눈 값에 100을 곱하여 백분율(Wt%)로 계산하였다. 표 1에서처럼 NP는 9.8%의 수율을 나타내었다.

NP 및 NE의 추출용매별 수율.

Sample	Solvent	Yields (Wt%)
Residues of Noni Juice extracts (NP)	70% Ethanol	9.8
Noni Juice (NE)	Water	6.5

실험예 1. 세포증식 증진 효과

상기 실시예에서 얻는 시료들의 UVB 유도 세포 사멸 저해효과를 통한 세포증식 증진효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Chen H.Y., Lin Y.C., Hsieh C.L., Evaluation of antioxidant activity of aqueous extract of some selected nutraceutical herbs, Food Chem., 2007, 104, 1418-1424; R. Wilson, R.E. Spier, Biochemistry of hybridoma technology, Dev Biol Stand , 1987, 66, 161-167).

1-1. 시약 및 항체

본 실험에 사용한 full-length PARP (46D11) 는 Cell signaling Technology (U.S.A.)에서 구입하였고 anticaspase-3 antibody H-277 (sc-7148)와 β-actin 는 Santa Cruz Biotechnology (U.S.A.). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco (USA)에 구입하여 사용하였다. APC-Annexin V Propidium iodide(PI)는 BD pharmigen (U.S.A.)에서 구입하였으며, 살아있는 세포내에서 ROS의 양을 측정하기 위해 image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (I36007) 는 Molecular Probes (U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 세포 및 배양조건

본 실험에 사용한 사람 각질형성세포인 HaCaT은 POSTECH.에서 분주받아 사용하였다. HaCaT은 1% penicilline/streptomycin와 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에 37 ℃, 5 % CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 실험과정에서 세포에 대한 모든 처리는 80∼90% confluency에서 수행하였다.

1-3. UVB 유도 세포 사멸 저해

인간 각질형성세포(human keratinocyte, HaCaT; POSTECH, normal keratinocyte)을 이용하여 MTT 어세이법을 하기와 같이 수행하였다.

NP에 대한 세포독성은 HaCaT cells에서 MTT assay를 통해 측정하였다. HaCaT cells은 NP를 24시간 동안 처리하였다. NP에 따른 HaCaT cells의 세포독성은 도 2와 같이 나타났다. NP는 100 μg/㎖에서 131.8% 이상, 500 μg/㎖에서 158.3% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. NP는 500 μg/㎖ 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았으며 NP를 처리하지 않은 control군(103.7%) 보다 NP를 처리한 HaCaT cells의 세포생존율(158.3%) 이 높게 나타났다.

1-4. UVB 조사에 의한 MTT 어세이법

UVB 조사에 따른 HaCaT cells의 세포독성은 도 3과 같이 나타났다. UVB (200 mJ/cm²)를 HaCaT cells에 각각 10, 30, 60초 조사시켰으며 24시간 이후 세포 생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다. 세포 생존율은 각각 10초에서 70.5%, 30초에서 61.7%, 60초에서 54.9%으로 UVB 조사시간이 증가함에 따라 UVB의 damage로 인해 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 2. 세포사멸 저해활성

상기 실시예에서 얻은 추출물 시료의 세포사멸저해 활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

2-1. UVB 조사

자외선 조사는 UVB lamp(UVP CL-1000, U.S.A.)를 사용하였으며, UVB 조사량은 UVX Radiometer (UVP CL-1000, U.S.A.)를 사용하여 광원을 측정한 후 사용하였다. 조사 시에는 세포 배양 용기에서 배지를 제거하고 Phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후 배양 용기의 크기에 따라 적당량의 PBS로 세포를 덮은 후 UVB(280-350nm) 200 mJ/㎠을 조사하였다. UVB 조사 후 PBS로 1회 세척한 후 샘플을 처리하였다(A. Balogh, G. Paragh, A. Juhasz, T. Kobling, E. Remenyik, Reference genes for quantitiative real time PCR in UVB irradiated keratinocytes, J Photochem . and Photobiol . B: Biology, 2008, 93(3), 133-139)

2-2. 세포생존율 어세이법 ( Keratinocyte , HaCaT )

96-well plate에 HaCaT를 2.5 x 10⁴ cell/well로 접종하여 24시간 배양하였다. DMSO와 NP를 처리한 실험군, UVB를 처리한 실험군으로 나누어 실험하였다. MTT 시약은 DMSO에 5mg/ml의 농도로 녹여 보관하였으며, MTT 시약 처리 후 세포는 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며 microplate reader (Infinite M200, Tecan Group, Switzerland)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 비교하였다(R. Wilson, R.E. Spier, Biochemistry of hybridoma technology, Dev Biol Stand, 1987, 66, 161-167)

2-3. 반응성 산소종 측정( Measurement of Reactive oxygen species ; ROS )

12-well plate에서 배양한 HaCaT 세포에 UVB를 조사한 후 시료를 처리한 다음 PBS로 두 번 세척하고 HBSS/Ca/Mg (Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium, Gibco, U.S.A.)에 20 μM DCFH-DA(10 mM H₂DCF-DA-stock solution in DMSO)를 처리하였다. 37℃와 어두운 조건에서 30분 동안 반응시킨 후 Axiovert 200M (ZEISS, Germany) 와 Axio vision v4.5 software를 사용하여 촬영(x100) 및 분석하였다 (C.P. LeBel, H. Ischiropoulos, S.C. Bondy, Evaluation of the probe 2′,7′-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress, Chem Res Toxicol, 1992, 5, 227231).

2-4. FACS 분석법

세포사멸 세포(Apoptotic cell)의 양을 측정하기 위해 HaCaT cell을 60㎜ dish에 배양하고 UVB를 조사시킨 후 NP를 농도별로 처리하였다. 6시간 이후 세포주를 파이펫팅(pippeting)하여 1 x 10⁶ cells/㎖만큼 시험관에 넣고 PBS로 washing한 후 상층액을 버리고 cell pellet에 binding buffer (10 mM Hepes/NaOH pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂)로 다시 파이펫팅을 하였다. 이후 FITC-conjugated annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmigen, 556547, U.S.A)와 propiium Ioddide(PI) (FITC annexin V kit 포함)를 넣고 암실에서 15분 동안 배양하여 염색 시킨 다음에 염색된 세포를 분석기 (flow cytometer; Fluorescence-activated cell sorting, FACS calibur;Becton-Dickinson)로 분석하고 소프트웨어(Cell Quest software)를 이용하여 apoptotic cell의 비율을 측정하였다(Kang-Beonm K., Su-Jin Y., Do-Gon R., Byung-Hyun P., Induction of apoptosis by diallyl disulfide through activation of caspase-3 in human leukemia HL-60 cells, Biochem Pharmacol., 2002, 63(1), 41-47).

2-5. Western blot analysis

100㎜ 배양 dish에서 배양한 HaCaT 세포를 UVB에 조사한 후 농도별 시료를 처리하고Phosphatase 저해제 (Phosphatase Inhibitor Cocktail, 78420 Thermo scientific, U.S.A) 가 첨가된 ice-cold PBS로 두 번 세척하였다. 그 다음 각 dish에 10x protease inhibitor cocktail을 9:1 비율로 만든 RIPA buffer (Radio immuno precipitation assay buffer, 25mM Tris-HCl, pH 7.2; 0.1% SDS; 1% Triton X-100; 1% sodium deoxycholate; 0.15 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF); 10 μg/㎖ aprotinin, 1 mM sodium orthovanadate; 5 μg/㎖ leupeptin)를 넣고 얼음 위에서 30분 동안 lysis한 후 cell scrapper로 cell을 모은 후에 12,000 rpm속도로 4℃에서 20분간 원심분리시켰다. 원심분리 후 상층액에 SDS-PAGE용 5x sample buffer를 넣고 100℃에서 5분간 가열하여 전기영동용 시료(sample)를 만들었다. 40 μg의 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 분리하였으며 막(nitrocellulose membrane)으로 분리된 단백질을 이동시켰다. 막은 5% skim-milk가 포함된 PBS-Tween (0.1%)로 blocking 하였으며 그 후 1차 항체(PARP, Cell signaling Technology, 46D11, U.S.A) Caspase-3(Santa Cruz Biotechnology, H-277 U.S.A)를 적당한 비율로 희석하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. PBS-Tween로 20분씩 3회 세척하고 난 후 2차 항체를 1: 5000으로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음에 PBS-Tween로 20분씩 3회 세척하였다. 키트(ECL detection kit, Amersham Life Sciences, U.S.A.)²⁴⁾을 사용하여 발광시키고 digital imaging system Alliance 4.7 (UVITEC Cambridge, UK)을 사용하여 사진으로 현상 및 분석하였다(Mrinal K., Sarkar, Parames C., Prevention of teriary butyl hydroperoxide induced oxidative impairment and cell death by a novel antioxidant protein molecule isolated from the herb, Phyllanthus niruri, Toxicol . in vitro , 2010, 24(6), 1711-1719).

2-6. DAPI 염색법

세포사멸 유발 여부 확인을 위해 UVB (200mJ/cm²)를 조사한 후 NP를 처리한 HaCaT cell을 6시간 이후 모은 다음에 1 x 10⁵ cells만큼 slide glass위에 5% paraformaldehyde로 10분간 고정하였다. 이후 PBS로 2∼3회 세척하고 PBS가 다 마르기 전에 0/2%의 Triton X-100을 첨가하여 상온에서 10분간 고정하였다.

그 후 PBS로 세척하고 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma. USA)용액을 세포가 고정된 슬라이드 글래스(slide glass) 위에 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단하고 상온에서 염색시켰다. 15분 정도 염색시킨 후, PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 증류수로 바로 세척한 다음에 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass위에 mounting solution (Molecular porbe Gold antifade reagent with DAPI, P36935, USA)을 처리한 후 형광 현미경 (Nikon ECLIPSE 80i & INTENSILIGHT C-HCFI, Japan)을 이용하여 NP 각 농도에 따른 HaCaT의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 사진 촬영을 하였다(M. Motomura, Kyung Min K., Seok-Jong S., Young-Choon L., Cheorl-Ho K., Propolis induces cell cycle arrest and apoptosis in human leukemic U937 cells through Bcl-2/Bax regulation, Environmental Toxicol and Pharmacol ., 2008, 26(1), 61-67).

2-7. DNA 단편화( fragmentation )

UVB를 조사시키고 NP를 처리한 세포주를 3 x 10⁶ cell만큼 모아 차가운 PBS로 세척하고 cell pellet을 70℃에 보관하였다. DNA를 분리하기 위해 0.5 ㎖ lysis buffer (50 mM Tris-HCl at pH 7.5, 10 mM EDTA at pH 8.0, 200 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5 mg/㎖ proteinase K)를 처리하고 30분 이상 얼음 위에 방치해 두었다. 4℃에서 10분동안 5,000 rpm으로 원심분리 시키고 상청액에 phenol을 넣어 10,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 단백질과 지질이 녹은 phenol층과 DNA가 있는 물층으로 분리하여 상층액만 떠내었다. 이 과정을 3회 정도 실시하고 마지막은 chloroform을 넣어 남아있는 phenol층을 녹인 후 DNA층만을 얻었다. 80% ethanol pellet로 헹구어 내고 5분간 14,000 rpm에서 원심 분리하여 배양기 (SA-MCO-18AIC, SANYO, Japan)에서 30분간 건조시켰다. 순수한 DNA만을 얻기 위해서 RNas가 포함된 TE solution(Life technologies, AM9849, U.S.A) 30㎕로 pellet을 용해시켜 RNA을 제거하였다. 37℃에서 incubator에 30분간 방치해둔 다음 SDS DNA loading buffer 3:1(sample:dye(Bio-rad, 166-0401EDU, U.S.A)비율로 섞은 후 2% agarose gel에서 80V로 전기영동시킨 후, 염색시약 (SYBR safe DNA gel stain; S33102, molecular probe, USA)로 염색하여 기기(UV illumination, Syngene GBOX Frederick, MD, USA)로 관찰하였다. (F. Thayyullathil, S. Chathoth, A. Hago, M. Patel, S. Galadari, Rapid reactive oxygen species (ROS) generation induced by curcumin leads to caspase-dependent and -independent apoptosis in L929 cells, Free Radic . Biol . (2008), pp. 14031412).

실험 결과

(1) NP의 세포 증식 촉진효과

UVB를 조사시킨 HaCaT cells에 대한 NP의 세포증식효과는 도 4과 같았다. UVB (200 mJ/cm²)를 조사시키지 않은 HaCaT cells에 비해 UVB (200 mJ/cm²)를 30초 동안 조사시킨 HaCaT cell의 세포증식률이 57.4%로 감소하였다. 이후 NP의 농도를 100, 250, 500 μg/㎖ 처리하고 6시간 이후의 세포 생존율(cell viability)는 60.1%, 67.3%, 및 79.3%로 각각 증가한 것으로 나타났다. NP가 UVB에 의한 손상(damage)를 회복시켜주는 것으로 보이며 세포 증식효과를 가진 것으로 확인하였다.

(2) ROS 소거능

본 실험에서는 NP가 UVB에 의해 생성되는 ROS 소거능을 DCFH-DA detection method를 통해 확인하였다. Confocal laser scanning microscopy로 확인한 결과, 도 5와 같았다. UVB를 (200mJ/cm²) 조사하지 않은 A에 비해 UVB만 30초 조사시킨 B의 ROS량은 증가한 것으로 나타났으며, UVB조사 이후 NP를 처리한 C, D, E, F는 NP의 농도가 증가함에 따라 ROS량의 감소를 나타내었다.

도 6에서처럼 UVB를 30초 동안 조사한 대조군(control)에 비해 NP를 50, 100, 250, 500 μg/㎖ 농도로 처리한 시료처치군(sample)은 각각 70.02%, 46.64%, 41.46% 그리고 37.38%로 농도의존적으로 ROS의 생성을 저해하는 것으로 나타났다. 따라서 NP가 UVB 조사로 생성되는 ROS량을 감소시키는 효과를 가진 것으로 확인하였다.

(3) Western blot analysis

(3-1) UVB 조사에 의해 잘라진 caspase -3 발현양 측정

잘라진 카스파제(Cleaved caspase)-3 형태(form)는 세포사멸(apotosis) 과정에서 PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase)의 파괴된 형태(cleavage form)을 활성화(activation) 시키고 활성화된 잘라진(activated cleaved) PARP 형태는 손상된 세포의 DNA의 재생(repair)를 저해한다. 따라서 세포사멸(apoptosis)를 유도하게 된다.(H. Takahashi, N. Aoki, S. Nakamura, H. Iizuka, Cornified cell envelope formation is distinct from apoptosis in epidermal keratincytes, J Dermatol . Sci ., 2000, 23(3), 161-169).

본 실험은 UVB에 유도된 세포사멸를 알아보기 위하여 UVB를 조사한 후 세포사멸 최종 신호(apoptosis final signal)인 잘라진(cleaved) caspase-3의 발현양을 확인하였다.

UVB (200mJ/cm²)를 HaCaT cell에 10, 30, 60 sec 동안 조사시킨 이후 western blotting으로 확인하였으며 액틴(actin)은 대조군(control)로 사용하였다.

결과는 도 7에서 처럼 UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 잘라진 카스파제-3의 발현이 나타나지 않았지만 UVB의 조사시간을 늘린 시료처치군에서는 잘라진 카스파제-3의 발현양이 증가하는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 UVB에 의해 유도된 apoptosis가 HaCaT cell에서 발생하는 것을 알 수 있었다.

(3-2) UVB 조사에 의해 잘라진 PARP 발현양 측정

PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase)는 DNA repair 기능과 programmed cell death와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. PARP의 활성에는 Caspase3가 관여하게 되는데 caspase3의 활성화된 form인 cleaved caspase3에 의해 PARP는 분절(Cleavage)하게 된다. 따라서 PARP가 분절(Cleavage)된 잘라진 PARP 으로 될 경우 이러한 PARP의 기능을 상실하게 되고 결국 apoptosis를 일으키게 된다. (K. Nys, H. Maes, G. Andrei, R. Snoeck, M. Garmyn, P. Agostinis, Skin mild hypoxia enhances killing of UVB-damaged keratinocytes through reactive oxygen species-mediated apoptosis requiring Noxa and Bim, Free radical Biol . and Medicine, 2012, 52(6), 1111-1120).

본 실험은 Apoptosis pathway 중 final signal인 Activated caspase-3의 cleaved caspase-3에 의하여 PARP의 잘라짐(cleavage)도 역시 증가하는지 확인하기 위해 UVB(200mJ/cm²)를 10, 30, 60초 동안 HaCaT cells에 조사하였으며, actin은 control로 사용하였다. 도 8와 같이 UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 잘라진 PARP의 발현이 나타나지 않았지만 UVB의 조사시간이 길어질수록 잘라진 PARP의 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 UVB에 의해 유도된 apoptosis가 HaCaT cell에서 발생하는 것을 알 수 있었다.

(3-3) UVB 조사에 의해 잘라진 caspase -3 발현양 측정

이전의 실험에서 UVB에 유도된 잘라진 카스파제(cleaved caspase)-3의 발현양이 증가하는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 NP가 UVB에 의해 유도된 cleaved caspase-3의 발현에 있어서 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 UVB 조사이후 NP를 처리하고 western blotting으로 통해 확인하였다.

UVB(200mJ/cm²)를 HaCaT cell에 30 sec 동안 조사시킨 이후 노니잔사(Residues of Noni Juice extracts; NP)를 100, 250, 500 μg/㎖ 처리하였고, Actin (abcam, ab6276, U.S.A)은 대조군(control)로 사용하였다.

도 9과 같이 UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 cleaved caspase-3가 발현되지 않았다. UVB를 30초간 조사한 후 NP를 처리하지 않은 시료처치군(sample)에서는 대조군에 비해 잘라진 caspase-3이 증가한 것을 확인 할 수 있었으며, UVB를 조사한 후 NP을 처리한 시료처치(sample)군에서는 NP의 농도가 증가 할수록 잘라진 caspase-3의 발현양이 감소하는 것을 확인하였다.

(3-4) UVB 조사에 의해 잘라진 PARP 발현양 측정

이전의 실험에서 UVB에 유도된 잘라진(cleaved) PARP의 발현양이 증가하는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 NP가 UVB에 유도된 잘라진 PARP의 발현에 있어서 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 UVB 조사이후 NP를 처리하고 western blotting으로 확인하였다

UVB(200mJ/cm²)를 HaCaT cell에 30 sec 동안 조사시킨 이후 NP를 100, 250, 500 μg/㎖ 처리하였고, Actin은 control로 사용하였다.

도 10와 같이 UVB를 조사하지 않은 대조군(control)에서는 잘라진 PARP가 발현되지 않았다. UVB를 30초간 조사한 후 NP를 처리하지 않은 시료처치군(sample)에서는 대조군에 비해 잘라진 PARP가 증가한 것을 확인할 수 있었으며 UVB 조사이후, NP를 처리한 시료처치군에서는 NP의 농도가 증가 할수록 잘라진 PARP의 발현양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

(3-5) FACS 분석법( analysis )

UVB-유도 세포사멸(induced Apoptosis)를 통해 생겨나는 세포사멸 세포체 (apoptotic cell)의 양을 확인하기 위하여 annexin-V/PI를 사용하여 유세포분석기(Flow cytometry)로 확인하였다.

도 11 내지 12과 같이 UVB(200mJ/cm²) 10, 30, 60 sec 동안 조사한 후 FACS 측정결과 각각 3.8%, 9.2%, 15.3%로 초기 세포사멸(early apoptosis)의 양이 증가하는 것을 확인하였다.

도 13 내지 14와 같이, 이후 모든 HaCaT cells에 UVB(200mJ/cm²)를 30 sec 동안 조사한 후 NP를 처리하였다. UVB를 30 sec 동안 조사하고 NP를 처리하지 않은 대조(control)군(9.7%)에 비해 NP를 100, 250, 500 μg/㎖ 처리한 시료처치(sample)군 각각 6.0%, 3.5%, 2.8%로 초기 세포사멸체의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

(3-6) DAPI staining

본 실험에서는 UVB를 조사 한 HaCaT에 NP를 처리하여 apoptosis를 확인한 결과, 도 15 와 같았다. UVB 조사 이후 NP를 100, 250, 500 μg/㎖씩 처리하였다. UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 5.5%로 형광 빛이 밝게 발광하는 세포가 많이 보이지 않았다. UVB(200mJ/cm²)를 30 sec 동안 조사하고 NP를 처리하지 않은 대조에 비해 각각 83.2%, 72.9%, 46.4% and 28.7%로 나타났으며, 농도 의존적으로 세포사멸이 적게 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 NP가 UVB에 유도된 HaCaT cells 내에 발생하는 세포사멸의 발생률을 억제하는 것으로 나타났다.

(3-7) DNA 단편화( fragmentation )

Apoptosis 가 진행되면 DNA 단편화가 일어나게 된다. 따라서 본 실험에서는 UVB로 유도된 apoptosis와 NP의 효과를 확인하기 위하여 DNA 단편화 어세이법(fragmentation assay)를 통해 확인하였다. 도 16에서처럼 UVB (200mJ/cm²)를 처리하지 않은 대조군은 DNA 단편화가 나타나지 않았다. UVB를 30 sec 동안 조사하고 NP를 처리하지 않은 시료처치군보다 UVB를 30 sec 동안 조사하고 NP를 100, 250, 500 μg/㎖을 처리한 sample이 DNA 단편화가 적게 나타났다. 따라서 UVB 조사 이후 노니 잔사 추출물 (NP)을 처리하였을 경우 Apoptosis의 한 과정인 DNA 단편화의 발생이 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 4. 화장료 조성물의 세포사멸 관련 단백질 발현에 대한 효과

상기 실시예에서 얻은 추출물 시료를 함유한 화장료 조성물에 대한 동물을 이용한 세포사멸 관련 단백질 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 분석법을 하기와 같이 실험을 수행하였다 (F. Afaq, N. Ahmad, H. Mukhtar, Suppression of UVB-induced phosphorylation of mitogen-activated protein kinases and nuclear factor kappa B by green tea polyphenol in SKH-1 hairless mice, Oncogene, 2003, 22, 9254-9264).

4-1. 재료

Oil 상은 극성이 다른 서로 다른 종류의 오일인 Dimethylpolysiloxane fluid (KF96 100cs, Shin-Etsu), Triglyceride/caprylic acid/capric acid (ODO, Nisshin Oil Mills) 그리고 2,2,4,4,6,6,8-hepamethylnonane/Isohexadecane (Arlamol HD, Uniqema, Uniqema grade)을 사용하였다.

다중 에멀젼(Multiple emulsion) 제조에 있어 사용한 계면활성제들은 Polyoxyethylene(30) dipolyhydroxystearate/PEG-30 Dipolyhy-droxystearate (Arlacel P135, Uniqema U.S.A.), Poly(oxy-1,2-ethanediyl) distearate/Steareth-2(Brij 71, Uniqema, U.S.A.), Poly(oxy-1,2-ethanediyl) distearate/Steareth-21(Brij 721, Uniqema, U.S.A.) 그리고 Cetyl alcohol (Lorol C-16, Cognis, U.S.A.)이다.

수(Water) 상은 Glycerin (Glycerin, P&G Chemical, U.S.A.) and 1,3-Butylene glycol (1,3-BG, DAICEL, Japan). Urea (Transammonia, U.S.A.)을 포함하며 입자 외부와 내부의 water상의 점증제로써는 Polyglycerylmethacrylate/prop-ylenglycol (Luragel DV, United Guardian, U.S.A.) and Carboxyl vinylpolymer (Carbopol 940, Lubrizol, U.S.A.)을 사용하였다. 유화장비로는 homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark II, Tokushu kika kogyo, Japan) 와 mechanical stirrer (Wise Stir HS-30D, U.S.A.)를 사용하였으며, 본 실험에 사용한 모든 원료는 한국콜마로부터 얻어서 사용하였다. Nile red (Nile Blue A Oxanzone)는 Sigma-Aldrich (U.S.A.)로부터 구입하여 사용하였다.

4-2. 다중 에멀젼 ( multiple emulsion ) 제조(1)

NP를 첨가한 다중 에멀젼은 표 2과 같은 처방전을 통해 다음과 같이 제조하였다. Blanco에 따르면 다중 에멀젼은 이중 유화 기술로 알려져 있다. 첫 번 유화 단계에서 유용성 원료는 유화이전에 미리 오일 상에 용해시켜 놓고 다른 오일상의 원료들은 90℃ 수조에서 용해시켰다(phase A). 미리 풀어놓은 친수성 점증제 (phase B)는 교반하기 시작할 때 천천히 첨가 시키고 40℃까지 냉각시킨 다음 NP를 첨가하였다. first emulsion(W₁/O)은 오일상(oil phase; phase A)와 수상(Water phase 1, phase B) 그리고 NP로 구성된다. first emulsion(W₁/O)과 Water phase ₂ (W_{2 ,} phase C)을 유화시키기 위해서 Water phase ₂ (W₂)를 second emulsion 단계에서 다음과 같이 준비하였다. Water phase ₂ (W₂)의 수용성 원료들은 미리 물에 충분히 용해시키고 다른 수상의 원료들은 90℃ 수조에서 30분 동안 가열하여 용해시키고 40℃까지 냉각 시켰다. 그 다음 Multiple emulsion(W₁/O/W₂)를 제조하기 위해서 first emulsion (W₁/O)을 Water phase ₂ (W₂)에 천천히 첨가시켰다. 그리고 homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark II, Tokushu kika kogyo, Japan)를 이용하여 2,500 rpm으로 2분 30초동안 유화시켰다. 그리고 중화된 점증제 상 (phase D)을 첨가하고 2분 동안 교반하여 노니잔산 추출물 함유 다중 에멀젼제(이하, MENP라 함)을 제조하여 본 실험에 사용하였다.(표 2 참조)

MENP (MENP : Multiple Emulsion containing Residues of Noni Juice extracts)의 조성.

PHASE	INCI NAME	QUANTITY
	Water	qs to 100.00% w/w
Oil phase (O, Phase A)	Polyoxyethylene Stearylether	1.00
	Polyoxyethylene 21 Stearylether	2.00
	PEG-30 Dipolyhydroxy stearate	0.50
	Caprylic/Capric Triglycerides	5.50
Water phase 1 (W1, Phase B)	Polyglycerylmethacrylate/ propylene	3.00
Active ingredients phase	Resdiues of Noni Jucie extracts(NP)	0.5
Water phase 2 (W2, Phase C)	UREA	0.50
	Glycerin	2.50
	1,3-Butylene Glycol	1.00
Thickner phase (Phase D)	Carboxyl vinylpolymer	0.1
	Triethanol amine	0.1

4-3. 동물 모델(Animal models)

SHK-1 무모마우스(hairless mice)는 PBC (Postech Biotech Center)로부터 6주령 수컷(체중 25 ± 3g)을 분양받아 일주일간 적응시키고 실험하였다. 모든 동물 규약은 POCEB (Pohang Center for Evaluation of Biomaterials)의 동물보호지침(Animal Care guideline)과 프로토콜( protocols)에 따라 진행하였다. 동물 사육실은 온도 24±2℃, 상대 습도 50±10%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였고 사료와 물은 초과하지 않도록 공급하였다.

4-4. UVB 조사에 의한 잘라진 카스파제 ( Cleaved caspase )-3 발현에 대한 효과

UVB에 의한 세포사멸(apoptosis) 관련 단백질인 잘라진(cleaved) caspase-3를 확인하기 위하여 도 17와 같이 SHK-1 무모 마우스 (6∼7주령) 등에 UVB (360mJ/cm²)를 각각 1, 2, 3 시간동안 조사하고 western blotting을 통해 확인하였다. UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 잘라진 카스파제(cleaved caspase)-3가 발현되지 않았으며 조사시간이 증가함에 따라 발현되는 잘라진 카스파제-3의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

4-5. UVB 조사에 의한 잘라진 PARP 발현에 대한 효과

UVB에 의한 apoptosis 관련 단백질인 cleaved PARP를 확인하기 위하여 도 18과 같이 SHK-1 무모 마우스 (6∼7주령) 등에 UVB(360mJ/cm²)을 각각 1, 2, 3 시간 동안 조사하고 western blotting을 통해 확인하였다. UVB를 조사하지 않은 대조군에서는 잘라진 PARP가 발현되지 않았으며 조사시간이 증가함에 따라 발현되는 잘라진 PARP의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

4-6. MENP 를 처치후 UVB 조사에 의한 잘라진 카스파제 -2 발현에 대한 효과

NP를 첨가한 다중 에멀젼(multiple emulsion; MENP)이 UVB에 의한 세포사멸 관련 단백질인 잘라진 (cleaved) caspase-3의 발현에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 SHK-1 무모 마우스 (6∼7주령) 등에 UVB (360mJ/cm²)을 3시간 조사시키고 MENP를 도포하였다. 도 19에서처럼 UVB를 조사하지 않은 그룹(group)에서는 잘라진 caspase-3가 발현되지 않았으며, UVB를 조사하고 MENP를 도포한 그룹이 UVB만 조사한 그룹에 비해 잘라진caspase-3의 발현양이 감소하는 것으로 나타났다.

4-7. MENP 롤 처치후 UVB 조사에 의한 잘라진 PARP 발현에 대한 효과

NP를 첨가한 다중 에멀젼 (MENP)이 UVB에 의한 세포사멸 관련 단백질인 잘라진 PARP의 발현에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 SHK-1 무모 마우스 (6∼7주령) 등에UVB(360mJ/cm²)을 3시간 조사시키고 MENP를 도포하였다. 도 20에서처럼 UVB를 조사하지 않은 그룹(group)에서는 잘라진 PARP가 발현되지 않았으며, UVB를 조사하고 MENP를 도포한 그룹(group)이 UVB만 조사한 그룹(group)에 비해 잘라진 PARP의 발현양이 감소하는 것으로 나타났다.

UVB로 유도된 HaCaT cell의 apoptosis 저해효과는 western blotting, annexin V/PI staining, DAIP assay 그리고 DNA fragmentation 방법을 통해 확인하였고, UVB로 인해 생성되는 ROS의 저해 또한 확인하였다.

NP는 UVB 조사로 인한 사람각질형성세포가 받는 damage로부터 보호하는 활성을 지닌 것으로 확인하였다. UVB 조사로 유도되는 photo-oxidation 효과로 인해 생성되는 ROS를 저해하는 효과와 cleaved PARP의 발현을 저해함으로써 DNA 손상 또한 회복시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 NP가 세포의 생존율을 증진시켜 세포증식효과를 나타내는 것으로 확인하였다.

NP가 UVB로 유도된 ROS 생성 저해를 통해 cleaved caspase-3와 cleaved PARP를 저해하게 되고 DNA 손상 막는 것으로 확인하였다. 따라서 NP가 UVB로 인해 cell death가 일어나는 것을 막고 apoptotic cell의 발생을 저해하는 것으로 확인하였다.

NP의 효과를 화장품 추출물로써 적합한지 확인하기 위하여 multiple emulsion에 첨가한 제형(MENP)을 hairless mouse에 도포하고 western blotting으로 확인하였다. UVB를 조사한 후 MENP를 도포하지 않은 mouse group에 비해 UVB를 조사한 후 MENP를 도포한 mouse group의 피부에서 claeved PARP와 cleaved caspase-3의 발현양을 저해하는 것으로 확인하였다. 노니열매로부터 얻은 잔여물인 NP는 daily 화장품 천연소재로 충분히 활용가능 할 것으로 판단된다.

통계 분석

모든 결과는 수치(values)± 표준 편차(standard deviation) (mean±SD)로 표현하였다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 5를 사용하였으며, 유의차검증은 One way-ANOVA : nonparametric 을 한 후 p=0.05 수준에서 다중검증법 (Turkey : Compare all pairs of columns test)에 따라 분석하였다.

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (10)

1. 세척한 미국산, 필리핀산, 인도산(India), 바르바도스산(Barbados), 말레이시아산(Malaysia), 발리산(Bali), 또는 자바산(Java) 노니열매를 배럴(barrel)에 포장하여 아미노산의 양을 증가시키기 위해 1 내지 12개월 동안 상온에서 숙성시켜 숙성된 노니 열매를 제조하는 제 1단계; 제 1단계의 숙성된 노니 열매를 압착 추출하고 여과하여 수용성 노니쥬스 및 남은 노니 잔사를 수득하는 제 2단계; 제 2단계의 노니 잔사를 시료 중량의 0.5 내지 100배 부피(v/w)의 물 및 에탄올의 혼합용매로 실온 및 암실 상태에서 초음파추출법으로 1 내지 72시간 동안 침지 및 추출하여 노니 잔사 추출물을 수득하는 제 3단계 공정을 포함하는 노니 잔사 추출물을 제조하는 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항의 제조방법으로 제조된 노니 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상의 치료 또는 예방용 피부외용 약학조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
7. 삭제
8. 제 1항의 제조방법으로 제조된 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상의 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
9. 제 8항에 있어서 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 삭제

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