KR101655395B1 - 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 굴피나무의 지상부의 조추출물, 극성용매 가용추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 굴피나무 지상부는 굴피나무 수피, 심재, 가지, 잎이 선택되어 질 수 있다. 구체적으로 본 발명의 추출물은 멜라닌 생합성 과정에 핵심적으로 작용하는 효소인 티로시나아제 활성을 효과적으로 저해하고, B16 멜라노마 세포의 멜라닌의 생합성을 억제하므로 미백 효능을 가지며, 또한 엘라스타아제 억제 효과, MMP-1 발현 억제 효과, 피부 탄력도 개선 효과 및 피부상태개선 효과를 나타내어 주름억제 및 완화 효능을 가진다. 따라서, 본 발명의 추출물은 피부노화방지 활성, 피부미백 활성 또는 피부주름개선 활성을 갖는 조성물을 제공할 수 있다.

굴피나무, 수피, 심재, 가지, 잎, 피부노화, 피부미백, 피부주름

Description

굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic compositions comprising extracts of Platycarya strobilacea}

본 발명은 굴피나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 활성, 피부미백 활성 또는 피부주름개선 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

기미, 주근깨 등 피부에 생기는 색소 침착은 표피 내 멜라닌의 증가에 기인하고, 피부색을 결정하는 중요 요인도 멜라닌에 의한 것이다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트내의 멜라노좀이라는 소기관에서 만들어진다. 즉, 자외선에 의하여 멜라노사이트의 유사분열이 일어나고 이어서 멜라노사이트가 활성화된다. 활성화된 멜라노사이트에서는 티로시나아제의 합성이 촉진되고 멜라닌의 생성이 항진되어 이를 표피 밖으로 운반, 배출하게 된다 (V. J. Hearing and M. Jimenez., Int. J. Biochem, 19(20), p.1141, 1987., I. Koiso., Fragrance J. 6, p39, 1990).

자연적으로 생성되는 멜라닌은 알칼리 난용성의 흑색 멜라닌(뉴멜라닌)과 알칼리 가용성의 황색 내지는 적색 멜라닌(페오멜라닌)의 혼합물이다 (Y. Tomita., Fragrance J, 6, p20, 1990.) 일반적으로 멜라닌 중합체라고 하면 뉴멜라닌을 지칭할 때가 많으며, Prota (G. Prota., J. Invest. Dermatol., 75, p122, 1980)와 Pavel (S. Pavel et al., Cancer Detection and Prevention, 6, p311., 1983)등의 연구에 의해 뉴멜라닌은 이제껏 생각되어 왔던 5,6-디하이드록시 인돌뿐만 아니라, 별개의 멜라닌 단량체인 5,6-디하이드록시 인돌-2-카르보산이나, 각종 멜라닌 중간 대사산물로부터 생성된다는 것을 알았다. 멜라노좀 내에 있어서의 멜라닌 생성과정은 티로신이 효소 티로시나아제에 의해 산화되어 도파→도파퀴논→도파크롬→5,6-디하이드록시인돌→인돌-5,6-퀴논이 되고, 이어서 인돌-5,6-퀴논의 중합에 의해 멜라닌을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그 중에서 티로신-도파퀴논까지는 효소 티로시나아제가 관여하고, 그 이후는 자동산화의 기여가 크다고 알려져 있다. 일광욕 등에서 생기는 색소침착 즉, 흑화현상은 태양광선 중의 자외선에 의해 멜라닌 생성이 증가한 결과라는 것이 잘 알려져 있다.

현재까지 분명히 밝혀져 있는 멜라노사이트 내에서의 멜라닌 생성과정으로부터 멜라닌 생성억제의 작용기전을 살펴보면, 멜라노사이트에 대한 세포독성에 의해서 결과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 기전, 멜라노사이트 내의 멜라닌 생성을 저해함으로서 멜라닌 생성 억제작용을 나타내는 기전의 두 가지로 대별된다. 최근에 발표된 사실에 의하면 티로시나아제뿐만 아니라 티로시나아제-릴레이티드 프로테인 1(Tyrosinase related protein 1: TRP-1) 및 티로시나아제-릴레이티드 프로테인 2(TRP-2, Dopachrome tautomerase)에 의해서도 멜라닌이 생성된다는 것이 새로이 밝혀져 이것들 역시 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소인 바, 이러한 효소들을 저해할 수 있는 물질을 개발하는 것도 피부색소 침착을 방지할 수 있는 방법이 될 수 있다 (Marmol V. at al., FEBS Letter, 327, p.307, 1993 ; Winder A.J. at al., Pigment Cell Research, 7, p.305, 1994).

피부의 노화는 주름 증가와 탄력감소, 색소 침착 등의 여러 형태로 나타난다. 그 중 가장 대표적인 노화의 현상은 바로 주름이다. 이러한 주름을 생성하게 하는 피부의 노화원인은 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 나이가 들어감에 따른 자연적인 노화인 내적 요인과 외적 요인으로 인한 노화이다. 외적 요인으로는 자외선, 공해, 병, 음주, 흡연 등이 있고, 내적 요인으로는 프리라디칼과 염증의 발생, 스트레스, 세포 활성의 저하 및 돌연변이화, 세포대사 불균형 등이다 (Peter T., et al., Physiology Of The Skin, Allured Publishing Corporation, pp61-72). 피부의 구조에 따라 주름 발생 원인을 좀 더 자세히 설명하면, 피부는 크게 표피와 진피로 나뉜다. 표피에서의 주름 생성 원인으로는 각질 형성 세포의 턴-오버(turn-over)의 감소로 각질층의 누적과 이로 인해 각질층의 두꺼워지고, 각질층의 수분 함유 능력이 감소되고, 각질이 경화되어 주름이 발생하게 된다. 표피와 진피의 경계부위는 표피세포 지지, 부착, 영양물질의 이동, 표피 분화의 조절 등에 관여하는데, 각종 노화 요인으로 특히, UV에 인하여 콜라겐 IV, VII이 감소되어 표피, 진피 지지기능이 감소되고, 선별 투과 기능이 약화되어 해로운 성분이 쉽게 진피에 영향을 미치게 되어 주름이 생성된다 (Keene, J. Cell Biol., 104, pp611-621, 1987). 피부의 제일 바깥부분인 표피층은 진피층으로부터 생성되며, 진피층은 콜라겐과 엘라스틴으로 구성된다. 피부에 윤택을 주고 탄력을 주는 것은 진피층의 이 두성분인데, 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제와 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타아제가 활성이 되면, 피부가 탄력을 잃고 주름이 생기게 된다 (Herrmann G. et al., Journal of Investigative Dermatology, 107(3), pp92, 1996; Brenneisen P. et.al., Photochemistry & Photobiology, 64(5), pp649, 1996). 또한 메트릭스 메탈로프로티나제(Matrix Metallo-Proteinase; MMP)-1은 활성중심부에 아연을 가지는 금속단백 분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen)형태로 분비된다. 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(macroglobulin)이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase)와 같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 케라티노사이트(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다 (Fisher, G. J. et al., Photochem. Photobiol. 69, 154, 1999). 1회의 UV조사에도 피부내의 MMP활성이 증가되며 피부내의 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 MMP들이 진피층의 콜라겐 붕괴에 영향을 미치며 광 노화에 매우 중요한 역할을 한다.

굴피나무(Platycarya strobilacea)는 한국(충청남도 이남), 일본, 타이완, 중국 등지에 분포하며 지방에 따라서는 꾸정나무라고도 부른다. 산기슭의 양지바른 곳이나 바닷가 수성암 지대에서 자라며, 높이 5-20m, 10-50cm 정도이다. 잎은 홀수깃꼴겹잎이며, 잎자루가 없는 7-19개의 작은 잎으로 이루어져 있으며, 작은 잎은 타원형 바소꼴 또는 달걀 모양 바소꼴로 끝이 뾰족하고 가장자리에 골이 깊은 톱니가 있다. 잎의 양면과 꽃자루에 흰 털이 있으나 점차 없어진다. 5-6월에 노란빛을 띤 녹색 꽃이 피는데 수꽃이삭은 5-8cm, 암꽃이삭은 2-4cm이다. 성숙한 암꽃이삭은 솔방울 모양이며, 열매이삭은 긴 타원형이고 검은빛을 띤 갈색이며 털이 없다. 포조각은 떨어지지 않으며 바소꼴이다. 열매는 날개를 가진 견과이고 9-10월에 익는다. 주요 성분 및 효능으로는 껍질에 유글론이 있고, 살충 및 살균작용이 강하여 짓찧어서 피부의 급성 화농증이나 머리의 부스럼 등의 치료에 사용한다. 열매에는 탄닌질이 있으며, 한방에서는 열매를 화향수과(化香樹果)라고 하는데, 진통·소종(消腫)· 거풍(祛風) 등의 효능이 있어 근육통, 복통, 치통, 습진종창 등의 치료에 사용한다. 수피를 머리염색제로 사용하고, 잎은 유독하므로 복용을 금하고 있다.

본 발명자들은 이전에 굴피나무 열매로부터 항노화와 피부 미백에 대한 효능을 확인하여 출원번호 10-2006-0079021의“굴피나무 열매 추출물을 함유하는 항노화용 조성물”과 출원번호 10-2008-0087979의“굴피나무 열매 추출물을 함유하는 피부 미백 조성물”의 특허를 출원한 바 있다. 통상적으로, 한의학적인 측면에서 볼 때, 식물의 부위별로 다른 한약재명을 가지며 각기 다른 성분을 가지고 있고 다른 처방에 의하여 사용되며, 다른 효능을 가지고 있음은 널리 공지되어 있으므로, 굴피나무도 열매 이외의 다른 부위에서 유사한 활성을 가질 것이라고 예상되지 않 는다. 그러나 본 발명자들은 굴피나무의 열매 이외에 수피, 심재, 가지, 잎 추출물에 대하여도 실험을 계속 진행하였으며, 이로부터 우수한 효능을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 활성산소 소거능으로 인해 피부노화를 방지하고, 티로시나아제 활성 및 멜라닌의 생합성을 억제하여 피부미백 효능을 가지며, 또한 엘라스타아제 및 MMP-1 발현을 억제하여 피부탄력도 개선 효과를 갖는 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 굴피나무(Platycarya strobilacea)의 수피(나무껍질), 심재(心材, 나무속), 가지 또는 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 활성, 피부미백 활성 또는 피부주름개선 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 추출물은 활성산소 소거능이 우수하고, 멜라닌 생합성 과정에 핵심적으로 작용하는 효소인 티로시나아제 활성을 효과적으로 저해하며, B16 멜라노마 세포의 멜라닌의 생합성을 억제하므로 미백 효능을 가지고, 또한 엘라스타아제 억제 효과, MMP-1 발현 억제 효과, 피부 탄력도 개선 효과 및 피부 상태 개선 효과를 나타내어 주름억제 및 완화 효능을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서, 상기 피부노화방지 활성은 프리라디칼 소거, 활성산소 소거, 활성산소에 의한 세포보호 및 광용혈 억제에 의해 유도되는 것을 특징으 로 한다. 본 발명의 실험예 1 내지 3에서는 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 이용하여 피부노화에 중요한 영향을 미치는 상기 요소들의 소거 또는 억제 효과를 확인하였다.

본 발명의 조성물에서, 상기 피부미백 활성은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생합성을 저해함으로써 유도되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실험예 4 내지 6에서는 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 이용하여 피부의 색소 침착에 관여하는 티로시나아제 활성 및 멜라민의 생성 억제 효과를 확인하였다.

본 발명의 조성물에서, 상기 피부주름개선 활성은 엘라스타아제 활성 및 MMP-1 mRNA 발현을 저해함으로써 유도되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실험예 7과 8에서는 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 이용하여 피부주름 생성에 관여하는 엘라스타아제 및 MMP-1의 활성 또는 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 조추출물, 극성 용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함한다.

추출물의 유효성분이 파괴되지 않거나 파괴가 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 적절한 용매를 선택하여 사용하도록 한다.

추출방법은 특별히 제한되지 않고, 추출물의 종류와 추출하는 방법에 따라, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 상온 추출, 열수 추출 등을 이용할 수 있다.

여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과, 원심분리 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 다양한 크로마토그래피(예컨대, 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.

여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린 또는 이들의 혼합용매로 추출된 조추출물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 조추출물의 고형분을 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 초산에틸 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 비극성 용매 또는 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성 용매로 추출한 가용 추출물인 것을 특징으로 한다.

본원에서 사용된 용어, “조추출물”은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 그룹으로 부터 선택된 하나 이상의 용매로부터 추출되는 추출물을 포함한다.

본원에서 사용된 용어, “극성용매 가용 추출물”에는 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 극성 용매로 추출되는 추출물이 포함된다.

본원에서 사용된 용어, “비극성용매 가용추출물”에는 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 초산에틸 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 비극성 용매로 추출되는 추출물이 포함된다.

이하, 본 발명의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성 용매 가용 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

조추출물은 추출용매로서 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 용매를 이용하여 추출할 수 있다.

극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물의 고형분로부터 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 가용용매를 이용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 부탄올을 이용하여 추출할 수 있다.

비극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물의 고형분로부터 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 초산에틸 등을 포함하는 비극성 용매를 이용하여 추출할 수 있다.

하나의 구체적 실시예에서, 조추출물은 이하 단계를 거쳐 수득할 수 있다. 건조된 상기 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물에 그 부피의 1 내지 30배, 바람직하게는 10 내지 20배의 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 용매; 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 30 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 95℃의 추출 온도; 1 내지 30시간, 바람직하게는 3 내지 20시간; 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 3회 추출; 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출, 바람직하게는 열수추출법을 이용하여 추출; 수득한 추출액을 여과하고 감압 농축한 뒤 동결 건조나 분무 건조하여 건조 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 하나의 구체적 실시예에서, 본 발명의 극성용매 및 비극성용매 가용 추출물은 상기 실시예 과정을 통해 얻은 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 조추출물, 바람직하게는 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물의 에탄올 가용 조추출물에 그 부피의 2 내지 7배, 바람직하게는 4 내지 6배의 물을 분산시킨 후, 물과 동량의 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획시킴으로써 수득할 수 있다.

상기 제조방법에 의해 얻어진 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 고형분의 중량으로 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 보다 바 람직하게는 0.1 내지 40 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 30 중량%로 포함될 수 있다.

상기 조추출물, 극성용매 가용추출물, 비극성용매 가용추출물은 항산화활성, 티로시나아제 억제효과, 엘라스타아제 저해효과, B16 멜라노마 발현억제, MMP-1 유전자 발현 억제효과, 피부주름개선 및 피부탄력증진 효과를 확인한 결과 뛰어난 효과를 나타내었으며, 또한 피부에 적용시 안전성에도 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

특히, 굴피나무의 수피를 물과 에탄올의 혼합용매로 조추출한 후 헥산과 에틸아세테이트로 순차적으로 분획한 가용추출물(실시예 10, PSB-10)은 상기 언급한 항산화, 피부주름개선 및 피부미백 효과가 월등히 우수하였다.

본 발명의 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 함유하는 조성물은 또 다른 양태로서, 피부노화방지 활성, 피부미백 활성 또는 피부주름개선 활성을 갖는 피부외용 약학조성물로 제조될 수도 있다.

본 발명의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어 로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에 틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 외용투여로 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산 화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스 테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리 돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 % 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-1)의 제조

완전 건조시킨 굴피나무 수피 200g(제주도)을 70% 에탄올 1kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 3시간 끓여서 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 추출물을 0.45μm 의 필터로 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 추출물 (PSB-1) 49.2g을 얻었다.

실시예 2. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-2)의 제조

70% 에탄올을 정제수로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-2) 28.7g을 얻었다.

실시예 3. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-3)의 제조

70% 에탄올을 30% 에탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-3) 25.9g을 얻었다.

실시예 4. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-4)의 제조

70% 에탄올을 30% 글리세린으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-4) 23.8g을 얻었다.

실시예 5. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-5)의 제조

70% 에탄올을 30% 부틸렌글리콜로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-5) 27.2g을 얻었다.

실시예 6. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-6)의 제조

70% 에탄올을 80% 메탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-6) 34.7g을 얻었다.

실시예 7. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-7)의 제조

70% 에탄올을 80% 아세톤으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-7) 26.1g을 얻었다.

실시예 8. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-8)의 제조

70% 에탄올을 에틸아세테이트로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSB-8) 27.2g을 얻었다.

실시예 9. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-9)의 제조

상기 실시예 1의 감압농축물 50g 을 증류수 1kg에 현탁시킨 다음 헥산 1kg을 사용하여 진탕 추출한 후 분획하고 감압 농축하여 추출물 (PSB-9) 3.76g을 얻었다.

실시예 10. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-10)의 제조

상기 실시예 9의 잔류 물층을 에틸아세테이트 1kg으로 진탕 추출한 후 분획하고 감압 농축하여 추출물 (PSB-10) 8.46g을 얻었다.

실시예 11. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-11)의 제조

상기 실시예 10의 잔류 물층을 n-부탄올 1kg으로 진탕 추출한 후 분획하고 감압 농축하여 추출물 (PSB-11) 10.8g을 얻었다.

실시예 12. 굴피나무 수피 추출물 (PSB-12)의 제조

상기 실시예 11의 잔류 물층을 감압 농축하여 추출물 (PSB-12) 19.3g을 얻었다.

실시예 13. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-1)의 제조

완전 건조시킨 굴피나무 심재 200g(제주도)을 70% 에탄올 1kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 3시간 끓여서 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 추출물을 0.45μm 의 필터로 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 추출물 (PSH-1) 39.9g을 얻었다.

실시예 14. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-2)의 제조

70% 에탄올을 정제수로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-2) 25.6g을 얻었다.

실시예 15. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-3)의 제조

70% 에탄올을 30% 에탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-3) 31.5g을 얻었다.

실시예 16. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-4)의 제조

70% 에탄올을 30% 글리세린으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동 일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-4) 19.5g을 얻었다.

실시예 17. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-5)의 제조

70% 에탄올을 30% 부틸렌글리콜로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-5) 21.8g을 얻었다.

실시예 18. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-6)의 제조

70% 에탄올을 80% 메탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-6) 33.6g을 얻었다.

실시예 19. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-7)의 제조

70% 에탄올을 80% 아세톤으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-7) 25.8g을 얻었다.

실시예 20. 굴피나무 심재 추출물 (PSH-8)의 제조

70% 에탄올을 에틸아세테이트로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 13과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSH-8) 19.3g을 얻었다.

실시예 21. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-1)의 제조

완전 건조시킨 굴피나무 가지 200g(제주도)을 70% 에탄올 1kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 3시간 끓여서 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 추출물을 0.45μm 의 필터로 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 추출물 (PSR-1) 45.8g을 얻었다.

실시예 22. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-2)의 제조

70% 에탄올을 정제수로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-2) 21.9g을 얻었다.

실시예 23. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-3)의 제조

70% 에탄올을 30% 에탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-3) 23.5g을 얻었다.

실시예 24. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-4)의 제조

70% 에탄올을 30% 글리세린으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-4) 24.9g을 얻었다.

실시예 25. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-5)의 제조

70% 에탄올을 30% 부틸렌글리콜로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-5) 21.2g을 얻었다.

실시예 26. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-6)의 제조

70% 에탄올을 80% 메탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-6) 36.7g을 얻었다.

실시예 27. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-7)의 제조

70% 에탄올을 80% 아세톤으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-7) 27.5g을 얻었다.

실시예 28. 굴피나무 가지 추출물 (PSR-8)의 제조

70% 에탄올을 에틸아세테이트로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 21과 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSR-8) 23.3g을 얻었다.

실시예 29. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-1)의 제조

완전 건조시킨 굴피나무 잎 200g(제주도)을 70% 에탄올 1kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 3시간 끓여서 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 추출물을 0.45μm 의 필터로 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 추출물 (PSL-1) 31.4g을 얻었다.

실시예 30. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-2)의 제조

70% 에탄올을 정제수로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-2) 21.9g을 얻었다.

실시예 31. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-3)의 제조

70% 에탄올을 30% 에탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-3) 22.5g을 얻었다.

실시예 32. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-4)의 제조

70% 에탄올을 30% 글리세린으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-4) 23.1g을 얻었다.

실시예 33. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-5)의 제조

70% 에탄올을 30% 부틸렌글리콜로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-5) 19.4g을 얻었다.

실시예 34. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-6)의 제조

70% 에탄올을 80% 메탄올로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-6) 25.6g을 얻었다.

실시예 35. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-7)의 제조

70% 에탄올을 80% 아세톤으로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-7) 18.8g을 얻었다.

실시예 36. 굴피나무 잎 추출물 (PSL-8)의 제조

70% 에탄올을 에틸아세테이트로 바꾸는 점만 제외하고 상기 실시예 29와 동일한 반응 공정을 수행하여 추출물 (PSL-8) 19.2g을 얻었다.

실험예 1. 굴피나무 추출물의 DPPH법을 이용한 프리라디칼 소거 활성

상기 실시예 1 내지 36의 굴피나무 추출물에 대하여 프리라디칼 소거 활성을 DPPH법으로 측정하였다. 프리라디칼은 노화, 특히 피부노화의 원인 물질로 간주되고 있다. 굴피나무 추출물에 대한 프리라디칼 소거 활성의 측정은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하였다.

구체적으로, 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer)로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 하기 계산식 1에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, μg/mL)로서 표기하였으며, 그 결과 를 하기 표 1에 나타내었다.

[식 1]

[표 1]

실험결과, 상기 표 1에서 나타나는 바와 같이 유의할 만한 항산화 활성을 보였으며, 특히 추출물 PSB-10의 경우 대표적 항산화물질로 알려진 L-아스코르브산과 비교할 때 유사한 효능을 나타내었다.

실험예 2. 굴피나무 추출물의 루미놀발광법을 이용한 활성산소 소거 활성

상기 실시예 1 내지 36의 굴피나무 추출물에 대하여 루미놀발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 계에 있어서 활성산소 소거 활성을 측정하였다. 철이나 구리 같은 전이금속은 반응성이 가장 큰 히드록시 라디칼(hydroxyl radical: ·OH)을 생성시키는 촉매로 작용한다. 본 발명에서 사용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 계는 각종 활성산소(O²ㆍ-, ·OH 및 H₂O₂)를 생성시킨다. 따라서 이 계를 이용하면 활성산소(Reactive Oxygen Species: ROS)에 대한 총 항산화능을 측정할 수 있다. 이 총 항산화능에는 활성산소의 생성을 막아주는 킬레이트작용도 포함될 수 있다. Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 계에서 생성된 ROS의 검출은 루미놀(luminol)과 ROS간의 반응을 통한 화학발광을 측정함으로써 알 수 있다.

구체적으로, 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.78 mL를 넣고 다양한 농도의 추출물을 넣었다. 여기에 2.5 mM EDTA 40 μL 및 5 mM FeCl₃·6H₂O 10 μL를 가한 후 35 mM 루미놀(luminol, Sigma, USA) 80 μL를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 셀 홀더(cell holder)에 튜브를 넣고 5분 동안 항온시킨 후 150 mM H₂O₂ 40 μL를 넣고 화학발광을 25분 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H₂O₂와 FeCl₃·6H₂O을 첨가하지 않은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학발광으로 측정한 저해율을 하기 계산식 2와 같이 나타내었고, 활성산소 소거활성의 크기는 화학발광의 세기가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, OSC₅₀, μg/mL)로서 표기하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

[계산식 2]

여기서, cpm은 count per minute로, 빛의 세기 또는 광량을 나타낸다.

[표 2]

실험결과, 상기 표 2에 나타나는 바와 같이 본 발명의 굴피나무의 수피, 심재, 가지 및 잎 추출물은 양성대조군인 루틴(Rutin) 또는 아스코르브산(L-Ascorbic acid)과 유사하거나 그 보다 높은 활성산소 소거 활성을 나타내었다.

실험예 3. 광용혈 (Photohemolysis)법을 이용한 세포보호 효과 측정

상기 실시예 1 내지 36의 굴피나무 추출물에 대하여 광용혈(Photohemolysis) 법을 이용하여 세포보호 효과를 측정하였다. 사람 적혈구를 대상으로 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 이러한 실험방법을 이용하여 천연물을 대상으로 활성산소에 대한 세포보호 효과를 측정할 수 있다.

실험예 3-1. 적혈구 현탁액 제조

적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 헤파린(heparin)이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.9 % PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 3회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 4 ℃의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 12시간 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법 (Park. S.N. Effects of flavonoids and other phenolic compounds on reactive oxygen-mediated biochemical reactions. Ph. D. Dissertation, Seoul National University (1989))에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 흡광도(O.D)가 0.6이었으며, 이 때 적혈구 수는 1.5×10⁷ cells/mL이었다.

실험예 3-2. 굴피나무 추출물의 광용혈 억제 효과

적혈구 현탁액 3.5 mL를 파이렉스 시험관 (No. 9820)에 넣은 후, 시료용액을 첨가하였다. 추출물을 농도별로 각각 50 μL씩 첨가하였다. 암소에서 30분 동안 전-배양(pre-incubation) 시킨 후, 광증감제 로즈-뱅갈(rose-bengal, 10 μM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15분 동안 광조사 하였다.

광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50cm×20cm×25cm 크기의 상자 안에 20W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15분 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 20℃ 항온실에서 행하였다. 굴피나무 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 농도인 τ50을 구하여 비교하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

대조군(control)은 τ50이 31분으로 오차범위±1분 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다. 로즈-뱅갈을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 로즈-뱅갈을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120분까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

[표 3]

실험결과, 표 3에 나타난 바와 같이 본 발명의 굴피나무 수피, 심재, 가지 및 잎 추출물은 광용혈 억제 효과 비교 시 높은 항산화활성을 나타내는 것으로 알려진 루틴(rutin)보다 대체적으로 높게 나타나고 있으므로, 이로부터 세포보호 효과가 뛰어나다고 판단할 수 있다.

실험예 4. 티로시나제 활성 저해 효과

상기 실시예 1 내재 36의 굴피나무 추출물에 대하여 티로시나제 활성 저해 효과를 측정하였다. 티로시나제의 저해활성은 일반적으로 분광학적인 방법으로 측정한다. 본 발명에서는 바니 등의 방법으로 실시하였다 (Vanni A. at al., Annali di Chimica, 80(35), 1990). 티로시나아제는 감자나 버섯으로부터 정제되는 효소로서, 본 발명에서는 버섯류로부터 추출한 것을 사용하였다. 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8) 1.0 ㎖, 0.3 ㎎/㎖ L-티로신 수용액 1.0 ㎖ 및 1250 unit/㎖ 머쉬룸 티로시나제 0.1 ㎖(sigma, USA)를 혼합 한 후 여기에 시료용액을 농도에 따라 각각 0.2㎖씩 첨가하여 37℃에서 10분간 효소반응 시켰다. 그 다음, 반응용액의 흡광도를 480 nm(JASCO V-550, japan)에서 측정하고, 하기 계산식 3에 따라 계산하여 시료의 효소 저해활성 정도를 구하였다. 양성대조군으로는 실험군과 동일한 농도의 알부틴(바이오랜드 사) 0.2㎖을 사용하였으며 실험군의 대조구로는 시료를 첨가하지 않은 반응용액을 사용하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.

[계산식 3]

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 480nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 480nm에서 흡광도

[표 4]

상기 표 4에서, 본 발명의 굴피나무 추출물은 미백제로 널리 쓰이고 있는 알부틴과 유사한 수치를 보여주고 있다. 따라서 본 발명의 굴피나무 추출물은 티로시나제 억제효과가 뛰어남을 알 수 있다.

실험예 5. B16-F1 멜라노마 세포를 이용한 세포 독성 측정

실시예 1 내지 36의 굴피나무 추출물 및 분획물을 시료로 사용하여 B16-F1 멜라노마 세포(CRL-6323, ATCC)의 세포생존율을 측정하였다. 본 발명은 세포 독성 측정을 위하여 MTT실험을 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 이하와 같다.

B16-F1 멜라노마 세포를 10% FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium, Gibco)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 6웰 플레이트(Nunc)에 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 그 후 10% FBS가 함유된 새로운 DMEM으로 교체 후 시료를 농도별로 처리하여 3일간 배양하였다. 3일 후 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT ((3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), Sigma) 용액 2 ㎖을 처리하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 MTT 용액을 제거한 세포에 DMSO (dimethylsulfoxide) 2 ㎖을 첨가하여 MTT formazan을 용해시키고 570 nm에서 흡광도로 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 통계 처리하여 평균값을 구하였고, 그 결과로부터 세포 생존률을 하기 계산식 4를 이용하여 구하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

[계산식 4]

[표 5]

상기 표 5에서 나타내는 바와 같이, 세포생존율은 100%에 근접하는바, 굴피나무 추출물은 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.

실험예 6. B16-F1 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생합성 억제 효과 측정

B16-F1 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성(melanogenesis) 저해 효과는 푸쿠다의 방법 (Fukuda et al., J. Soc. Cosmetic Chem., 42(361), 1991)을 변형하여 측정하였다. 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다.

구체적으로, B16-F1 멜라노마 세포를 10% FBS을 첨가한 DMEM에 1×10⁵ 세포 의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 10% FBS가 함유된 새로운 DMEM으로 교체 후 시료를 처리하여 3일간 배양하였다. 3일 후 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphate buffered saline) 2 ㎖로 세척하고 1N NaOH 0.5 ㎖을 처리하여 세포를 1.5 ㎖ 튜브로 수거하여 세포 내 멜라닌을 얻었다. 수거한 세포를 96웰 플레이트에 옮긴 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 일정 단백질 당 멜라닌 양을 구하였다. 대조군으로는 10 μg/ml 농도의 알부틴(바이오랜드 사)를 사용하였으며, 실험군의 대조구로는 시료를 첨가하지 않은 반응액을 사용하였다. 이로부터 하기 계산식 5를 이용하여 본 발명의 굴피나무의 멜라닌 생성 억제 효과를 구하였고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[계산식 5]

CVa : 시료를 처리한 반응용액의 세포생존률

MCa : [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 처리하지 않은 반응용액의 450nm에서 흡광도

B : 시료를 처리한 반응용액의 450nm에서 흡광도

[표 6]

상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 굴피나무 추출물은 10 μg/ml의 적은 양으로도 높은 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었다. 또한, 이들 추출물은 이미 미백효과가 우수한 것으로 알려진 알부틴과 비교해보아도, 동등한 혹은 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 7. 엘라스타아제 억제 효과 측정

상기 실시예 1 내지 36의 굴피나무 추출물의 엘라스타아제 저해 효과를 측정 하기 위하여 하기와 같이 실험하였다 (James A.E.K., et al, Biochemistry, 35, 9090-9096 (1996)).

0.267M 트리스 용액은 pH 8.0이 되도록 0.267M 염산(HCl)액으로 조정하여 완충액을 제조하였고, 엘라스타제 기질은 Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 표준품(Sigma)을 8.8mM 농도로 하여 기질액을 제조하였으며, 돼지 췌장 엘라스타제(Porcine Pancreatic Elastase) 표준품을 10 μg/ml 농도로 하여 효소액을 제조하였다. 시료 대신 정제수 100㎕를 가지고 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 공시험액으로 하여 그 흡광도 A를 측정하였고, 효소액 및 검액 대신 정제수 120 μl를 넣어 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 색보정액으로 하여 그 흡광도 D를 측정하였다.

상기에서 만든 완충액 60 μl에 기질액 20 μl, 실시예의 시료 100 μl를 넣어 섞은 뒤, 효소액 20 μl를 넣어 흔들어 섞어 25℃에서 15분간 반응시켰고, p-니트로아닐린의 생성량을 410 nm에서 흡광도 B를 측정하였다. 완충액 60 μl에 기질액 20 μl, 정제수 20 μl, 시료 100 μl를 넣어 위와 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 대조액으로 하여 흡광도 C를 측정하였다.

엘라스타아제 저해율은 하기의 계산식 6으로 계산하였으며, 엘라스타아제 저해율로부터 다시 본 발명의 굴피나무 추출물들의 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀을 구하였다. 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀은 엘라스타아제의 활성을 50% 저해하는데 요구되는 추출물의 농도(㎍/㎖)를 표시하는 것으로, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

[계산식 6]

[표 7]

실험결과, 상기 표 7에서 나타나는 바와 같이 본 발명의 굴피나무 추출물들은 엘라스타아제 저해활성 IC₅₀ 값이 60 μg/㎖ 이하로 나타났으며, 이는 소량으로도 엘라스타아제 저해활성 효과가 뛰어남을 보여주는 것이다. 또한 대조구로 사용 된 캠퍼롤(Kaempferol) 및 케르세틴(Quercetin)과 비교할 때, 몇몇 추출물에서는 약간 높게 나타났으나 대체로 근접한 효과가 나거나는 것으로 확인하였다.

실험예 8. MMP-1 mRNA 발현 저해 효과 측정

피부내의 콜라겐 붕괴를 촉진하는 기질 메탈로프로티나제(Matrix Metallo- Proteinase)-1은 UVA에 의해 발현이 촉진되며 MMP-1의 유전자 발현 저해 효과를 보기 위해 RT-PCR을 실시하였다.

섬유아세포를 60 mm 디쉬에 1×10⁶ 세포의 밀도로 분주한 후 24시간 37℃에서 배양하였다. UVA를 6J 조사한 후 실시예 1 내지 36을 5 μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 37℃에서 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 트리졸(Trizol, invitrogen, USA) 1 ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260 nm에서 RNA 양을 정량한 후, 역전사 중합반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트(All-in-one RT-PCR kit, SuperBio, Korea)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 하기의 표 8 및 표 9와 같고, 올인원 역전사 중합 반응 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다.

[표 8]

[표 9]

[표 10]

MMP-1 발현 억제 효과를 측정한 결과는, 액틴에 대해 보정을 하여 나타내었고 상기 표 10에서 나타나는 바와 같이 실시예 1 내지 36은 UVA에 의해 유도된 MMP-1의 활성을 대조군으로 사용한 EGCG(Epigallocatechin gallate) 수준 이하로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 굴피나무 조추출물, 극성용매 가용추출물, 비극성용매 가용 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제제의 예를 설명하나, 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1. 유연 화장수(스킨)의 제조

굴피나무 조추출물을 함유한 화장료 중 유연 화장수(스킨)의 제조예를 하기 표 11에 나타내었다.

[표 11]

제형예 1.

상기 표 1에서 원료물질 12에 3, 4, 5 및 9을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 6을 60℃정도 가열하여 용해시킨 후 11을 투입 교반하여 12에 투입한다. 마지막으로 1 또는 2와 7, 8 및 10을 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이크로플루 다이져를 통과시킨 후 숙성시켰다.

비교제형예 1.

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 2. 영양화장수(로션)의 제조

굴피나무 조추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수(로션)의 제조예를 하기 표 12에 나타내었다.

[표 12]

제형예 2.

상기 표 12에서 원료물질 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1 또는 2와 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 2.

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 3. 영양크림의 제조

굴피나무 조추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 제조예를 표 13에 나타내었다.

[표 13]

제형예 3.

상기 표 13에서, 원료물질 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1 또는 2와 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 3.

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 4. 에센스의 제조

굴피나무 조추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 제조예를 표 14에 나타내었다.

[표 14]

제형예 4.

상기 표 14에서, 원료물질 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1 또는 2와 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마 이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 4.

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 5. 파운데이션의 제조

굴피나무 조추출물을 함유한 화장료 중 파운데이션의 제조예를 하기 표 15에 나타내었다.

[표 15]

제형예 5.

상기 표 15에서, 원료물질 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 18을 혼합교반하면서 80-85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 80-85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 17을 투입하였고, 35℃까지 냉각한 뒤 1 또는 2를 투입하였으며, 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

비교제형예 5.

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제조예 6. 친수성 연고제의 제조

[표 16]

임상 실험예 1. 피부 미백 효과

피부미백에 대한 굴피나무 추출물의 영향을 실험하기 위해, 상기 제제예 2의 제형예 2(시험군) 및 비교제형예 2(대조군)의 로션을 건강한 피부를 가진 19-22세의 여성을 대상으로 인공색소 침착을 유도한 뒤 이중맹검법과 무작위화된 인체시험 방법을 적용하여 6주간 시험 제형을 사용하게 한 후 굴피나무 추출물의 피부 미백 효과를 평가하였다.

임상 실험예 1-1. 육안 평가

제형 사용 전과 사용 1주, 2주, 4주, 6주 후 시점에서 피부 미백 효과를 평 가하였다. 평가 기준은 1-7점 척도를 사용하여 2명의 관찰자가 평가하였다 (표 17 및 18 참조). 시험군과 대조군을 시점 별로 반복 평가하였고 시험 결과를 반복측정 분산분석법을 적용하여 군간, 시점별 차이를 검정하였다 (p<0.05).

[표 17]. 관찰자 1에 의한 육안 평가

[표 18]. 관찰자 2에 의한 육안 평가

피부미백에 대한 육안 평가 실험결과, 상기 표 17 및 18에서와 같이 굴피나무 추출물의 첨가된 제형을 사용한 경우가 사용하지 않은 대조군에 비해 유의한 개선 효과를 보였다.

임상 실험예 1-2. 색차계를 이용한 멜라닌 지수 측정

색차계(MPA-580)를 이용하여 시험군과 대조군의 제형 사용전과 사용 1주, 2주, 4주, 6주 후 시점에서 멜라닌 지수 측정을 통해 피부색 개선 정도를 평가하였고, 시험군과 대조군의 멜라닌 지수를 각 시점별로 평가한 결과를 표 19에 나타내었다.

[표 19]. 시험군과 대조군의 멜라닌 지수

피부미백에 대한 멜라닌 지수 평가결과, 상기 표 19에서와 같이 각 시점별 멜라닌 지수 분석 결과 굴피나무 추출물을 첨가한 제형을 사용한 시험군이 대조군에 비해 멜라닌 지수가 감소하였다.

임상 시험예 2. 주름 깊이 감소에 의한 피부 탄력도 개선 효과 측정

피부주름에 대한 본 발명의 굴피나무 추출물의 영향을 실험하기 위해 제조예 3의 제형예 3 및 비교제형예 3을 여성 20명씩 두 그룹으로 나누어 왼쪽 눈 가장자리에 하루에 세안 후 아침, 저녁 두 번 적용하였다. 대조군의 영양크림은 오른쪽 눈 가장자리에 처리하였다. 적용 15일, 30일 후 피부 표면의 피부 주름 깊이를 피부탄력도 측정기(Cutometer SEM 474)에 의해 측정하였다. 피부탄력도 측정기에 의한 피부 탄력도 측정은 주름의 깊이를 측정하는 것으로서, 값이 적을수록 탄력성이 좋은 것이다. 탄력도 값은 대조군에 비해 감소한 값을 %로 나타내었으며, 피검자 20명의 평균값을 결과에 나타내었다. 결과를 하기 표 20에 나타내었다.

[표 20]

실험결과, 상기 표 20에서 나타나는 바와 같이 제형예 3 및 비교제형예 3에서의 피부 탄력도 효과가 대조군(표 13의 대조군)보다 뛰어남을 확인하였다.

임상 시험예 3. 피부상태 개선효과 확인 실험

제조예 4의 제형예 4 및 비교 제형예 4의 에센스에 대한 피부도포 시 피부상태 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 36-69세의 건강한 여성층으로서 30명씩 두 그룹으로 나누어 안면 왼쪽 부분에는 제조예 4의 제형예 4 및 비교 제형예 4에 대한 에센스를 안면 오른쪽 부분에는 대조군의 에센스를 매일 아침, 저녁 세안 후 피부에 1일 2회 4주간 도포한 후 피부상태 개선을 확인하기 위하여 피부상태 개선 정도를 측정하였다. (가) 피부의 탄력, 늘어짐에 대한 개선 효과 및 (나) 주름, 잔주름에 대한 개선 효과에 관해서 다음의 평점으로 판정하여, 30명의 평균점으로 평가한 결과를 표 21에 나타내었다. 제형예 4를 사용한 군에서는 피부의 탄력 및 늘어짐에 대한 개선 효과와 주름 및 잔주름에 대한 개선 효과 모두에서 비교제형예 4를 사용한 군에 비교하여 훨씬 뛰어난 피부 개선 효과가 확인되었다 (표 22 참조).

[표 21]

[표 22]

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 세포독성, 피부 첩포시 부작용 등의 안전성 문제가 없으며 항산화 작용, 세포보호 작용, 주름개선, 미백효과 및 피부 상 태 개선 효과를 나타내어 궁극적으로 피부노화방지, 주름개선 및 피부미백 효과를 갖는 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (9)

1. 굴피나무(Platycarya strobilacea)의 수피, 심재, 가지, 또는 잎에서 선택된 어느 하나의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 활성, 피부미백 활성 또는 피부주름개선 활성을 갖는 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 피부노화방지 활성은 프리라디칼 소거, 활성산소 소거, 활성산소에 의한 세포보호 및 광용혈 억제에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 피부미백 활성은 티로시나제 활성 및 멜라닌 생합성을 저해함으로써 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 피부주름개선 활성은 엘라스타제 활성 및 MMP-1 mRNA 발현을 저해함으로써 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 조추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 조추출물의 고형분을 물, 에틸아세테이트, 부탄올 및 헥산으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 가용 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 굴피나무의 수피, 심재, 가지 또는 잎 추출물을 조성물의 총 중량 대비 0.01 내지 50 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 군에 서 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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