KR101190792B1 - 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응 - Google Patents

변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 형광물질이 연결된 뉴클레오티드, 이를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물, 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 중합효소 반응 기질 중 하나인 뉴클레오티드를 화학적으로 변형하여 기질의 역할 외에 형광 신호 생성의 역할도 부여함으로써, 프로브를 제작할 필요가 없어 경제적이며, PCR, RCA 및 등온 중합 반응 등 다양한 실시간 중합효소 반응에 용이하게 적용될 수 있으며 분석 성능도 기존 방법에 비하여 매우 우수하다.

Description

변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응{Modified nucleotides and real-time polymerase reaction using the same}
본 발명은 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 형광물질이 연결된 뉴클레오티드, 이를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물, 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다.
DNA 중합효소 반응의 정량적 분석은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하거나 시료내의 특정 유전자의 함량을 정량하거나 DNA-항체 결합체를 이용하여 수행하는 immuno-PCR 등의 다양한 기술에 필수적으로 적용되는 과정이다.
상기와 같은 정량적 분석을 위해서는 DNA 자체가 신호를 낼 수 있는 부위를 포함하고 있지 않아, 반응의 진행 정도를 신호화하여 검출할 수 있는 방법이 필요하다.
전통적으로는 젤-전기영동 후 DNA 염기 사이에 삽입 가능한 염료로 착색하는 방법이 널리 이용되었으나, 상기 방법은 지나치게 번거롭고, 자동화가 불가능하고 또한 DNA 검출의 동적 영역이 매우 좁은 단점이 있다. 나아가, 상기 젤을 이용한 방법은 최종점 검출(end-point detection)에 의한 반응 산물의 DNA를 정량하는 것이므로 반응 진행과정에서 중합반응에 의해 만들어지는 DNA의 양을 실시간으로 정량하는 것은 불가능하다.
상기와 같은 단점을 극복하고 실시간 중합효소 반응분석을 가능하게 하기 위하여, 현재 두 종류의 형광 신호 탐침 분자가 사용되고 있다.
그 중 하나는 DNA결합 형광 염료(예, SYBR Green I)를 사용하는 방법으로, 상기 염료는 본래 형광을 발산하지 않지만 DNA와 결합시 형광을 발산하는 성질을 있어서, 반응의 진행에 따라 생성되는 DNA 이중 사슬의 양에 비례해서 염료가 DNA와 결합하게 된다. 이를 통해 DNA 이중 사슬의 양에 비례하여 형광 세기 신호를 수득할 수 있다.
또 다른 방법은 5‘, 3’양 말단에 각각 형광물질(fluorophore) 및 형광 소멸물질 (quencher)로 표지가 되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법이다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 중합되어 생성되는 DNA의 염기서열의 일부분과 상보적이다. 중합효소 반응용액에 상기 올리고뉴클레오티드를 포함시켜 반응시키면, 중합효소가 상기 상보적인 부분에 결합하게 되고, 올리고뉴클레오티드가 구조적으로 변형되거나(hybridization probe) 중합효소의 뉴클레아제활성에 의해 파괴됨으로써(hydrolysis probe: TaqMan probe), 형광세기가 증가하게 된다. 따라서, 생성된 DNA의 양에 비례하여 형광 세기가 증가하게 되며 이 신호를 이용하여 실시간으로 중합효소 반응을 정량적으로 분석할 수 있다.
그러나 상기 두 종류의 방법은 많은 단점이 있는 것으로 지적되고 있다.
먼저 DNA결합 형광 염료를 이용한 방법은 형광 염료 자체가 종종 중합반응의 효율에 영향을 미칠 수 있고, 형광 염료가 단일 사슬보다는 이중 DNA 사슬에 더 큰 결합력을 지니기 때문에, RCA(rolling circle amplification)같은 단일 사슬이 중합효소 반응의 산물일 경우에는 분석에 이용될 수 없는 단점이 있다. (Gusev, Y et al. American Journal of Pathology, 159, 63-69, 2001) 또한 상기 DNA 결합 형광 염료를 사용하여 실시간 PCR 분석에 사용하는 경우에도 프라이머 이합체(primer dimer)와 같이 중합반응과 상관없이 생성된 이중 사슬에도 비특이적으로 결합하여 형광신호를 발산할 수 있으므로 잘못된 검출신호(false-positive signal)가 생성되는 문제가 있다.(Ponche, F et al. BMC Biotechnology, 3, 18, 2003)
또한 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법의 경우에도 프로브의 제조 비용이 상대적으로 높으며 원하는 검출 신호를 얻기 위해서 세심한 염기서열을 선택하여 프로브를 제작하여야 하는 문제가 있다. 특히 온도 변화를 주지 않는 등온반응(isothermal reaction) 조건에 의해 DNA 이중사슬이 생성되는 중합효소 반응에서는 생성된 이중 사슬의 열적 안정성 때문에 올리고뉴클레오티드 탐침 분자가 결합하기 힘들거나 결합하더라도 매우 오랜 시간이 필요하기 때문에 분석이 불가능하다. 이러한 단점은 프로브가 반응 자체에는 필요가 없으나 신호 검출을 위해 추가적으로 제작되어 사용되기 때문인 것으로 볼 수 있다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 프로브를 사용하지 않고 실제 중합 반응에 관여하는 뉴클레오티드 단량체 중에서 퓨린(purine) 계열 염기를 가진 dGTP또는 dATP를 화학적으로 변형하여 형광물질을 연결하고, 이를 통해 실시간 중합효소 반응을 분석할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112010052608309-pat00001
또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반응용 분석 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계, (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반응 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112010052608309-pat00002
또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반응용 분석 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계, (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반응 분석방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 감마 인산기에 링커를 통해 형광물질이 결합된 구조로, 뉴클레오티드 자체에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기와 형광물질을 모두 함유하고 있다.
본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112010052608309-pat00003
상기 화학식 1에서 R1은 아데닌(Adenine) 또는 구아닌(Guanine)이며, 상기 R2는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-, -(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이고, 여기에서 m은 1 내지 20인 정수이고 n은 2 내지 60인 정수이고, 상기 R3는 형광물질이며, 상기 Y는 O 또는 S이다.
본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 상기와 같이 퓨린 계열의 염기를 가진 dATP(deoxyadenosine triphosphate) 또는 dGTP(deoxyguanosine triphosphate)의 감마 인산기에 링커(R2)를 연결하고 이에 형광물질(R3)이 결합된 구조이다. 상기 링커(R2)는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-, -(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이며, 여기에서 상기 m이 20을 초과하거나, 상기 n이 60을 초과하는 경우 뉴클레오티드 내에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기 부위와 형광물질간의 거리가 너무 멀게 되어 형광소멸이 효과적으로 일어나지 않을 수 있으며, 또한 상기 m이 1 미만이거나, 상기 n이 2 미만인 경우 중합효소가 기질로 이용할 수 없을 수 있으므로 상기 m은 1 내지 20인 정수이고, 상기 n은 2 내지 60인 정수인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 m은 2 내지 10인 정수이고 상기 n은 2 내지 20인 정수임이 바람직하다.
본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 그 자체에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기와 형광물질을 모두 함유하고 있음이 특징이다. 구체적으로 DNA 중합효소에 의해 본 발명의 뉴클레오티드가 기질로 사용될 때, 부산물로 형광이 표지된 파이로포스페이트가 생성되면서 반응 전에 소멸되어 있던 형광 세기가 복원되어 증가하게 된다.(도 1 참조)
따라서 기존의 실시간 중합효소 분석 방법들에서 반응에 참여하는 기질(dNTPs) 외에 추가적으로 형광 신호 생성을 위한 프로브들이 필수적인 반면, 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 이용하는 경우, 반응에 참여하는 기질 외의 추가적인 프로브들이 필요치 않아 반응 자체의 진행을 통하여 형광 신호의 생성이 가능하다.
본 발명에서 형광물질은 퓨린 염기에 의하여 형광 세기가 소멸될 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 플루오레세인(fluorescein), 보디피 FL (Bodipy-FL), 보디피 R6G (Bodipy-R6G), 퍼시픽 블루 (Pacific Blue), 마리나 블루 (Marina Blue), 쿠마린 (coumarin), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), Cy5, Cy3 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 퓨린 염기에 의하여 형광 세기가 가장 크게 소멸될 수 있는 보디피 FL (Bodipy-FL)일 수 있다.
본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 (1) dATP 또는 dGTP과 탄소 또는 탄소와 산소가 혼합된 원소 2 내지 60개로 이루어지는 사슬의 아민류 바람직하게는 에틸렌디아민(ethylenediamin)을 반응시켜, dATP 또는 dGTP의 감마 인산기에 아민기를 형성하는 단계, (2) 감마 인산기에 아민기가 형성된 dATP 또는 dGTP와 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester)기가 연결된 형광체와 반응시키는 단계를 통하여 제조될 수 있다. (도 2 참조)
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 본 발명의 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 실시간 중합효소 반응에 사용되는 기질(dNTPs)이 함유된 반응 용액일 수 있으며, 본 발명에서는 상기 기질에서 종래 dATP 또는 dGTP 대신에 본 발명의 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 dCTP(deoxycytidine triphosphate) 및 dTTP(deoxythymidine triphosphate)를 추가적으로 함유할 수 있다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 상기 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 기질로 사용할 수 있는 중합효소를 추가적으로 함유할 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 Taq DNA 중합효소, Therminator γ DNA 중합효소 및 phi29 DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 중합효소를 추가적으로 함유할 수 있다.
상기 Taq DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 NCBI accession no가 AAA27507인 중합효소 일 수 있으며 상기 Therminator γ DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 New England Biolabs사(catalog no: M0334L 또는 M0334S)에서 판매되는 것일 수 있으며, 상기 phi29 DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 NCBI accession no가 YP_002004529인 중합효소일 수 있다.
또한 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 당업자에게 널리 알려진 중합효소 반응에 필요한 완충용액과 염을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 완충용액과 염은 DNA 중합효소 반응에 통상적으로 사용되는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 검출 대상 핵산을 주형으로 검출 대상 핵산의 특정 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하여 중합효소 반응을 수행함으로써 검출 대상 핵산을 정량적으로 분석하는데 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출 대상 핵산은 당업자가 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 검출하고자 하는 핵산 서열이 특정되면 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머는 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명에서 실시간 중합효소 반응은 핵산(DNA 또는 RNA)의 특정 부위를 선택적으로 복제하고 증폭시켜 검출하고자 하는 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 반응이다. 상기 실시간 중합효소 반응은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
구체적으로 상기 실시간 PCR은 농도를 알고 있는 검출 대상 핵산 및 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물로 증폭하여 상기 농도 변화에 따른 형광세기를 측정하고 일정한 형광세기(threshold)에 도달하는 PCR 반응회수(Ct값)를 분석하는 단계와, 상기 농도와 Ct값을 대응시켜 표준 곡선을 작성하는 단계와, 미지 검출 시료로부터 핵산을 추출한 다음 PCR 증폭하여 Ct값을 수득하고 이를 상기 표준 곡선에 대응시켜 미지 검출 시료에 함유된 검출 대상 핵산을 정량적으로 분석하는 방법이다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 종래 DNA 결합 형광 염료를 이용한 경우의 문제점을 해결한 것으로 구체적으로 종래 DNA 결합 형광 염료(SYBR green I)를 사용하여 PCR 분석하는 경우, 주로 단일 사슬보다 이중 DNA 사슬에 더 큰 결합력을 지니기 때문에 RCA와 같이 단일 사슬이 중합효소 반응의 산물일 경우에는 분석에 이용될 수 없지만, 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 RCA에도 적용될 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 기존의 실시간 중합효소 반응용 조성물에 필수적인 프로브가 필요하지 않으므로, 종래 검출 신호를 얻기 위해서 특정한 염기서열을 선택하여 프로브를 제작하는데 소요되는 비용 및 시간을 절감할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 분석 키트는 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분석 키트는 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물을 함유하는 것이외에 당업계에 공지된 키트에 함유되는 구성 성분을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 비드 및 기판 등의 기제등을 포함할 수 있다.
본 발명의 분석 키트는 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 반응 분석에 적용될 수 있으며 나아가 검출 대상이 RNA인 경우 실시간 RT(reverse transcription)-PCR에 적용될 수 있다.
본 발명의 분석 키트를 통한 형광 신호는 당업계에 공지된 형광 신호 측정 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
한편, 본 발명의 실시간 중합효소 반응 분석방법은 (a) 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계, (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 실시간 중합효소 반응 분석방법은 핵산(DNA 또는 RNA)의 특정 부위를 선택적으로 복제하고 증폭시켜 검출하고자 하는 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 분석 방법이다. 바람직하게는 실시간 중합효소 반응의 결과로 발생하는 형광 세기를 측정함으로써 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 분석 방법이다.
각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
상기 (a) 단계에서 프라이머는 검출 대상 핵산의 특정 부위를 증폭할 수 있는 것으로 이는 검출 대상 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 부위가 특정되면 당업자가 공지된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 시료는 바람직하게는 인간을 포함한 동물의 체액, 혈청, 혈장 또는 혈액일 수 있으며, 상기 시료로부터 핵산을 추출하는 것은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 Qiagne사의 QIAamp DNA Blood Mini Kit을 이용하여 정해진 매뉴얼에 따라 추출할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 프라이머와 본 발명의 반응용 조성물을 이용해 시료로부터 추출된 핵산을 주형으로 실시간 중합효소 반응을 수행하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 형광물질이 삽입된 뉴클레오티드를 기질로 사용될 수 있는 중합효소를 사용하는 것이 바람직하며 이에 대해서는 앞서 기재한 바와 같다.
상기 (c) 단계에서 형광신호는 당업계에 공지된 형광 신호 측정 장치를 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 측정 결과를 통하여 검출 대상 시료에서 핵산의 함량을 정량적으로 분석할 수 있다.
상기 정량 분석을 위해서는 농도를 알고 있는 검출 대상 핵산 및 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물로 증폭하여 상기 농도 변화에 따른 형광세기를 측정하고 일정한 형광세기(threshold)에 도달하는 PCR 반응회수(Ct값)를 분석하고 상기 농도와 Ct값을 대응시켜 작성된 표준 곡선을 통하여 정량 분석을 할 수 있으며 이에 대해서는 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.
상기 분석방법은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 반응 분석에 적용될 수 있으며 나아가 검출 대상이 RNA인 경우 실시간 RT(reverse transcription)-PCR에 적용될 수 있다.
본 발명의 분석방법은 종래 SYBR green I을 이용한 실시간 중합효소 반응에 비하여 각 분석 성능의 지표가 되는 비교 항목(효율성, 민감도)에서 개선된 결과를 나타내어, 보다 효과적으로 실시간 중합효소 반응을 분석하는데 용이하게 사용될 수 있다.(표 2 참조)
또한 본 발명의 분석방법은 종래 방법에서 프로브로 인하여 야기될 수 있는 잘못된 신호 생성이 근본적으로 불가능하며, 비용적 측면에서도 매우 유리하다. 특히 하기 표 1에 기재한 바와 같이, 기존의 방법들을 사용하여 분석할 수 없는 중합효소 반응들을 본 발명의 방법을 사용하면 쉽게 분석이 가능하기 때문에 보다 다양하게 적용될 수 있다.
본 발명의 분석기술과 종래 방법의 비교
기술 분야 DNA binding dyes Hydrolysis probes (oligonucleotides) Hybridization probes (oligonucleotides) 본 발명
PCR Good Good Good Good
RCA Moderate Bad Good Good
Isothermal polymerization Moderate Good Bad Good
본 발명은 중합효소 반응 기질 중 하나인 뉴클레오티드를 화학적으로 변형하여 기질의 역할 외에 형광 신호 생성의 역할도 부여함으로써, 프로브를 제작할 필요가 없어 경제적이며, PCR, RCA 및 등온 중합 반응 등 다양한 실시간 중합효소 반응에 용이하게 적용될 수 있으며 분석 성능도 기존 방법에 비하여 매우 우수하다.
도 1은 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행할 경우 형광 신호가 생성되는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 합성하는 방법을 나타낸 반응식이다.
도 3은 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 기질로 중합반응을 유도할 수 있는 중합효소를 검색한 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드와 Therminator γ DNA 중합효소를 이용하여 정량적인 실시간 PCR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
(표준시료의 DNA 농도를 10 nM 내지 10 fM로 10배수로 설정함)
도 5는 자연 뉴클레오티드와 Taq DNA 중합효소를 이용하여 정량적인 실시간 PCR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드와 phi29 DNA 중합효소를 이용한 실시간 RCA 분석결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
NH 2 - dGTP 의 합성
100 mM MES 완충용액 (Sigma-Aldrich) 500 ul에 100mM 농도의 dGTP 50 ul와 EDC(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, Sigma-Aldrich) 30 mg을 가했다. 실온에서 5분 동안 교반한 뒤, 이 혼합 반응용액에 10 mg의 ethylenediamine?HCl (Sigma-Aldrich)을 가한 뒤, 4℃에서 16시간 동안 교반하였다. 역상 HPLC를 사용하여 정제된 NH2-dGTP를 수득하였다.
구체적으로 상기 역상 HPLC를 수행하기 위하여, A 버퍼로 물에 희석된 20 mM TEAB (tetraethylammonium bicarbonate)를, B 버퍼로 90 % 아세토니트릴(acetonitrile)에 용액에 20 mM TEAB (tetraethylammonium bicarbonate)를 사용하고, 10분 동안 B 버퍼를 0%로 설정하고 10 내지 40분 동안 B 버퍼를 0에서 100%로 설정하여 HPLC를 진행하였다.
< 실시예 2>
γF- dGTP 의 합성
상기 <실시예 1>에서 정제된 NH2-dGTP를 PBS(phosphate buffered saline) 50 ul에 5.4 mM이 되도록 녹이고 이에 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹아있는 Bodipy-FL(10 mM, 400 ul)을 가한 다음, 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 <실시예 1>에 기재된 역상 HPLC를 사용하여 정제된 γF-dGTP를 수득하였다.
< 실시예 3>
γF- dGTP 를 기질로 사용 가능한 DNA 중합효소 검색
DNA 중합효소 검색은 시발체(primer) 연장 반응을 통하여 수행되었다.
구체적으로 상기 시발체 연장 반응은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 형광이 표지된 시발체 (5’-fluorescein-CTGACTGCATCT AGACGTGACTGA , 1 uM, Intergrated DNA Technologies), 서열번호 2의 염기서열로 기재된 주형사슬 (5’-AGATGCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG TCAGTCACGTCT , 1 uM, Intergrated DNA Technologies), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), γF-dGTP (25 uM), 중합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs), 및 4 units의 DNA 중합효소(Taq, Vent(exo-), DeepVent (exo-), Bst, 또는 Therminator γ)(모두 New England Biolabs에서 구입)를 포함하는 20 ul부피의 반응 혼합용액을 제조하여 수행하였다.
보다 구체적으로 상기 제조된 반응 혼합용액을 94°C에서 20초, 46°C에서 40초, 그리고 60°C에서 90초간 가열하는 과정으로 이루어지는 사이클을 다섯 번 반복함으로써 수행되었다.
대조군 실험을 위해 상기와 똑같은 실험 조건 하에서 γF-dGTP 대신 자연상태의 dGTP를 사용하여 Taq DNA 중합효소 반응을 수행하였다.
또한, 등온성 중합효소인 Klenow Fragment (exo-)( New England Biolabs에서 구입)를 이용한 연장 반응을 수행할 시에는 반응 온도를 37°C에서 7.5분간 가열하였다.
각 중합효소 반응 후에, 반응 혼합 용액은 20% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)을 이용하여 전개하고(Vertical Gel Electrophoresis Unit, Sigma-Aldrich) 그 결과로 얻은　DNA 형광밴드의 이미지를 형광 scanner (Typhoon9400, GE healthcare)를 사용하여 수득하였으며 이를 도 3에 기재하였다.
상기 도 3에 기재한 바와 같이, Taq DNA 중합효소와, Therminator γ DNA 중합효소가 변형된 뉴클레오티드인 γF-dGTP를 기질로 사용하여 DNA의 주형 사슬을 연장하여 완전히 연장된 중합 산물을 만들 수 있음을 알 수 있다.
< 실시예 4>
γF- dGTP 을 이용한 실시간 PCR ( real - time PCR ) 분석
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 (5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC, 100 nM), 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 (5’- ACCCTGTTGCTGTAGCCA , 100 nM), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 주형사슬 (5’-CCACTCCTCCACCTTTGCCGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGCCAACGAATT TGGCTACAGCAACAGGGT , 10 nM 내지 10 fM), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), γF-dGTP (25 uM), 중합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs), 및 Therminator γ DNA 중합효소(2 units)를 포함하는 20 ul부피의 반응 혼합 용액을 실시간 PCR 반응 분석에 사용하였다.
상기 PCR 사이클은 94°C에서 10초, 54°C에서 15초, 그리고 72°C에서 10초로 구성하고 총 40사이클을 수행하였다. 형광 세기량은 StepOne real-time PCR system(ABI)기기를 사용하여 각 사이클이 진행된 후에 실시간으로 측정하여 그 결과를 도 4에 기재하였다. (형광 필터: ex/em = 490/520 nm) (도 4).
상기 도 4에 기재한 바와 같이, 주형사슬을 10 nM 내지 10 fM로 10배씩 희석한 반응용액으로부터 총 7개의 증폭 곡선을 수득하고, 도 4에 표시된 특정 수치를 역가(threshold)로 설정하여 이와 증폭 곡선이 만나는 점을 Ct(threshold cycle)값으로 산정하여 Ct 값과 초기 주형사슬 함량의 함수 관계를 도시하였다.
< 비교예 1>
SYBR green I을 이용한 실시간 PCR ( real - time PCR ) 분석
상기 <실시예4>에서 사용된 프라이머와 주형사슬을 동일한 양으로 포함하면서, dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), dGTP (25 uM, Promega), 중합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs), SYBR green I (1/20,000 희석, Invitrogen) 그리고 Taq DNA 중합효소(2 units)를 포함하는 20 ul부피의 반응 혼합 용액을 사용하여 실시간 PCR 반응 분석을 실시하였다. 상기 <실시예 4>와 같은 PCR 조건 및 기기를 사용하여 동일한 방법으로 분석을 수행하고 그 결과를 도 5에 기재하였다.
상기 도 5에 기재한 바와 같이, 종래 알려진 real-time PCR을 수행한 결과와, 상기 <실시예 4>에서 γF-dGTP를 사용하여 real-time PCR을 수행한 결과는 매우 유사함을 알 수 있으며, 이를 통해 γF-dGTP를 사용함으로써 real-time PCR 분석이 가능함을 알 수 있다.
상기 <실시예 4>와 <비교예 1>의 결과를 비교하면 하기 표 2과 같다.
기술 항목 SYBR green I
(비교예 1)		 본 발명
(실시예 4)		 기준
Efficiency　 (%)
[100×( 10(-1/ slope ) -1)]		 80.5 93.4 최고 = 100%
Data Fitting
(R2 value)		 0.999 0.999 최고 = 1.00
Sensitivity
(Required PCR cycles for 1 copy number: Y-intercept)		 47.2 41.5 낮을수록 민감
각 수치에 대한 구체적인 내용은 http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_053906.pdf를 참조
상기 표 2에 기재된 바와 같이, 본 발명은 종래 SYBR green I을 이용한 실시간 중합효소 반응에 비하여 각 분석 성능의 지표가 되는 비교 항목(효율성, 민감도)에서 개선된 결과를 나타내었다.
< 실시예 5>
γF- dGTP 을 이용한 실시간 RCA ( real - time RCA ) 분석
서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 (5’-CTGCTGCATCTAGACGTGACTGA, 100 nM), 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 주형사슬 (5’-GATGCAGTCAGTCGTCATCGAGTCGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCACGTCT, 100 nM), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), γF-dGTP (25 uM), BSA (100 μg/mL), Phi29 DNA 중합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs), 그리고 Phi29 DNA 중합효소 (6 units)를 포함된 20 ul 부피의 반응 혼합용액을 제조하고 이를 실시간 RCA (rolling circle amplification) 반응 분석에 사용하였다. 상기 반응은 30°C에서 20분 동안 수행하였으며, 매 20초마다 반응 용액의 형광 세기를 상기 <실시예 4>에서 사용한 기기를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
상기 도 6에 기재한 바와 같이, 본 발명의 변형된 뉴클레오티드를 이용하여실시간 RCA (real-time RCA)를 실시하여도 형광 강도가 증가함을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기의 화학식 1로 표시되는 뉴클레오티드, 및
    Taq DNA 중합효소 및 Therminator γ DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 중합효소
    를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112012028724437-pat00011

    상기 R1은 아데닌(Adenine) 또는 구아닌(Guanine)이며,
    상기 R2는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-, -(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이고, 여기에서 m은 1 내지 20인 정수이고 n은 2 내지 60인 정수이고,
    상기 R3는 형광물질이며,
    상기 Y는 O 또는 S이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 dCTP(deoxycytidine triphosphate) 및 dTTP(deoxythymidine triphosphate)를 추가적으로 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR (polymerase chain reaction) 및 등온 중합 (isothermal polymerization)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 실시간 중합효소 반응용 조성물.
  8. 제3항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항의 실시간 중합효소 반응용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반응용 분석 키트.
  9. (a) 제3항 또는 제4항의 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계;
    (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및
    (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반응 분석방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 및 등온 중합 (isothermal polymerization)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 실시간 중합효소 반응 분석방법.
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