WO2012023675A1 - 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응 - Google Patents

변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응 Download PDF

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WO2012023675A1
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한국과학기술연구원
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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to modified nucleotides and real-time polymerase reaction using the same, and more particularly, the present invention relates to a nucleotide to which a fluorescent substance is linked : a composition, an analysis kit, and an analysis method for real-time polymerase reaction containing the same.
  • Quantitative analysis of DNA polymerase reactions is an essential procedure for various techniques such as immuno-PCR, which measures the expression level of a specific gene, quantifies the content of a specific gene in a sample, or performs a DNA-antibody conjugate.
  • the method of staining with dyes insertable between DNA bases after gel-electrophoresis has been widely used, but the method has the disadvantages of being too cumbersome, non-automable and having a very narrow dynamic range of DNA detection. Furthermore, since the method using the gel is to quantify the DNA of the reaction product by end-point detection, it is impossible to quantify the amount of DNA produced by the polymerization reaction in real time.
  • One of them is a method of using a DNA-binding fluorescent dye (for example, SYBR Green I).
  • the dye does not inherently emit fluorescence but has a property of emitting fluorescence upon binding to DNA. Double chain In proportion, the dye binds to the DNA. This allows obtaining a fluorescence intensity signal in proportion to the amount of the DNA double chain.
  • Another method is to use oligonucleotides labeled with a fluorophore and a fluorescent quencher at 5 ', 3 and both ends, respectively.
  • the base sequence of the oligonucleotide is complementary to a portion of the base sequence of the DNA produced by polymerization. Including the oligonucleotide in the polymerase reaction solution causes the polymerase to bind to the complementary moiety, and the oligonucleotide is structurally modified (hybridization probe) or destroyed by nuclease activity of the polymerase (hydrolysis). probe: TaqMan probe), increasing fluorescence intensity. Therefore, the fluorescence intensity increases in proportion to the amount of generated DNA, and this signal can be used to quantitatively analyze the polymerase reaction in real time.
  • the method using DNA-linked fluorescent dyes is a single method, such as rolling circle amplification (RCA), because fluorescent dyes themselves can often affect the efficiency of polymerization reactions and fluorescent dyes have a greater binding capacity to double DNA chains than single chains. If the chain is the product of a polymerase reaction, there is a disadvantage that cannot be used for analysis. (Gusev, Y et al. American Journal of Pathology, 159, 63-69, 2001) In addition, even when used for real-time PCR analysis using the DNA-binding fluorescent dye, irrespective of polymerization reaction, such as primer dimer. There is a problem in that false-positive signals are generated because non-specifically binding to the generated double chain can emit a fluorescent signal (Ponche, F et al. BMC Biotechnology, 3, 18, 2003).
  • RCA rolling circle amplification
  • the present inventors chemically modify dGTP or dATP having a purine-based base among nucleotide monomers involved in the actual polymerization reaction without using a probe, thereby connecting the fluorescent material, and
  • the present invention has been completed by revealing that the real-time polymerase reaction can be analyzed.
  • an object of the present invention is to provide a nucleotide to which the fluorescent material represented by the following formula (1) is linked.
  • the present invention (a) preparing a primer composition capable of amplifying the real-time polymerase semi-finished composition and the site of the nucleic acid to be detected, (b) extracting the nucleic acid from the sample, in the step (a) as a template Performing real-time polymerase reaction using the prepared real-time polymerase reaction composition and primer and (c) detecting and detecting the fluorescence signal in step (b)
  • An object of the present invention is to provide a real-time polymerase reaction analysis method comprising the step of quantitatively analyzing the content of a nucleic acid of interest.
  • the present invention provides a nucleotide is connected to the fluorescent material represented by the formula (1).
  • the present invention also provides a composition for real-time polymerase reaction containing the nucleotide.
  • the present invention provides an analysis kit for a real-time polymerase reaction containing the composition for real-time polymerase reaction.
  • the present invention (a) preparing a primer composition capable of amplifying the real-time polymerase semi-finished composition and the site of the nucleic acid to be detected, (b) extracting the nucleic acid from the sample, in the step (a) as a template Real-time polymerase reaction using the prepared real-time polymerase reaction composition and primer and (c) real-time comprising the step of quantitatively analyzing the content of the target nucleic acid by measuring the fluorescence signal in the step (b) Provided polymerase reaction method.
  • a primer composition capable of amplifying the real-time polymerase semi-finished composition and the site of the nucleic acid to be detected
  • the nucleotide to which the fluorescent material is connected is a structure in which the fluorescent material is coupled to the gamma phosphate group of the nucleotide through a linker, and contains both a purine-based base and a fluorescent material which acts as a fluorescence decay in the nucleotide itself.
  • the nucleotides to which the fluorescent material is linked are represented by the following formulas.
  • R is-(CH 2 OCH 2 ) m-CH 2 NH-, -NHCH 2- (CH 2 OCH 2 ) m-CH 2 NH -,-(CH 2 ) n-NH- or -NH- (CH 2 ) n-NH-, where m is an integer from 1 to 20, n is an integer from 2 to 60, and R 3 is a fluorescent substance And Y is 0 or S.
  • the nucleotide to which the fluorescent material is linked is connected to a linker (R 2 ) to a gamma phosphate group of a deoxyadenosine triphosphate (dATP) or a deoxyguanosine triphosphate (dGTP) having a purine-based base as described above, and a fluorescent material (R 3 ) is bonded thereto.
  • a linker R 2
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine triphosphate
  • linker (R 2 ) is-(CH 2 OCH 2 ) m-CH 2 NH-, -NHCH 2- (CH 2 OCH 2 ) m-CH 2 NH-,-(CH 2 ) n-NH- or- NH- (CH 2 ) n-NH-, where m is greater than 20, or if n is greater than 60, the distance between the base of the purine series and the fluorescent material acting as fluorescence decay in the nucleotide is too far Fluorescence extinction may not occur effectively, and when m is less than 1 or n is less than 2, the polymerase may not be used as a substrate, and m is an integer of 1 to 20, and n is 2 to 60 It is preferable that it is an integer which is. More preferably, m is an integer of 2 to 10 and n is an integer of 2 to 20.
  • the nucleotide to which the fluorescent material of the present invention is connected is characterized by containing both a purine-based base and a fluorescent material which itself act as a fluorescence quench.
  • the nucleotide of the present invention is When used as a substrate, a fluorescence-labeled pyrophosphate is produced as a by-product, and the fluorescence intensity that has been extinguished before the reaction is restored and increased.
  • probes for generating fluorescence signals are essential, whereas in the case of using the nucleotides to which the fluorescent substance of the present invention is linked, Since no additional probes other than the substrate are required, the fluorescence signal can be generated through the progress of the reaction itself.
  • the fluorescent material is not limited thereto as long as the fluorescence intensity may be extinguished by the purine base, but preferably, fluorescein, fluorescein (Bodipy-FL), and bodice R6G (Bodipy-R6G) , Pacific Blue, Marina Blue, coumarin, tetramethylrhodamine, Cy5, Cy3 and Texas Red, most preferably May be Bodipy-FL, in which the fluorescence intensity is most extinguished by the purine base.
  • fluorescein fluorescein
  • fluorescein Bodipy-FL
  • bodice R6G Bodipy-R6G
  • the nucleotide to which the fluorescent substance of the present invention is linked is (1) dATP or dGTP and amines of a chain consisting of 2 to 60 elements in which carbon or carbon and oxygen are mixed, preferably ethylenediamine, to react gamma of dATP or dGTP.
  • Forming an amine group in the phosphate group, (2) gamma phosphate group can be prepared by the step of reacting with a phosphor to which the dATP or dGTP and the succinimidyl ester group is formed. (See FIG. 2)
  • the composition for real-time polymerase reaction of the present invention is not limited thereto, and preferably, the nucleotide of the present invention is contained.
  • composition for real-time polymerase reaction of the present invention may be a reaction solution containing a substrate (dNTPs) used for real-time polymerase reaction, and in the present invention, the substrate contains the nucleotide of the present invention instead of the conventional dATP or dGTP. It features.
  • composition for real-time polymerase reaction of the present invention is not limited thereto but is preferably dCTP (deoxycytidine triphosphate) and dTTP (deoxythymidine). triphosphate).
  • the real-time polymerase reaction composition of the present invention may further contain a polymerase that can use the nucleotides to which the fluorescent material is linked, but is not limited thereto.
  • a polymerase that can use the nucleotides to which the fluorescent material is linked, but is not limited thereto.
  • TaqDNA polymerase, Therminator ⁇ DNA polymerase, and phi29 DNA It may further contain a polymerase selected from the group consisting of polymerases.
  • the Taq DNA polymerase may be, but is not limited to, a polymerase having NCBI accession no of AAA27507, and the Therminator ⁇ DNA polymerase is not limited thereto but is preferably New England Biolabs (catalog no: M0334L or M0334S).
  • the phi29 DNA polymerase may be, but is not limited to, a polymerase having NCBI accession no of YP_002004529.
  • the real-time polymerase half-fung composition of the present invention may further comprise a complete solution and salt required for the polymerase reaction well known to those skilled in the art.
  • the complete layer solution and salt is not limited to those conventionally used in the DNA polymerase reaction.
  • composition for real-time polymerase reaction of the present invention can be usefully used to quantitatively analyze a target nucleic acid by performing a polymerase reaction by designing a primer capable of amplifying a specific region of the target nucleic acid as a template. Can be.
  • the nucleic acid to be detected means a nucleic acid sequence to be detected by those skilled in the art, and the nucleic acid includes DNA or RNA.
  • primers capable of specifically amplifying them can be easily designed by those skilled in the art.
  • the real-time polymerase reaction is a reaction capable of selectively replicating and amplifying a specific site of a nucleic acid (DNA or RNA) to confirm the presence of a nucleic acid to be detected and further quantitatively detecting the nucleic acid in real time.
  • the real time polymerase reaction is not limited thereto, but preferably, real time
  • PCR Polymerase chain reaction
  • RCA real time rolling circle amplification
  • the real-time PCR amplifies the composition for real-time polymerase reaction of the present invention using a nucleic acid for detecting a target and a primer capable of specifically amplifying the concentration, thereby measuring the fluorescence intensity according to the change in concentration and constant fluorescence. Analyzing the number of PCR reactions (Ct value) reaching the intensity, generating a standard curve by treating the concentration and the Ct value, extracting nucleic acid from the unknown detection sample and then PCR amplification to determine the Ct value It is a method of quantitatively analyzing the target nucleic acid contained in an unknown detection sample by obtaining and subtracting it on the standard curve.
  • the composition for real-time polymerase reaction of the present invention solves the problem of using a conventional DNA-binding fluorescent dye. Specifically, when performing PCR analysis using a conventional DNA-binding fluorescent dye (SYBR green I), a double DNA is mainly used than a single chain. Single chains are products of polymerase reactions, such as RCA, because of their greater binding capacity ; Although the case may not be used for analysis, the composition for real-time polymerization effect of the present invention has an effect that can be applied to RCA.
  • a conventional DNA-binding fluorescent dye SYBR green I
  • Single chains are products of polymerase reactions, such as RCA, because of their greater binding capacity ;
  • the composition for real-time polymerization effect of the present invention has an effect that can be applied to RCA.
  • composition for real-time polymerase reaction of the present invention does not require a probe essential for the existing composition for real-time polymerase reaction, the cost and time required to manufacture a probe by selecting a specific sequence to obtain a conventional detection signal are reduced. can do.
  • the analysis kit for real-time polymerase reaction of the present invention is characterized in that it contains the real-time polymerase reaction composition.
  • the assay kit of the present invention may further contain components contained in kits known in the art.
  • it can contain base materials, such as a bead and a board
  • the assay kit of the present invention is a real-time polymerase reaction, such as real-time PCR (polymerase chain reaction), isothermal polymerization (isothermal polymerization), and real-time
  • RNA For response analysis selected from the group consisting of RCA (rolling circle amplification)
  • PCR real-time reverse transcription
  • the fluorescence signal through the assay kit of the present invention can be measured using a fluorescence signal measuring device known in the art.
  • the real-time polymerase reaction method of the present invention comprises the steps of (a) preparing a composition for real-time polymerase reaction reaction of the present invention and a primer that can amplify the site of the target nucleic acid, (b) extracting the nucleic acid from the sample By using this as a template, real-time polymerase reaction is carried out using the composition and primer for real-time polymerase reaction prepared in step (a) and (c) measuring the fluorescence signal in step (b) to detect the target nucleic acid. It characterized in that it comprises the step of quantitative analysis of the content.
  • the real-time polymerase reaction method is an analysis method capable of confirming the presence or absence of a nucleic acid to be detected by selectively copying and amplifying a specific site of a nucleic acid (DNA or RNA) and further quantitatively detecting the nucleic acid in real time.
  • a nucleic acid DNA or RNA
  • the real-time polymerase reaction method is an analysis method capable of confirming the presence or absence of a nucleic acid to be detected by selectively copying and amplifying a specific site of a nucleic acid (DNA or RNA) and further quantitatively detecting the nucleic acid in real time.
  • the primer can amplify a specific site of the nucleic acid to be detected, which can be easily prepared according to a method known to those skilled in the art once a site capable of specifically detecting the nucleic acid to be detected is specified.
  • the sample may be body fluid, serum, plasma or blood of an animal including a human, and extracting nucleic acid from the sample may be performed using a method known to those skilled in the art. Can be extracted using Qiagne's QIAamp DNA Blood Mini Kit according to a specific manual.
  • the fluorescent material of the present invention is It is preferable to use a polymerase which can use the inserted nucleotides as a substrate, as described above.
  • the fluorescence signal may be measured using a fluorescence signal measuring apparatus known in the art, and quantitatively analyzes the nucleic acid content in the sample to be detected through the measurement result.
  • the PCR reaction frequency (Ct value) reaching the threshold can be analyzed and quantitative analysis can be performed through a standard curve prepared by treating the concentration and the Ct value, which can be easily performed by those skilled in the art.
  • the present invention may be applied to reaction reactions selected from the group consisting of, but not limited to, real-time polymerase chain reaction (PCR), isothermal polymerization, and real-time rolling circle amplification (RCA). (reverse transcription)-can be applied to PCR.
  • PCR real-time polymerase chain reaction
  • RCA real-time rolling circle amplification
  • Analysis method of the present invention is compared with the real-time polymerase banung using conventional SYBR green I indicated improved results in comparison items (efficiency, sensitivity) which is an index for each analysis performance, more 'easily to effectively analyze the real-time polymerase banung Can be used. (See Table 2)
  • the analytical method of the present invention is fundamentally impossible to generate a false signal that can be caused by the probe in the conventional method, it is also very advantageous in terms of cost.
  • polymerase reactions that cannot be analyzed using existing methods can be applied in a variety of ways because it can be easily analyzed using the method of the present invention.
  • Probe Bo Dim DNA binding (Hydrolysis probes, (Hybridization probes, dyes) oligonucleotides) oligonucleotides) PCR Good Good Good Good
  • the present invention chemically modifies nucleotides, which are one of the polymerase reaction substrates, to impart the role of fluorescence signal generation in addition to the role of substrates, thereby eliminating the need to fabricate probes and is economical. It can be easily applied to the polymerase reaction and the analysis performance is also very good compared to the existing method.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of generating a fluorescent signal when performing a real-time polymerase reaction using a nucleotide linked to the fluorescent material of the present invention.
  • Figure 2 is a semi-ungsik showing a method for synthesizing nucleotides linked to the fluorescent material of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) to search for a polymerase capable of inducing a polymerization reaction using a nucleotide linked to the fluorescent material of the present invention.
  • 4a and 4b are graphs showing the results of quantitative real-time PCR analysis using the nucleotide and therminator ⁇ DNA polymerase to which the fluorescent material of the present invention is linked.
  • FIGS. 5A and 5B are graphs showing the results of quantitative real-time PCR analysis using natural nucleotides and Taq DNA polymerase.
  • Figure 6 is a graph showing the results of real-time RCA analysis using nucleotides and phi29 DNA polymerase linked to the fluorescent material of the present invention.
  • TEAB tetraethylammonium bicarbonate
  • a buffer 20 mM TEAB (tetraethylammonium bicarbonate) in solution in 90% acetonitrile (acetonitrile) with B buffer
  • HPLC was performed with B buffer set to 0% for 10 minutes and B buffer set from 0 to 100% for 10 to 40 minutes.
  • NH 2 -dGTP purified in Example 1 was dissolved in 50 ul of PBS (phosphate buffered saline) to 5.4 mM, and Bodipy-FL (10 mM, 400 ul) dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) was added thereto. And stirred at room temperature for 3 hours. Purified Y F-dGTP was obtained using reversed phase HPLC described in ⁇ Example 1>.
  • DNA polymerase detection is accomplished through primer extension reactions. Was performed.
  • the sieve extension reaction is a sieve sieve labeled with a fluorescence described by the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the prepared reaction mixture was performed by repeating the cycle consisting of heating the process for 20 seconds at 94 ° C., 40 seconds at 46 ° C., and 90 seconds at 60 0 C.
  • Taq DNA polymerase reaction was performed using natural dGTP instead of yF-dGTP under experimental conditions such as above.
  • Taq DNA polymerase and Y F-dGTP a nucleotide modified by Therminator ⁇ DNA polymerase, can be used as a substrate to extend the template chain of DNA to form a fully extended polymerization product. It can be seen. ⁇ Example 4>
  • DATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), dGTP (25 uM, Promega), including the same amount of primer and template surgery used in ⁇ Example 4> ), Polymerase reaction buffer (New England Biolabs), SYBR green I (1 / 20,000 Talc, Invitrogen) and Taul DNA Polymerase (2 units) containing 20 ul of volumetric reaction mixture were used to analyze the real-time PCR reaction. Analysis was performed in the same manner using the same PCR conditions and instruments as in Example 4, and the results are shown in FIGS. 5A and 5B. As shown in FIGS.
  • the present invention showed an improved result in a comparison item (efficiency, sensitivity) that is an indicator of the performance of each assay compared to the real-time polymerase reaction using the conventional SYBR green I.
  • TCAGTCAGTCACGTCT 100 nM
  • dATP 25 uM, Promega
  • dCTP 25 uM, Promega
  • dTTP 25 uM, Promega
  • yF-dGTP 25 uM
  • BSA 100 g / mL
  • Phi29 DNA polymerase reaction mixture New England Biolabs
  • Phi29 DNA polymerase 6 units

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Abstract

본 발명은 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반응에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 형광물질이 연결된 뉴클레오티드, 이를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물, 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다. 분 발명은 중합효소 반응 기질 중 하나인 뉴클레오티드를 화학적으로 변형하여 기질의 역할 외에 형광 신호 생성의 역활도 부여함으로써, 프로브를 제작할 필요가 없어 경제적이며, PCR, RCA 및 등온 중합 반응 등 다양한 실시간 중합효소 반응에 용이하게 적용될 수 있으며 분석 성능도 기존 방법에 비하여 매우 우수하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반웅 【기술분야】
본 발명은 변형 뉴클레오티드 및 이를 이용한 실시간 중합효소 반웅에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 형광물질이 연결된 뉴클레오티드 : 이를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물, 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
DNA 중합효소 반웅의 정량적 분석은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하거나 시료내의 특정 유전자의 함량을 정량하거나 DNA-항체 결합체를 이용하여 수행하는 immuno-PCR 등의 다양한 기술에 필수적으로 적용되는 과정이다.
상기와 같은 정량적 분석을 위해서는 DNA 자체가 신호를 낼 수 있는 부위를 포함하고 있지 않아, 반웅의 진행 정도를 신호화하여 검출할 수 있는 방법이 필요하다.
전통적으로는 젤-전기영동 후 DNA 염기 사이에 삽입 가능한 염료로 착색하는 방법이 널리 이용되었으나, 상기 방법은 지나치게 번거롭고, 자동화가 불가능하고 또한 DNA 검출의 동적 영역이 매우 좁은 단점이 있다. 나아가, 상기 젤을 이용한 방법은 최종점 검출 (end-point detection)에 의한 반응 산물의 DNA를 정량하는 것이므로 반웅 진행과정에서 중합반응에 의해 만들어지는 DNA의 양을 실시간으로 정량하는 것은 불가능하다.
상기와 같은 단점을 극복하고 실시간 중합효소 반응분석을 가능하게 하기 위하여, 현재 두 종류의 형광 신호 탐침 분자가 사용되고 있다.
그 중 하나는 DNA결합 형광 염료 (예， SYBR Green I)를 사용하는 방법으로, 상기 염료는 본래 형광을 발산하지 않지만 DNA와 결합시 형광올 발산하는 성질을 있어서, 반응의 진행에 따라 생성되는 DNA 이중 사슬의 양에 비례해서 염료가 DNA와 결합하게 된다. 이를 통해 DNA 이중 사슬의 양에 비례하여 형광 세기 신호를 수득할 수 있다.
또 다른 방법은 5'， 3，양 말단에 각각 형광물질 (fluorophore) 및 형광 소멸물질 (quencher)로 표지가 되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법이다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 중합되어 생성되는 DNA의 염기서열의 일부분과 상보적이다. 중합효소 반응용액에 상기 올리고뉴클레오티드를 포함시켜 반웅시키면, 중합효소가 상기 상보적인 부분에 결합하게 되고, 올리고뉴클레오티드가 구조적으로 변형되거나 (hybridization probe) 중합효소의 뉴클레아제활성에 의해 파괴됨으로써 (hydrolysis probe: TaqMan probe), 형광세기가 증가하게 된다. 따라서, 생성된 DNA의 양에 비례하껴 형광 세기가 증가하게 되며 이 신호를 이용하여 실시간으로 증합효소 반응을 정량적으로 분석할 수 있다.
그러나 상기 두 종류의 방법은 많은 단점이 있는 것으로 지적되고 있다. 먼저 DNA결합 형광 염료를 이용한 방법은 형광 염료 자체가 종종 중합반웅의 효율에 영향을 미칠 수 있고, 형광 염료가 단일 사슬보다는 이중 DNA 사슬에 더 큰 결합력을 지니기 때문에, RCA(rolling circle amplification)같은 단일 사슬이 중합효소 반응의 산물일 경우에는 분석에 이용될 수 없는 단점이 있다. (Gusev, Y et al. American Journal of Pathology, 159, 63-69, 2001) 또한 상기 DNA 결합 형광 염료를 사용하여 실시간 PCR분석에 사용하는 경우에도 프라이머 이합체 (primer dimer)와 같이 중합반웅과 상관없이 생성된 이중 사슬에도 비특이적으로 결합하여 형광신호를 발산할 수 있으므로 잘못된 검출신호 (false-positive signal)가 생성되는 문제가 있다 .(Ponche, F et al. BMC Biotechnology, 3, 18, 2003)
또한 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법의 경우에도 프로브의 제조 비용이 상대적으로 높으며 원하는 검출 신호를 얻기 위해서 세심한 염기서열을 선택하여 프로브를 제작하여야 하는 문제가 있다. 특히 온도 변화를 주지 않는 등온반응 (isothermal reaction) 조건에 의해 DNA 이중사슬이 생성되는 중합효소 반웅에서는 생성된 이중 사슬의 열적 안정성 때문에 올리고뉴클레오티드 탐침 분자가 결합하기 힘들거나 결합하더라도 매우 오랜 시간이 필요하기 때문에 분석이 불가능하다. 이러한 단점은 프로브가 반응 자체에는 필요가 없으나 신호 검출을 위해 추가적으로 제작되어 사용되기 때문인 것으로 볼 수 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
상기와 같은 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 프로브를 사용하지 않고 실제 중합 반웅에 관여하는 뉴클레오티드 단량체 중에서 퓨린 (purine) 계열 염기를 가진 dGTP또는 dATP를 화학적으로 변형하여 형광물질을 연결하고, 이를 통해 실시간 중합효소 반응을 분석할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure imgf000005_0001
또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 함유하는 실시간 중합효소 반웅용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반응용 분석 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 실시간 중합효소 반웅용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계, (b) 시료로부터 핵산을 추출하고， 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반웅용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반웅을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반응 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
【기술적 해결방법】
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 제공한다.
[화학식 1]
Figure imgf000006_0001
또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 실시간 중합효소 반웅용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반응용 분석 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 실시간 중합효소 반웅용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계， (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반웅을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반웅 분석방법을 제공한다. 이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 감마 인산기에 링커를 통해 형광물질이 결합된 구조로, 뉴클레오티드 자체에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기와 형광물질을 모두 함유하고 있다. 본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 하기 화학식 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1] '
Figure imgf000007_0001
상기 화학식 1에서 R " 아데닌 (Adenine) 또는 구아닌 (Guanine)이며, 상기 R2는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-, -(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이고， 여기에서 m은 1 내지 20인 정수이고 n은 2 내지 60인 정수이고, 상기 R3는 형광물질이며, 상기 Y는 0 또는 S이다.
본 발명에서 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 상기와 같이 퓨린 계열의 염기를 가진 dATP(deoxyadenosine triphosphate) 또는 dGTP(deoxyguanosine triphosphate)의 감마 인산기에 링커 (R2)를 연결하고 이에 형광물질 (R3)이 결합된 구조이다. 상기: 링커 (R2)는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-, -(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이며， 여기에서 상기 m이 20을 초과하거나, 상기 n이 60을 초과하는 경우 뉴클레오티드 내에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기 부위와 형광물질간의 거리가 너무 멀게 되어 형광소멸이 효과적으로 일어나지 않을 수 있으며, 또한 상기 m이 1 미만이거나, 상기 n이 2 미만인 경우 중합효소가 기질로 이용할 수 없을 수 있으므로 상기 m은 1 내지 20인 정수이고, 상기 n은 2 내지 60인 정수인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 m은 2 내지 10인 정수이고 상기 n은 2 내지 20인 정수임이 바람직하다.
본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 그 자체에 형광소멸 역할을 하는 퓨린 계열의 염기와 형광물질을 모두 함유하고 있음이 특징이다. 구체적으로 DNA 중합효소에 의해 본 발명의 뉴클레오티드가 기질로 사용될 때, 부산물로 형광이 표지된 파이로포스페이트가 생성되면서 반웅 전에 소멸되어 있던 형광 세기가 복원되어 증가하게 된다. (도 1 참조) 따라서 기존의 실시간 중합효소 분석 방법들에서 반응에 참여하는 기질 (dNTPs) 외에 추가적으로 형광 신호 생성을 위한 프로브들이 필수적인 반면, 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 이용하는 경우， 반웅에 참여하는 기질 외의 추가적인 프로브들이 필요치 않아 반응 자체의 진행을 통하여 형광 신호의 생성이 가능하다.
본 발명에서 형광물질은 퓨린 염기에 의하여 형광 세기가 소멸될 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 플루오레세인 (fluorescein), 보디피 FL (Bodipy-FL), 보디피 R6G (Bodipy-R6G), 퍼시픽 블루 (Pacific Blue), 마리나 블루 (Marina Blue), 쿠마린 (coumarin), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), Cy5, Cy3 및 텍사스 레드 (Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 퓨린 염기에 의하여 형광 세기가 가장 크게 소멸될 수 있는 보디피 FL (Bodipy-FL)일 수 있다.
본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드는 (1) dATP 또는 dGTP과 탄소 또는 탄소와 산소가 흔합된 원소 2 내지 60개로 이루어지는 사슬의 아민류 바람직하게는 에틸렌디아민 (ethylenediamin)을 반응시켜, dATP 또는 dGTP의 감마 인산기에 아민기를 형성하는 단계， (2) 감마 인산기에 아민기가 형성된 dATP 또는 dGTP와 숙신이미딜 에스테르 (succinimidyl ester)기가 연결된 형광체와 반웅시키는 단계를 통하여 제조될 수 있다. (도 2 참조) 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 본 발명의 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시간 중합효소 반웅용 조성물은 실시간 중합효소 반웅에 사용되는 기질 (dNTPs)이 함유된 반응 용액일 수 있으며, 본 발명에서는 상기 기질에서 종래 dATP 또는 dGTP 대신에 본 발명의 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 dCTP(deoxycytidine triphosphate) 및 dTTP(deoxythymidine triphosphate)를 추가적으로 함유할 수 있다.
본 발명의 실시간 중합효소 반웅용 조성물은 상기 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 기질로 사용할 수 있는 중합효소를 추가적으로 함유할 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 TaqDNA 중합효소， Therminator γ DNA 중합효소 및 phi29 DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 증합효소를 추가적으로 함유할 수 있다.
상기 Taq DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 NCBI accession no가 AAA27507인 중합효소 일 수 있으며 상기 Therminator γ DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 New England Biolabs사 (catalog no: M0334L 또는 M0334S)에서 판매되는 것일 수 있으며， 상기 phi29 DNA 중합효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 NCBI accession no가 YP_002004529인 중합효소일 수 있다.
또한 본 발명의 실시간 증합효소 반웅용 조성물은 당업자에게 널리 알려진 중합효소 반응에 필요한 완층용액과 염을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 완층용액과 염은 DNA 중합효소 반웅에 통상적으로 사용되는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 검출 대상 핵산을 주형으로 검출 대상 핵산의 특정 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하여 중합효소 반웅을 수행함으로써 검출 대상 핵산을 정량적으로 분석하는데 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출 대상 핵산은 당업자가 검출하고자 하는 핵산 서열올 의미하며, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 검출하고자 하는 핵산 서열이 특정되면 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머는 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
. 본 발명에서 실시간 중합효소 반웅은 핵산 (DNA 또는 RNA)의 특정 부위를 선택적으로 복제하고 증폭시켜 검출하고자 하는 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 반응이다. 상기 실시간 중합효소 반웅은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 실시간
PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
구체적으로 상기 실시간 PCR은 농도를 알고 있는 검출 대상 핵산 및 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물로 증폭하여 상기 농도 변화에 따른 형광세기를 측정하고 일정한 형광세기 (threshold)에 도달하는 PCR 반응회수 (Ct값)를 분석하는 단계와, 상기 농도와 Ct값을 대웅시켜 표준 곡선을 작성하는 단계와, 미지 검출 시료로부터 핵산을 추출한 다음 PCR 증폭하여 Ct값을 수득하고 이를 상기 표준 곡선에 대웅시켜 미지 검출 시료에 함유된 검출 대상 핵산을 정량적으로 분석하는 방법이다.
본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 종래 DNA 결합 형광 염료를 이용한 경우의 문제점을 해결한 것으로 구체적으로 종래 DNA 결합 형광 염료 (SYBR green I)를 사용하여 PCR 분석하는 경우, 주로 단일 사슬보다 이중 DNA 사슬에 더 큽 결합력을 지니기 때문에 RCA와 같이 단일 사슬이 중합효소 반응의 산물일 ; 경우쎄는 분석에 이용될 수 없지만, 본 발명의 실시간 중합효^ 반응용 조성물은 RCA에도 적용될 수 있는 효과가 있다 ·
또한 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 조성물은 기존의 실시간 증합효소 반응용 조성물에 필수적인 프로브가 필요하지 않으므로, 종래 검출 신호를 얻기 위해서 특정한 염기서열을 선택하여 프로브를 제작하는데 소요되는 비용 및 시간을 절감할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시간 중합효소 반응용 분석 키트는 상기 실시간 중합효소 반웅용 조성물을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분석 키트는 상기 실시간 중합효소 반응용 조성물을 함유하는 것이외에 당업계에 공지된 키트에 함유되는 구성 성분을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 비드 및 기판 등의 기제등을 포함할 수 있다. 본 발명의 분석 키트는 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간
RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 반응 분석에 적용될 수 있으며 나아가 검출 대상이 RNA인 경우 실시간 RT(reverse transcription)-PCR에 적용될 수 있다.
본 발명의 분석 키트를 통한 형광 신호는 당업계에 공지된 형광 신호 측정 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
한편, 본 발명의 실시간 중합효소 반웅 분석방법은 (a) 본 발명의 실시간 중합효소 반웅용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계, (b) 시료로부터 핵산을 추출하고, 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 정량 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 실시간 중합효소 반웅 분석방법은 핵산 (DNA 또는 RNA)의 특정 부위를 선택적으로 복제하고 증폭시켜 검출하고자 하는 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 분석 방법이다. 바람직하게는 실시간 중합효소 반응의 결과로 발생하는 형광 세기를 측정함으로써 핵산의 존재 여부를 확인할 수 있고 나아가 실시간으로 핵산을 정량 검출할 수 있는 분석 방법이다.
각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
상기 (a) 단계에서 프라이머는 검출 대상 핵산의 특정 부위를 증폭할 수 있는 것으로 이는 검출 대상 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 부위가 특정되면 당업자가 공지된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 시료는 바람직하게는 인간을 포함한 동물의 체액， 혈청, 혈장 또는 혈액일 수 있으며, 상기 시료로부터 핵산을 추출하는 것은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 Qiagne사의 QIAamp DNA Blood Mini Kit을 이용하여 정해진 매뉴얼에 따라 추출할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 프라이머와 본 발명의 반응용 조성물을 이용해 시료로부터 추출된 핵산을 주형으로 실시간 중합효소 반웅을 수행하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 형광물질이 삽입된 뉴클레오티드를 기질로 사용될 수 있는 중합효소를 사용하는 것이 바람직하며 이에 대해서는 앞서 기재한 바와 같다.
상기 (C) 단계에서 형광신호는 당업계에 공지된 형광 신호 측정 장치를 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 측정 결과를 통하여 검출 대상 시료에서 핵산의 함량을 정량적으로 분석할 수 있다.
상기 정량 분석을 위해서는 농도를 알고 있는 검출 대상 핵산 및 이를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 본 발명의 실시간 중합효소 반웅용 조성물로 증폭하여 상기 농도 변화에 따른 형광세기를 측정하고 일정한 형광세기 (threshold)에 도달하는 PCR 반웅회수 (Ct값)를 분석하고 상기 농도와 Ct값을 대웅시켜 작성된 표준 곡선을 통하여 정량 분석을 할 수 있으며 이에 대해서는 당업자가 용이하게 수행할 수 있다ᅳ 상기 분석방법은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 반웅 분석에 적용될 수 있으며 나아가 검출 대상이 RNA인 경우 실시간 RT(reverse transcription)-PCR에 적용될 수 있다.
본 발명의 분석방법은 종래 SYBR green I을 이용한 실시간 중합효소 반웅에 비하여 각 분석 성능의 지표가 되는 비교 항목 (효율성， 민감도)에서 개선된 결과를 나타내어, 보다 ' 효과적으로 실시간 중합효소 반웅을 분석하는데 용이하게 사용될 수 있다. (표 2 참조)
또한 본 발명의 분석방법은 종래 방법에서 프로브로 인하여 야기될 수 있는 잘못된 신호 생성이 근본적으로 불가능하며, 비용적 측면에서도 매우 유리하다. 특히 하기 표 1에 기재한 바와 같이, 기존의 방법들을 사용하여 분석할 수 없는 중합효소 반웅들을 본 발명의 방법을 사용하면 쉽게 분석이 가능하기 때문에 보다 다양하게 적용될 수 있다/
【표 1】
본 발명의 분석기술과 종래 방법의 비교
기술 분야 DNA 결합가수분해 프로브 흔성화 프로브 보 밤명 염료 (DNA binding (Hydrolysis probes, (Hybridization probes, dyes) oligonucleotides) oligonucleotides) PCR Good Good Good Good
RCA Moderate Bad Good Good 등온중합반웅 Moderate Good Bad Good
(Isothermal
polymerization) 본 발명은 중합효소 반응 기질 중 하나인 뉴클레오티드를 화학적으로 변형하여 기질의 역할 외에 형광 신호 생성의 역할도 부여함으로써， 프로브를 제작할 필요가 없어 경제적이며, PCR, RCA 및 등온 중합 반응 등 다양한 실시간 중합효소 반응에 용이하게 적용될 수 있으며 분석 성능도 기존 방법에 비하여 매우 우수하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행할 경우 형광 신호가 생성되는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 합성하는 방법을 나타낸 반웅식이다.
도 3은 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드를 기질로 중합반응을 유도할 수 있는 중합효소를 검색한 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드와 Therminator γ DNA 중합효소를 이용하여 정량적인 실시간 PCR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
(표준시료의 DNA 농도를 10nM 내지 ΙΟίΜ로 10배수로 설정함) 도 5a 및 5b는 자연 뉴클레오티드와 Taq DNA 중합효소를 이용하여 정량적인 실시간 PCR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명의 형광물질이 연결된 뉴클레오티드와 phi29 DNA 중합효소를 이용한 실시간 RCA 분석결과를 나타낸 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명 한다.
단， 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것 일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다. <실시 예 1>
NH2-dGTP의 합성
100 mM MES 완층용액 (Sigma-Aldrich) 500 ul에 lOOmM 농도의 dGTP 50 ul와 EDC(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, Sigma-Aldrich) 30 mg을 가했다. 실온에서 5분 동안 교반한 뒤 , 이 흔합 반웅용액에 10 mg의 ethylenediamine'HCl (Sigma-Aldrich)을 가한 뒤， 4 °C에서 16시간 동안 교반하였다. 역상 HPLC를 사용하여 정 제된 NH2-dGTP를 수득하였다.
구체적으로 상기 역상 HPLC를 수행하기 위하여， A 버 퍼로 물에 회석된 20 mM TEAB (tetraethylammonium bicarbonate)를， B 버 퍼로 90 % 아세토니트릴 (acetonitrile)에 용액에 20 mM TEAB (tetraethylammonium bicarbonate)를 사용하고, 10분 동안 B 버퍼를 0%로 설정하고 10 내지 40분 동안 B 버퍼를 0에서 100%로 설정하여 HPLC를 진행하였다.
<실시 예 1>
vF-dGTP의 합성
상기 <실시 예 1>에서 정 제된 NH2-dGTP를 PBS(phosphate buffered saline) 50 ul에 5.4 mM이 되도록 녹이고 이 에 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹아있는 Bodipy-FL(10 mM, 400 ul)을 가한 다음, 상온에서 3시 간 동안 교반하였다. 상기 <실시 예 1>에 기 재된 역상 HPLC를 사용하여 정 제된 YF-dGTP를 수득하였다.
<실시 예 3>
YF-dGTP를 기질로 사용 가능한 DNA 중합효소 검 색
DNA 중합효소 검색은 시발체 (primer) 연장 반응을 통하여 수행되 었다.
구체적으로 상기 시 발체 연장 반응은 서 열번호 1의 염 기서 열로 기 재된 형 광이 표지된 시 발체
(5'-fluorescein-CTGACTGCATCTAGACGTGACTGA. 1 uM, Intergrated DNA Technologies), 서뎔번호 2의 염 기서 열로 기 재된 주형사슬
CAGTCAGTCAGTCAGTCACGTCT. 1 uM, Intergrated DNA Technologies), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), yF-dGTP (25 uM), 중합효소 반응 완층용액 (New England Biolabs), 및 4 units의 DNA 중합효소 (Taq, Vent(exo-), DeepVent (exo-), Bst, 또는 Therminator γ)(모두 New England Biolabs에서 구입 )를 포함하는 20 ul부피의 반응 흔합용액을 제조하여 수행하였다.
보다 구체적으로 상기 제조된 반웅 흔합용액을 94°C에서 20초, 46°C에서 40초, 그리고 600C에서 90초간 가열하는 과정으로 이루어지는 사이클을 다섯 번 반복함으로써 수행되 었다.
대조군 실험을 위해 상기 와 뽁같은 실험 조건 하에서 yF-dGTP 대신 자연상태의 dGTP를 사용하여 Taq DNA 중합효소 반웅을 수행하였다.
또한, 등온성 중합효소인 Klenow Fragment (exo-)(New England Biolabs에서 구입 )를 이용한 '연장 반응을 수행할 시 에는 반웅 온도를 37°C에서 7.5분간 가열하였다.
각 중합효소 반웅 후에 , 반웅 흔합 용액은 20% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)을 이용하여 전개하고 (Vertical Gel Electrophoresis Unit, Sigma-Aldrich) 그 결과로 얻은 DNA 형 광밴드의 이 미지를 형광 scanner (Typhoon9400, GE healthcare)를 사용하여 수득하였으며 이를 도 3에 기 재하였다.
상기 도 3에 기 재한 바와 같이 , Taq DNA 중합효소와, Therminator γ DNA 증합효소가 변형 된 뉴클레오티드인 YF-dGTP를 기 질로 사용하여 DNA의 주형 사슬을 연장하여 완전히 연장된 증합 산물을 만들 수 있음을 알 수 있다. <실시예 4>
YF-dGTP을 이용한실시간 PCR (real-time PCR) 분석
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머
(5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC, 100 nM), 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 (5 -ACCCTGTTGCTGTAGCCA, 100 nM), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 주형사슬
Figure imgf000016_0001
I；， 10 nM 내지 10 fM), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), yF-dGTP (25 uM), 증합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs): 및 Therminator γ DNA 중합효소 (2 units)를 포함하는 20 ul부피의 반웅 흔합 용액을 실시간 PCR 반응 분석에 사용하였다.
상기 PCR 사이클은 94°C에서 10초, 54°C에서 15초, 그리고 72°C에서 10초로 구성하고 총 40사이클을 수행하였다. 형광 세기량은 StepOne real-time PCR system(ABI)기기를 사용하여 각 사이클이 진행된 후에 실시간으로 측정하여 그 결과를 도 4a 및 4b에 기재하였다. (형광 필터: ex/em = 490/520 nm) (도 4a 및 4b).
상기 도 4a 및 4b에 기재한 바파 같이， 주형사슬을 10 nM 내지 10 fM로 10배씩 회석한 반응용액으로부터 총 7개의 증폭 곡선을 수득하고， 도 4a 및 4b에 표시된 특정 수치를 역가 (threshold)로 설정하여 이와 증폭 곡선이 만나는 점을 Ct(threshold cycle)값으로 산정하여 Ct 값과 초기 주형사슬 함량의 함수 관계를 도시하였다. <비교예 1>
SYBRereenl을 이용한실시간 PCRireal-time PCR) 분석
상기 <실시예 4>에서 사용된 프라이머와 주형사술을 동일한 양으로 포함하면서， dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), dGTP (25 uM, Promega)， 중합효소 반응 완충용액 (New England Biolabs), SYBR green I (1/20,000 회석, Invitrogen) 그리고 Taq DNA 중합효소 (2 units)를 포함하는 20 ul부피의 반응 흔합 용액을 사용하여 실시간 PCR 반응 분석을 실시하였다. 상기 <실시예 4>와 같은 PCR 조건 및 기기를 사용하여 동일한 방법으로 분석을 수행하고 그 결과를 도 5a 및 5b 에 기재하였다. 상기 도 5a 및 5b 에 기재한 바와 같이, 종래 알려진 realᅳ time PCR을 수행한 결과와, 상기 <실시예 4>에서 yF-dGTP를 사용하여 real-time PCR을 수행한 결과는 매우 유사함을 알 수 있으며, 이를 통해 YF-dGTP를 사용함으로써 real-time PCR 분석이 가능함을 알 수 있다.
상기 <실시예 4>와 <비교예 1>의 결과를 비교하면 하기 표 2과 같다. 【표 2】
Figure imgf000017_0001
(상기 표에서 각 수치에 대한 구체작인 내용은 http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldoc uments/cms— 053906.pdf를 참조)
상기 표 2에 기재된 바와 같이, 본 발명은 종래 SYBR green I을 이용한 실시간 증합효소 반응에 비하여 각 분석 성능의 지표가 되는 비교 항목 (효율성, 민감도)에서 개선된 결과를 나타내었다.
<실시예 5>
YF-dGTP을 이용한실시간 RCA (real-time RCA) 분석
서열번호 6의 . 염기서열로 표시되는 프라이머
(5 ' -CTGCTGC ATCTAGACGTGACTGA, 100 nM), 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 주형사슬
TCAGTCAGTCACGTCT, 100 nM), dATP (25 uM, Promega), dCTP (25 uM, Promega), dTTP (25 uM, Promega), yF-dGTP (25 uM), BSA (100 g/mL), Phi29 DNA 중합효소 반웅 완층용액 (New England Biolabs), 그리고 Phi29 DNA 중합효소 (6 units)를 포함된 20 ul 부피의 반웅 흔합용액을 제조하고 이를 실시간 RCA (rolling circle amplification) 반응 분석에 사용하였다. 상기 반응은 30°C에서 20분 동안 수행하였으며, 매 20초마다 반웅 용액의 형광 세기를 상기 <실시예 4>에서 사용한 기기를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
상기 도 6에 기재한 바와 같이, 본 발명의 변형된 뉴클레오티드를 이용하여실시간 RCA (real-time RCA)를 실시하여도 형광 강도가 증가함을 알 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
1. 하기 화학식 1로 표시 되는 형광물질이 연결된 뉴클레오티드: [화학식 1]
Figure imgf000019_0001
상기 ！^은 아데닌 (Adenine) 또는 구아닌 (Guanine)이며 ,
상기 R2는 -(CH2OCH2)m-CH2NH-, -NHCH2-(CH2OCH2)m-CH2NH-,
-(CH2)n-NH- 또는 -NH-(CH2)n-NH-이고， 여기 에서 m은 1 내지 20인 정수이고 n은 2 내지 60인 정수이고,
상기 R3는 형광물질이며 ,
상기 Y는 0 또는 S이다.
2. 계 1항에 있어서 , 상기 형광물질은 플루오레세 인 (fluorescein), 보디피 FL (Bodipy-FL), 보디피 R6G (Bodipy-R6G), 퍼 시픽 블루 (Pacific Blue), 마리나 블루 (Marina Blue), 쿠마린 (coumarin), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), Cy5, Cy3 및 텍사스 레드 (Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택된 것 인 뉴클레오티 드.
3. 제 1항의 뉴클레오티드를 함유하는 실시 간 중합효소 반웅용 조성물.
4. 제 3항에 있어서 , 상기 조성물은 dCTP(deoxycytidine triphosphate) 및 dTTP(deoxythymidine triphosphate)를 추가적으로 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물.
5. 게 4항에 있어서, 상기 조성물은 중합효소를 추가적으로 함유하는 실시간 중합효소 반응용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Therminator γ DNA 중합효소 및 phi29 DNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된 것인 실시간 증합효소 반웅용 조성물.
7. 제 3항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR (polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 것인 실시간 중합효소 반응용 조성물.
8. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 실시간 중합효소 반웅용 조성물이 함유된 실시간 중합효소 반웅용 분석 키트.
9. (a) 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 실시간 중합효소 반응용 조성물 및 검출 대상 핵산의 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 준비하는 단계;
(b) 시료로부터 핵산을 추출하고， 이를 주형으로 상기 (a) 단계에서 준비된 실시간 중합효소 반웅용 조성물 및 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 수행하는 단계 및
(c) 상기 (b) 단계에서의 형광신호를 측정하여 검출 대상 핵산의 함량을 분석하는 단계를 포함하는 실시간 중합효소 반응 분석방법.
10. 게 9항에 있어서, 상기 실시간 중합효소 반응은 실시간 PCR
(polymerase chain reaction), 등온 중합 (isothermal polymerization), 및 실시간 RCA (rolling circle amplification)로 이루어진 군에서 선택된 것인 실시간 중합효소 반응 분석방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2017010854A1 (ko) * 2015-07-13 2017-01-19 국립암센터 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법
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GB2605404A (en) * 2021-03-30 2022-10-05 Sumitomo Chemical Co Sequencing method

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7125671B2 (en) * 2003-02-05 2006-10-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Nucleic acid amplification with terminal-phosphate labeled nucleotides
US7405281B2 (en) * 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080091005A1 (en) * 2006-07-20 2008-04-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Modified nucleotides, methods for making and using same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7125671B2 (en) * 2003-02-05 2006-10-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Nucleic acid amplification with terminal-phosphate labeled nucleotides
US7405281B2 (en) * 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUMAR, S. ET AL.: "Terminal phosphate labeled nucleotides: synthesis, applications, and linker effect on incorporation by DNA polymerases", NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES,AND NUCLEIC ACIDS., vol. 24, no. 5-7, 2005, pages 401 - 408 *
SOOD, A. ET AL.: "Terminal phosphate-labeled nucleotides with improved substrate properties for homogeneous nucleic acid assays", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 127, no. 8, 2 March 2005 (2005-03-02), pages 2394 - 2395 *

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