JP2012040000A - 修飾ヌクレオチド及びこれを用いたリアルタイムポリメラーゼ反応 - Google Patents
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Abstract
【課題】修飾ヌクレオチド及びこれを用いたリアルタイムポリメラーゼ反応に関する。
【解決手段】蛍光物質が連結されたヌクレオチド、これを含むリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物、分析キット、及び分析方法に関するものである。ポリメラーゼ反応基質のうちの一つであるヌクレオチドを化学的に修飾して、基質の役割以外に蛍光信号の発生の役割も付与することによって、プローブを製作する必要がないので経済的であり、ＰＣＲ、ＲＣＡ、及び等温重合反応など多様なリアルタイムポリメラーゼ反応に容易に適用されることができ、分析性能も従来の方法に比べて非常に優れている。
【選択図】図１
【解決手段】蛍光物質が連結されたヌクレオチド、これを含むリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物、分析キット、及び分析方法に関するものである。ポリメラーゼ反応基質のうちの一つであるヌクレオチドを化学的に修飾して、基質の役割以外に蛍光信号の発生の役割も付与することによって、プローブを製作する必要がないので経済的であり、ＰＣＲ、ＲＣＡ、及び等温重合反応など多様なリアルタイムポリメラーゼ反応に容易に適用されることができ、分析性能も従来の方法に比べて非常に優れている。
【選択図】図１
Description
本発明は修飾ヌクレオチド及びこれを用いたリアルタイムポリメラーゼ反応に関し、具体的には、本発明は、蛍光物質が連結されたヌクレオチド、これを含むリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物、分析キット、及び分析方法に関する。
ＤＮＡポリメラーゼ反応の定量分析は、特定遺伝子の発現程度の測定、試料内の特定遺伝子の定量、またはＤＮＡ−抗体結合体を用いて行うイムノＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）などの、多様な技術に必須の過程である。
このような定量分析のためには、ＤＮＡそのものは信号を放出する部位を含んでいないため、反応の進行程度を信号化して検出することができる方法が必要である。
伝統的には、ゲル−電気泳動の後、ＤＮＡ塩基の間に挿入可能な染料で着色する方法が幅広く利用されていたが、前記方法は過度に煩わしく、自動化も不可能であり、また、ＤＮＡ検出の動的領域が非常に狭いという短所がある。さらに、前記ゲルを用いた方法は、終点検出（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）による反応産物のＤＮＡを定量することであるため、反応進行の過程でポリメラーゼ反応によって作られるＤＮＡの量をリアルタイムで定量するのは不可能である。
このような短所を克服し、リアルタイムポリメラーゼ反応分析を可能にするために、現在、二種類の蛍光信号プローブ分子が使用されている。
そのうちの一つはＤＮＡ結合蛍光染料（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）を使用する方法であって、前記染料は本来蛍光を放出することはないが、ＤＮＡと結合すると蛍光を放出する性質を有しており、反応の進行によって生成されるＤＮＡ二重鎖の量に比例して、染料がＤＮＡと結合するようになる。これによってＤＮＡ二重鎖の量に比例して蛍光強度信号を収得することができる。
また、他の方法は、５’及び３’の両末端に、各々蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）及び蛍光消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を標識したオリゴヌクレオチドを用いる方法である。前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、重合して生成されるＤＮＡの塩基配列の一部分と相補的である。ポリメラーゼ反応溶液に前記オリゴヌクレオチドを含ませて反応させると、ポリメラーゼが前記相補的な部分に結合するようになり、オリゴヌクレオチドが構造的に変形するか（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ）、またはポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって破壊されることにより（例えば、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅなどの加水分解プローブ）、蛍光強度が増加する。したがって、生成されたＤＮＡの量に比例して蛍光強度が増加するようになり、この信号を利用すれば、リアルタイムでポリメラーゼ反応を定量的に分析することができる。
しかし、前記二種類の方法は、多くの短所があることが指摘されている。
まず、ＤＮＡ結合蛍光染料を用いた方法は、蛍光染料そのものがしばしばポリメラーゼ反応の効率に影響を与える恐れがあり、また蛍光染料は単鎖ＤＮＡよりも二重鎖ＤＮＡにより大きな結合力を有するため、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような、単鎖ＤＮＡがポリメラーゼ反応の産物である場合には、分析に利用できないという短所がある（Ｇｕｓｅｖ、Ｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５９、６３−６９、２００１）。また、前記ＤＮＡ結合蛍光染料を用いてリアルタイムＰＣＲ分析を行う場合、プライマー二量体（ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒ）のように、ポリメラーゼ反応と関係なく生成された二重鎖にも非特異的に結合して蛍光信号を放出することができるため、偽陽性信号（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）が発生するという問題もある（Ｐｏｎｃｈｅ、Ｆ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１８、２００３）。
また、オリゴヌクレオチドを用いる方法は、プローブの製造費用が相対的に高く、また所望の検出信号を得るためには、注意深く塩基配列を選択してプローブを製作しなければならないという問題がある。特に、温度変化を与えない等温反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）条件によって、ＤＮＡ二重鎖が生成されるポリメラーゼ反応においては、生成された二重鎖の熱的安定性により、オリゴヌクレオチドプローブ分子が結合し難くなり、または結合するとしても非常に長い時間が必要であるため、分析が不可能である。このような短所は、該プローブは反応そのものには必要ないが、信号検出のためにさらに製作されて使用されることが原因であると考えられる。
本発明は、上記の問題点を克服することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明は、下記の化学式（１）で示される蛍光物質が連結されたヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、前記ヌクレオチドを含むリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物を提供する。
また、本発明は、前記リアルタイムポリメラーゼ反応用組成物を含む、リアルタイムポリメラーゼ反応用分析キットを提供する。
また、本発明は、（ａ）前記リアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及び検出対象の核酸の部位を増幅させるプライマーを準備する段階と、（ｂ）試料から核酸を抽出し、これを鋳型にして前記（ａ）段階で準備されたリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及びプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ反応を行う段階と、及び（ｃ）前記（ｂ）段階における蛍光信号を測定し、検出対象の核酸の量を定量分析する段階とを含む、リアルタイムポリメラーゼ反応分析方法を提供する。
本発明は、ポリメラーゼ反応基質のうちの一つであるヌクレオチドを化学的に修飾して、基質の役割以外に蛍光信号の発生の役割も付与することにより、プローブを製作する必要がないので、経済的であり、かつＰＣＲ、ＲＣＡ、及び等温重合反応などの、多様なリアルタイムポリメラーゼ反応に容易に適用されることができ、分析性能も従来の方法に比べて非常に優れている。
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明において蛍光物質が連結されたヌクレオチドは、ヌクレオチドのγリン酸基にリンカーを介して蛍光物質が結合された構造であって、ヌクレオチドそのものに、蛍光消光物質として作用するプリン系の塩基と蛍光物質とを含んでいる。
本発明において、蛍光物質が連結されたヌクレオチドは、下記の化学式（１）で示されることを特徴とする。
前記化学式（１）で、Ｒ１はアデニンまたはグアニンであり、前記Ｒ２は−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、または−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、ｍは１乃至２０の整数であり、ｎは２乃至６０の整数であり、前記Ｒ３は蛍光物質であり、前記ＹはＯまたはＳである。
本発明において、蛍光物質が連結されたヌクレオチドは、前記のようにプリン系の塩基を有するｄＡＴＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはｄＧＴＰ（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のγリン酸基にリンカー（Ｒ２）を連結し、これに蛍光物質（Ｒ３）が結合した構造である。前記リンカー（Ｒ２）は、−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、または−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、前記ｍが２０を超えるか、または前記ｎが６０を超える場合、ヌクレオチド内に蛍光消光物質として作用するプリン系の塩基部位と蛍光物質との間の距離があまりに遠くなりすぎて、蛍光消光が効果的に起こらない恐れがあり、また、前記ｍが１未満であるか、または前記ｎが２未満である場合には、ポリメラーゼの基質として利用できないこともあるため、前記ｍは１乃至２０の整数であり、前記ｎは２乃至６０の整数であるのが好ましい。より好ましくは、前記ｍは２乃至１０の整数であり、前記ｎは２乃至２０の整数である。最も好ましくは、前記ｎは２乃至５の整数である。
本発明の蛍光物質が連結されたヌクレオチドは、それ自体に蛍光消光物質として作用するプリン系の塩基と蛍光物質とを含んでいることが特徴である。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼによって本発明のヌクレオチドが基質として使用される時、副産物として蛍光が標識されたピロリン酸塩が生成されながら、反応前に実質的に消滅していた蛍光強度が復元されて増加する（図１参照）。
したがって、従来のリアルタイムポリメラーゼ分析方法において、反応に関与する基質（ｄＮＴＰｓ）以外に、さらに蛍光信号の発生のためのプローブが必須であるのに対して、本発明の蛍光物質が連結されたヌクレオチドを用いる場合、反応に関与する基質以外の追加的なプローブは必要ないので、反応そのものを行うことによって蛍光信号の発生が可能になる。
本発明における蛍光物質は、プリン塩基によって蛍光強度が実質的に消滅される物質であれば特に限定されないが、好ましくはフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー−ＦＬ（Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ）、ボディピー−Ｒ６Ｇ（Ｂｏｄｉｐｙ−Ｒ６Ｇ）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５、Ｃｙ３、及びテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）からなる群より選択されるものが使用され、最も好ましくは、プリン塩基によって蛍光強度が最も大きく実質的に消滅されるボディピー−ＦＬ（Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ）が使用される。
本発明の蛍光物質が連結されたヌクレオチドは、（１）ｄＡＴＰまたはｄＧＴＰと、２乃至６０個の炭素原子、または炭素原子と酸素原子との合計が２乃至６０である鎖のアミン類、好ましくはエチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）とを反応させて、ｄＡＴＰまたはｄＧＴＰのγリン酸基にアミン基を形成する段階と、（２）γリン酸基に、アミン基が形成されたｄＡＴＰまたはｄＧＴＰと、サクシニミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）基とが連結された蛍光体と反応させる段階とによって製造することができる（図２参照）。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、前記本発明のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、リアルタイムポリメラーゼ反応に使用される基質（ｄＮＴＰｓ）を含む反応溶液であることができ、本発明では、前記基質として従来のｄＡＴＰまたはｄＧＴＰの代わりに、本発明のヌクレオチドを含むことを特徴とする。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は特に限定されないが、好ましくは、ｄＣＴＰ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びｄＴＴＰ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をさらに含むことができる。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、前記蛍光物質が連結されたヌクレオチドが基質として用いられるポリメラーゼをさらに含むことができ、特に限定されないが、好ましくは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼ、及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼをさらに含むことができる。
前記ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、好ましくは、ＮＣＢＩ受入番号がＡＡＡ２７５０７であるポリメラーゼであることができ、前記Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、好ましくは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（カタログ番号：Ｍ０３３４Ｌ、またはＭ０３３４Ｓ）より販売されるものであることができ、前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、好ましくは、ＮＣＢＩ受入番号がＹＰ_００２００４５２９であるポリメラーゼであることができる。
また、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、当業者に広く知られたポリメラーゼ反応に必要な緩衝溶液と塩をさらに含むことができる。前記緩衝溶液と塩は、ＤＮＡポリメラーゼ反応に通常使用されるものであれば、特に制限されない。
また、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、検出対象の核酸を鋳型として用い、かつ検出対象の核酸の特定部位を増幅させるプライマーをデザインしてポリメラーゼ反応を行うことによって、検出対象の核酸の定量分析に有用に用いることができる。
前記検出対象の核酸は、当業者が検出しようとする核酸配列を意味し、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含む。前記検出しようとする核酸配列が特定されれば、当業者はこれを特異的に増幅させるプライマーを容易にデザインすることができる。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定部位を選択的に複製しかつ増幅させて検出しようとする核酸が存在するか否かを確認することができ、さらに、リアルタイムで核酸を定量検出することができる反応である。前記リアルタイムポリメラーゼ反応は特に限定されないが、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、等温重合（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、及びリアルタイムＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）からなる群より選択されるものであることができる。
具体的には、前記リアルタイムＰＣＲは、既知の濃度の検出対象の核酸及びこれを特異的に増幅させるプライマーを用いて、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物で増幅し、前記濃度変化による蛍光強度を測定して、一定の蛍光強度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に到達するＰＣＲ反応回数（Ｃｔ値）を分析する段階と、前記濃度とＣｔ値とを対応させて標準曲線を作成する段階と、未知検出試料から核酸を抽出した後、ＰＣＲ増幅してＣｔ値を収得し、これに前記標準曲線を対応させて、未知検出試料に含まれている検出対象の核酸を定量分析する段階とを含む方法である。
本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、従来のＤＮＡ結合蛍光染料を用いた場合の問題点を解決したものであって、具体的には、従来のＤＮＡ結合蛍光染料（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ）を使用してＰＣＲ分析する場合、主に単鎖ＤＮＡより二重鎖ＤＮＡに大きな結合力を有するために、ＲＣＡのように単鎖ＤＮＡがポリメラーゼ反応の産物である場合には分析に利用することができないが、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物はＲＣＡにも適用できるという効果がある。
また、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物は、従来のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物に必須であったプローブが必要でないので、従来の検出信号を得るために、特定の塩基配列を選択してプローブを製作することに所要される費用及び時間を節減することができる。
一方、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用分析キットは、前記リアルタイムポリメラーゼ反応用組成物を含むことを特徴とする。
本発明の分析キットは、前記リアルタイムポリメラーゼ反応用組成物を含むこと以外に、当技術分野で既知のキットに含まれている構成成分をさらに含むことができる。例えば、ビーズ及び基板などの基材などを含むことができる。
本発明の分析キットは、リアルタイムＰＣＲ、等温重合、及びリアルタイムＲＣＡからなる群より選択されるリアルタイムポリメラーゼ反応分析に適用され、さらに、検出対象がＲＮＡである場合は、リアルタイムＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲに適用されることができる。
本発明の分析キットを介した蛍光信号は、当技術分野で既知の蛍光信号測定装置を用いて測定することができる。
一方、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応分析方法は、（ａ）本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及び検出対象の核酸の部位を増幅させるプライマーを準備する段階と、（ｂ）試料から核酸を抽出し、これを鋳型にして前記（ａ）段階で準備されたリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及びプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ反応を行う段階と、及び（ｃ）前記（ｂ）段階における蛍光信号を測定し、検出対象の核酸の量を定量分析する段階とを含むことを特徴とする。
本発明におけるリアルタイムポリメラーゼ反応分析方法は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定部位を選択的に複製しかつ増幅させて検出しようとする核酸が存在するか否かを確認することができ、さらに、リアルタイムで核酸を定量検出する分析方法である。好ましくは、リアルタイムポリメラーゼ反応の結果で発生する蛍光強度を測定することによって核酸が存在するか否かを確認することができ、さらに、リアルタイムで核酸を定量検出する分析方法である。
以下で、各段階について具体的に説明する。
前記（ａ）段階において、プライマーは検出対象の核酸の特定部位を増幅させるものであって、これは検出対象の核酸を特異的に検出できる部位が特定されれば、当業者は既知の方法によって容易に製造することができる。
前記（ｂ）段階において、試料は、好ましくは人間を含む動物の体液、血清、血漿または血液であり、前記試料から核酸を抽出することは当業者に既知の方法を用いて行うことができ、好ましくは、Ｑｉａｇｎｅ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて、取扱説明書に従って抽出することができる。
前記（ｂ）段階において、前記プライマーと本発明の反応用組成物を用いて試料から抽出された核酸を、鋳型にしてリアルタイムポリメラーゼ反応を行う場合、特に限定されないが、好ましくは、本発明の蛍光物質が挿入されたヌクレオチドを基質として使用可能であるポリメラーゼを用いるのが好ましく、これについては前述した通りである。
前記（ｃ）段階において、蛍光信号は当業界に公知された蛍光信号測定装置を用いて測定することができ、前記測定結果を通じて、検出対象の試料より核酸の量を定量分析することができる。
前記定量分析のためには、既知の濃度の検出対象の核酸及びこれを特異的に増幅させるプライマーを用いて、本発明のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物で増幅して前記濃度変化による蛍光強度を測定し、一定の蛍光強度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に到達するＰＣＲ反応回数（Ｃｔ値）を分析し、前記濃度とＣｔ値を対応させて作成した標準曲線を通して定量分析を行うことができ、これについては当業者であれば容易に行うことができる。
前記分析方法は特に限定されないが、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、等温重合、及びリアルタイムＲＣＡからなる群より選択される反応分析を適用することができ、さらに、検出対象がＲＮＡである場合は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを適用することができる。
本発明の分析方法は、従来のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイムポリメラーゼ反応に比べて各分析性能の指標となる比較項目（効率性、敏感度）で改善された結果を示すので、より効果的かつ容易にリアルタイムポリメラーゼ反応を分析することができる（表２参照）。
また、本発明の分析方法は、従来の方法におけるプローブによって惹起し得る、誤った信号の発生は根本的に起こり得ないため、費用的側面からも非常に有利である。特に、下記表１に記載した通り、従来の方法では分析することができないポリメラーゼ反応を、本発明の方法を用いれば簡単に分析可能であるので、より多様に適用することができる。
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されない。
＜実施例１＞ＮＨ２−ｄＧＴＰの合成
１００ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌに、１００ｍＭ濃度のｄＧＴＰ５０μｌとＥＤＣ（Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ'−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）３０ｍｇを加えた。室温で５分間攪拌した後、この混合反応溶液に１０ｍｇのエチレンジアミン・ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４℃で１６時間攪拌した。逆相ＨＰＬＣを用いて、精製されたＮＨ２−ｄＧＴＰを収得した。
１００ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌに、１００ｍＭ濃度のｄＧＴＰ５０μｌとＥＤＣ（Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ'−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）３０ｍｇを加えた。室温で５分間攪拌した後、この混合反応溶液に１０ｍｇのエチレンジアミン・ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４℃で１６時間攪拌した。逆相ＨＰＬＣを用いて、精製されたＮＨ２−ｄＧＴＰを収得した。
具体的には、前記逆相ＨＰＬＣを行うために、Ａバッファーとして水に希釈された２０ｍＭのＴＥＡＢ（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を、Ｂバッファーとして９０％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）溶液に２０ｍＭのＴＥＡＢを使用し、１０分間Ｂバッファーを０％、及び１０乃至４０分間Ｂバッファーを０から１００％に設定して、ＨＰＬＣを行った。
＜実施例２＞γＦ−ｄＧＴＰの合成
前記＜実施例１＞で精製されたＮＨ２−ｄＧＴＰをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）５０μｌに５.４ｍＭになるように溶解させ、これにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解したボディピー−ＦＬサクシニミジルエステル（１０ｍＭ、４００μｌ）を加えた後、常温で３時間攪拌した。前記＜実施例１＞に記載された逆相ＨＰＬＣを用いて、精製されたγＦ−ｄＧＴＰを収得した。
前記＜実施例１＞で精製されたＮＨ２−ｄＧＴＰをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）５０μｌに５.４ｍＭになるように溶解させ、これにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解したボディピー−ＦＬサクシニミジルエステル（１０ｍＭ、４００μｌ）を加えた後、常温で３時間攪拌した。前記＜実施例１＞に記載された逆相ＨＰＬＣを用いて、精製されたγＦ−ｄＧＴＰを収得した。
＜実施例３＞γＦ−ｄＧＴＰを基質として使用可能なＤＮＡポリメラーゼの検索
ＤＮＡポリメラーゼ検索は、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）伸長反応を通して行われた。
ＤＮＡポリメラーゼ検索は、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）伸長反応を通して行われた。
具体的には、前記プライマー伸長反応は、配列番号１の塩基配列に記載された蛍光が標識されたプライマー（５’−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＡ、１μＭ、Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、配列番号２の塩基配列に記載された鋳型鎖（５’−ＡＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＴＣＴ、１μＭ、Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、γＦ−ｄＧＴＰ（２５μＭ）、ポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び４ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｂｓｔ、またはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒγ）（全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入）を含む２０μｌの反応混合溶液を製造して行った。
より具体的には、前記製造された反応混合溶液を９４℃で２０秒、４６℃で４０秒、及び６０℃で９０秒間加熱するサイクルを、５回繰り返すことによって行われた。
対照群実験のために、前記と同一な実験条件下でγＦ−ｄＧＴＰの代わりに天然型ｄＧＴＰを使用して、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ反応を行った。
また、等温性ポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入）を用いた伸長反応を行う際には、反応温度３７℃で７.５分間加熱した。
各ポリメラーゼ反応後、反応混合溶液は２０％の変性ＰＡＧＥ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて展開し（Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｕｎｉｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、その結果得られたＤＮＡ蛍光バンドのイメージを、蛍光スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して撮像して、これを図３に示した。
図３から分かるように、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼが、修飾されたヌクレオチドであるγＦ−ｄＧＴＰを基質として使用してＤＮＡの鋳型鎖を伸長し、完全に伸長された重合産物を製造することができる。
＜実施例４＞γＦ−ｄＧＴＰを用いたリアルタイムＰＣＲ分析
配列番号３の塩基配列で示される正方向プライマー（５'−ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣ、１００ｎＭ）、配列番号４の塩基配列で示される逆方向プライマー（５’−ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡ、１００ｎＭ）、配列番号５の塩基配列で示される鋳型鎖（５’−ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴ、１０ｎＭ乃至１０ｆＭ）、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、γＦ−ｄＧＴＰ（２５μＭ）、ポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼ（２ｕｎｉｔｓ）を含む２０μｌの反応混合溶液を、リアルタイムＰＣＲ反応分析に使用した。
配列番号３の塩基配列で示される正方向プライマー（５'−ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣ、１００ｎＭ）、配列番号４の塩基配列で示される逆方向プライマー（５’−ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡ、１００ｎＭ）、配列番号５の塩基配列で示される鋳型鎖（５’−ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴ、１０ｎＭ乃至１０ｆＭ）、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、γＦ−ｄＧＴＰ（２５μＭ）、ポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼ（２ｕｎｉｔｓ）を含む２０μｌの反応混合溶液を、リアルタイムＰＣＲ反応分析に使用した。
前記ＰＣＲは、９４℃で１０秒、５４℃で１５秒、及び７２℃で１０秒のサイクルを、４０サイクル行った。蛍光強度量はＳｔｅｐＯｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）機器を使用して、各サイクルの進行後にリアルタイムで測定し、その結果を図４に示した（蛍光フィルター：ｅｘ/ｅｍ＝４９０/５２０ｎｍ）（図４）。
図４に示したように、鋳型鎖を１０ｎＭ乃至１０ｆＭに１０倍ずつ希釈した反応溶液から全部で７つの増幅曲線を収得し、同図に示された特定数値を閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に設定し、これと増幅曲線とが交差する点をＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値として算定して、Ｃｔ値と初期鋳型鎖含有量との関数関係を示した。
＜比較例１＞ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ）の分析
前記＜実施例４＞で使用されたプライマーと鋳型鎖を同一な量で含みながら、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＧＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（１／２０,０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２ｕｎｉｔｓ）を含む２０μｌの反応混合溶液を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応分析を実施した。前記＜実施例４＞と同一のＰＣＲ条件及び機器を使用して、同一方法で分析を行い、その結果を図５に示した。
前記＜実施例４＞で使用されたプライマーと鋳型鎖を同一な量で含みながら、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＧＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（１／２０,０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２ｕｎｉｔｓ）を含む２０μｌの反応混合溶液を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応分析を実施した。前記＜実施例４＞と同一のＰＣＲ条件及び機器を使用して、同一方法で分析を行い、その結果を図５に示した。
図５に示した通り、従来に知られたリアルタイムＰＣＲを行った結果と、前記＜実施例４＞でγＦ−ｄＧＴＰを使用してリアルタイムＰＣＲを行った結果とは非常に類似していることが分かり、これによって、γＦ−ｄＧＴＰを使用してリアルタイムＰＣＲ分析が可能であることが分かる。
前記＜実施例４＞と＜比較例１＞の結果を下記表２に示す。
各数値に対する具体的な内容は、ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ/ｃｍｓ/ｇｒｏｕｐｓ/ｍｃｂ_ｍａｒｋｅｔｉｎｇ/ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ/ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ/ｃｍｓ_０５３９０６．ｐｄｆを参照すればよい。
前記表２で分かるように、本発明は、従来のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイムポリメラーゼ反応に比べて、各分析性能の指標となる比較項目（効率性、感度）において改善された結果を示した。
＜実施例５＞γＦ−ｄＧＴＰを用いたリアルタイムＲＣＡの分析
配列番号６の塩基配列で示されるプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＡ、１００ｎＭ）、配列番号７の塩基配列で示される鋳型鎖（５’−ＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＴＣＴ、１００ｎＭ）、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、γＦ−ｄＧＴＰ（２５μＭ）、ＢＳＡ（１００μｇ/ｍＬ）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（６ｕｎｉｔｓ）が含まれている２０μｌの反応混合溶液を製造し、これをリアルタイムＲＣＡ反応分析に使用した。前記反応は３０℃で２０分間行っており、毎２０秒ごとに反応溶液の蛍光強度を、前記＜実施例４＞で用いた機器を用いて測定し、その結果を図６に示した。
配列番号６の塩基配列で示されるプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＡ、１００ｎＭ）、配列番号７の塩基配列で示される鋳型鎖（５’−ＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＴＣＴ、１００ｎＭ）、ｄＡＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＣＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＴＴＰ（２５μＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、γＦ−ｄＧＴＰ（２５μＭ）、ＢＳＡ（１００μｇ/ｍＬ）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（６ｕｎｉｔｓ）が含まれている２０μｌの反応混合溶液を製造し、これをリアルタイムＲＣＡ反応分析に使用した。前記反応は３０℃で２０分間行っており、毎２０秒ごとに反応溶液の蛍光強度を、前記＜実施例４＞で用いた機器を用いて測定し、その結果を図６に示した。
図６に示したように、本発明の修飾されたヌクレオチドを用いてリアルタイムＲＣＡを行っても、蛍光強度が増加することが分かる。
Claims (10)
- 下記の化学式（１）で示される蛍光物質が連結されたヌクレオチドであって、
前記Ｒ２は、−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍ−ＣＨ２ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、または−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、ｍは１乃至２０の整数であり、ｎは２乃至６０の整数であり、
前記Ｒ３は蛍光物質であり、
前記ＹはＯまたはＳである、ヌクレオチド。 - 前記蛍光物質は、フルオレセイン、ボディピー−ＦＬ（Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ）、ボディピー−Ｒ６Ｇ（Ｂｏｄｉｐｙ−Ｒ６Ｇ）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５、Ｃｙ３、及びテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）からなる群より選択される、請求項１に記載のヌクレオチド。
- 請求項１または２のヌクレオチドを含む、リアルタイムポリメラーゼ反応用組成物。
- 前記組成物はｄＣＴＰ及びｄＴＴＰをさらに含む、請求項３に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物。
- 前記組成物はポリメラーゼをさらに含む、請求項３または４に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物。
- 前記ポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ γ ＤＮＡポリメラーゼ、及びｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項５に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物。
- 前記リアルタイムポリメラーゼ反応は、リアルタイムＰＣＲ、等温重合、及びリアルタイムＲＣＡからなる群より選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物。
- 請求項３〜７のいずれか一項に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物を含む、リアルタイムポリメラーゼ反応用分析キット。
- （ａ）請求項３〜７のいずれか一項に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及び検出対象の核酸の部位を増幅させるプライマーを準備する段階と、
（ｂ）試料から核酸を抽出し、これを鋳型にして前記（ａ）段階で準備されたリアルタイムポリメラーゼ反応用組成物及びプライマーを用いてリアルタイムポリメラーゼ反応を行う段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階における蛍光信号を測定して検出対象の核酸の量を定量分析する段階
とを含む、リアルタイムポリメラーゼ反応分析方法。 - 前記リアルタイムポリメラーゼ反応は、リアルタイムＰＣＲ、等温重合、及びリアルタイムＲＣＡからなる群より選択される、請求項９に記載のリアルタイムポリメラーゼ反応分析方法。
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