KR101088004B1

KR101088004B1 - 발효된 한약재를 이용한 정장용 조성물

Info

Publication number: KR101088004B1
Application number: KR1020100112814A
Authority: KR
Inventors: 김호준; 김영수
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2011-12-01
Also published as: WO2012064158A3; WO2012064158A2

Abstract

본 발명은 발효된 백출, 신곡 및 백편두를 함유하는 한약재의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 기능성 장 질환의 효능을 극대화시키기 위한 최적의 발효조건으로 발효된 백출, 신곡 및 백편두를 함유하는 한약재의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

발효된 한약재를 이용한 정장용 조성물{Composition for treating irritable bowel syndrome comprising fermented herbal mixture }

과민성 대장증후군은 복통과 배변습관의 변화 (설사, 변비, 또는 설사와 변비의 반복)로 특징지어지는 질병으로 전형적인 증상은 간헐적이지만 때로 지속적이기도 하고 최소 3개월 이상 증상이 있어야 하는 만성적인 질환이다. 미국에서 변비나 설사 또는 두 증상이 모두 나타나는 과민성 대장증후군 (IBS)으로 고생하는 사람은 약 4240만 명 있는 것으로 추정됨에도 불구하고, IBS (Irritable bowel syndrome)는 생명에 지장을 주는 질환이 아니기 때문에 치료를 받는 사람이 30%에 불과하며 이 중 처방약을 복용하는 사람은 8.8%에 지나지 않고 있다.

IBS 질환의 경우 주요 수요층은 신경을 많이 쓰거나 스트레스를 많이 받는 층, 위장이 약한 사람, 운동부족인 사람, 꼼꼼하고 소심한 사람들에게 많이 나타난다. 예를 들면 회사원, 수험생, 젊은 주부, 직업운전사, 산후나 수술 후의 허약인, 불규칙적인 흡연이나 음주자 등으로 다양한 계층에게 발생하는 고질적인 질병으로 치료 및 예방 기술 개발이 필수적이다.

과민성 대장증후군의 원인이 다양하지만 장내 미생물의 불균형, 즉 유익균이 부족하고 대사에 악영향을 미치는 유해균이 지나치게 많아 지는 상황과 매우 밀접한 관계를 가지고 있어, 서구에서는 probiotics 라고 불리는 유익균 제제를 많이 활용하고 있다.

현재 정장제 시장은 현대인의 생활 습관병과 관련되어 그 수요가 늘고 있는데 배가 아프거나 설사를 할 때만 먹는 ‘정장제’가 아닌 평소에 소화기계의 기능을 높이고 장을 ‘튼튼히’ 할 수 있는 신제품 개발이 절실히 요구된다. 한국은 김치, 된장 등 식품 발효에 세계적인 인지도를 얻어가고 있으므로, 한약과 발효기술을 결합한 조성물 개발을 통해 경쟁력을 높일 수 있을 것으로 생각된다. 미생물이 살아있으면서 균주가 관리된 발효한약은 부가가치를 더욱 높일 수 있을 것으로 기대된다.

장내 미생물이 부족하기 쉬운 만성질환의 사람들에게는 몸 밖에서 발효 과정을 거친 발효한약으로 인하여 한약의 효과를 증진할 수 있으며 이로 인하여 미생물의 역할 및 천연물의 약리작용, 천연물 의약품 개발에 초석이 될 수 있다. 또한 한약은 흡수가 늦고 효능이 늦게 발현되므로 빠르고 신속하게 약효가 발현되는 한약의 개발이 필요하다.

본 발명은 발효된 천연물 자원을 이용해 혼합발효과정에서 천연물 유래 정장 성분의 생산수율 향상 및 향상된 독소저감 효능을 가지는 성분을 생산하고, 정장 효능이 검증된 천연물의 유익균 혼합발효를 통해 정장효과를 극대화하여, 만성 과민성 대장증세 및 배앓이질환, 음식물 불내성에 효과를 나타내는 고 기능성 소재의 개발 및 상기 소재를 주성분으로 하여 국민 모두의 건강증진에 활용될 수 있는 조성물을 개발한 것이다.

본 발명의 목적은 발효된 백출, 신곡 및 백편두를 함유하는 한약재의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 기능성 장 질환의 효능을 극대화시키기 위한 최적의 발효조건으로 발효된 백출, 신곡 및 백편두를 함유하는 한약재의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발효된 백출, 신곡 및 백편두의 혼합물을 포함하는 정장용 조성물을 제공한다.

상기 백출의 발효는 1~3% 포도당을 배지로 Bacillus licheniformis을 발효균주로 하여 발효시키는 것이 바람직하다.

상기 신곡의 발효는 1~3% 포도당을 배지로 Leuconostoc mesenteroides을 발효균주로 하여 발효시키는 것이 바람직하다.

상기 백편두의 발효는 1~3% LB broth를 배지로 Bacillus licheniformis을 발효균주로 하여 발효시키는 것이 바람직하다.

상기 혼합물에 함유된 발효된 백출, 신곡, 백편두의 비율은 1:1:1인 것이 바람직하다.

상기 혼합물의 양은 300 내지 3000mg/kg인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 발효된 백출, 신곡 및 백편두의 혼합물을 포함하는 정장용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 조성물은 정장 효과가 뛰어날 뿐 아니라 생체 내 흡수율 및 독성이나 부작용이 없고, 안정성이 우수하기에 이를 이용하여 의약품 및 건강식품으로 사용할 수 있다.

도 1은 RAW 264.7 세포에 다양한 농도의 발효 혹은 비 발효 한약재 처리물들이 세포 생존율에 미치는 영향을 표시한 그래프이다. C는 대조군을 나타낸다.
도 2는 LPS로 유도된 세포독성에 대한 발효 및 비 발효된 한약재의 보호작용과 관련된 그래프이다. C는 대조군을 나타내고, a, b는 각각 대조군 및 LPS 처리된 군으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 3은 RAW264.7 세포에서 발현되는 iNOS의 유전자 발현에 대한 한약재의 효과를 나타낸 그래프이다. C는 대조군을 나타내고, a는 LPS 처리된 군으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 4는 LPS에 의해 RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 발효 한약과 비 발효 한약의 억제효과를 나타낸 그래프이다. C는 대조군을 나타내고, a는 LPS 처리된 군으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 5는 LPS로 유도된 Raw 264.7cells에서 COX-2 발현에 대한 한약재의 효과를 나타낸 그래프이다. C는 대조군을 나타내고, a는 LPS 처리된 군으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 6은 혼합된 발효물 및 비 발효물 또는 초유의 LPS로 유도된 endotoxin level에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.a는 LPS로 처리된 군으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 7은 LPS로 유도된 혈청 CRP level에 대한 혼합된 발효물 및 비 발효한약재의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 LPS로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 초유의 주입에 따른 lactulose/mannitol ratio을 나타낸 그래프이다. a는 LPS로 처리된 그룹으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 9는 Neomycin로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 probiotics의 주입에 따른 대변의 수분함량에 대한 그래프이다. a는 Neomycin로 처리된 그룹으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 10은 Neomycin로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 probiotics 주입에 따른 CRP레벨에 대한 그래프이다. a는 Neomycin로 처리된 그룹으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 11은 Neomycin로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 probiotics의 주입에 따른 인터페론-γ에 대한 그래프이다. a는 Neomycin로 처리된 그룹으로부터 현저한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 12는 Neomycin로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 probiotics의 투여에 따른 대장조직의 현미경 사진이다. 항생제 유발 설사군에서는 장점막의 손상, 염증세포의 침윤, 하부조직의 부종과 불연속성이 관찰되나 발효한약을 함께 투여한 군의 장점막 조직에서는 병리소견이 뚜렷이 개선되어 있는 것이 보인다.
도 13은 LPS로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 초유의 주입에 따른 장내 유익균 (Lactobacillus) 증식을 나타내는 그래프이다. 대조군에 비해 발효 한약군에서 유의하게 Lactobacillus genus(속)이 증가된 것을 볼 수 있다.
도 14는 LPS로 처리된 rat에서 혼합된 발효물 또는 비 발효물 또는 초유의 주입에 따른 장내 유익균 (Bifidobacterium) 증식을 나타내는 그래프이다. 대조군에 비해 발효 한약군에서 유의하게 Bifidobacterium genus(속)이 증가된 것을 볼 수 있다.

본 발명에서의 “백출 (Atractylodis Rhizoma alba)”은 국화과에 속하며, 그의 성분으로 아트랙틸론 (Atractylone), 아트랙틸레놀라이드 (Atractylenolide), 베타-에우데스몰 및 하이네솔 (Hynesol) 등이 알려져 있다. 백출은 소화관 및 피하조직에서 일어나는 수분대사의 이상에 대하여 이뇨 및 발한 작용을 하고, 동통, 위장염에 효험이 있으며, 민간에서는 혈압강하제로도 쓰인다.

또한 본 발명에서의 “백편두 (白扁豆; 라틴명 Dolichos Semen, 학명 Dolichoris lablab L., 과명 Leguminosae)”는 흰색의 말린 종자로 둥근 달걀모양이다. 비위를 튼튼히 하고 중초를 조화시키며 더위를 억제하고 수분을 감소시키는 효능이 있다. 구토, 설사등으로 인한 식욕감퇴 등을 치료한다. 맛은 달고 성질은 약간 따뜻하다. 백편두의 성분으로는 단백질 0.227%, 지방 0.018%, 탄수화물 0.57%와 칼슘, 인, 아연, 철분 등을 함유하고 있으며, 트립신 저해제 (trypsin inhibitor), 아밀라제 저해제 (amylase inhibitor), 적혈구 응집소 A, B가 함유되어 있다.

또한, 본 발명에서의 신곡 (神?)은 밀가루, 밀기울, 창이 즙, 야료 (野蓼) 즙, 청호 즙, 행인니 (杏仁泥), 붉은팥 따위를 섞어 발효시켜 만든 약재로서, 건제(健劑) 및 소화제로 사용된다.

본 발명은 발효된 백출, 백편두 및 신곡을 함유하는 한약재의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 기능성 장질환의 효능을 극대화시키기 위한 최적의 발효조건으로 발효된 백출, 신곡 및 백편두를 함유하는 한약재의 발효물을 포함하는 정장용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

한약재의 혼합물에 함유되는 백출, 신곡, 백편두의 비율은 1:1:1이 바람직하다.

상기 각 한약재의 기능성 장질환의 효능을 극대화시키기 위한 최적의 발효조건으로는 이하와 같다.

먼저, 백출의 경우 가압 멸균된 Mili-Q water에 용해시켜 발효시킬 수 있다. 구체적으로 발효 중에 1~3% LB broth 또는 1~3% 포도당을 배지로서 주입하는 것이 바람직하며, 2% 포도당을 주입하는 것이 보다 바람직하다. 상기 혼합물을 가압 멸균처리를 한 후 식혀 박테리아 접종물을 주입하여 발효시킬 수 있다. 상기 박테리아 접종물은 발효 균주로서 Bacillus licheniformis, Lactobacillus acidophilus 또는 Leuconostoc mesenteroides이 바람직하며, Bacillus licheniformis을 주입하는 것이 보다 바람직하다.

백편두의 경우 가압 멸균된 Mili-Q water에 용해시켜 발효시킬 수 있다. 구체적으로 발효 중에 1~3% LB broth 또는 1~3% 포도당을 배지로서 주입하는 것이 바람직하며, 2.5% LB broth을 주입하는 것이 보다 바람직하다. 상기 혼합물을 가압 멸균처리를 한 후 식혀 박테리아 접종물을 주입하여 발효시킬 수 있다. 상기 박테리아 접종물은 발효 균주로서 Bacillus licheniformis, Lactobacillus acidophilus 또는 Leuconostoc mesenteroides이 바람직하며, Bacillus licheniformis을 주입하는 것이 보다 바람직하다.

신곡의 경우 가압 멸균된 Mili-Q water에 용해시켜 발효시킬 수 있다. 구체적으로 발효 중에 1~3% LB broth 또는 1~3% 포도당을 배지로서 주입하는 것이 바람직하며, 2% 포도당을 주입하는 것이 보다 바람직하다. 상기 혼합물을 가압 멸균처리를 한 후 식혀 박테리아 접종물을 주입하여 발효시킬 수 있다. 상기 박테리아 접종물은 발효 균주로서 Bacillus licheniformis, Lactobacillus acidophilus 또는 Leuconostoc mesenteroides이 바람직하며, Leuconostoc mesenteroides을 주입하는 것이 보다 바람직하다.

상기에 있어서 Bacillus licheniformis의 경우 30~32℃, Leuconostoc mesenteroides의 경우 33~36℃에서 발효시키는 것이 균주의 최적 성장 온도로 바람직하다.

또한 상기 약학조성물은 약학적으로 허용되는 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약학적 제제는, 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 현탁액, 과립제 또는 엑스제 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물을 포함하는 약학적 제제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 발효 혼합물의 양은 300 내지 3000mg/kg인 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 발효된 백출, 신곡 및 백편두의 혼합물을 포함하는 정장용 건강기능식품을 제공한다. 기능성 장질환의 예방 및 치료의 효능을 나타내는 상기 발효 혼합물을 유효성분으로 포함하는 정장용 건강기능식품을 제공한다. 상기 한약재의 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 기능성 장질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 발효물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 발효물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 발효물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 발효물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 발효과정

각 종류별로 한약재 20g을 200ml의 가압 멸균된 Milli-Q water에 용해시키는데, 추후 이들의 발효 과정 중에 분말형태의 LB 박테리아 배지 또는 포도당을 주입하였다. 그런 다음 이 혼합물을 121℃에서 20분간 가압 멸균 처리를 시행하였다. 식힌 다음, 2% 의 박테리아 접종물을 해당 배지에 주입하고 31℃ (바실러스 균 : Bacillus sp.) 또는 35.4℃ (Leuconostoc sp.)에서 24시간 동안 발효시켰다.

각 한약재의 비 발효 준비물은 위와 비슷한 방법으로 진행되었으나, 여기에 2%(v/v) 살균 박테리아 배지가 박테리아 접종물 대신에 사용되었다. 동물 실험에서는 개별 한약재의 비 발효 처리물을 멸균시켜 (멸균된 비 발효물) 박테리아를 전멸시켰으며, 실험 그룹은 그대로 멸균 없이 사용하였다

< 실시예 2> In vitro 실험 결과

1. 세포 배양

murine macrophage cell line인 RAW264.7 cells는 DMEM에 10% heat inactivated fetal bovine serum, 2mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin, 100??g/mL streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에 배양하였다.

2. 생존율 분석

RAW264.7 cells을 24 well plate에 2×10⁵cells/well로 분주한 다음 하룻밤 incubator에 배양하였다. 이후, 다양한 농도 (0.5% - 10% v/v)의 발효 한약과 비 발효 한약이 투여되었거나 투여 되지 않은 상태에서 RAW264.7 cells에 10 mcg/ml의 LPS (Pseudomonas aeruginosa 10, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

MTT를 넣은 후 3시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도하였으며 각각의 well로 부터 배지를 조심스럽게 제거하고 DMSO 용액을 첨가하여 formazan crystal 부산물을 완전히 용해하였다. 각각의 well의 흡광도는 microplate reader (Spectramax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm 에서 측정하였고 세포생존율은 OD values로 나타내었다.

가. 한약재의 세포생존율에 미치는 영향 및 LPS 로 유도된 세포독성에 대한 보호작용

도 1을 살펴보면, MTT 세포독성 분석에서 발효 한약과 비 발효 한약을 처리한 실험군이 대조군에 비해 어떠한 용량에도 cell viability에 세포독성을 유발하지 않았다.

도 2를 살펴보면, 10mcg/ml의 LPS를 처리하였을 때 대조군에 비해 세포 생존율의 58% 손실을 유발하는 세포독성 효과를 나타내었다. 1-1과 3-2의 0.5%를 처리한 그룹을 제외한 모든 발효 한약과 비 발효 한약 처리 그룹에서 LPS만 처리한 경우보다 세포 생존율을 높게 유지시켰다.

2-3 과 3-1 그룹 중에서, 10%를 처리한 그룹은 LPS로 유도된 세포독성에 대한 보호효과에서 가장 높은 보호효과를 보였고 세포 생존율은 각각 102%와 103%까지 유발되었고 각각의 결과는 통계적으로 유의하였다. 하기 표 1은 각 한약재 별로 배지 및 발효균주에 관한 것이다.

나. RAW264 .7 세포에서 발현되는 iNOS 의 유전자 발현에 대한 한약재의 효과

RT - PCR

RAW264.7 cells을 6 well plate에 8×10⁵cells/well로 분주한 다음 하룻밤 incubator에 배양한 후에 5%와 10%의 발효 한약과 비 발효 한약이 투여되었거나 투여 되지 않은 상태에서 10mcg/ml의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, Trizol® reagent (Invitrogen, Carsbad, CA, USA)를 사용하여 세포로부터 RNA를 추출하였고, 2 microgram RNA를 역전사하여 cDNA synthesis kit (SprintTM RT Complete Oligo-(dT)18, Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 first-strand cDNA를 얻었다. 최종 부피 20mcl의 시료를 LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostic, Roche Applied Science)를 이용하여 LightCycler instrument (Roche Applied Science, Indianapolis, Idaho, USA)에서 RT-PCR 분석을 하였다.

RAW264.7 세포에서 발현되는 iNOS의 유전자 발현에 대한 약물의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. LPS 처리 후 iNOS 발현이 현저히 증가하였다 (17750 fold over control, 도. 3). 10%를 처리한 3-2그룹을 제외하고는 발효 한약 또는 비 발효 한약을 처리한 그룹들은 iNOS 발현이 유의하게 (p<0.05) 억제되는 것으로 나타났다.

1-1그룹보다 1-2그룹이 iNOS 발현을 보다 더 억제시켰으며 1-2그룹에서는 LPS로 유도된 iNOS 발현에 비해 70% 가량 억제된 것으로 나타났고 2-3그룹이 iNOS 발현을 가장 많이 억제하는 것으로 나타났다.

3-2의 5% 처리 그룹은 LPS로 유도된 iNOS 발현에 비해 48% 가량 억제되었을지라도 3-2의 10% 처리 그룹은 통계적으로 유의한 변화가 관찰되지 않았다 (p>0.05).

다. LPS 에 의해 RAW264 .7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 발효 한약과 비 발효 한약의 억제효과

RAW264.7 cells을 6 well plate에 8×10⁵cells/well로 분주한 다음 하룻밤 incubator에 배양한 후에 5%와 10%의 발효 한약과 비 발효 한약이 투여되었거나 투여되지 않은 상태에서 10 mcg/ml의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포주로부터 생성된 NO는 Griess 시약 (Promega, Madison, WI, USA)을 사용한 colorimetric assay을 이용하여 측정하였다. culture medium 100 mcL 와 Griess 시약 100 mcL을 혼합하여 10분간 상온에서 배양한 후 540 nm로 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 준비된 sodium nitrite standard curve를 통하여 추정하였다.

LPS에 의해 RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 발효 한약과 비 발효 한약의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다. LPS에 의한 세포 배양액 내 NO의 농도는 세포만 배양하였을 때보다 16배 가량 증가되었다.

모든 발효 한약과 비 발효 한약을 처리한 그룹이 LPS로 유도된 NO 생성이 유의하게 (p<0.05) 억제되는 것으로 나타났다. 2그룹 중에서, 특히 2-1과 2-3그룹은 LPS로 유도된 NO 생성을 가장 많이 억제하는 것으로 나타났다 (도 4).

라. LPS 로 유도된 Raw 264.7 cells 에서 COX -2 발현에 대한 한약재의 효과

LPS로 유도된 Raw 264.7cells에서 COX-2 발현이 275배 가량 증가하였다. 1-1의 5%와 10%를 처리한 그룹과 3-2의 5%를 처리한 그룹을 제외한 모든 발효 한약과 비 발효 한약 처리 그룹에서 LPS로 유도된 COX-2 유전자 발현이 유의하게 (p<0.05) 억제되는 것으로 나타났다 그룹 2와 3-1이 LPS로 유도된 COX-2 유전자의 발현을 가장 많이 억제하는 것으로 나타났다 (도 5).

< 실시예 3> In vivo 내독소 저감 및 증가된 장투과성 개선 실험

가. 발효된 한약재의 혼합, 비 발효 한약의 항염증 작용

In vitro 실험에서 각각의 한약재-미생물 조합에서 가장 유의한 항염증 효과를 나타낸 짝을 선택하여 동물실험을 진행하였다. 즉, 신곡의 Leuconostoc mesenteroides 발효물, 백출과 백편두에서 Bacillus licheniformis 발효물을 혼합하였다. 상기 혼합된 신곡, 백출, 백편두 발효물의 비는 1:1:1이었다.

8 주된 체중 200 ± 20 g 의 Male Sprague-Dawley계 수컷 흰 쥐를 전 실험기간 동안 항온 (20 ± 2℃), 항습, 12시간은 밝게, 12시간은 어둡게 조성된 사육실에서 고형사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 실험 과정은 NIH의 the animal care guidelines에 따라 시행하였고 the Institutional Animal Ethical Committee of Dongguk University의 사전 동의하에 수행하였다. 환경 순응 후에 6개의 그룹으로 쥐들을 무작위로 배정하였다 (1) 대조군, 2) LPS-처리, 3) LPS-처리된 혼합된 발효 한약재(300 mg/kg), 4) LPS-처리된 혼합된 발효 한약재 (600 mg/kg), 5) 혼합된 비 발효 및 과압 멸균된 한약재 (600 mg/kg), 6) LPS-처리된 초유).

LPS (from Escherichia coli 055:B5, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 생리식염수에 용해한 후 2그룹에서 6그룹까지 1 mg/kg의 양으로 투여하였고 1그룹은 LPS가 없는 생리식염수를 투여하였다. 3,4그룹 그리고 5그룹의 쥐들에게 발효되거나 또는 발효되지 않은 1-2, 2-3, 그리고 3-1의 혼합물을 LPS 투여에 앞서 5일 동안 매일 300 mg/kg과 600 mg/kg을 각각 투여하였다. 반면에, 1그룹과 6그룹에 속한 쥐들에게 상기 계획에 따라 한약 대신에 물과 초유 (Diatech Korea, Seoul, Korea; dose: 1 ml/rat using 10% v/v solution)를 각각 투여하였다. LPS 투여 후 12시간가량 지난 이후, 쥐들은 각각의 metabolic cage로 옮겨졌고 그리고 나서 12시간가량 물을 제외한 어떠한 음식도 섭취 못하게 하였다. LPS 투여 후 24시간이 지나고 나서, 66 mg/ml lactulose과 50mg/ml mannitol을 함유한 1 ml 수용성 test solution을 각각의 쥐에게 intubation에 의해 구강으로 투여하였다. 이 상황에서 물만을 허용한 채 24시간가량 쥐들을 유지하였고 그 이후에 추가 분석을 위해 소변과 혈액 검사를 시행하였다.

나. LPS 로 유도된 혈청의 내독소 수치에 대한 발효 한약과 비 발효 한약의 억제효과

혈청의 내독소 수치

혈청의 내독소 수치는 Limulus Ameobocyte Lyasate(LAL)-based kit supplied by Diatech를 사용하여 Endo-Check TM analyzer (Diatech Korea, Seoul, Korea)으로 측정하였다. BD Biosciences(San Diego, CA, USA) 와 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)로부터의 rat-specific commercial kits를 사용한 ELISA에 의하여 혈청 CRP를 분석하였다.

LPS는 그람 음성균의 세포외막 성분으로 endotoxin shock을 일으킨다고 알려져 있다 1). LPS 투여로 endotoxin level이 대조군에 비해 300배 가량 증가되었다 (300 fold over control, 도 6). 혼합된 발효 한약을 5일 동안 경구 투여한 후 (300mg/kg, 600mg/kg) LPS를 투여한 그룹과 초유를 5일 동안 경구 투여한 후 LPS를 투여한 그룹은 LPS로 유도된 endotoxin level을 유의하게 (p<0.05) 감소시켰다.

혼합된 발효 한약 (600mg/kg)을 투여한 그룹은 LPS로 유도된 endotoxin level을 65% 가량 감소시켰고, 혼합된 발효 한약 (300mg/kg)을 투여한 그룹은 58% 가량 감소시켰으며 초유를 투여한 그룹은 62% 가량 감소시켰다. 혼합된 비 발효 한약과 멸균한 발효한약 그룹은 LPS로 유도된 endotoxin level을 유의성 있게 감소시키지는 못하였다 (p>0.05)(도 6).

다. LPS 로 유도된 혈청 CRP level 에 대한 혼합된 발효물 및 비 발효한약재의 영향

LPS로 유도된 혈청 CRP level은 대조군에 비해 64% 가량 증가하였다. 혼합된 발효 한약을 투여한 그룹과 혼합된 비 발효 한약과 멸균된 발효 한약 그룹, 그리고 초유를 투여한 그룹에서 혈청 CRP level이 LPS를 투여한 그룹에 비하여 감소하였으나 통계적으로 유의성 있게 감소시키지는 못하였다 (p>0.05)(도 7).

라. LPS 처리된 쥐의 L/M 비율에 대한 혼합된 발효물 및 비 발효한약재의 영향

증가된 장 투과성 (increased gut permeability)은 새는 장 증후군 (leaky gut syndrome)으로 알려져 있기도 하며 스트레스, 약물, 알콜 등에 의해 장점막의 건전성 (integrity)이 떨어지면 내독소 등의 미생물 독소, 음식물 독소 등이 전신 혈류 순환계를 진입하여 전신염증을 일으켜 각종 만성질환의 원인이 되는 것으로 연구를 통해 알려지고 있다.

큰 분자인 락툴로스는 정상적으로 소변에서 배출되면 안되고 작은 분자인 만니톨은 소변에서 검출되어지는데 이 비율을 이용하여 장점막의 건전성과 장투과성을 측정할 수 있다.

Megazyme (Bray, Co. Wicklow, Ireland)부터의 K-Lactul and K-Manol kit를 사용하여 소변의 lactulose와 mannitol 수치를 측정하였다. 분석은 the instruction of kit manufacturer에 따라 하였다. 소변 lactulose와 mannitol 수치는 섭취한 양을 통한 회복된 백분율에 의해 결정되었고 L/M 비율을 계산하였다.

혼합된 발효 한약이 용량에 의존하여 lactulose/mannitol ratio을 유의하게 (p<0.05) 감소시켰으며 혼합된 비 발효 한약과 압력솥에 찐 한약을 섞은 그룹과 초유를 투여한 그룹은 lactulose/mannitol ratio을 유의성 있게 감소시키지는 못하였다 (p>0.05)(도 8).

< 실시예 4> In vivo 항생제 유발 설사 억제 효과 실험

수컷 Spraque-Dawley (200 ± 20g, 6주)쥐들은 제어된 온도와 습도에서 유지되었다. 이 실험 대상 쥐들은 임의적으로 섭취할 수 있는 음식, 물과 함께 12시간 주/야간 주기 환경에 유지되었으며, 대한국립보건원의 animal care 가이드 라인에 따라 동국대학교 동물 윤리 위원회의 사전 허가 아래 실험이 진행되었다.

네오마이신 (Neomycin)은 쥐에게 항생제 복용 후 발생하는 설사를 유발시키는데 사용되었다. 여기에 적응된 동물들을 임의로 다음과 같이 6개의 그룹으로 구분하였다 (1)대조군, 2)네오마이신 주입, 3)혼합된 발효 한약재와 네오마이신 주입, 4)혼합된 비 발효 한약재와 네오마이신 주입, 5)혼합된 비 발효의 가압 멸균 처리된 한약재와 네오마이신 주입, 6)프로바이오틱스 (probiotics)와 네오마이신 주입). 네오마이신 (미국 캘리포니아주 라 호야 Calbiochem/EMD Biosciences 社 제품)을 멸균 정제수에 용해시키고, 그룹 2~6에 있는 동물들에게 800 mg/kg 을 구강으로 하루 1회, 연속 7일간 주입하였다. 반면 그룹 1에게는 멸균 정제수만 주입하였다. 그룹 3,4,5 에 있는 쥐들은 발효된 혼합물, 발효되지 않은 혼합물 그리고 발효되지 않고 가압 멸균 처리한 물질 각각 1-2, 2-3, 그리고 3-1을 각 한약재당 600mg/kg에 해당하는 양만큼 하루 1회, 연속 8일간 (네오마이신을 주입하기 시작하는 전날부터) 주입하였다. 반면 한약재 대신에 그룹 1과 그룹 6에 속한 동물들에게는 각각 위와 같은 일정대로 물과 프로바이오틱스 (Lactobacillus acidophilus, 1.0 X 10¹¹CFU/g,CellBiotech社 제품. 한국 경기도 김포시, 복용량 : 0.16g/kg)를 먹였다. 이러한 식이요법 이후에 혈액과 대변을 채취하여 추가 분석을 실시하였다. 실험대상 동물들은 희생시켜 맹장을 적출하였으며, 적출된 맹장은 인산염 완충식염수에 씻어 포르말린 용액에 고정시키어 융모의 퇴행을 막았다. 혈장은 실험대상의 혈액을 원심분리기에서 4°C, 1000 × g 로 15분 동안 분리하여 얻어내었다. 모든 샘플은 분석 전까지 -70°C에서 보존되었다.

가. Neomycin 처리된 쥐의 몸무게 및 대변의 특징에 대한 혼합된 발효물 및 비 발효한약재의 영향

대변의 수분함량 측정

각 채취한 모든 쥐의 대변을 즉시 무게를 측정하고 기록하였다. 그런 다음 이를 2시간 동안 원심 농축시키고 건조된 상태에서 다시 무게를 측정하였다. 대변의 수분함유량은 다음의 공식을 통해 산출되었다.

수분함유량(%)=((원래의 수분이 함유된 무게(g) - 건조된 상태에서의 무게(g))/ 원래의 수분이 함유된 무게(g)) X 100

대변의 신체검사를 통해 Neomycin 주입 2일차와 3일차 사이에 반고체 형태가 나타나기 시작했다. 위에서 언급된 한약재 물질 또는 probiotics의 주입은 Neomycin과 비교할 때 대변 양을 변화시키지는 않았다. 그러나 대변 수분함유량의 뚜렷한 증가는 설사 증상의 시작을 나타냄으로써 네오마이신 주입을 입증할 수 있는 근거가 된다. 그러나 대변의 수분함유량에서는 위에서 언급된 한약재 물질과 probiotics 주입에 따른 뚜렷한 변화가 나타나지 않았다 (도 9).

나. Neomycin 처리된 쥐의 CRP 및 인터페론-γ 레벨에 대한 혼합된 발효물 및 비 발효한약재의 영향

CRP , 인터페론 γ 농도 측정

혈청에서의 엔도톡신 수치는 균체 내 독소검사 (Limulus Ameobocyte Lyasate) 기반의 키트를 이용하여 Diatech 社 가 제공한 Endo-Check TM 분석기 (Diatech社, 한국)로 실시하였다. 제조업체의 지시에 따라 시행하였다. 혈중 CRP와 인터페론 γ 수치는 각각 BD Biosciences (미국 캘리포니아주, 샌디에이고)社와 Thermo Scientific (미국 일리노이아주 록퍼드)의 쥐 전용 상용 키트를 이용하여 ELISA (효소결합면역흡착검사)로 측정하였다(도 10).

다음으로 항생제 복용으로 인한 설사 유발 증상의 발현이 염증이 발생하는 과정에 관련이 있는지 판단하기 위해 Neomycin 주입에 따른 CRP 및 인터페론-γ의 변화를 분석해 보았다. Neomycin에 노출된 실험대상 동물들의 CRP 레벨은 Neomycin에 대한 급성 면역반응의 유도를 보여주고 있다. Probiotic을 주입한 결과 Neomycin 투약 쥐에서 유의한 CRP감소가 관찰되었다. 이것은 위 약물의 항염증작용을 암시하고 있다. 발효/비 발효 멸균 한약재 혼합물을 사용한 정기적 치료는 Neomycin 유도 CRP 레벨을 유의적으로 감소 시켰으며, 이는 두 가지 한약재의 항염증 (소염) 작용을 보여주었다. 하지만, 아직까지 명확하지 않은 이유로 비 발효 비 멸균 한약재의 혼합물을 Neomycin 투약 쥐들에서 혈청 CRP 레벨에 별다른 영향을 미치지 못했다. Neomycin을 통한 치료는 실험대상 동물들의 혈청 IFN-γ 을 유의적으로 증가시켰으며, 이는 Neomycin에 대한 면역 반응의 발현에 더욱더 힘을 실어주고 있다. 흥미롭게도, 모든 한약재 준비물을 사용한 치료는 Neomycin 투약 쥐들의 혈청 IFN-γ레벨의 유의적 감소를 불러 일으켰다. 이러한 결과를 통해, 한약재 물질에는 항 염증적 효능이 있으며, 이로써 설사를 유발할 수 있는 항생제 투여에 따른 면역반응으로부터 장점막을 보호할 수 있는 능력을 보여준다.

다. 조직학적 변화

포르말린에 충분히 고정시킨 후 맹장은 70% 에탄올 용액으로 옮겨 졌으며, 4°C에서 분석 전까지 보존하였다. 조직의 파라핀 프로세싱은 다음과 같이 이루어졌다. : 70% 메탄올에서 1시간, 90% 메탄올에서 1시간, 95% 메탄올에서 1시간, 100% 메탄올에서 1시간, 100% 에탄올에서 1시간, 자일렌에서 1시간 (2 체인지) ; 파라핀 (65°C)에서 30분. 다음으로 조직의 파라핀 블록이 준비되었다. 블록들은 박절기를 이용하여 4 μM 조직 절편을 만들어 물중탕에 담근 후, 깨끗한 유리 슬라이드에 고정하게 된다. 조직을 유리 슬라이드에 확실히 고정하기 위해서 65°C 오븐에서 20분 동안 유리 슬라이드를 가열하게 된다. 유리 슬라이드는 다음 스텝을 통해 탈파라핀과 재수화 작용을 거치게 된다. : 자일렌에서 2분 (3체인지); 100% 에탄올 (2체인지); 95% 에탄올 ; 80% 에탄올 ; 물. 헤마톡실린 & 에이오신 (H&E) 조직 염색은 다음과 같다. : 헤마톡실린에서 2분; 흐르는 물로 행굼; 염산 알코올 (76.6% 에탄올과 1/300(v/v) 농축 HCl); 물; 암모니아 용액 (0.084%(w/v) NH4OH); 5분 동안 흐르는 물에 행굼; 80% 에탄올 ; 에이오신 15초; 95% 에탄올 (2체인지) ; 100% 에탄올 (2체인지). 준비된 슬라이드는 현미경으로 관찰하였고 각각의 이미지들을 포착했다 (도 12).

무처치 군에서는 장점막이 깨끗하게 보존되어 있고 정상적인 융모의 생장, 하부 조직이 건전하게 보존되어 있다. 항생제 유발 설사군에서는 장점막의 손상, 염증세포의 침윤, 하부조직의 부종과 불연속성이 관찰되나 발효한약을 함께 투여한 군의 장점막 조직에서는 병리소견이 뚜렷이 개선되어 있었다.

Neomycin이 소화관에 병변을 일으키는지 그리고 이러한 손상을 한약재 물질이 치료할 수 있는지에 관해 평가하기 위해 맹장 조직에 대한 분석을 실행하였다. Neomycin 투약 쥐에서 상피조직 완전성 소실, 부종을 포함한 염증 증후와 움(crypts)의 소실과 같은 맹장 조직 병변 증상이 관찰되었다. 발효 비 멸균 한약재 물질에 노출된 Neomycin 투약 군에서의 맹장 조직 profile은 대조군의 그것과 유사하였으며, 이것은 한약재 물질이 Neomycin 투약 조직 손상과 소화관 염증에 대한 보호 능력을 암시하고 있다. 여기에 비교하여, 비 발효(멸균/비 멸균) 한약재 혼합물의 치료는 쥐의 맹장에서 Neomycin 투약 조직 병변에 대해 보통 정도의 효과만 보여주었다. Probiotics에 노출은 Neomycin 투약 쥐의 맹장 조직 손상에 있어 비 발효 한약재 물질보다 강한 보호 효과를 보여주었으며 이는 곧 소화관에서 Neomycin 투약 조직 병변에 있어 염증의 중요한 역할을 보여주고 있다. 종합해 볼 때, 발효 한약재 혼합물은 강력한 항염증(소염) 효능을 지니고 있으며, Neomycin이 야기한 조직 손상의 치료에 사용될 수 있다고 추측할 수 있다.

< 실시예 5> In vivo LPS 처리 장염 모델 동물에서의 장내미생물 균총 개선효과

동물의 분변을 희생 전에 채취하여 -80도로 보관한 후 분석하였다. 분변내의 DNA는 키트를 사용하여 추출하였고 A260/A280 비를 통해 순도를 검증하고 대략의 함량을 측정하였다. 각각의 속 (genus)에 맞는 primer를 문헌에서 검색하여 주문한 후 real time PCR에서 반응시켜 특이도를 측정하였다. Lactobacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Salmonella, Universal bacteria 등의 최적 반응조건을 구하고 melting curve로 확인하는 절차를 반복하였다. 최종적으로 universal bacteria에서 각각의 genus의 수를 빼서 상대적 abundance를 측정하였다. 유해균인 살모넬라와 클로스트리디움은 외부환경에 노출이 덜 된 동물이어서인지 거의 검출되지 않았으며 유익균인 락토바실러스 속과 비피도박테리움 속은 군별로 유의한 차이가 관찰되었다. (도 13, 14)

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

발효된 백출, 신곡 및 백편두의 혼합물을 포함하는 정장용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
백출의 발효는 1~3% 포도당을 배지로 Bacillus licheniformis을 발효균주로 하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 정장용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신곡의 발효는 1~3% 포도당을 배지로 Leuconostoc mesenteroides을 발효균주로 하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 정장용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백편두의 발효는 1~3% LB broth를 배지로 Bacillus licheniformis을 발효균주로 하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 정장용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합물에 함유된 발효된 백출, 신곡, 백편두의 비는 1:1:1인 것을 특징으로 하는 정장용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 혼합물의 양은 300 내지 3000mg/kg인 것을 특징으로 하는 정장용 약학 조성물.
발효된 백출, 신곡 및 백편두의 혼합물을 함유하는 정장용 건강기능식품.
제 7항에 있어서,
상기 혼합물에 함유된 발효된 백출, 신곡, 백편두의 비는 1:1:1인 것을 특징으로 하는 정장용 건강기능식품.