KR101055285B1 - 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 mmp―9 또는 mmp-2의 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생에 직접 관여하는 세포외기질분해효소 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명인 불가사리 추출물은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9과 MMP-2 모두의 활성을 억제시키고, MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 혈관 질환, 죽상경화성 질환, 관절염, 염증, 자가면역질환 또는 증식성 질환에 대한 예방 또는 치료에 매우 큰 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명은 MMP-9 또는 MMP-2의 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 MMP-9의 생성발현을 매개하는 p-ERK 시그널을 억제하며, NF-κB 핵 내 이동을 억제하는 바, MMP-9 또는 MMP-2의 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 MMP-9와 관련된 질환, 질병 또는 상태에 대한 예방 및 치료 효능을 가지는 불가사리 추출물의 의약 및 식품으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

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Description

불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 MMP―9 또는 MMP-2의 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for Treatment and Prevention of Diseases Caused by Overexpression of MMP―9 or MMP―2 Comprising Extract of Starfish}

불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 불가사리 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 MMP-9 또는 MMP-2의 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

매트릭스 메탈로프로디나아제(Matrix metalloproteinase: MMP)류는 세포외기질(extracellular matrix: ECM)의 여러 가지 성분을 분해하는데 중요한 역할을 한다. MMP류에 의하여 매개되는 질환으로는 동맥경화증, 재협착증, MMP-매개 골감소증, 중추신경계의 염증질환, 피부노화, 류마티스성 관절염, 폐혈증성 관절염, 각막궤양, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 안구건조증, 백내장, 비만, 염증, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이 등이 있다.

이러한 MMP류 중에서 특히 MMP-2와 MMP-9는 타입 IV 콜라겐에 특이적으로 작용하여 염증, 졸증, 종양생장 및 전이와 같은 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 동맥경화증, 재협착증, 류마티스성 관절염, 폐혈증성 관절염, 각막궤양, 이상 창상 유합, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 염증, 안구건조증, 각막이식 거부, 혈관신생, 비만, 암의 침윤과 전이, 뇌졸증, 종양생장 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

또한 척수액에서 MMP-9의 수준은 다발성 경화증 및 기타 신경성 질환과 관련되어 있으며(Beeley N.R.A. et al, Nature 362:839-841(1993)), 또한 아밀로이드 베타단백질을 분해하여 축적시키는데도 기여한다고 알려져 있다(Backstrom J.R. et al, J Neurosci 16(24):7910-9(1996)).

뿐만 아니라, MMP-9은 간암의 침윤과 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 암의 전이와 침윤은 악성암세포의 기본적인 특성이다. 암은 초기에 전이뿐만 아니라 혈관으로 침윤을 일으킨다. 암세포는 침윤과 전이 과정 에서 몇 가지 중요한 단계를 거친다. 이들 과정 중에서 암조직을 둘러싸는 세포외기질과 기적막은 암의 침윤에 있어서 벽으로 간주되므로 기저막(basement membrane)을 구성하는 세포외기질의 분해가 본질적인 초기 단계이다. 여러 가지 단백질 분해효소가 이 과정에 관여하여 외부환경 장벽인 세포외기질(ECM)과 기저막의 분해를 통하여 최종단계에 이른다(Woessner, J.G. Jr., FASEB J 5:2145-2154(1991)). 그러나 세포에서 분비되는 것은 비활성형의 프로MMP-9으로서 이것은 우로키나제-타입 프라즈미노겐 활성자(urokinase-type plasminogen activator, uPA)에 의한 프라즈미노겐(plasminogen)의 활성형의 생성(plasmin)을 포함한 일련의 효소 활성화를 통해서 활성화된다. 활성화된 MMP-9은 암세포의 침윤능을 증진시킨다(대한민국 특허공보 제2002-71674호).

한편 MMP-2와 MMP-9의 발현이 동맥경화에도 관련이 있음이 알려져 있으며 MMP 단백질의 발현과 혈관평활근세포의 증식과 혈관내막으로의 이동과의 관련성이 많이 연구 되어있다. 혈관벽의 손상에 의해 증가된 단백질분해활성은 혈관평활근세포를 둘러싸고 있는 세포외기질(ECM)의 분해를 촉매하며 또한 이것은 혈관평활근세포가 혈관내막쪽으로 이동하는 데 필요한 과정이다(Newby A.C. et al, J Pathol 190:3009(2000)). 혈관손상에 반응하여 이러한 장해부위의 발달의 매개자로서 MMP-2(72 kDa)와 MMP-9(92 kDa) 젤라티나아제(gelatinases)가 연관된다. 랫의 혈관손상 모델에서 MMP-9은 랫의 경동맥 손상 후 6시간 내에 발현되었고 6일동안 발현이 지속되었다. 한편 MMP-2의 활성은 손상 4일후 증가하였다(Bendeck M.P. et al, Circ Res 75:53945(1994)). 최근의 유전자의 녹아웃연구로부터 나타난 사실 은 MMP-9이 혈관평활근세포의 증식과 이동을 조절하는 능력으로 인해 혈관벽의 손상의 발달에 결정적인 것으로 보고되었다(Cho A. et al, Circ Res 91:845-51(2002); Galis Z.S. et al Circ Res 1:8529(2002)). 또한, MMP-2와 MMP-9이 비슷한 기질 특이성이 있지만 그들의 발현에서 차이점이 나타나는 것으로 밝혀졌다 (Senior R.M. et al, J Biol Chem 266:78705(1991); Okada Y. et al, J Biol Chem 267:217129(1992)). MMP-2는 평활근세포를 포함하여 여러 세포타입에서 구성적으로 발현되며 그것의 발현은 사이토카인이나 성장인자에 의해 유도되지 않는다 (Galis Z.S. et al, Circ Res 75:1819(1994); Fabunmi R.P. et al, Biochem J 315:33542(1996)). MMP-9의 발현은 이와 반대로 서로 다른 수 개의 실험실에서 이루어진 결과에 의하면 MMP-9의 발현은 기본적으로 낮으며, TNF-α의 처리에 의해 유도되는 것으로 나타났다(Cho A. et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:252732(2000)). 또한, MMP-9을 조절하는 시그널 전달경로의 연구는 몇가지 다른 유도 물질을 처리했을때 미토젠-활성 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinases: MAPK)인 세포외 신호-조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinase 1/2: ERK1/2), p38 그리고 PI-3 인산화효소 등의 경로가 MMP-9 의 발현에 중요하다는 것이 증명되었으며, 특히 혈관평할근세포(VSMC)에서 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α: TNF-α)와 신경성장인자(Nerve growth factor: NGF)가 ERK 1/2의 경로를 통해서 MMP-9의 발현을 조절하는 것이 밝혀졌다(Cho A. et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:252732(2000); Faisal Khan K.M. et al, J Biol Chem 277:23539(2002)). 한편 이전의 연구들에서 나타나듯이 혈관평활근세포에서 TNF-α에 의해 유도된 MMP-9의 프로모토 활성도(promoter activity)는 AP-1과 NF-κB(Nuclear Factor-kappaB)에 의해서 매개된다(Moon S.K. et al, Biochem Biophys Res Commun 301:106978(2003); Moon S.K. et al, J Cell Physiol 198:41727(2004); Bond M. et al, FEBS Lett 435:2934(1998)). 게다가 NF-κB는 TNF-α나 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인 유전자들의 활성화에 관여하는 핵심전사인자이다. 그래서 NF-κB 활성화에 관련되는 신호전달 경로 및 NF-κB의 활성에 의존하는 다양한 단백질들의 거동연구를 통해 동맥경화를 억제하는 다양한 연구들이 이루어지고 있다(Menno P. J. et al, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 25:904-914(2005)).

불가사리는 극피동물문에 속하는 해양 저서생물로서 수산생물에 많은 피해를 입히는 해적생물로 분류되고 있다. 우리나라 해안에는 약 4천 930만 마리의 불가사리가 서식하며 패류등에 대한 엄청난 피해로 인해 각종 구제책을 강구하고 있으나 아직 실효성 있는 대책은 나오지 않은 상태이다. 이들 불가사리는 토종인 별 불가사리와 일본에서 건너온 아무르 불가사리로 나뉘고 연간 1만 8천 400t의 패류피해가 발생하고 있다. 특히 토종 불가사리가 죽은 것을 먹는 것에 반해 일본에서 온 아무르 불가사리는 살아있는 것을 먹으며 엄청난 번식력과 포식력을 가지고 있다. 따라서 97년부터 예산을 들여 구제작업을 벌이고 잡아들인 불가사리를 수매하기도 하나 아직 확실한 대책이 없는 형편이다. 한편 수산과학원에서는 불가사리 구제장치의 개발 등을 비롯하여 불가사리에서 추출한 칼슘제제의 산업화과정을 거쳐 제품개발에 및 기술이전에 성공하였고, 또한 불가사리로부터 콜라겐을 추 출하여 마스크 팩 등 콜라겐 화장품개발에도 성공하였다. 콜라겐은 식품, 화장품, 의료용제품 등에 주로 이용되고 있으며 우리나라에서 소비 되는 콜라겐의 양은 연간 약 1,400톤에 달하고 대부분 수입에 의존하고 있는 실정이다. 또한 최근 광우병 등의 원인으로 인해 대부분 소등 가축에서 추출되는 콜라겐보다는 해양콜라겐을 선호하는 경향이 있다. 불가사리의 기존 연구개발로는 콜라겐을 분리하여 화장품비누개발이 제품으로 성공한 사례가 있다(국립수산과학원). 또한, 항 콜레스테롤 활성을 갖는 불가사리 추출물을 유효성분으로 하는 항 콜레스테롤 조성물을 용매추출 방법에 의해 불가사리로부터 분리·정제되고 in vitro 및 in vivo에서 항 콜레스테롤 활성을 나타내며, 혈중 총 콜레스테롤 함량을 효과적으로 저해하는 불가사리의 아세톤 추출물을 유효성분으로 하는 항 콜레스테롤 조성물이 발명보고 된 바 있다(대한민국특허 제10-408090호).

현재 해양 폐자원의 활용 및 생리활성물질의 새로운 재료를 개발하고 연구하기 위해, 인체 각종 대사질환과 암 발생기전에서 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있는 matrix metalloproteinase-9(MMP-9)와 MMP-2를 타겟으로 하여, 이의 길항작용을 가지는 불가사리 추출물에 대한 연구를 진행하였으며 아직 불가사리 추출물의 치주염, 치은염, 동맥경화증, 재협착증, 류마티스성 관절염, 폐혈증성 관절염, 각막궤양, 이상 창상 유합, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 염증, 안구건조증, 각막이식 거부, 혈관신생, 비만, 암의 침윤과 전이, 뇌졸증, 종양성장에 억제활성에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 불가사리 추출물의 생리적학 활성을 규명하고자 노력하였고, 그 결과 불가사리의 추출물이 직접적으로 MMP-9(matrix metalloprotease-9)의 발현 및 활성을 억제하여, 결국 MMP-9와 관련된 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 효능이 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 MMP-9-관련 질환, 질병 또는 상태에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9과 MMP-2 모두의 활성을 억제시키고, MMP-9-관련 혈관 질환, 죽상경화성 질환, 관절염, 염증, 자가면역질환 또는 증식성 질환에 대한 억제방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약물(medicament)을 제조하기 위한 신규한 용도(use)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 MMP-9-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 MMP-9-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료 약물(medicament)을 제조하기 위한 불가사리 추출물의 용도(use)를 제공한다.

본 발명자들은 불가사리 추출물의 생리학적 활성을 규명하고자 노력하였고, 그 결과 불가사리의 추출물이 직접적으로 MMP-9의 발현 및 활성을 억제하여, 결국 MMP-9와 관련된 질환, 질병 또는 상태를 예방 또는 치료에 효능이 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 불가사리(starfish)는 극피동물문에 속하는 해양 저서생물로서 우리나라 해안에 약 4천 930만 마리의 불가사리가 서식한다. 우리나라 해안에 서식하는 대표적인 불가사리는 토종인 별 불가사리(Asterina pectinifera)와 일본에서 건너온 아무르 불가사리(Asterias amurensis)로 나뉜다. 현재 불가사리에서 추출한 칼슘제제, 콜라겐 마스크 팩과 화장품비누로 이용되고 있다(국립수산과학원). 또한, 항 콜레스테롤 활성을 갖는 불가사리 추출물을 유효성분으로 하는 항 콜레스테롤 조성물을 용매추출 방법에 의해 불가사리로부터 분리·정제되고 in vitro 및 in vivo에서 항 콜레스테롤 활성을 나타내며, 혈중 총 콜레스테롤 함량을 효과적으로 저해하는 불가사리의 아세톤 추출물을 유효성분으로 하는 항 콜레스테롤 조성물이 발명보고 된 바 있다(대한민국특허 제10-408090호).

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 불가사리 추출물은 다양한 불가사리를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 불가사리는 아무르 불가사리(Asterias amurensis), 별불가사리(Asterina pectinifera), 거미불가사리(Ophioplocus japonicus) 또는 빨강 불가사리(Certonardoa semiregularis)이며, 가장 바람직하게는 아무르 불가사리(Asterias amurensis)이다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 불가사리 추출물을 포함한다. 본 명세서에서 불가사리를 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 불가사리에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 불가사리 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 불가사리 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 불가사리 추출물을 불가사리에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide) 를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 불가사리에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 불가사리 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 불가사리 추출물에 포함되는 것 이다.

본 발명에서 이용되는 불가사리 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

매트릭스 메탈로프로디나아제(Matrix metalloproteinase: MMP)는 아연-의존 엔도펩티다아제(endopeptidase)로서 세포외기질(extracellular matrix: ECM) 단백질을 분해하는 효소이다. MMP는 형태형성, 혈관신생, 조직 수선, 간경변, 관절염 및 암전이와 같은 다양한 생리학적 및 병리학적 진행과 관련된 조직 재형성(tissue remodeling)에 중요한 역할을 한다. 특히, MMP 중에서 MMP-9과 MMP-2는 암전이 및 혈관신생에 중요한 작용을 하는 것으로 잘 알려져 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 불가사리 추출물은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9 및 MMP-2 모두의 활성화를 직접적으로 또는 간접적, 보다 바람직하게는 직접적으로 억제한다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 불가사리 추출물은 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)에 의해 유도되는 ERK(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화(phosphorylation)를 저해하고, NF-κB(Nuclear Factor-kappaB)의 라지 서브유닛(large subunit)인 p65가 핵내로 이동하는 것을 저해함으로써 MMP-9-관련 질병, 질환 또는 상태 상태를 매우 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.

NF-κB는 전사인자인 단백질복합체로서 거의 모든 동물 세포 타입에서 발견되며, 스트레스, 사이토카인, 자유레디칼, 자외선조사, 박테리아 또는 바이러스 항원과 같은 자극이 존재하는 경우 세포핵 안으로 이동하여 약 200개 정도의 유전자 발현에 관여한다. NF-κB는 감염에 대한 면역반응조절에 중요한 역할을 한다. 이러한 면역반응조절에 있어서 부정확한 잘못된 조절은 종양, 염증, 자가면역반응, 폐혈성 쇼크, 바이러스 감염, 및 비정상적인 면역반응으로 연결이 된다. NF-κB은 (i) Class I에 속하는 NF-κB1(also called p105→p50)과 NF-κB2(also called p100→p52)가 있으며, (ii) Class Ⅱ에 속하는 RelA (also named p65), RelB 및 c-Rel의 5가지 단백질로 구성된다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은 MMP-9이 관여되는 모든 질환을 포함하며, 바람직하게는 혈관 질환, 죽상경화성 질환, 관절염, 염증, 자가면역질환 또는 증식성 질환(proliferative disease)이다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관질환은 바람직하게는, 동맥경화, 미성숙 죽상 동맥경화증, 대동맥류, 심근경색증, 혈관재협착증, 복대동맥류 질환, 혈전, 혈전용해제투여 따른 대출혈 또는 뇌출혈, 혈관신생, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 신생혈관 녹내장, 백내장, 홍색증, 증식성 망막증, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 혈관 접착 및 혈전성 미소혈관증 질환을 포함한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 증식성 질환은 암 및 혈관신생-관련 질환을 포함한다. 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암 질환은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 직장암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 자궁내막 암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, non-Hodgkin 임파선암, 부갑상선암 및 요관암 세포 또 는 조직을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는, 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈 병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 관절염은 건선성 관절염, 전신 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 턱관절의 관절염 및 라임병성 관절염을 포함한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 죽상경화성 질환은 동맥경화증, 미성숙 죽상 동맥경화증, 아테롬성 동맥 경화 및 대동맥류를 포함한다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 동맥경화, 미성숙 죽상 동맥경화증, 아테롬성 동맥 경화, 대동맥류, 류마티스 관절염, 골관절염, 전신 관절염, 골다공증, 심근경색증, 혈관재협착증, 폐혈증성 관절염, 각막궤양, 이상 창상 유합, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 홍반성 난창, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 염증, 안구건조증, 각막이식 거부, 패혈증, 폐렴, 혈전, 혈전용해제투여 따른 대출혈 또는 뇌출혈, 혈관신생, 비만, 종양의 전이, 침윤 또는 성장과 관련한 질환을 예방 또는 치료에 매우 효과적인 효능을 나타낸다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 암, 동맥경화증, 아테롬성 동맥 경화, 염증 질환(바람직하게는, 류마티스 관절염 또는 골관절염) 또는 혈관재협착증 의 예방 또는 치료에 이용된다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 불가사리 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 불가사리 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환 자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 불가사리 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 불가사리 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 불가사리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명인 불가사리 추출물은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9과 MMP-2 모두의 활성을 억제시켜 MMP-9(matrix metalloprotease-9)-관련 혈관 질환, 죽상경화성 질환, 관절염, 염증, 자가면역질환 또는 증식성 질환에 매우 큰 효능을 발휘한다.

(ⅲ) 본 발명은 MMP-9(matrix metalloprotease-9)와 관련된 질환, 질병 또는 상태에 대한 예방 및 치료 효능을 가지는 불가사리 추출물의 의약 및 식품으로서의 가능성을 제시한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 불가사리 추출물의 추출모식도

불가사리(Asterias amurensis) (대한민국, 남해안) 1.4 ㎏을 분쇄한 후 메탄올을 사용하여 추출하였으며, 추출물을 진공증발기(vacuum evaporator)를 사용하여 메탄올을 증발시키고 40 g의 분말추출성분을 획득하였다. 이 분말추출물에 H₂O 200 ㎖과 헥산 200 ㎖을 첨가하여 분획하였으며, 헥산분획을 진공증발기를 사용하여 건조시키고 5.301 g의 분말추출물을 얻었다. 수용성(Aqueous) 분획에 200 ㎖의 아세트산에틸(ethylacetate: EtOAc)를 첨가하여 분획하였으며, EtOAc 분획을 진공증발기로 건조하여 0.308 g의 분말추출물을 얻었다. 다시 수용성 분획에 200 ㎖ 의 부탄올(Buthanol)을 처리하여 분획하였으며, 부탄올 분획을 진공증발기로 건조하여 2.465 g의 분말추출물을 획득하였다. 마지막으로 남은 수용성 분획을 동결건조하여 19.6 g의 분말추출물을 획득하였다. 이들 분말추출물은 DMSO(dimetylsulfoxide)에 녹여서 활성검정에 사용하였다.

실시예 2: 불가사리 추출물의 MMP-9 및 MMP-2 효소활성에 미치는 효과

불가사리 추출물의 MMP-9과 MMP-2의 효소활성인 젤라틴 분해활성에 대한 억제효과를 검정하기 위하여 TNF-α를 처리한 인간동맥평활근세포 (Human Aortic Smooth Muscle Cells: HASMC) 세포배양액으로부터 얻은 조건배지를 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤(glycerol), 2% SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 0.00625%(w/v) 브로모페놀블루(bromophenol blue)가 함유된 같은 완충액에 재희석하였다. 그리고 이 용액을 0.1%(w/v) 젤라틴이 함유된 10% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 가열하지 않고 전기영동시켰다. 전기영동 후에 젤을 실온에서 2.5% 트리톤(Triton) X-100(2 x 30분)에 담가 적시고 나노퓨어(NanoPure) 증류수 (Millipore NanoPurem, Millipore Co., CA, USA)로 세척하였다. 그런 다음 젤을 각 전기영동 레인단위로 슬라이스 조각으로 세절하여 다양한 농도의 불가사리 추출물을 함유한 반응용 완충액[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 200 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂]을 담은 각각의 탱크용기에 담구었다. 이렇게 준비된 불가사리 추출물을 처리한 젤을 37℃에서 24시간동안 보온하였다. 효소활성에 해당하는 흰 밴드가 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brillinat blue) R-250(Bio-Rad, 미국)을 사용한 염색에서 확인되었다(도 2). 도 2에서 알 수 있듯이 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)에서 얻은 밴드의 강도가 불가사리 추출물의 첨가에 따라 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 불가사리 추출물의 MMP-9에 대한 IC50은 325 ㎍/㎖ 으로 판명되었으며 MMP-2에 대한 IC50은 527 ㎍/㎖으로 확인되었다.

실시예 3: 불가사리 추출물의 인간 간암세포와 인간동맥평활근세포 (HASMC)의 증식에 미치는 억제효과 측정

세포배양은 인간 간암세포 (American Type Culture Collection, ATCC, MD, USA) 와 인간동맥평활근세포(Human Aortic Smooth Muscle Cells: HASMC)(Bio-Whittaker Co., San Diego, CA, USA)를 10% 열처리된 소태아혈청(FBS. Gibco-BRL, USA), 페니실린(100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎕/㎖) 및 중탄산나트륨(sodium bicarbonate, 2.2 g/ℓ)이 함유된 Dulbecco의 수식배지(DMEM,Gibco-BRL, USA)에서 37℃, 5% CO₂-공기배양기에서 배양하였다.

세포증식검정은 시판중인 증식검정 킷트-II(XTT, Boehringer Mannhein, 독일)를 구입하여 측정하였다. 간단하게 설명하면 HASMC 세포를 96웰 배양플레이트에서 100 ㎕의 DMEM 배양배지당 1 x 10³개의 세포수까지 이르도록 24시간동안 배양한 뒤 96웰 플레이트상의 배지를 버리고 여러 가지 농도의 불가사리 추출물이 첨가된 100 ㎕ 용량의 새로운 배지를 대체하였다. 플레이트를 5% CO₂로 유지하고 24시간동안 37℃에서 습도유지 배양기에서 보온배양하였다. 배양 후에 배지를 버리고 세포를 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline: PBS) 생리식염수로 세척하고 5 ㎖의 XTT-표식시약과 100 ㎕의 전자 커플링(electron coupling) 시약 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)을 혼합하여 조제한 XTT시약 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간동안 보온하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 측정기(Molecular Devices, 미국)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

불가사리 추출물이 인간동맥평활근세포인 HASMC에 미치는 효과를 검정하기 위하여 HASMC 세포에 여러 농도의 불가사리 추출물을 각각 첨가하고 24 시간 동안 반응시킨 후 세포증식 억제활성을 XTT법으로 측정하였다. 흡광도는 490 nm에서 ELISA 측정기로 측정하였다. 또한 상기 그래프는 불가사리 추출물을 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하여 세포증식을 백분율로 나타내었고, 각 데이터는 3번의 독립적인 실험을 실시하여 평균치 ±SD로 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 불가사리 추출물은 인간 간암세포와 인간동맥평활근세포에 대해 별다른 세포독성을 나타내지 않았다(도 3).

실시예 4: 불가사리 추출물을 인간평활근세포인 HASMC에 직접 처리했을때 MMP-9 억제효과

인간 간암세포와 HASMC 세포에서 TNF-α로 유도된 MMP-9의 발현을 억제하는 불가사리 추출물의 효과를 확인을 하기위해 인간 간암세포와 HASMC 세포에 100 ng/㎖ TNF-α 존재하에서 불가사리 추출물을 처리하고 MMP-9의 발현정도를 상기의 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography) 방법으로 평가하였다. HASMC 세포를 10% FBS/DMEM 배지에서 배양하고 PBS 생리식염수로 세척후 TNF-α 존재하에서 24시간동안 불가사리 추출물을 처리하여 무혈청 DMEM 배지에서 배양하였다. 그 후 이러한 조건배지를 모으고 0.1% 젤라틴이 함유된 10% 아크릴아미드 젤에 혼합시켜 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 젤을 2.5%(v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 1시간동안 세척하여 SDS를 제거하고, 반응완충액에서 24시간동안 보온하여 젤라틴 기질을 분해하도록 하였다. 활성부분에 해당하는 흰색의 밴드가 쿠마시브릴리언트블 루 R-250 염색으로 발색되었으며 분자량은 예비염색한 SDS-PAGE 마커와 비교하여 추정하였다 (도 4).

불가사리 추출물의 MMP-9과 MMP-2의 활성에 미치는 효과를 검정하기 위하여 젤라틴 자이모그래피방법으로 불가사리 추출물의 농도를 증가시켜가면서 TNF-α로 유도한 인간 간암세포와 인간평활근세포 HASMC를 조건배지에 키워 실시하였다. 도 4에서 알수 있듯이 젤라틴 자이모그래피에서 얻은 밴드의 강도가 불가사리 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 확인하였다. 특히 세포에 불가사리 추출물을 직접 처리하였을 때는 MMP-9에 대한 IC50은 455 ㎍/㎖ 로 나타났으며 MMP-2에 대한 IC50은 852 ㎍/㎖로 나타났다.

실시예 5: 불가사리 추출물로부터 TNF-α로 유도한 MMP-9 발현을 위한 p-ERK 시그널의 억제

인간 간암세포와 인간동맥평활근세포의 MMP-9 유전자의 발현을 조절하는 주요 신호 분자(signal molecular)인 p-ERK(phospho-extracellular signal-regulated protein kinase)의 인산화 정도를 측정하기 위해 인간 간암세포와 인간동맥평활근세포 HASMC를 6웰 플레이트에 5 x 10⁴개의 세포를 투여하고 10% 열처리된 소태아혈청(FBS. Gibco-BRL, 미국), 페니실린(100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 및 중탄산나트륨(sodium bicarbonate, 2.2 g/ℓ)이 함유된 Dulbecco의 수식배지(DMEM,Gibco-BRL, 미국)에서 37℃, 5% CO₂-공기배양기에서 배양하였다. 배양된 세포는 PBS 생리적 식염수(PBS; NaCl 137 mM, KCl 27 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 2 mM)로 세척하여 무혈청 조건배지에서 TNF-α 존재하에서 1000 ㎍/㎖의 불가사리 추출물의 유무에 따라 ERK 단백질의 인산화를 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 검출하였다.

면역학적 방법으로 시그널 단백질들을 검출하기 위하여 p-ERK, ERK 등의 항체(Chemicon, El Segundo, CA, USA)를 사용하였으며 단백질 추출을 위하여 반응용액(Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4; NP-40: 1%; Na-데옥시콜릭산: 0.25%; NaCl: 150 mM; EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid): 1 mM; PMSF(Phenylmethyl sulfonyl fluoride): 1 mM; 아프로티닌(Aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 펩스타틴(pepstatin): 1 ㎍/㎖ 각각; Na₃VO₄: 1 mM; NaF: 1 mM , 5 mM)을 사용하였다. 시료가 처리된 세포는 PBS 생리식염수(PBS; NaCl 137 mM, KCl 27 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 2 mM)로 2회 수세하고 리파 용액을 사용하여 세포를 용해(lysis) 한 후 단백질정량을 하였다. 정량된 샘플은 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane; Amersham co., 영국)을 사용하여 블롯팅(blotting)한 후 실험에 사용하였다.

MMP-9 유전자의 발현조절(regulation)은 미토젠-활성 단백질 인산화효소(MAPKinase)의 작용에 의해 영향을 받는 것으로 알려졌으며 특히 세포외 신호 조절 인산화효소 1 과 2(ERK 1/2)의 활성과 관련있다고 알려져 있다. 따라서 ERK의 인산화 작용에 불가사리 추출물이 어떻게 작용하는지 보기 위해서 도 5와 같이 TNF-α만 처리하였때, 그리고 TNF-α와 불가사리 추출물을 같이 처리하였다. ERK 인산화정도의 차이점을 보기 위해 세포에 그림과 같이 TNF-α 또는 TNF-α 및 불가사리 추출물 획분을 각각 5분, 15분 및 30분 간격으로 처리하였다. 전체세포 용해물(total cell lysate)을 추출한 후 p-ERK와 ERK 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 1000 ㎍/㎖의 불가사리 추출물은 TNF-α 처리 후 5분과 15분에 유도되는 ERK의 인산화를 거의 완전히 저해하는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 6: 불가사리 추출물의 NF-κB 핵내 이동 억제

MMP-9의 프로모터 부위는 NF-κB와 AP-1등의 전사 인자(transcription factor)의 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Moon S.K. et al, Biochem Biophys Res Commun 301:106978(2003)). 도 6 (A)와 같이 NF-κB 결합 부위(binding site)가 프로모터 내에 존재하고 있으며, NF-κB에 의한 프로모터의 조절과 MMP-9의 발현기작은 잘 알려져 있다. 따라서 NF-κB의 라지 서브유닛(large subunit)인 p65의 세포핵내 이동 정도를 측정하기 위하여 인간 간암세포와 인간동맥평활근세포 HASMC를 6웰 플레이트에 5 x 10⁴개의 세포를 투여하고 10% 열처리된 소태아혈청(FBS. Gibco-BRL, 미국), 페니실린(100 units/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 및 중탄산나트륨(sodium bicarbonate, 2.2 g/ℓ)이 함유된 Dulbecco의 수식배지(DMEM, Gibco-BRL, 미국)에서 37℃, 5% CO₂-공기배양기에서 배양하였다. 배양된 세포는 PBS 생리적 식염수로 세척하여 무혈청 조건배지에서 TNF-α 존재하에서 300, 700, 1000 ㎍/㎖ 농도의 불가사리 추출물을 6시간 전처리(pretreat) 한 뒤 TNF-α를 30분간 처리하여 핵단백질을 분리하였다. 핵단백질 분리에는 Schreiber 등(1989)이 소개한 방법을 사용하였다. 충분히 자란 세포를 1 ㎖의 PBS 완충액으로 2번 수세하고, 0.5 ㎖의 PBS로 처리한 후 스크랩퍼(scraper)로 긁어 EP 튜브(eppendorf tube)로 옮긴다. 용액 A (HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid): 10 mM, pH 7.9; KCl: 10 mM; EDTA: 0.1 mM; EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid): 0.1mM)에 사용직전 DTT(dithiotreitol) 1mM, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.5mM, 적당량의 프로티아제 칵테일(protease cocktail)을 각각 첨가하여 사용하였으며, NP40와 혼합하여 세포막을 용해시킨 후 원심분리하여 핵을 분리하였다. 핵단백질을 녹이기 위해서는 용액 C(HEPES: 20 mM, pH 7.9; NaCl: 0.4 M; EDTA: 1 mM; EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid):1 mM)를 사용하였으며, 사용직전 DTT 1 mM, PMSF 1 mM 및 프로디아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail)의 적정농도를 첨가하여 사용하였고, 추출된 핵단백질은 -70℃에 보관하였다.

분리된 핵단백질을 웨스턴 블롯으로 분석해본 결과 p65는 TNF-α를 처리함에 따라 핵내로의 이동도가 증가하였고 불가사리 추출물을 처리한 샘플에서는 처리량에 따라 p65의 핵내 이동이 저해되는 것을 관찰할 수 있었다(도 6(B)).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 다양한 용매를 사용하여 불가사리의 추출물을 분획하는 것을 나타낸 모식도이다.

도 2는 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 이용하여 불가사리 추출물의 MMP(matrix metalloproteinase)-9과 MMP-2에 대한 효소저해 활성을 측정한 그래프이다.

도 3은 불가사리 추출물의 인간 간암세포 및 동맥평활근세포 HASMC에서의 세포증식억제 효과를 XTT 어세이로 측정한 그래프이다

도 4는 본 발명인 불가사리 추출물이 TNF-α로 유발된 인간 간암세포 및 동맥평활근세포 HASMC의 MMP-9 발현을 억제시키는 것을 나타낸 젤라틴 자이모그래프 결과이다.

도 5는 본 발명인 불가사리 추출물이 TNF-α로 유발된 간암세포 및 동맥평활근세포의 ERK(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 억제시키는 결과를 나타낸 웨스턴 블롯(western-blot)이다.

도 6은 MMP-9 유전자의 전사조절은 NF-κB의 활성에 의해 조절이 된다. 핵단백질을 분리하여 웨스튼 블랏으로 확인해 보았을 때 불가사리 추출물에 의해 NF-κB의 활성이 억제된다. 간암세포 및 동맥평활근 세포에 TNF-α를 처리하여 NF-κB의 활성을 높이고 핵내로의 이동을 유도하였으며, 또한 불가사리 추출물을 동시 처리하였을 때 NF-κB의 핵내 이동이 억제된 결과를 보여준다. (A)는 MMP-9 유전자의 프로모터 위치의 모식도이다. (B)는 불가사리 추출물이 NF-κB의 핵내 이동을 저 해하는 것을 보여주는 웨스튼 블롯이다.

Claims (13)

1. 아무르 불가사리(Asterias amurensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화증, 아테롬성 동맥 경화 또는 혈관재협착증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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6. 제 1 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9과 MMP-2 모두의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 MMP-9, MMP-2 또는 MMP-9과 MMP-2 모두의 효소 활성을 직접적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 MMP-9의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 MMP-9의 발현을 위한 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 ERK(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화(phosphorylation)를 저해하여 MMP-9의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 아무르 불가사리 추출물은 NF-κB(Nuclear Factor-kappaB)의 라지 서브유닛(large subunit)인 p65가 세포핵내로 이동하는 것을 저해하여 MMP-9의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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13. 아무르 불가사리(Asterias amurensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화증, 아테롬성 동맥 경화 또는 혈관재협착증 개선용 식품 조성물.

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