KR102386502B1 - 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물, 상처치유 또는 피부 재생 촉진용 피부외용제 및 피부 재생 및 항염증용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 복합 이온미네랄 용액은 각질형성세포의 상처치유를 촉진하는 효과를 나타내므로 염증성 피부 및 창상치유에 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부란 인체에서 가장 넓은 기관으로 물리적, 화학적, 면역학적 장벽을 형성하여 감염과 외부 이물질로부터 인체를 보호하고 표피, 진피, 피하지방층으로 구성되어 있다. 또한 피부는 항상성 유지에 필수적이며 체온조절, 수분손실 억제, 감각수용기 함유, 외부의 물리적 혹은 화학적 변화와 자극으로부터의 충격 완충, 인체 내부의 환경을 보호하고 유지하는 등 몸을 지키는 생체 장벽의 기능을 수행하는 조직이자 기관이기 때문에 피부 재생 및 상처치유는 매우 중요한 연구 분야이다.
각질형성세포(keratinocyte)의 증식 및 이동은 type IV 콜라겐과 라미닌(laminin)의 합성을 유도하여 피부 탄력의 증진과 유지, 재생 및 상처복원을 촉진한다. 또한 기저막 형성에 있어서도 중요한 역할을 한다. 표피와 진피의 경계부에 위치하는 기저막(basement membrane)은 type IV, Ⅶ 콜라겐, 피브로넥틴(fibronection), 라미닌 등의 당단백질(glycoprotein)과 헤파란 설페이트(heparan sulface)와 같은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)으로 구성되어 있다. 이러한 기저막은 피부 세포의 증식 및 부착 등의 피부 세포 기능을 조절하며, 물질투과를 선택적으로 조절하는 장벽의 역할을 한다. 또한, 표피와 진피 사이의 상호작용, 상처치유 등 피부의 다양한 역할을 하는 중요 구조물이다.
한편, 한국등록특허 제2196414호에는 '지의류 유래 미네랄 및 갈락토미세스 복합 발효물을 함유하는 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2021-0001042호에는 '나노콜라겐펩타이드 킬레이트 미네랄을 함유하는 피부 주름 개선 및 피부 보습 화장품 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 천연광물로부터 추출된 복합 이온미네랄 용액의 피부 재생 효과를 테스트한 결과, 본 발명에서 사용된 복합 이온미네랄 용액이 각질형성세포의 상처치유를 촉진하는 것을 확인하였으며, 저농도에서 세포 미세환경의 pH 및 삼투압을 변화시키지 않으며, 소량의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시켜 세포의 증식과 이동 신호를 활성화시켰고, NF-κB의 활성을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 상처치유 또는 피부 재생 촉진용 피부외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 각질형성세포의 상처치유를 촉진하는 효과를 나타내므로 염증성 피부 및 창상치유에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 각질형성세포(HaCaT)에서 복합 이온미네랄 용액(K1)의 세포독성을 확인한 결과로, A는 MTT 결과이고, B는 아크리딘오렌지(AO)/EtBr 염색 결과이다.
도 2는 복합 이온미네랄 용액(K1)의 피부 상처치유 촉진 효과를 확인한 것으로, A는 HaCaT 세포를 이용한 wound healing 실험 결과이고, B는 트랜스웰 세포 이동 분석 결과이다.
도 3은 복합 이온미네랄 용액(K1) 처리 후 배양액 내 pH(A), 삼투압(B), 칼슘 농도(C)의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 복합 이온미네랄 용액(K1)이 처리된 세포에서 활성산소(ROS) 생성(A) 및 세포 내 칼슘 농도 변화(B-D)를 측정한 결과이다.
도 5는 복합 이온미네랄 용액(K1)의 항염증 효과를 분석한 것으로, A와 B는 각각 RAW264.7 세포와 HaCaT 세포에서 NF-κB의 활성을 분석한 것이고, C는 ERK와 p38 활성을 분석한 결과이다.
도 2는 복합 이온미네랄 용액(K1)의 피부 상처치유 촉진 효과를 확인한 것으로, A는 HaCaT 세포를 이용한 wound healing 실험 결과이고, B는 트랜스웰 세포 이동 분석 결과이다.
도 3은 복합 이온미네랄 용액(K1) 처리 후 배양액 내 pH(A), 삼투압(B), 칼슘 농도(C)의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 복합 이온미네랄 용액(K1)이 처리된 세포에서 활성산소(ROS) 생성(A) 및 세포 내 칼슘 농도 변화(B-D)를 측정한 결과이다.
도 5는 복합 이온미네랄 용액(K1)의 항염증 효과를 분석한 것으로, A와 B는 각각 RAW264.7 세포와 HaCaT 세포에서 NF-κB의 활성을 분석한 것이고, C는 ERK와 p38 활성을 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부 재생용 화장료 조성물에 있어서, 상기 복합 이온미네랄 용액은 철광석, 일메라이트(Ilmenite), 맥반석, 견운모 중에서 선택되는 천연 광물을 100~300 매쉬(mesh) 범위의 분말로 분쇄하고, 그 분말 1-15 중량%에 무기산 15-30 중량%와 잔량은 물로 하여 100 중량%를 이룬 후, 50-80℃ 범위에서 24시간 내지 72시간 동안 교반한 후 여과한 여액(filtrate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 무기산은 황산, 염산, 질산, 인산 등일 수 있으며, 바람직하게는 황산일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 복합 이온미네랄 용액은 황, 철, 알루미늄, 아연, 코발트, 구리, 바나듐, 칼슘, 칼륨, 스트론튬, 마그네슘, 나트륨, 티타늄, 망간, 규소, 인, 붕소, 니켈, 크롬, 비소, 납 및 몰리브덴 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 피부 재생용 화장료 조성물은 상술한 복합 이온미네랄 용액의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 피부 재생용 화장료 조성물에 있어서, 상기 복합 이온미네랄 용액은 0.0001~0.001 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0002~0.0005 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 제형에서 선택된 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에는 상기 복합 이온미네랄 용액 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 식물 추출물로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분이나, 효과를 증강하는 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 추가된 성분은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 10 중량부로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 상처치유 또는 피부 재생 촉진용 피부외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부외용제 조성물에 있어서, 상기 복합 이온미네랄 용액 및 이의 유효량은 전술한 것과 같으며, 상기 복합 이온미네랄 용액은 인간 각질형성세포의 이동 또는 재생을 촉진할 수 있어 상처치유 효과가 우수하다.
본 발명의 피부외용제 조성물은 다양한 방식 또는 형태로 인체에 적용할 수 있으나, 바람직하게는 피부에 국소적으로 도포되어 적용 가능한 피부외용제의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 파우더, 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 또는 에어로졸제 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 피부 외용제로 제제화할 경우, 본 발명의 피부외용제 조성물 외에 첨가물 등을 적절하게 배합하여 제조할 수 있다. 상기 첨가물은 당 업계에서 통상적으로 이용되는 것으로, 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
본 발명은 또한, 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에 있엉서, 상기 복합 이온미네랄 용액은 전술한 것과 같으며, 상기 복합 이온미네랄 용액은 저농도에서 세포 미세환경의 pH 및 삼투압을 변화시키지 않으며 세포 외 칼슘 농도를 미세하게 조절하여 세포 내 칼슘 농도를 일시적으로 증가시키고, 소량의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시켜 세포의 증식과 이동 신호를 활성화시켰고, NF-κB의 활성을 억제하여 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 피부 재생 및 항염증용 건강기능식품 조성물에서, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.
본 발명의 피부 재생 효과 및 항염 활성을 가지는 복합 이온미네랄 용액은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 복합 이온미네랄 용액 이외에 함유하는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 복합 이온미네랄
용액의 제조
천연광물인 철광석을 150 매쉬 이하의 분말로 분쇄하고, 그 분말 10 중량%를 황산 25 중량%와 잔량은 물로하여 100 중량%로 조정한 후, 60℃에서 48시간 교반하고, 상온으로 냉각한 후 수 시간 정치 후 상등액을 취하고 잔량은 여과지로 여과하여 여액을 취하였다. 상기 여액은 외관은 연한 노랑색 투명 용액상태로 상기 여액을 복합 이온미네랄 용액으로 명명하였다.
상기 복합 이온미네랄 용액을 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 성분 분석을 실시하였고, 그 결과 복합 이온미네랄 용액은 황, 철 및 알루미늄을 주성분으로 하여, 아연, 코발트, 구리, 바나듐, 칼슘, 칼륨, 스트론튬, 마그네슘, 나트륨, 티타늄, 망간, 규소, 인, 붕소, 니켈, 크롬, 비소, 납 및 몰리브덴의 성분으로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
또한, 한국화학융합시험연구원과 한국화학연구원(안전성평가연구소)에서 수행한 독성시험 결과 본 발명의 복합 이온미네랄 용액은 생체에 무해한 것으로 확인되었다.
| 구분 | 반수치사량 (㎎/㎏) | 자극성 평가점수 | 비고 |
| 급성경구독성 | > 5,000 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 급성경피독성 | > 4,000 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 피부자극성 | - | 0.0 | |
| 피부감작성 | - | 0.0 | |
| 안점막자극 | - | 0.0 | |
| 어류독성 | > 10 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 물벼룩 급성유영저해 | > 100 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 조류경구독성 | > 2,000 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 아급성경구독성 | > 1,000 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 아급성경피독성 | > 1,000 | - | 사망 실험동물 "0" |
| 유전독성(복귀돌연변이시험) | > 5,000 | - | 유전자 변이 "0" |
실시예 1. 복합 이온미네랄 용액(K1)의 세포 독성 분석
인간 각질형성세포(HaCaT)는 10% FBS (fetal bovine serum), 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)을 포함하는 DMEM 배지, 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서 배양하였고, 상기 배지를 2일에 한 번씩 교체하였다. MTT 검사법을 이용하여 HaCaT에서 여러 농도 K1의 세포 독성을 조사하였다. 지수기 상의 HaCaT 세포를 24 웰 플레이트에 4x104 cells/㎖로 분주하였다. 그 후 K1을 농도별(0, 0.0001, 0.0002, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5%)로 처리하고 24시간이 경과한 다음, 20 ㎕의 MTT 용액(5 mg/㎖)을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, 200 ㎕ DMSO (dimethyl sulfoxide)를 각 웰에 가하여 각 웰의 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 다음, 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 분석하였다.
도 1A는 다양한 농도의 K1이 HaCaT의 생존에 미치는 영향을 나타내었다. 도 1A를 보면, 24시간 동안 0.0001~0.5%의 K1에 노출시킨 HaCaT 세포의 생존율은 대조군에 비하여 유의한 차이가 없었다. 그러나 1% 및 5%의 K1에 노출시킨 HaCaT 세포는 세포 생존성이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05).
K1에 노출된 세포를 아크리딘오렌지(acridine orange, AO)/Ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색하고 세포사멸 형태를 관찰하였다. 이미지 디시에 HaCaT 세포를 100 cells/㎕로 분주하여 대조군과 각각의 처리군을 배양한 후 비교하였다. 각 처리군을 24시간 배양한 후, 배양액을 제거한 후 AO(1 ㎍/㎖)와 EtBr(1 ㎍/㎖)이 혼합된 염색액 150 ㎕를 넣어 5분간 염색한 후 수세하여 형광현미경(Olympus, Japan)으로 세포를 관찰하여, 각 군의 세포사멸 정도를 비교하였다. AO는 정상 세포막을 통과하여 핵 내의 dsDNA에 결합되면 형광현미경으로 관찰 시 녹색 형광을 나타내며, 세포질 내에서 RNA에 결합되면 주황색 형광을 나타낸다. 반면 EtBr은 죽은 세포에만 염색되어 핵은 밝은 주황색으로, 세포질은 짙은 붉은색으로 관찰된다. 즉, 정상 세포는 균일한 녹색의 핵과 주황색 점이 분포된 세포질을 보이게 되고, 세포막이 완전한 초기의 아포토시스(apoptosis) 세포는 응축된 염색질을 밝은 녹색으로 관찰할 수 있고, 후기 아포토시스 세포는 핵 내의 응축된 염색질을 밝은 주황색으로 관찰할 수 있다. 또한 괴사된 세포는 핵이 균일한 주황색으로 보이게 되어, 상기의 특징으로 아포토시스 세포를 확인할 수 있다.
도 1B를 통해 0.005~0.5%의 농도로 K1이 처리된 군에서는 세포자멸사나 세포괴사를 확인할 수 없었으나, MTT 분석 결과와 일치하게 1% 및 5%의 K1 처리군에서 세포자멸사와 괴사가 확인되었다.
실시예 2. 복합 이온미네랄 용액(K1)의 피부 상처치유 촉진 효과
K1의 피부 상처치유와의 관련성을 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 이용하여 상처치유(wound healing) 테스트를 수행하였다. 상처치유 분석을 위해 세포를 1x105 cells/well의 밀도로 24-웰 배양 접시에 분주하였다. 세포를 멸균 피펫 팁으로 긁고, PBS로 세척하고, 여러 농도(0.0002~0.5%)의 K1을 처리한 후 배양하였다. 도 2에 표시된 시간 동안(K1 처리 후 9시간 경과) 배양한 후, 현미경(Axiovert 40C, Carl Zeiss MicroImaging, Germany)으로 촬영하였다. 상처치유의 상대적인 효과는 현미경으로 세포 단층의 상처 너비를 측정하고 초기 값(즉, 0시간에서의 초기 상처 너비)에서 이 값을 빼서 결정했다. 각 웰의 독립적인 세 군데의 상처로부터 얻은 데이터는 주어진 시간에 상처 봉합의 백분율로 변환되었다.
분석 결과, 도 2A에 도시된 바와 같이, 상처 봉합은 상응하는 대조군과 비교하여 0.0002%, 0.0005%의 K1 처리에 의해 9시간에 각각 ~80%, ~90%까지 향상되었다. 0.002%와 0.005% K1 처리도 상처 봉합이 대조군에 비해 향상되었으나, 유의한 차이는 없었다. 0.02% 보다 높은 농도에서는 상처 봉합이 억제되는 것을 확인하였다.
본 발명자는 또한, K1의 세포 이동에 미치는 영향을 트랜스웰 세포이동 분석으로 평가하였다. 실험은 제조업체의 지침에 따라 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(8 ㎛ 기공 멤브레인; Cell Biolabs, Inc., USA)이 포함된 CytoSelect™ Cell Migration Assay Kit를 사용하여 수행하였다. 간단하게, 성장 인자가 없는 배지에 1x105 cells/㎖의 세포 현탁액을 준비하고, 300 ㎕의 세포 현탁액을 각 삽입물의 상부 챔버에 첨가하였다. 여러 농도의 K1을 세포 현탁액에 직접 첨가하였다. 하부 챔버에는 트랜스웰 배양 삽입물의 하부면으로 세포 이동을 허용하기 위해 10% FBS가 포함된 배지가 포함되었다. 그 후, 세포를 95% 공기-5% CO2 가스, 37℃에서 9시간 동안 배양하였다. 트랜스웰 배양 삽입물의 내부에 있는 비이동성 세포를 면봉으로 부드럽게 제거하고, 바닥 표면에 남아있는 이동된 세포를 세포 염색 용액[0.5% 크레실 바이올렛(cresyl violet)]으로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 삽입물 당 5개의 개별 영역을 현미경(Axiovert 40C)을 사용하여 촬영하고 이동한 평균 세포 수를 계산하였다. 트랜스웰 이동 분석은 증식에 의한 변수를 제거하기 위해 배양 배지에서 8 ㎍/㎖ 미토마이신(mitomycin) C로 2시간 동안 처리한 세포를 사용하였다. 그 결과, 0.0005%의 K1 처리는 세포 이동을 대조군에 비해 5.9배 증가시켰으며, 0.1%의 K1 처리는 세포이동을 53% 감소시키는 것으로 관찰되었다(도 2B).
상기 결과를 통해 K1이 인간 각질형성세포주의 상처를 치유하기 위한 이동에 도움을 주는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 복합 이온미네랄 용액(K1) 처리 후 배양액 내 pH, 삼투압, 칼슘농도의 변화 측정
여러 농도의 K1을 24시간 동안 처리한 후 배양액 내 pH, 삼투압 및 칼슘 농도의 변화를 분석하였다. pH는 유리전극으로 된 pH 측정기(Orion™ 2-Star Benchtop pH Meter, Thermo SCI, USA)로 측정하였다. 배양된 세포에 K1을 24시간 처리한 후 배양액의 pH를 실온에서 측정하였을 때 pH 8 이상의 알카리를 나타내었다. 이는 HCO3 - 완충제의 작용으로 실온에서 측정하기 적합한 HEPES 완충제를 포함한 배양액에서 재분석한 결과 pH 7 정도를 보였다. 도 3A는 HEPES 완충제를 포함한 배양액에 처리된 0.0001~0.2%의 K1은 대조군에 비하여 유의한 pH 변화를 보이지 않았다(7.0-7.3). 그러나 0.5%, 1%, 2%, 5%는 pH를 각각 6.4, 5.1, 3.7, 2.6으로 K1의 처리 농도가 높아질수록 강한 산성을 보였다.
삼투압은 배양액 및 증류수에 희석된 K1의 오스몰 농도를 응고점강하법으로 측정하였다(Multi-OSMETTETM, Precision Systems Inc., USA). 여러 농도의 K1이 처리된 배양액에서 오스몰 농도를 측정한 결과, 대조군에 비하여 유의한 변화를 보이지 않았다(도 3B). 0.0001%-0.5% K1의 농도에서 오스몰농도는 323-333 mOsm/kg을 나타내었다.
칼슘 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 칼슘 검출 분석 키트(Abcam, UK)를 사용하여 측정되었다. HaCaT 세포에 여러 농도의 K1을 처리한 후 배양액을 회수하여 12,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 깨끗한 튜브에 옮겨 사용하였다. 칼슘 표준은 5 mM 표준 스톡을 증류수에 희석하여 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1 mM의 연속 희석액으로 제조하였다. 반응은 50 ㎕의 칼슘 표준 또는 K1 처리된 배양액, 90 ㎕의 발색 시약 및 60 ㎕의 칼슘 분석 완충액을 96-웰 플레이트에 혼합한 다음 상온의 어두운 곳에서 10분 동안 반응시킨 후 측정하였다. 575 nm에서의 흡광도는 VERSAmax™ 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices., USA)를 사용하여 측정되었다. 칼슘 농도(mM)는 표준 곡선에 대입하여 계산하였다. 도 3C는 K1이 처리된 세포 배양액에서 측정된 칼슘 농도의 변화를 보여준다. 저농도의 K1 처리 시 배양액에서 칼슘 농도가 증가하는 경향을 보였다. 그러나 고농도의 K1 처리 시에는 칼슘 농도가 감소되는 경향을 보였다.
상기 결과를 통해 저농도의 K1은 세포의 미세환경에 있어서 pH 및 삼투압을 변화시키지 않아 독성을 나타내지 않는 것으로 유추하였다.
실시예 4. 복합 이온미네랄 용액(K1) 처리 후 ROS 생성 및 세포 내 칼슘 농도 변화
HaCaT 세포에 여러 농도의 K1을 처리한 후 24시간 배양하였다. 빛이 없는 환경에서 5μM의 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, Thermo Fisher Scientific)를 30분 동안 처리하고 배양하였다. 배양 후, 세포들을 PBS로 세 번 세척하고, 즉시 공초점 레이저 주사 현미경(IX70 Fluoview, Olympus)을 사용하여 형광강도를 측정하였다. 녹색 형광((H2DCFDA)을 검출하기 위하여 488 nm 및 518 nm 레이저를 세포에 조사하였다. 형광 이미지는 TIFF 포맷으로 저장한 후, Fluoview 소프트웨어 프로그램(version 2.0, Olympus)을 사용하여 분석하였다.
도 4A는 여러 농도(0.0005, 0.005, 0.05, 0.1, 0.5%)의 K1을 24시간 동안 처리한 후의 활성산소종(ROS) 생성을 보여주는 이미지이며, 도 4B는 녹색형광을 분석한 결과로 K1의 농도가 증가함에 따라 ROS의 생성이 증가하는 것을 볼 수 있으며, 0.1% 이상의 농도에서 높은 ROS가 생성되었음을 보여주었다. 대조군과 비교하여 0.5%의 K1 처리는 ROS 생성을 12배 정도 증가시켰다. 고농도에서 보여준 높은 ROS 생성은 K1에 의한 세포사멸과 연관됨을 시사하였다. 대조군에 비해, 0.0005% K1은 ROS를 2배 정도 증가시켰고, 이는 세포 내 신호전달의 활성을 유도할 수 있을 것으로 생각되었다.
도 4C는 세포 내 Ca2+ 농도의 변화를 측정한 것이다. 세포 내 Ca2+ 농도([Ca2+]i)는 공초점 레이저 주사 현미경(IX70 Fluoview, Olympus)과 Ca2+ 민감성 형광 지시약인 Fluo-3, AM (Molecular probe, USA)을 사용하여 측정되었다. HaCaT 세포를 이미지 디시(SPL Life Science, Korea)에 배양한 후, 성장 인자가 없는 배양액에서 5 μM Fluo-3, AM과 함께 35분 동안 배양하고, 성장 인자가 없는 배지로 3회 세척하였다. 그 후, 488 nm에서 5초마다 형광 이미지를 스캔하였다. 모든 스캔 이미지에서 단일 세포 수준에서 [Ca2+]i의 변화를 분석하였다. 0.0005% K1을 처리한 후 세포 내 칼슘 농도 변화를 8분간 분석한 결과, K1 처리후 즉시 세포 내 칼슘 농도가 증가하였고 빠르게 기저수준으로 회복되는 것을 알 수 있었다. 또한 세포 외 칼슘이 존재하는 상황에서는 세포 내 칼슘 농도의 변화가 세포 외 칼슘이 존재할 경우와 비교하여 감소하였으며, 세포 내 칼슘 저장고에 존재하는 IP3 (inositol 1,4,5-trisphosphate) 수용체의 차단제인 Xestospongin-C (Xes-C)와 리아노딘(ryanodine) 수용체의 차단제인 dantrolen (Dan) 5 μM을 처리하였을 때 세포내 칼슘농도 증가가 감소되었다. 이러한 결과를 통해 0.005%의 K1은 칼슘 유입과 세포 내 칼슘 분비 기전에 작용함을 알 수 있었다.
실시예 5. 복합 이온미네랄 용액(K1)의 NF-κB 활성 저하 및 ERK 활성화
도 5의 A와 B는 여러 농도의 K1을 처리한 후 염증 신호 경로인 NF-κB p65(pS536) 및 NF-κB p65 total을 반정량적 측정법으로 분석한 결과이다. 여러 농도의 K1이 처리된 대식세포주 RAW264.7 세포와 HaCaT 세포를 24시간 배양하여 얻은 배양액을 회수하여 4℃, 18,000xg에서 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 깨끗한 튜브로 옮겨 단백질 농도는 BCA (Bicinchoninic acid) 분석 키트를 사용하여 정량화하였다. 배양액에서 NF-κB p65(pS536) 및 NF-κB p65 total의 반정량적 측정은 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 분석 키트를 사용하여 측정하였다(Abcam). 효소반응결과는 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5A는 RAW264.7 세포에서 LPS (lipopolysaccharide)로 염증 환경을 조성한 후에 여러 농도의 K1을 병용처리하여 그 효과를 조사한 것으로, 0.0005~0.5%의 K1 처리군은 염증에 의해 활성화된 pNF-κB의 수준이 감소되는 것으로 확인되었다. 도 5B는 HaCaT 세포에서 K1을 처리한 결과로 NF-κB의 활성이 감소하였다. 0.0005%의 K1을 12시간 또는 24시간 처리한 결과 NF-κB의 활성이 감소됨을 확인하였다.
도 5C는 HaCaT 세포를 단백질 추출 용액(PRO-PREPTM, iNtRON Biotechnology Inc, Korea)에 혼합하여 균질화한 후, 항 phosphor-ERK, ERK, phosphor-p38, p38 항체 (1:1,000 희석, Cell signaling Technology, USA), 항β-actin 항체( (1:10,000 희석, Sigma, USA)를 이용한 웨스턴블랏을 통해 단백질 양을 측정한 결과이다. 이차 항체(secondary peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse antibody)는 1:10,000의 비율로 사용하였다. 면역 양성 밴드(Immuno-positive bands)는 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL Plus kit, ELPIS, Korea) 및 iBright™ CL1500 이미징 시스템(Thermo Scientific Fisher/Life Technologies Holdings Pte Ltd)에 의해 시각화되었다. 0.0005%의 K1을 HaCaT 세포에 처리한 후 표시된 시간에 단백질량을 측정하였다. 24시간에 비해 12시간까지 ERK의 활성이 확인되었고, p38은 24시간에 활성화되었다. ERK의 경우에는 초기 10분에 활성이 최고치를 보였다. ERK의 초기 활성은 세포의 증식과 p38 늦은 시간대 활성은 세포사멸과 연관되어 있다. 결과적으로, 0.0005%의 K1은 세포의 증식과 연관됨을 시사한다.
Claims (6)
- 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하며, 표피 각질세포의 증식 또는 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물로서,
상기 복합 이온미네랄 용액은 철광석을 100~300 매쉬(mesh) 범위의 분말로 분쇄하고, 그 분말 1-15 중량%에 무기산 15-30 중량%와 잔량은 물로 하여 100 중량%를 이룬 후, 50-80℃ 범위에서 24시간 내지 72시간 동안 교반한 후 여과한 여액(filtrate)인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물.
- 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하며, 표피 각질세포의 증식 또는 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부 재생 촉진용 피부외용제 조성물로서,
상기 복합 이온미네랄 용액은 철광석을 100~300 매쉬(mesh) 범위의 분말로 분쇄하고, 그 분말 1-15 중량%에 무기산 15-30 중량%와 잔량은 물로 하여 100 중량%를 이룬 후, 50-80℃ 범위에서 24시간 내지 72시간 동안 교반한 후 여과한 여액(filtrate)인 것을 특징으로 하는 피부 재생 촉진용 피부외용제 조성물. - 삭제
- 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하며, 표피 각질세포의 증식 또는 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 건강기능식품 조성물로서,
상기 복합 이온미네랄 용액은 철광석을 100~300 매쉬(mesh) 범위의 분말로 분쇄하고, 그 분말 1-15 중량%에 무기산 15-30 중량%와 잔량은 물로 하여 100 중량%를 이룬 후, 50-80℃ 범위에서 24시간 내지 72시간 동안 교반한 후 여과한 여액(filtrate)인 것을 특징으로 하는 피부재생용 건강기능식품 조성물.
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| KR1020210181620A KR102386502B1 (ko) | 2021-12-17 | 2021-12-17 | 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170065851A (ko) * | 2015-12-04 | 2017-06-14 | 진태원 | 천연 광물질을 이용한 미네랄복합체의 효율적인 제조방법 |
| KR102022671B1 (ko) * | 2018-11-06 | 2019-11-04 | (주)카데시인코퍼레이션 | 미네랄 이온 혼합물을 포함하는 피부상처 치유 또는 피부재생용 조성물 |
| KR102343912B1 (ko) * | 2021-03-19 | 2021-12-28 | 경상국립대학교산학협력단 | 복합 이온미네랄 용액을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 항염증 조성물 |
-
2021
- 2021-12-17 KR KR1020210181620A patent/KR102386502B1/ko active IP Right Grant
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