KR101045551B1 - 복분자 발효주의 추출물 또는 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

복분자 발효주의 추출물 또는 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 복분자 발효주를 메틸렌클로라이드 유기용매로 추출하여 수득한 메텔렌클로라이드 분획물 및 상기 분획물로부터 분리 및 정제한 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메텔렌클로라이드 분획물 및 이로부터 분리된 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)은 콜린성 흥분 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하고, 페닐에프린 및 고칼륨에 의한 혈관수축을 억제하며, 혈압을 강하시키는 효과가 우수하므로 고혈압을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 체내에 대한 부작용이 없기 때문에 고혈압을 예방 또는 개선할 수 있는 건강식품으로도 사용할 수 있는 효과가 있다.

복분자 발효주, 메틸렌클로라이드, 에틸 갈레이트, p-히드록시벤조산, 고혈압, 카테콜아민, 혈관수축, 혈압강하

Description

복분자 발효주의 추출물 또는 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating of hypertension comprising extract of Rubus Coreanus wine or compounds derived from the same}

복분자 발효주의 추출물 또는 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대인들은 기름진 육류를 다량으로 자주 섭취하는 식습관으로 인해 인체 내부에 지방층이 형성되는 비만증과 혈관 내부에 콜레스테롤이 축적되어 발병하는 고혈압, 동맥경화 등에 쉽게 노출되어 있다. 그러나 현대의학의 눈부신 발전에도 불구하고 높은 사망율를 차지하는 고혈압 및 심장병 등의 순환기계 질환을 포함한 만성 성인병에 대해서는 아직까지 뚜렷한 치료책이 제시되지 않고 있는 실정이다.

고혈압(hypertension)은 혈관 노화의 전형적인 한 형태로서, 혈관에 주어지는 압력이 증가하는 것을 의미하며, 순환기 질환의 가장 정점에 있는 중요한 질환 이다. 사람의 경우, 수축기 혈압이 140mmHg 이상, 이완기 혈압이 90mmHg 이상일 때를 고혈압으로 진단하는데, 원인에 따라 본태성 고혈압(essential hypertension)과 이차성 고혈압(secondary hypertension)으로 분류한다. 본태성 고혈압은 원인이 정확히 규명되어 있지 않은 것으로 90%이상의 고혈압이 이에 해당하며, 이차성 고혈압은 여러 가지 질환에 의해 발생되는 신장, 심장, 내분비 계통의 이상에 의해 파생되는 고혈압을 지칭한다.

지금까지 알려진 고혈압의 원인은 교감신경계의 이상 활성, 세포막의 기능이상, 신장에서의 물 및 나트륨의 배설장애, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 나트륨 배설촉진 펩티드, 내피세포유래 방출인자(endothelium derived releasing factor, EDRF) 등의 혈압강하제의 분비저하, 카테콜아민 및 레닌-앤지오텐신(renin-angiotensin)의 기능 변화 등이 알려져 있다. 또한, 이러한 원인에 의하여 신경계, 내분비계 등의 비정상적 활성이 발생하며, 이러한 비정상적 활성에 의하여 말초 저항혈관의 압력이 증가되어, 고혈압 증상을 나타내는 것으로 알려져 있다.

한편, 현재까지 개발된 고혈압의 치료제로는 이뇨제, 베타 차단제, Ca2+ 채널(channel) 억제제, 혈관이완제, 칼륨저하제, 지질저하제, 안지오텐신 전환효소 억제제 및 안지오텐신 수용체 길항제 등의 약제들이 있다. 그러나 고혈압은 아직까지도 치료에 의한 완치보다는 고혈압을 조절하는 조절제로서 개발되어 왔기 때문에 고혈압 치료를 시작하는 동시에 평생 동안 약물을 복용해야 하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 이러한 치료제를 환자들이 장기 복용할 경우 심각한 인체 부작용이 발 생하는 문제점을 가지고 있다.

따라서 장기간 복용하여도 체내에서 조직특이성이나 내성에 따른 부작용이 없으며 동시에 고혈압을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다. 이에 최근에는 인체 부작용이 없는 고혈압 치료제를 천연에서 얻기 위한 노력들이 시도되고 있는데, 이와 관련된 종래 기술들을 살펴보면, 대한민국특허등록 제327894호에는 삼칠근과 단삼의 혼합 추출물을 포함하는 고혈압 치료 조성물 및 그의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국특허등록 제577674호에는 반하, 백출, 천마, 진피, 복령, 산사, 희렴 및 황련의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 치료 및 예방용 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국특허등록 제587179호에는 천궁 추출물을 유효성분으로 포함하는 항고혈압 조성물이 개시되어 있고, 대한민국특허등록 제594989호에는 해조 식물로부터 추출한 안지오텐신 전환효소 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 고혈압 치료제가 개시되어 있다.

그러나 이러한 천연유래의 고혈압 치료제들은 인체에 대한 부작용을 감소시킬 수 있는 효과를 가지고 있었지만 고혈압을 치료하는 효과 면에서는 종래의 고혈압 치료제에 미치지 못하여 그 약효가 미비한 단점이 있다.

한편, 복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과의 낙엽관목인 루부스 코리아넘(Rubus coreanum)의 덜 익은 열매, 즉 미성숙 과실을 일컫는다. 이러한 복분자에는 무기질인 인, 철, 칼륨이 많이 함유되어 있고, 비타민 C가 풍부하며 기타 지방, 당분, 섬유소, 회분, 칼슘, 인, 철, 나트륨, 비타민 A, B1, B2, 니아신 등이 포함되어 있어 식용으로 이용되고 있을 뿐만 아니라 예로부터 한방에서 덜 익은 복 분자 과일을 건조시켜 약재로 사용되고 있다. 또한, 이와 같은 복분자는 신장을 보강해주고, 보호해주어 여자의 임신을 돕고, 모발을 검게하며, 눈을 맑게 하고, 콩팥으로 오는 음위증, 소아뇨 등에 효능이 있고, 탁월한 강장제 및 정력제로서의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 부작용이 없으면서도 고혈압을 치료하는 효과가 우수한 치료제를 새로운 천연식물에서 찾으려고 연구하던 중, 복분자의 발효물을 유기용매인 메틸렌클로라이드를 사용한 용출한 분획물 및 상기 분획물로부터 유래된 화합물이 우수한 항고혈압 활성을 가지고 있어 고혈압의 증상을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 복분자 발효주로부터 추출한 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 복분자 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 복분자 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메틸렌클로라이드 분획물은 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 포함할 수 있다.

<화학식 I> <화학식 II>

또한, 본 발명은 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

<화학식 I> <화학식 II>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)는 복분자의 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획으로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메틸렌클로라이드 분획으로부터의 분리 는 세파덱스(sephadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 RP-18 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 복분자 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획물, 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

<화학식 I> <화학식 II>

본 발명에 따른 복분자 발효주의 메텔렌클로라이드 분획물 및 이로부터 분리된 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)은 콜린성 흥분 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하고, 페닐에프린 및 고칼륨에 의한 혈관수축을 억제하며, 혈압을 강하시키는 효과가 우수하므로 고혈압을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제의 소재로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 부작용이 없기 때문에 고혈압을 예방 또는 개선할 수 있는 건강식품의 소재로도 사용할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 복분자 발효주로부터 추출 및 분리하여 수득한 메틸렌클로라이드 분획물(CH₂Cl₂)을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 분획물은 복분자 발효주를 제조한 후 이로부터 발효주의 추출물을 얻는 공정으로 수행될 수 있는데, 복분자 발효주의 제조는 당업계에 공지된 일반적인 방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들면, 먼저 복분자를 파쇄하고 펙틴분해효소를 처리한 다음, 당도 조절을 한 뒤에 발효용 효모를 접종하여 배양함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 복분자주의 제조는 복분자 과즙을 마쇄한 복분자 마쇄액에 펙틴분해효소를 첨가하여 효소처리를 수행할 수 있다. 이때, 복분자 마쇄액에 첨가되는 펙틴분해효소의 농도는 200-1000 ppm, 바람직하게는 200 ppm이고, 처리온도는 40-50℃, 바람직하게는 50℃이며, 처리시간은 30-60분, 바람직하게는 50분간 처리할 수 있다. 이후 상기 효소처리된 과즙에 메타중아황산칼륨(K2S2O5)을 첨가하여 여과한 후 당류를 첨가하여 당도를 조정한다. 이후 발효용 효모를 전처리된 복분자 과즙에 접종하여 배양할 수 있는데, 상기 전처리된 복분자 과즙 및 효모스타터는 1-3%(v/v), 바람직하게는 2%(v/v)의 비율로 접종하여 23-26 ℃에서 10일간 배양할 수 있다. 발효용 효모는 시판되는 것을 사용할 수도 있고 직접 배양하여 제조할 수도 있는데, 상기 효모로는 이에 제한지는 않으나, 향과 맛이 우수한 전통약주, 머루주, 및 메주로부터 순수 분리된 약주분리효모, 머루주분리효모, 및 기탁효모를 액상맥아배지에 접종하여 증식시켜 제조할 수 있다.

상기 복분자주로부터 본 발명에 따른 메틸렌클로라이드 추출 분획물을 분리하는 공정은 상기 과정으로부터 수득한 복분자주에 유기용매인 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂) 용매를 첨가하여 용출함으로써 수득할 수 있다. 바람직하게는 복분자주를 감압 농축한 복분자주 농축액에 물을 첨가하여 현탁한 다음, 메틸렌클로라이드를 첨가하여 추출함으로써 수득할 수 있다.

한편, 본 발명자들은 복분자주로부터 유기용매의 추출분획을 수득하는데 있어서, 추출 시 사용하는 용매의 종류에 따라 고혈압의 예방 또는 치료의 효과가 각기 다른지 확인하기 위하여 상기 복분자주로부터 획득한 메틸렌클로라이드 분획물 이외의 물 분획을 가지고 다시 에틸아세테이트 및 n-부탄올 용매를 이용하여 순차적으로 용매 추출분획을 수득하였고, 수득한 각 용매 추출 분획들에 대하여 고혈압을 예방할 수 있는 효과 중 하나인 아세틴콜린에 의한 카테콜아민 분비억제 영향을 조사한 결과, 본 발명에서 최초로 복분자주의 메틸렌클로라이드 추출 분획물이 아세틴콜린에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하여 고혈압을 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 규명하였다(도 5 참조).

따라서 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 콜린성 흥분 작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하는 효과가 있다.

일반적으로 카테콜아민은 중추신경계의 신경전달물질로 알려져 있으며, 부신수질에서도 생성되는데 교감신경계와 함께 작용하여 긴장이 많이 되는 상황에서 신체가 재빠르게 반응을 하도록 유도하는 역할을 한다. 카테콜아민은 간과 근육에 있는 포도당을 분해하고 트리글리세리드를 유리지방산으로 분해하는 등의 열과 에너지를 생성하는 반응을 자극하며, 콜린성 흥분 작용(니코틴 및 무스카린 수용체) 및 막탈분극에 의해 분비되는 것으로 알려져 있다. 또한, 부신수질은 노르아드레날린성 신경세포 뿐만 아니라 뉴론을 포함한 수많은 세포기능을 연구하는 모델로 사용되고 있다. 부신수질은 신경흥분 시 아세틸콜린이 내장 신경말단으로부터 유리되어 크롬친화세포막에 있는 콜린 수용체를 활성화하며, 이와 같이 콜린수용체가 활성화되면 흥분-분비 결합으로 알려진 일련의 반응을 개시하여 최종적으로 분비소포로부터 카테콜아민 및 기타 성분을 세포외로 유출시키는 작용이 일어나며, 내장신경이 흥분되면 아세틸콜린이 신경말단에서 유리된 다음 니코틴성 카테콜아민의 분비작용을 촉진하게 된다. 그러나 이러한 카테콜아민의 과다분비는 고혈압을 유발시키며 나아가 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색 및 동맥경화와 같은 심혈관 질환의 발병과 관련이 있으므로 카테콜아민의 분비를 억제할 수 있는 물질은 고혈압을 예방 및 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 부신 정맥내로 관류시 농도 및 시간-의존적으로 아세틸콜린, 고칼륨, 막탈분극화제, DMPP(선택성 니코틴수용체 작용제), 및 McN-A-343(선택성 무스카린수용체 작용제)에 의한 카테콜라민 분비량을 현저하게 억제할 수 있었다(도 6 내지 도 9 참조). 또한, 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물 존재 하에서, Bay-K-8644(L형 칼슘통로 활성화제), 베라트리딘(전압의존성 나트륨 이온 통로의 분활성화 차단제) 및 사이클로피아존산(세포질에서 Ca2+-ATPase 억제제)에 의한 카테콜라민 분비량도 현저하게 억제되었다(도 10 내지 도 12 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물에 대한 카테콜라민 분비 억제 작용이 산화질소와 관련성이 있는지 확인하기 위하여, 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물과 산화질소합성효소 억제제인 L-NAME을 부신정맥내로 관류시킨 결과, 단독 처리한 아세틸콜린, 고칼륨, DMPP, McN-A-343, Bay-K-8644 및 사이클로피아존산에 의한 카테콜라민 분비증가에 있어서 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물의 억제효과는 상대적으로 감소하여 카테콜라민 분비량이 대조군 수준까지 회복됨을 알 수 있었다(결과 미도시).

따라서 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 콜린성 흥분작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하는 효과가 있으며, 이러한 카테콜아민의 분비 억제 작용은 부신수질에서 산화질소 합성제의 활성에 의한 산화질소 생성의 증가에 의한 것이며, 크롬친화세포내로의 칼슘 유입과 세포내 칼슘저장고로부터 칼슘유리를 억제하는 것과 관련되어 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 콜린성 흥분작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비 억제를 통해 고혈압을 예방 및 치료할 수 있는 특징이 있다.

또한, 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 혈관의 수축반응을 억제하고 혈관을 이완시키는 작용을 통해 고혈압을 예방 및 치료할 수 있는 특징이 있다.

일반적으로 고칼륨은 혈관 세포막을 탈분극시킴으로서 전압의존성 칼슘통로를 개방시켜 세포외 칼슘의 유입을 증가시키는 것으로 알려져 있으며,(Bolton, 1979; Schwartz 및 Taira, 1983; Dube 등, 1985; 1988), CaCl2 및 고칼륨에 의한 혈관 평활근의 수축반응은 전압의존성 칼슘통로를 통해서 세포외 칼슘유입을 증가시킨다고 하였다. 또한, 이전의 연구에서 혈관 평활근의 이완반응은 다음과 같은 3 가지의 세포기전을 통해 발생하는 것으로 알려져 있는데. 즉, (1) 세포내로 세포외 칼슘유입차단 (Fleckenstein, 1977; Schwartz 및 Triggle, 1984), (2) 세포내 칼슘의 결합 및 포집 증가 (Watkins 및 Davidson, 1980; Imai 및 Kitagawa, 1981), (3) 세포내 저장칼슘의 유리억제(Imai 및 Kitagawa, 1981; Ito 등, 1980) 등이 있다. 한편, 이와 대조적으로 신경전달물질에 의한 혈관 평활근의 수축작용은 세포내부로부터 유리된 칼슘에 의한 수축반응과 칼슘유입과 관련된 강직성 수축반응이있는데 두 가지 모두가 세포내 칼슘증가를 나타낸다. 이러한 세포내로의 칼슘의 증가는 고혈압 및 각종 심혈관 질환을 일으키는 원인으로 작용하고 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 복분자주 메틸렌클로라이드 분획물이 혈관 수축을 억제하고 혈관을 이완시키는 작용이 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 정상혈압 쥐 및 고혈압 쥐의 적출 대동맥편을 대상으로 본 발명의 복분자주 메틸렌클로라이드 분획물이 페닐에프린(phenylephrine) 및 고칼륨(KCl)에 의한 수축반응에 미치는 영향을 조사한 결과, 정상혈압 쥐 및 고혈압 쥐의 모델 모두에서 용량 의존적으로 혈관을 이완시키는 작용을 하는 것으로 나타났으며(도 14a 내지 도 15 참조), 또한, 산화질소 합성효소 억제제인 L-NAME의 처리시 메틸렌클로라이드 분획물에 의한 혈관 이완 작용이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다(도 16 참조).

따라서 본 발명의 복분자주 메틸렌클로라이드 분획물이 동물모델의 적출 대동맥편에서 평활근 세포내로 세포외 칼슘유입을 차단함으로써 혈관을 이완시킨다는 것을 알 수 있었으며, 부분적으로는 산화질소 및 내피와 관련이 있음을 예상할 수 있었다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 내피제거 물질인 CHAPS의 처리 하에서 본 발명의 메틸렌클로라이드 분획물에 의한 혈관의 이완작용 효과를 조사한 결과, CHAPS에 의해 혈관의 이완작용이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다(도 17 참조).

이를 통해 본 발명자들은 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물의 혈관 이완 작용, 즉, 혈관 수축 억제 작용은 내피 의존성일 뿐만 아니라 산화질소와 관련이 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 혈압을 강하시키는 효과가 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 정상혈압 쥐 및 자연발증고혈압 쥐를 대상으로 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물을 처리한 결과, 혈압이 모두 낮아진 것을 확인할 수 있었다(도 18a 및 18b 참조).

그러므로 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물은 콜린성 흥분작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비을 억제할 수 있고, 혈관수축 반응을 억제할 수 있으며, 혈압을 강하시킬 수 있다.

나아가, 본 발명자들은 본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물이 고혈압을 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 상기 분획물에 함유된 유효성분을 분리 및 정제하였고, 그 결과 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 및 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물이 분리 및 정제되었다.

따라서 본 발명은 하기 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 특징으로 한다.

<화학식 I> <화학식 II>

본 발명에 따른 상기 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능 한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물은 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 복분자로부터 수득될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 복분자 발효주로부터 수득될 수 있다. 이때, 상기 복분자 발효주는 앞서 기술한 방법으로 제조될 수 있으며, 복분자 발효주로부터 상기 화합물들의 정제는 복분자 발효주를 적절한 용매로 추출하고, 상기 추출물을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 통해 본 발명의 화합물들을 정제할 수 있다.

상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메틸렌클로라이드를 사용할 수 있다.

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 또는 분획물로부터 본 발명의 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 바람직하게, 메틸렌클로라이드 분획으로부터의 분리는 세파덱스(sephadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 RP-18 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물은 순수하게 분리·정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 및 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물은 상기 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물과 동일하게 아세틸콜린에 의한 카테콜아민의 분비 작용을 억제하는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 분리 및 정제된 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물을 흰쥐의 적출 관류부신 모델에 대하여 투여한 후 아세틸콜린에 의한 카테콜아민의 분비 작용을 확인한 결과, 카테콜아민의 분비 작용이 억제되는 것으로 나타났으며(도 19a 및 19b 참조), 이러한 효과는 카테콜아민의 분비를 억제하는 것으로 알려진 레스베라톨(resveratrol)과 거의 유사하거나 또는 용량 의존적으로 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명은 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함 하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 또한, 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 화합물 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 고혈압의 예방 및 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 고혈압 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 고혈압 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 고혈압의 예방 및 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 고혈압 예방 및 치료용 조성물은 고혈압 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 고혈압의 예방 및 치료용 조성물은 우수한 항고혈압 효과를 통해 고혈압의 증상을 완화시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분들은 천연인 복분자로부터 수득한 것이므로 상기 본발명의 조성물은 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.

따라서 본 발명의 고혈압의 예방 및 치료용 조성물은 고혈압 증상의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물을 고혈압 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명의 고혈압 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물은 고혈압 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 건강식품 및 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 고혈압 증상의 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허 용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 고혈압 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 고혈압 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 고혈압 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상 기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

복분자 발효 추출물의 분리

<1-1> 복분자 발효주의 제조

복분자 마쇄액 10L에 펙틴분해효소(Pectinex 100L)를 500ppm 농도로 첨가하여 50℃에서 50분간 효소처리 하였다. 과즙의 유해균 번식을 억제하기 위하여 메타중아황산칼륨(K2S2O5)을 복분자 원료 10L당 200ppm 농도로 첨가 및 여과한 후, 설탕을 첨가하여 당도를 25 Brix로 조정하였다. 향과 맛이 우수한 전통약주 및 머루주를 멸균수에 희석하여 0.1mL을 배지에 도말한 후 25 ℃에서 배양하면서 특징적인 효모 형태의 집락을 분리하였고 분리된 효모를 다시 Tween 80이 0.1％ 함유된 희석액으로 희석하여 3~4회 반복적으로 배양한 후 순수분리 하였다. 상기로부터 얻은 약주분리효모를 액상맥아배지에 접종하여 증식시켜 효모별로 스타터(starter)를 제조하였다. 상기 보당된 복분자 과즙액에 스타터를 2％(v/v)로 접종하여 25℃에서 10일간 배양함으로써 발효된 복분자주를 제조하였다.

<1-2> 복분자 발효주의 추출물 분리

상기 실시예 <1-1>에서 얻은 복분자주를 다음과 같은 과정을 통해 추출물을 분리하였다. 즉, 상기 실험에서 수득한 복분자주 6L를 감압 농축하여 복분자주 농축액을 얻었다. 이후 상기 농축액을 물로 충분히 현탁한 다음, 농축액의 2배 부피에 해당하는 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출함으로써 물 추출물과 메틸렌클로라이드 추출물을 수득하였다. 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물을 수득하는 공정은 도 1에 나타내었다.

< 실시예 2>

복분자 유래의 항고혈압 활성을 가진 화합물의 분리 및 동정

<2-1> 화합물의 분리

상기 실시예 <1-2>에서 추출한 복분자주의 메틸렌클로라이드 추출물에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 통해 특정 화합물을 분리하였다. 이를 위해 먼저 메틸렌클로라이드 추출 분획을 가지고 TLC를 수행하여 HP-20을 충진제로 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 용출 용매로는 100%의 물 용매로 시작하여 메탄올이 10%에서 50%가 될 때까지 양을 증가시키면서 농도구배로 용출시켰다. 용출 과정을 통해 100%의 물 용출 분획 및 10%, 20% 30% 40% 및 50%의 메탄올 용출 분획의 총 6개의 용출 분획을 수득하였다. 이후 상기 수득한 6개의 분획 중 TLC 상에서 UV 단파장의 강한 흡수를 나타내는 뚜렷한 스팟이 10%의 메탄올 용출 분획에서 관찰됨에 따라 이 분획을 다시 세파덱스 LH-20을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 용출 용매로는 10%의 메탄올 용매로부터 시작하여 메탄올의 양을 증가시켜(10%→50%) 총 5개의 소분획을 수득하였다. 이 중, 4번째의 소분획이 TLC 상으로 가장 뚜렷한 스팟이 관찰됨에 따라 4번째의 소분획을 가지고 다시 RP-18을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 I을 수득하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 메틸렌 클로라이드 추출물로부터 수득한 총 6개의 분획 중 30%의 메탄올 용출 분획에 대하여 다시 세파덱스 LH-20을 이용하여 상기 기술된 방법과 동일하게 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 3개의 소분획을 수득하였다. 이 중, 1번째의 소분획이 TLC 상으로 가장 뚜렷한 스팟이 관찰됨에 따라 1번째의 소분획을 가지고 다시 RP-18을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 II를 수득하였다.

<2-2> 화합물의 동정

상기 실시예 <2-1>의 과정을 통해 수득한 화합물 I 및 II에 대하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 의 분광학적 방법을 실시하여 두 가지의 화합물을 동정하였으며, 그 결과 화합물 I은 p-히드록시벤조산이었고, 화합물 II는 에틸 갈레이트(ethyl gallate)임을 확인하였다.

화합물 I: p-히드록시벤조산(p- hydroxybenzoic acid )

¹H-NMR (300MHz, CDCl₃)d : 6.82 (2H, J=8.7 Hz, H-3,5), 7.88 (2H, d, J=8.7Hz, H-2,6), ¹³C-NMR (75MHz, CDCl₃)δ : 122.6 (C-1), 133.0 (C-2,6), 163.2 (C-4), 115.3(C-3,4), 170.2 (COOH)

화합물 I: p-히드록시벤조산

화합물 II : 에틸 갈레이트 ( ethyl gallate )

¹H-NMR (500MHz, CDCl₃)d : 7.04 (2H, s, gallaoyl-2,6), 4.27 (2H, q, 7.14 Hz,OCH₂),1.34(3H,t,J=7.14Hz,CH₃), ¹³C-NMR (125MHz,CDCl₃)d : 121.8 (C-1), 110.0 (2,6), 146.5 (C-3,5), 139.7(C-4), 61. 6 (OCH₂),14.6(CH₃),168.6(C=O)

화합물 II: 에틸 갈레이트

< 실험예 1>

복분자 발효주에서 추출한 메틸렌클로라이드 분획에 대하여 적출관류 동물모델에서 카테콜아민 분비에 미치는 영향 조사

상기 실시예 1의 과정에서 수득한 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획이 고혈압을 유발시키는 작용을 하는 카테콜아민의 분비를 억제하는 활성이 있는지를 조사하였으며, 특히 콜린수용체 흥분작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민 분비작용에 대한 복분자 발효 추출물의 효능을 조사하였다. 이를 위해 사용한 약물 및 구체적인 실험 방법은 하기에 기술된 바와 같다.

<1-1> 사용 약물

본 발명에 사용한 약물로는 1.1-dimethyl-4 -phenyl piperazinium iodide (DMPP), 아세틸콜린(ACh), 노르에피네프린 비타르트레이트(norepinephrine bitartrate), KCl, NaNO₂, 베라트리딘(verataridine), N-nitro-l-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME), methyl-1,4 -dihydro-2,6-dimethyl-3-nitro-4-(2-trifluoromethyl-phenyl)-pyridine-5-carboxylate (BAY-K-8644), 사이클로피아존산 (시그마, 미국.) 및 (3-(m-cholro-phenyl-carbamoyl-oxy)-2-butynyltrimethyl ammonium chloride [McN-A-343] (RBI, 미국)은 모두 증류수에 희석하여 Krebs-bicarbonate 용액에 첨가하여 사용하였고, Bay-K-8644는 99.5% 에탄올로 용해하여 Krebs-bicarbonate 용액으로 적절히 희석하여(알코올 최종농도는 0.1% 이하임) 사용하였으며, 복분자주에서 추출한 methylen chloride분획은 DMSO에 용해하여 Krebs-bicarbonate용액으로 적절히 희석하여(용매의 최종농도는 0.1%이하임) 사용하였다. 또한, 상기 모든 약물의 농도는 몰 농도로 사용하였으며, 노르에피네프린은 0.9% acid saline(pH=4.0)로 용해하여 사용하였다.

<1-2> 부신 적출 분리

실험동물로는 체중이 200~250g인 스프래그-돌리(Sprague-Dowley)종의 흰 랫트를 사용하였고, 체중 kg당 50 mg의 thiopental-Na을 복강내로 투여하여 마취하였다. 마취된 랫트를 동물 고정대의 배위로 고정시킨 후 복부 정중선을 따라 절개하였고 적출을 용이하게 하기 위해 주위의 조직장기를 three-hook retractor로 고정시켜 부신을 노출시킨 다음 혈액응고를 방지하기 위해 heparin-saline액(400 I.U./ml)을 신정맥 직하부위의 대정맥에서 상행쪽으로 주사하였다. 도 4에서와 같이, 부신의 관류를 위하여 부신 주위의 모든 혈관을 결찰시킨 후 가는 polyethylene tube를 삽입하여 고정하였다. 부신정맥 입구 반대쪽의 부신피질부위 에 작은 슬릿(slit)을 낸 후 즉시 관류를 시작하여 슬릿 이외의 부위로부터 누출 유무를 확인한 다음 결찰한 혈관과 cannula를 따라서 서서히 조심스럽게 적출 분리하여 leucite chamber 상에 고정한 다음 Krebs-bicarbonate 용액으로 관류를 계속하였다.

<1-3> 부신의 관류

적출 분리한 부신은 연동펌프(Peristaltic pump, Isco사, 미국)를 이용하여 0.31ml/min 속도로 관류하였고, 관류액으로는 Krebs-bicarbonate 용액을 사용하였다. 이때, 상기 관류액의 조성은 118.4 mM NaCl, 4.7 mM NaCl, 2.5mM CaCl2, 1.18mM MgSO4, 25mM NaHCO3, 1.2mM KH2PO4, 및 11.7mM Glucose를 혼합하여 제조하였으며, 이렇게 제조된 Krebs-bicarbonate 용액은 95% O₂와 5% CO₂를 실험 종료시까지 공급시켜 주었으며 최종 pH는 7.4-7.5로 조절하였다. 또한, 카테콜아민(CA)의 산화를 방지하기 위하여 disodium EDTA(10㎍/ml) 및 ascorbic acid(100㎍/ml)를 첨가하였다. 관류실험은 37±1℃에서 시행하였다. 도 1은 스프래그-돌리 랫트로부터 부신의 적출분리방법(좌측) 및 부신의 관류방법(우측)을 나타낸 모식도이다.

<1-4> 약물 투여

약물투여시 고정해 놓은 three-way stopcock를 통해 관류액 내로 직접 아세틸콜린(ACh) 등을 주입하였고, 투여량은 0.05 ml로 조절하여 투여하였다. 또한, 다 른 약물을 처리시 Krebs-bicarbonate 용액에 희석하여 관류시켜 투여하였다. 예비실험을 통해, 분비촉진제의 일 회 투여에 의한 카테콜아민 분비효과가 대략 4분 내지 8분 후 투여전 상태로 회복됨을 확인하였고, 모든 부신의 관류액을 약물투여 후 4분 내지 8분 동안 채집하였다. 실험조작을 완료한 후, 약 1시간 동안 Krebs-bicarbonate 용액으로 관류시켰고 아세틸콜린을 투여하여 부신수질로부터 분비기능을 확인한 다음 본 실험을 시행하였다. 부신으로부터 관류액의 채집 시는 카테콜아민의 분해를 최소화하기 위하여 ice bath 안에서 채집하였다.

<1-5> 관류액 채집

다양한 분비촉진제로 자극하기 전 기초 카테콜아민 분비량을 측정하기 위하여 4분간 관류액을 채집하였다. 상기 대조군 샘플을 채집한 후 곧바로 분비촉진제를 함유한 관류액이 부신에 도착하는 시점부터 관류액을 채집하였다. 분비촉진제로 자극한 관류액 샘플은 4분 내지 8분간 채집하였다. 샘플 중 카테콜아민 함량은 분비자극제에 의해 분비된 카테콜아민 분비량에서 대조군의 카테콜아민 분비량을 뺀 값을 순수 카테콜아민 분비량으로 환산하여 모든 도면에 표기하였다.

복분자 발효 추출물이 대조군 및 분비촉진제에 의한 카테콜아민 분비에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 부신을 복분자 발효 추출물로 90분간 관류하면서 상기와 같이 일정시간 동안 대조군 및 분비촉진제로 자극한 관류액 샘플을 채집하였다.

<1-6> 카테콜아민의 측정

부신 관류액 중 카테콜아민 함량은 Anton 및 Sayre(J. Pharmacol . Exp . Ther., 138, 360-375, 1962)의 방법에 따라 alumina상에서 중간정제과정을 거치지 않고 fluorospectrophotometer(Kontron사, 이탈리아)를 이용하여 직접적으로 측정하였다. 이때, 채집한 관류액 중 0.2 ml를 수취하여 카테콜아민 측정에 이용하였으며 관류액 중 카테콜아민 함량 계산은 기지농도의 표준 노르에피네프린(base로 환산) 치와 비교 및 환산한 값을 총량으로 표시하였다. 본 실험의 모든 데이터는 (평균±표준오차)로 기재하였으며, 통계학적 차이는 Student's paired "t" test 또는 ANOVA test를 이용하여 비교하였고, Tallarida 및 Murray(1987)의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 검정하였다.

우선, 스프래그-돌리(Sprague-Dowley) 랫트의 부신관류모델에서 카테콜아민 분비작용에 대한 복분자 발효 추출물 자체의 효능을 조사하기 위하여, 산소를 공급한 Krebs-bicarbonate 용액을 스프래그-돌리(Sprague-Dowley) 랫트의 적출 분리된 관류부신에 1시간 동안 관류시킨 후 카테콜아민 유리량을 측정한 결과, 2분간 20±2ng(n=12)임을 확인하였다. 이는, 본 발명의 복분자 발효 추출물 자체는 스프래그-돌리(Sprague-Dowley) 랫트의 부신관류모델에서 기존 카테콜아민 분비량에 어떠한 영향도 주지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 본 실시예에서는 콜린수용체 흥분작용 및 막탈분극에 의한 카테콜아민 분비작용에 대한 복분자 발효 추출물의 효능을 조사하였고, 이를 위해 여러 개의 분비촉진제를 15-20분 간격으로 투여 및 분비촉진제의 대조군 유리량을 확립한 후 복분자 발효 추출물을 90분 동안 관류시켰다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각각의 용매로 추출한 복분자 발효 추출물의 존재 하에서 아세틸콜린에 의한 카테콜아민의 분비량은 다른 추출 분획에 비해 메틸렌클로라이드로 용출한 분획에서 가장 많이 감소되는 것으로 나타났으며, 특히, 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 유리량은 대조군의 유리량(100%)에 비해 55%까지 억제되는 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 복분자의 발효주를 물, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매를 사용하였을 경우보다 메틸렌클로라이드로 용출한 분획이 카테콜아민의 분비 억제 효과가 가장 우수하다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 바탕으로 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획에 대하여 고칼륨에 의한 카테콜아민의 분비 억제 효과를 측정한 결과, 고칼륨에 의해 촉진된 카테콜아민의 분비량을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며(도 7 참조),

니코틴수용체 작동제인 DMPP(10-4M)에 의한 카테콜아민의 분비도 시간 및 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 단지 첫 0~8 분대에서만 별다른 영향이 없었을 뿐 그 이후에는 계속적인 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었고 대조군 분비량(100%)의 62%까지 억제하는 것으로 나타났다(도 8 참조).

또한, 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물이 McN-A-343에 의한 카테콜아민(CA) 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도-의존적으로 관찰한 결과, 메틸렌클로라이드 추출물 존재 하에서 McN-A-343에 의한 카테콜아민 분비량은 첫 30~40분대에 서는 별다른 영향이 없었으나, 그 이후부터 계속적으로 억제되어 대조군 분비량(100%)의 70%까지 억제하는 것으로 나타났으며(도 9 참조), 랫트로부터 적출한 부신의 관류모델에서 Bay-K-8644에 의한 카테콜아민 분비량을 대조군 분비량과 비교했을 때 처음 0~19분 까지는 별다른 영향이 없었으나 그 이후부터는 유의적으로 감소하기 시작하여 75~97 분대에서는 가장 높은 억제효과를 보여 대조군(100%)의 70%까지 억제하는 것으로 나타났다(도 10 참조).

또한, 골격근의 근형질세망(SR)에서 Ca^{2 +}-ATPase의 선택적인 억제제로 알려져 있는 사이클로피아존산에 대한 카테콜아민의 분비 작용에 대하여 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물의 억제 효능을 조사한 결과, 최초 20분간을 제외하고는 대조군(100%)의 80%까지 억제하는 것으로 나타났고(도 11 참조), 베라트리딘(veratridine)에 의한 카테콜아민의 분비 작용 역시 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다(도 12 참조).

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물이 스프래그-돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 콜린성 흥분 및 막탈분극에 의한 카테콜아민 분비를 유효하게 억제함을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

복분자 발효주에서 추출한 메틸렌클로라이드 분획에 대하여 관류부신에서 산 화질소 유리에 미치는 영향 조사

스프래그-돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 콜린성 흥분 및 막탈분극에 의한 카테콜라민 분비에 있어서의 산화질소 및 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물의 억제작용 간의 상관관계를 조사하기 위하여, 본 실험예에서는 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물과 산화질소 합성 억제제로 알려진 L-NAME을 함께 주입한 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 실험을 수행하였고, 이때 정상혈압 흰쥐의 적출관류 부신에서 메틸렌클로라이드 추출분획을 처치하기 전후의 산화질소 유리량을 측정하였다.관류액 채집은 분당 0.31ml 속도로 추출 분획을 관류한 후 8분간 시행하였다. 또한, 산화질소 유리량은 산화질소 선택성 microelectrode (amiNO-700, Innovative Instruments Inc.) 및 Amplifier(inNO meter, Innovative Instruments)를 사용하여 측정하였다. 부신수질의 산화질소 생산량은 microelectrode로 감지된 도입 신호로서 산화질소 표준액과 비교하여 정량하였다. 전극은 NONO₂ 표준액으로부터 0.1 mol/L H₂SO₄에 0.5% (wt/vol) KI 용액으로 산화질소를 표준농도를 만들어서 측정하였다. 산화질소 유리량은 채취한 시료 중에서 유리된 량으로서 picomoles로 측정하였다.

그 결과, 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물과 산화질소 합성 억제제인 L-NAME을 함께 주입함에 따라 아세틸콜린, 고칼륨, DMPP, McN-A-343, Bay-K-8644, 사이클로피아존산 및 베라트리딘에 의한 카테콜아민의 분비작용은 E대부분 대조군과 거의 동일한 수죽으로 회복되는 것으로 나타났으며(결과 미도시), 따라서 복분자주의 메틸렌클로라이드 분획에 의해 억제된 카테콜아민 분비반응은 L-NAME에 의해 다시 회복됨을 알 수 있었다.

또한, 도 13에 나타낸 바와 같이 본 발명의 메틸렌클로라이드 분획을 처치한 후 관류액 내에서 채집한 유리된 산화질소 농도는 처치 이전보다 월등히 증가한 것으로 나타났으며, 그 증가량은 무려 2262%나 상승한 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과로 본 발명의 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획은 산화질소를 유리시키는 활성이 있는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 3>

정상혈압흰쥐 및 자연발증고혈압쥐의 적출 대동맥편에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획에 대한 혈관수축 영향 조사

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출물이 정상혈압흰쥐 및 자연발증고혈압쥐의 적출 대동맥편에서 수축반응을 억제하여 고혈압을 예방할 수 있는 효과가 있는지를 조사하였다. 상기 조사를 위해 사용한 실험동물 및 약물과 실험방법의 내용은 다음과 같다.

<3-1> 실험동물

체중 200-250g Sprague-Dowley 종의 정상혈압 흰쥐 및 자연발증 고혈압쥐를 성의 구별 없이 사용하였으며 실험에 이용할 때에는 사혈 치사시킨 다음 흰쥐를 동 물 고정대에 배위로 고정한 후 갑상연골에서 하복부까지 정중선을 따라서 절개하고 흉강을 절개하여, 기관을 노출시켜 적출을 용이토록 주위의 조직 장기를 three-hook retractor를 이용하여 고정시킨 후 대동맥을 심장직하부에서 간장 상부까지를 분리 적출하여 혈관내의 혈액을 제거 한 후 3-4 mm길이로 절단하였다.

<3-2> 혈관이완실험

절단한 대동맥편을 Magnus bath 내에 force transducer (Grass FT, 03)에 스테인레스 후크(지경 0.15 mm)를 이용하여 고정한 다음 polygraph (Grass제 Model 79)에 연결한 후 고칼륨으로 수축반응을 확인한다. 반응이 일정하게 안정된 다음 이어서 아드레날린 α₁-수용체 작동제인 phenylephrine과 막탈분극제인 고칼륨으로 혈관을 수축시킨 다음 CH₂Cl₂분획을 각각 투여하여 이완반응을 확인 검색하였다.

<3-3> 배스액

Krebs-bicarbonate액을 사용하였으며, 이의 조성은 다음과 같다, 즉, NaCl 118.4mM, KCl 4.7mM, CaCl₂ 2.5mM, MgSO₄ 1.18mM, NaHCO₃ 25mM, KH₂PO₄ 1.2mM, Glucose 11.7mM로 제조된 Krebs액은 95% O₂와 5% CO₂로 실험 종료 시까지 공급시켜 주었고 최종 pH는 7.4-7.5로 조절하였으며, 배스내 온도는 37℃±1℃로 유지하였다.

<3-4> 약물투여

Resting tension은 0.5그램으로 조정하였다. 배스액은 30분 간격으로 교환하여 주었으며, 약물투여는 120분 간격으로 배스내로 투여하였다. 모든 데이터는 대조치의 %로 표기하였다.

<3-5> 사용한 약물

Phenyephrine HCl, KCl, CHAPS, L-NAME (시그마, 미국)을 0.9% 생리식염수 또는 Krebs 액으로 희석하여 사용하였다.

<3-6> 통계학적 분석

대조그룹과 실험(전처치)그룹 간의 통계학적 차이는 Student's t-test나 ANOVA test로 검정하였다. 본원에서 특별히 기술하지 않는 한 P값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의한 변화를 나타내는 것으로 간주하였다. 본원에 기술한 Data값은 평균±표준오차(S.E.M.)으로 표기하였으며 모든 실험결과의 통계학적 분석은 Tallarida 및Murray(1987)의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 검정하였다.

본 실험예에 따른 방법은 정상혈압 흰쥐의 적출 대동맥 편에서 본 발명의 메틸렌클로라이드 분획이 페닐에프린의 수축반응에 미치는 영향을 조사하였다, 이를 위해 약물 투여 전 2시간 동안 쥐를 Krens 액으로 안정시킨 다음, 10uM의 페닐에프린 및 페닐에프린과 메틸렌클로라이드 추출물을 각각 투여하였고 혈관 수축 반응을 조사하였다.

그 결과, 정상 혈압흰쥐(SDs)의 적출 대동맥편에서 CH₂Cl₂분획(200, 400 및 800 μg/㎖)으로 전처치한 후에 PE (10 μM)에 의한 수축반응은 용량 의존적으로 뚜렷이 억제되었으며, 대조군(1.80±0.2g)의 각각 60±9% (P<0.01), 50±5% (P<0.01) 및 36±5% (P<0.01)로 현저하게 감소하였다(도 14a 참조). 또한, 직접적인 막탈분극제인 고칼륨을 56 mM 농도로 배스 내에 투여하였을 때, 뚜렷한 대동맥 수축 반응을 나타내었다(1.72±0.2g). 그러나 CH₂Cl₂분획(200, 400 및 800 μg/㎖) 존재 하에서 고칼륨(56 mM)에 의한 수축반응은 용량의존성으로 뚜렷한 억제반응을 나타내었으며, 각각 대조군(1.72±0.2g)의 38±4% (P<0.01), 38±4% (P<0.01) 및 38±4% (P<0.01)로 현저하게 감소한 것으로 나타났다(도 14b 참조).

또한, 자연발증 고혈압쥐의 적출 대동맥편에서 본 발명에 따른 복분자 발효주의 CH₂Cl₂추출 분획에 대한 혈관수축 반응을 조사한 결과, 정상 혈압흰쥐에서의 결과와 유사하게 PE(10 μM)에 의한 수축반응이 뚜렷이 억제되었으며, 대조군(1.40±0.04g)의 54±1% (P<0.01)로 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 또한, 직접적인 막탈분극제인 고칼륨을 56 mM 농도로 배스 내에 투여하였을 때, 뚜렷한 대동맥 수축 반응을 나타내었으나(1.60±0.04g) CH₂Cl₂분획(400 μg/㎖) 존재 하에서는 고칼륨(56 mM)에 의한 수축반응도 뚜렷한 억제반응을 나타내었으며, 대조군(1.60±0.04g)의 50±6% (P<0.01)로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(도 15 참조).

< 실험예 4>

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획이 정상혈압흰쥐의 적출 대동맥 편에서 L- NAME 존재하에 혈관수축에 미치는 영향 조사

앞서 실험 결과에서 확인된 바와 같이 복분자 발효주의 CH₂Cl₂ 추출분획이 정상혈압 흰쥐(SDs)의 적출 관류 부신에서 카테콜아민 분비를 억제하고, 이와 같은 억제작용은 NO 합성제의 활성화에 의한 NO 합성의 증가에 기인함을 확인하였다. 또한 CH₂Cl₂ 분획이 정상혈압흰쥐(SDs)의 적출 대동맥편에서 페닐에프린 및 고칼륨에 의한 혈관수축반응도 뚜렷이 억제함을 확인하였다. 따라서 CH₂Cl₂ 분획에 의한 혈관이완 작용이 NO 합성증가와 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 NO 합성효소 억제제인 L-NAME와 CH₂Cl₂ 분획을 동시에 전처치한 후 고칼륨 및 PE에 의한 수축반응에 대한 영향을 관찰하였다. 상기 실험은 CH₂Cl₂ 분획에 300uM의 L-NAME을 추가하고 정상혈압 흰쥐를 대상으로 한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, CH₂Cl₂ 분획에 의한 혈관이완작용이 내피 유래의 NO와 관련성이 있는지 확인하기 위하여 내피 제거 물질인 CHAPS를 처리한 후 CH₂Cl₂ 분획에 의한 혈관수축 반응을 조사하였다. 이때 상기 실험은 CH₂Cl₂ 분획에 0.4%의 CHAPS를 추가하고 정상혈압 흰쥐를 대상으로 한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와, 정상혈압흰쥐의 적출 대동맥편에서 PE(10μM) 및 고칼륨(56 mM)의 혈관수축반응은 CH₂Cl₂ 분획 (400 μg/㎖) 단독처치 하에서 각각 대조치의 50% 및 38%로 현저히 억제되었으나, bath내에 L-NAME (300 μM)와 CH₂Cl₂ 분획(400 μg/㎖)을 동시 부하시킨 후에는 PE(10μM) 및 고칼륨(56 mM)의 혈관수축반응이 각각 대조군의 86±11% 및 54±4%로 회복된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 정상혈압흰쥐의 적출 대동맥편에서 0.4% CHAPS로 전처치 한 다음 혈관수축반응을 확인한 결과, CH₂Cl₂ 분획 (400 μg/㎖) 존재 하에서 PE(10μM) 및 고칼륨(56 mM)의 혈관수축반응은 각각 대조군의 67±11% 및 56±11%로 회복된 것을 확인할 수 있었다(도 17 참조).

< 실험예 5>

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획이 정상혈압흰쥐 및 자연발증 고 혈압쥐의 혈압반응에 미치는 영향 조사

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획이 실제적으로 정상혈압흰쥐 및 자연발증고혈압쥐의 혈압을 낮추는 효과가 있는지를 조사하였다. 상기 조사를 위해 사용한 동물 및 실험방법은 하기에 기술된 바와 같다.

<5-1> 실험동물

체중 200-300g Sprague-Dowley 종의 웅성 정상혈압 흰쥐 및 자연발증고혈압 쥐를 사용하였으며 실험에 이용할 때에는 복강 내에 thiopental-Na을 체중kg당 50mg을 주사하여 마취를 유도한 한 다음 urethane 0.5 g/kg을 피하로 주사하여 마취를 유지하였다. 일단 마취된 흰쥐를 동물 고정대에 배위로 고정한후 갑상연골에서흉골직 하부까지 정중선을 따라서 절개하고 기관을 노출시켜 플라스틱제 기관카뉼을삽입 고정하여 호흡을 용이하게 해주었다. 체온 보존을 위해서 heating blanket을 덮어준 다음 heating lamp를 조사시켜 체온을 36.5℃로 실험종료 시까지 유지하였다.

<5-2> 혈압측정

우측 경동맥을 노출시켜 heparin (400 IU) 식염수로 채워진 컷다운 (Cutdown) 튜브 (21 G)를 경동맥에 삽입고정하고 pressure transducer (Gould)에 연결한다. Pressure transducer는 polygraph (Grass)에 연결하여 혈압변동을 기록하면서 동시에 polygraph와 PowerLab (AD Instruments)을 연결하였고 이때 polygraph로부터 나온 signals를 PowerLab을 통하여 컴퓨터에 기록 저장하였다.

<5-3> 약물투여

양측 대퇴정맥을 노출시켜 polyethylene 튜브 (OD 0.61 ㎜)를 각각 삽입고정하고, 한쪽 대퇴정맥은 단회 (oneshot) 약물주사 경로로, 다른 쪽은 CH₂Cl₂ 분획의 지속적 주입 (infusion) 경로로 사용하였다. 약물의 단회 주사량은 150 μl 이내로 하였고, CH₂Cl₂ 분획의 지속적 주입속도는 Infusion pump (Harvard)를 이용하여 0.013 ㎖/min 이내로 하였다.

<5-4> 사용약물

Norepinephrine bitartrate (NE), sodium nitroprusside (SNP), phentolamine, chlorisondamine, propranolol은 Sigma/RBI로부터 구매하였고, NE는 산성 (PH=4.0) 0.9% 식염수에, CH₂Cl₂ 분획을 포함한 다른 약물은 모두 0.9% 식염수에 용해하여 사용하였다. 특히 CH₂Cl₂ 분획 주입 액은 투여 직전에 흰쥐의 체중과 투여량 (X ㎍/㎏/min)을 고려하여 만들어 사용하였다.

<5-5> 자료분석

약물투여에 의한 혈압의 변동은 일련의 실험이 끝난 다음 PowerLab을 통하여 컴퓨터에 저장된 signals 기록을 분석하여 측정하였다. 즉 약물투여 전후 일정 시점에서 일정 기간 혈압의 각 변동치 (mmHg)를 측정하여 약물투여 전후를 비교분석하였다. 실험 성적은 평균±표준오차로 나타냈고, 유의성 검정은 양 군 간에 Students' “t"-test를 실시하여 p＜0.05 이하를 유의한 것으로 종합 표기하였다.

그 결과, 실험조작을 완료한 후 약 30분정도 기다렸다가 혈압상태가 어느 정도 일정하게 안정되었을 때, 마취한 정상혈압흰쥐에서 CH₂Cl₂ 분획 0.3 mg/㎏을 0.9% 생리식염수에 용해하여 정상혈압흰쥐의 일측 대퇴정맥내로 투여시 혈압하강을 일으켰다. 또한 투여량을 증량하여 1.0㎎/㎏를 투여하였을 때는 평균 9.3±1.1 mmHg의 혈압하강작용을 보였으며, 3.0㎎/㎏를 투여시에는 25.5±2.7 mmHg의 혈압 하강도를 나타내었다(도 18a 참조).

또한, 자연발증 고혈압쥐에서도 CH₂Cl₂ 분획을 투여한 결과 혈압이 강하되는 것으로 나타났는데, CH₂Cl₂ 분획 1.0, 3.0 및 10.0 mg/kg을 각각 일측 대퇴정맥내로 투여시 각각 16.8±0.4 mmHg, 27.7±0.9 mmHg 및 43.0±0.6 mmHg의 혈압 하강도를 나타내었다(도 18b 참조).

< 실험예 6>

복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획에서 분리된 에틸 갈레이트 및 p-히 드록시벤조 산 화합물의 카테콜아민 분비작용에 미치는 영향 조사

나아가 본 발명자들은 상기 실시예 2에서 분리 및 동정된 에틸 갈레이트 및 p-히드록시벤조산 화합물에 대하여 카테콜아민의 분비 작용을 억제하는 효과가 있는지를 조사하였다. 상기 조사는 실험예 1에서 메틸렌클로라이드 분획 대신 에틸 갈레이트를 100uM 또는 p-히드록시벤조산을 100uM 및 300uM로 사용하였으며, 카테콜아민의 분비는 아세틸콜린의 처리에 의해 유도한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 상기 화합물들의 카테콜아민 분비 효과가 적포도주에 존재하는 폴리페놀 화합물인 레스베라트 롤(resveratrol)에 의한 효과와 비교 분석하였다. 이때 레스베라트롤은 10~100uM로 흰쥐의 적출 관류부신에 투여하였다.

그 결과, p-히드록시벤조산 100 및 300 μM을 정상혈압흰쥐의 부신정맥 내로 90분간 관류 시 용량 및 시간 의존적으로 아세틸콜린에 의한 카테콜아민의 분비반응은 감소되는 것으로 나타났다. 특히. 100 μM 관류하였을 경우에는 카테콜아민의 분비량이 90-94 분대에서 대조군(1622±65ng/0-4분)의 68%까지 감소되는 것으로 나타났으며, 300 μM의 경우에는 60-94 분대에서 대조군의 50%로 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 19a 참조).

또한, 100 μM의 에틸 갈레이트의 경우에는 카테콜아민의 분비량이 90-94 분대에서 대조군(1440±12ng/0-4분)의 74%까지 감소되는 것으로 나타났으며, 300 μM의 경우에는 45-94 분대에서 대조군의 60%로 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 19b 참조).

또한, 아세틸콜린에 의한 카테콜아민의 분비 작용에 있어서 레스베라트롤(resveratrol)과 본 발명의 화합물인 p-히드록시벤조산 및 에틸 갈레이트와 비교한 결과, 도 20a 및 20b에 나타낸 바와 같이, 100 μM의 레스베라트롤은 아세틸콜린의 카테콜아민 분비작용을 대조군(100%)의 최대 60%까지 억제하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 100 μM의 p-히드록시벤조산을 처리하였을 경우와 유사하였다. 100 μM 에틸 갈레이트의 경우에도 100 μM 레스베라트롤을 처리한 경우와 비슷한 카테콜아민의 분비 억제률을 보였으며 300 μM의 에틸 갈레이트 경우에는 오 히려 더 강력한 카테콜아민 분비 억제작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이상 상기와 결과를 통해, 본 발명자들은 복분자 발효주를 메틸렌클로라이드 용매로 추출한 추출 분획이 콜린성 흥분 및 막탈분극에 의한 카테콜아민의 분비를 억제하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었으며, 혈관 수축의 이완 효과 및 혈압강하 효과 또한 우수하여 고혈압을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었고, 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출분획에서 분리 및 동정된 p-히드록시벤조산 및 에틸 갈레이트 화합물 또한 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 분비 작용을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 p-히드록시벤조산 및 에틸 갈레이트 화합물도 고혈압의 예방 및 치료를 위한 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 복분자 발효주로부터 본 발명에 따른 메틸렌클로라이드 추출 분획을 수득하는 공정을 나타낸 순서도이다.

도 2a는 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 분획으로부터 분리된 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2b는 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 분획으로부터 분리된 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3a는 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 분획으로부터 분리된 에틸 갈레이트(ethyl gallate)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3b는 본 발명에 따른 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 추출 분획으로부터 분리된 에틸 갈레이트(ethyl gallate)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 스프래그 돌리(Sparague-Dowely) 랫트로부터 부신의 적출분리방법(좌측) 및 부신의 관류방법(우측)dmf 나타낸 모식도이다.

도 5는 복분자 발효주를 부탄올, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드 유기용매로 추출한 각 분획물들에 대해 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간별로 나타낸 그래프이다.

도 6은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 7은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 고칼륨에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 8은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 DMPP에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 9는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 McN-A-343에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 10은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 BAY-K-8644에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 11은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 사이클로피아존산에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 12는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 베라트리딘에 의한 카테콜아민 분비에 미치는 효능을 시간 및 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 13은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물을 처리하리 전과 후의 산화질소 유리량을 비교한 그래프이다.

도 14a는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 대동맥편에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 페닐에프린의 수축반응에 미치는 효능을 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 14b는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 대동맥편에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 고칼륨의 수축반응에 미치는 효능을 농도별로 나타낸 그래프이다.

도 15는 자연발증 고혈압쥐로부터 적출 분리한 대동맥편에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 페닐에프린 및 고칼륨의 수축반응에 미치는 효능을 나타낸 그래프이다.

도 16은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 대동맥편에서 L-NAME가 페닐에프린 및 고칼륨의 수축반응에 대하여 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 이완작용에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 17은 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 대동맥편에서 CHAPS가 페닐에프린 및 고칼륨의 수축반응에 대하여 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 이완작용에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 18a는 스프래그 돌리 랫트(정상혈압)에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라 이드 분획물이 혈압반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 18b는 자연발증 고혈압 랫트에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물이 혈압반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 19a는 정상혈압흰쥐에서 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 분리된 p-히드록시벤조산이 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 분비 작용에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 19b는 정상혈압흰쥐에서 적출 분리한 부신의 관류모델에서 복분자 발효주의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 분리된 에틸 갈레이트가 아세틸콜린에 의한 카테콜아민 분비 작용에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 20a는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 아세틸콜린의 카테콜아민 분비작용에 대한 레스베라톨 및 p-히드록시벤조산의 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 20b는 스프래그 돌리 랫트로부터 적출 분리한 부신의 관류모델에서 아세틸콜린의 카테콜아민 분비작용에 대한 레스베라톨 및 에틸 갈레이트의 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다.

Claims (6)

1. 복분자 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 메틸렌클로라이드 분획물은 하기 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물.

   <화학식 I> <화학식 II>

   

   
3. 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물.

   <화학식 I> <화학식 II>

   

   
4. 제3항에 있어서, 상기 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)는 복분자의 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 메틸렌클로라이드 분획으로부터의 분리는 세파덱스(sephadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 RP-18 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물.
6. 복분자 발효주에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)를 첨가하여 용출한 메틸렌클로라이드 분획물, 화학식 I의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 또는 화학식 II의 에틸 갈레이트(ethyl gallate)를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 건강식품.

   <화학식 I> <화학식 II>

   

   

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