KR101022275B1 - 캐리어와 프로브 사이에서 생물학적 세포의 전이를 위한방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 전이 방법에 관한 것으로, 캐리어(80)와 프로브(10) 사이에서 자연적 세포 이동을 나타내는 적어도 하나의 세포(21)가 전이된다. 프로브(10)와 캐리어(80)는 전이 배치에서 서로 상관되게 위치 지정되고, 세포(21)는 자연적이 세포 이동의 결과로 전이된다. 본 발명은 또한 세포들을 전이하기 위한 프로브와 세포 조작기에도 관련된 것이다.

세포 전이, 캐리어, 프로브, 세포, 세포 조작기, 픽업 도구, 위치지정장치, 자연적 세포 이동

Description

캐리어와 프로브 사이에서 생물학적 세포의 전이를 위한 방법 및 장치{Method and devices for transferring biological cells between a carrier and a probe}

본 발명은 생물학적 세포들의 이동을 위한 방법, 특히 캐리어와 프로브 사이에서 자연적 세포 이동을 실행하는 적어도 하나의 세포의 이동을 위한 방법, 예를 들면 세포물질(cell material) 안 혹은 바깥으로 세포나 세포군을 제거 또는 도입하기 위한 세포 전이 방법, 이러한 방법들을 실행하기 위해 적용된 조작 및/또는 시험 장치 특히, 캐리어로부터 또는 캐리어로 적어도 하나의 세포를 전이시키기 위한 프로브, 적어도 하나의 이러한 조작 및/또는 시험 장치를 가지는 세포 조작기, 그리고 상기 언급된 방법들의 응용에 관한 것이다.

의학, 생명공학, 생화학 분야에서는 생물학적 물질을 시험 또는 처리(수정)하기 위해 세포에 시험되거나 처리되거나 사용되는 무수한 방법들이 있다. 예를 들면, 세포들은 의학적 세포 치료를 위해 발단자의 특정한 세포나 세포군을 재생하기 위하여 동물이나 사람 발단자로부터 제거되어 발단자 몸 밖에서 처리되고, 수집되고, 분류 및/또는 배양된다. 줄기 세포를 이용한 의학 세포 치료로부터 특별한 이익이 기대되는데, 이는 그것들이 신체의 거의 모든 세포 형태로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으므로 개별 세포 치료와 조직의 생체조건 외에서의(in-vitro) 재생 가능성을 대표한다. 오늘날, 적절한 조건에서 성체 줄기 세포나 배아 줄기 세포로 인체의 사실상 모든 세포 구현이 가능하고, 따라서 다른 조직 배양이나 재생을 위해서도 적합하다고 인식되고 있다. 따라서 세포의 보존이나 재생 처리에 많은 흥미를 갖게 되었다.

생물학적 세포의 시험이나 조작, 특히 의학 세포 치료와 조직공학과 관련된 필수적인 과제는 각각 미리 선택된 세포들이나 세포군은 추가되거나 제거될 수 있고 또는 ㎛ 범위의 정밀도로 조직이나 세포 결합과 같은 미리 정해진 장소에서 특징이 되는 측정들이 될 수 있다는 사실을 포함한다. 지금까지는 줄기 세포는 주사기를 이용하여 목표 조직으로 옮겨졌다. 이러한 과제들은 세포나 조직에 손상이나 피해 없이 높은 재생성, 조절성 및 정밀도로 해결되어야만 한다. 하지만 이러한 요구는 아직까지 만족스럽게 해결되지 않았다.

병든 조직에 세포를 주입하는 것과 같은 비슷한 실행 방법에도 불구하고 동물 실험에서 반대의 결과가 얻어졌다는 것은 경험으로부터 알려져 있다. 조직 재생의 바람직한 진행은 절차 조건, 특히 주입 방식, 도입 세포나 물질의 수, 사용된 주입도구에 민감하게 의존한다는 것이 알려졌다. 종양의 도입과 같은 것을 제외하 고는 수많은 실험에서 생겨난 세포나 조직 형태의 재생이나 새로운 발생은 원하는 대로 이루어지지 않았다. 줄기 세포의 통제되지 않는 세포 증식과 같은 종양의 도입은 주입 지점에서 물리적, 화학적 또는 외부의 기계적 영향을 통해 촉진된다고 추측된다. 이러한 영향들은 종래의 주입 기술로는 조절이나 적어도 재현성을 얻을 수 없다.

생체조건외에서의(in-vitro) 배양으로부터 접착력을 가지고 자라는 세포를 응력 없이 선별적으로 제거하는 것은 다음과 같은 문제점을 야기한다. 첫 번째, 원하는 세포를 물리적으로 떼어내는 것은 가능하다. 그러나 동시에 상기 언급한 손상의 위험이 있다. 대안으로 분리는 세포 배지에서 강하고, 비생리학적이고, 생화학적인 개입을 대표하는 트립신화에 의하는데 분리된 세포들의 접착 단백질들은 새롭게 발현되어야만 한다. 또한, 트립신화는 세포 제거의 선별성에 관한 문제점을 만들어낸다. 선별된 세포는 트립신 처리 후에만 재발견될 수 있고 어렵게 배지로부터 각각 제거된다.

세포 치료에서의 이러한 문제점들과 조직 공학에서 얻어진 결과는 지금까지 부분적으로 불만족스러우며, 근래에는 생명공학과 의학 분야에서 이들 방법들의 광범위한 응용에 이러한 문제점이 가장 중대한 제한 및 지연 요소가 되고있다.

본 발명의 목적은 캐리어 및 프로브처럼 이물(forigen body)와 관련된 생물학적 세포의 이동(cellular locomotion)을 위한 개선된 방법을 제공하는 것으로, 종래 방법의 문제점이 극복되고 특히 캐리어와 프로브 사이의 원활한 세포 전이가 가능한 방법을 제공하는 것이다. 그 방법에 의하여 필요하다면 캐리어나 프로브 상에 존재하는 전이된 세포나 세포들의 기계적 또는 생화학적 영향이 최소화되게 하는 것이다. 특히, 트립신화와 같은 비생리학적 개입은 세포 물질에서 배제될 것이다. 또, 본 발명의 목적은 이러한 방법들을 실행하기 위한 개선된 조작기구 및/또는 시험장비(프로브)를 제공하는 것이고, 종래의 주입이나 생체 검시 기구의 문제점을 극복할 수 있는 적어도 하나의 상기한 프로브를 갖춘 세포 조작기를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포들의 전이를 위한 프로브의 새로운 용도(적용)를 제공하는 것이다.

이러한 목적들은 청구항 1, 20 또는 36에 따른 특성을 가지는 방법들, 프로브들 및 세포 조작기들에 의하여 해결된다. 본 발명의 유용한 실시예와 적용은 종속항에서 정의된다.

본 발명의 방법은 세포 전이 방법을 더욱 발전시키는 보편적이고 기술적인 지침에 기초하고 있는데, 고체 표면과 접촉하고 그 고체 표면 위에서 세포 이동을 하는 자연적으로 내재된 움직임을 가지는 적어도 하나의 생물학적 세포가 캐리어와 프로브 사이에서 전이되고, 그 캐리어와 프로브는 적어도 하나의 생물학적 세포가 캐리어로부터 프로브로(또는 프로브에서 캐리어로의 역방향) 자연적인 세포 이동에 의해 이동되도록 서로 인접하게 또는 접촉하게 되는 범위에 배치된다. 캐리어와 프로브의 상호 정렬은 전이 배치로서 지정된다. 본 발명자들은 전이가 높은 세포 운동성(예를 들면 1시간 이내 또는 그 이하)에 기초하여 실제로 충분히 빠르고 놀랍게 일어날 수 있다는 것을 발견했다.

자연적인 세포 이동은 일반적으로 고체표면이나 세포물질에서 세포 기관(세포막 기관, 예를 들면 세포막 돌출)의 접착 접촉(adhension contact)에 따른 재배열에 의한 완성된 세포의 위치 이동이라고 이해된다. 이는 M. Abercrombie et al.에 의한 출판물 "The Locomotion of Fibroblasts In Culture"("Experimental Cell Reserch", vol. 67, 1971. pp.359-367)과 L. P. Cramer에 의한 출판물 "Organization and polariry of actin filament networks in cells: implications for the mechanism of myosin-based cell motility" ("Bilchem. Soc. Symp. "vol. 65, 1999, pp. 173-205)에 설명되어 있다. 본 발명에서는 세포 이동은 두 표면으로부터 동시에 분리하는 세포를 제외하고 프로브의 표면으로부터 캐리어의 표면(또는 반대로)으로 직접 일어나는 것을 말한다.

본 명세서에서 세포 물질은 일반적으로 대다수의 세포들로 이해되는데 그것들은 접착 접촉을 통해 그들의 환경과 접촉하고 있다(거대분자 화학적 화합물들, 반 데르 발스 결합이 없음). 세포물질은 예를 들면 개개 세포의 결합이나 군 형성, 세포 배지, 조직(같은 종류로 분화된 세포들의 결합) 또는 기관이다. 세포물질, 특히 각각의 세포의 비유체(non-fluid) 합성물은 추가적인 합성 성분, 예를 들면 합성 세포간 물질을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 광범위한 분야에 유익하게 응용될 수 있다. 전이되는 세포는 바람직하게는 예를 들어 섬유아 세포, 대식세포, 림프구, 종양 세포 또는 신경 세포와 같은 동물이나 사람 세포를 포함한다.

본 발명의 방법이 동물이나 사람의 유기체 밖에 위치하는 세포물질에 실시된다면 특별한 이익을 얻을 수 있다. 적합한 배양 조건 하에서 세포 물질은 캐리어에 배치될 수 있다. 세포물질과 프로브의 위치 지정은 증가된 정밀도로 단순화되어 실행될 수 있다.

대신, 세포물질은 살아있는 유기체에서 화합물로 발견될 수 있다. 프로브는 예를 들면 시험 프로브, 생체실험 기구 또는 주입 도구로서 조직 위에 배치되거나 또는 내부로 삽입될 수 있다. 삽입은 영향을 받은 조직이 고정되어 있는 상태, 예를 들면 영향을 받은 조직이 캐리어에서 움직일 수 없는 유기체 주위 부분에 고정된 상태에서 위치 지정 또는 연속적으로 상관적인 이동(하기 참조) 동안 최소 진행 속도로 이루어진다. 마취제의 사용은 그 방법에 의한 상처를 피한다는 관점에서 대상을 정지시켜 유지시키기에 바람직하지만 반드시 요구되는 것은 아니다.

프로브와 캐리어는 대체로 세포나 세포물질에 대해서 경계지어질 수 있는 고체 표면을 가지는 물질로 만들어지는 별개의 이물(forigen body)들 또는 물체들이다. 프로브는 특히 주입 모세관과 같은 조작 장치 및/또는 시험 장치를 포함할 수 있다. 캐리어는 특히 유리나 플라스틱 접시와 같은 세포나 세포 배지를 각각 가지는 공지의 배양 지지체를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 표면들에 결합하는 거대분자에서 자연적인 세포 이동과 변동이 놀랍게도 활성화될 수 있어서 세포가 하나의 고체 몸체(예를 들면 캐리어)에서 다른 곳, 즉 별개의 고체 몸체(예를 들면 프로브)로 이동될 수 있다는 것을 발견했다. 단지 전이 배치에서 프로브와 캐리어를 위치 지정하는 것에 의하여 캐리어에 남아있는 세포나 제거된 세포에 대해 불리하게 방해되는 생화학적이나 기계적 조건 없이 캐리어에서 하나 이상의 세포를 집어내는 것이 가능하다. 각각의 세포나 세포군은 프로브로 상처 없이 꺼내지거나 배치될 수 있다. 프로브와 캐리어를 위치시키는 동안 수반된 세포는 그것들의 물리적, 화학적 상태 변화 없이 유지된다. 손상 없는 전이는 상기 세포가 움직일 때마다 일어나고 필요에 따라 세포 배지를 둘러싸는 세포는 변형되고, 또 필요에 따라 그것들의 공간적 위치는 변화되지만, 메신저 물질이나 물질 분리의 형태인 어떠한 화학적 신호도 방출되지 않는다.

본 발명은 또한 다음과 같은 본 발명자들의 고찰에 근거하고 있다. 첫째, 지금까지 다른 방식으로 일어난 조직이나 세포 결합으로 주입된 세포들과의 반응들은 예를 들면, 종래에 도입된 도구에 의해 이용할 수 있는 세포 물질에서 세포들이 손상되거나 파괴되기 때문에 영향을 받아 상처를 입는 결과가 초래된다. 상처는 손상된 조직에서의 경우보다는 생화학적으로 다른 경계 조건을 나타낸다. 세포 또는 조직 손상 화학적 신호(분자 메신저 물질을 보내는 것) 또는 섬유아 세포 유입, 섬유결합소(fibronectin) 유출 등등의 세포적-지지 과정(cellular-surpported process)들이 발생된다. 손상된 세포들의 반응은 주입된 세포들 또는 부가물들의 효과에 영향을 미친다. 예를 들면 줄기 세포를 해치는 세포의 환경은 손상되지 않은 세포물질에서 줄기 세포에 다르게 작용한다. 둘째, 본 발명자들은 지금까지의 증거와는 대조적으로 세포들은 기질에 접착하여 결합될 때조차 인접하는 기질로 손상 없이 이동할 수 있다는 것을 발견했다.

세포의 자연적인 움직임에 의해, 위에서 언급한 요건은 충분히 충족될 수 있다. 주입되는 목표 조직이나 각각의 세포들은 파괴되거나 손상되지 않는다. 세포들의 물리적, 화학적 및 기계적 상태는 충분히 특성화될 수 있다. 체외에서 세포와 표면 사이의 손상을 입히는 접촉이 회피되며, 원하지 않는 표면 접촉에 의한 세포 신호들이 방지된다. 손상 없는 움직임으로 세포 조작이 이상적으로 원활하게 일어난다. 프로브는 캐리어 위 세포 물질내의 미리 정한 곳으로 목표한 정밀도로 안내될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 바람직한 실시예에 따라, 세포 전이 방법은 캐리어로부터 적어도 하나의 생물학적 세포의 제거에 적용된다. 프로브는 생체 검시 도구를 형성한다. 접착 접촉을 비생리학적으로 빠르게, 기계적으로 떼어내는 것이나 트립신화에 의한 생화학적 방해(interruption)는 유리하게 회피된다. 또, 세포 물질이 캐리어에 배치되고, 그 세포가 캐리어로부터 집어져서 프로브로 전이될 때, 생화학적 조건에 대하여 상기 물질은 방해를 받거나 손상되지 않고 남는 부가적인 이득이 있다. 이 실시 예에서는 수정되지 않고 생리학적 세포가 얻어질 수 있다는 이점이 있다.

본 발명의 수정 변형에 따라 적어도 하나의 센서가 프로브 표면이나 안에 배치된다면, 적어도 하나의 세포의 특성 즉, 세포막 전위, 기질 분리, 세포 임피던스 또는 형광이 측정될 수 있다는 유익한 가능성이 있다. 프로브 표면에 위치해 있는 세포가 미리 정한 선택 조건을 만족하는 지의 여부가 즉시 결정될 수 있다. 특히 프로브 표면에서 세포를 시험하는 것은 본 발명의 세포 전이 방법을 자동화할 수 있는 이점을 가진다.

바람직하게는 일반적으로 세포 전이 이후에 세포를 가지고 있는 프로브가 목표 기질로 이동되게 된다. 세포를 가지고 있는 프로브를 캐리어로부터 제거하는 것의 이점은 제거된 세포의 또 다른 조작이 캐리어의 취급, 특히 캐리어에서 배지 조건의 또 다른 조정과 독립해서 실행될 수 있다는 것이다. 프로브를 세포에서 제거하는 것은 특히 프로브 위에서 측정하는 세포 특성에 의존할 수 있다.

상기한 본 발명의 첫 번째 실시예와 대조적으로 본 발명의 다른 변형에 의해, 적어도 하나의 생물학적 세포가 프로브에서 캐리어로 전이될 수 있다. 움직이는 세포나 세포 물질로부터 캐리어로 갈 때의 손상 또한 이 경우 세포의 내재된 움직임 때문에 배제될 수 있다. 본 발명의 바람직한 적용에 따라 세포물질이 캐리어 위에 배치되면 프로브는 세포물질에 근접하게 위치되거나 또는 세포물질 내로 투입될 수 있는데, 그것에 의하여 세포물질에 대한 손상은 회피된다.

이러한 대안은 세포가 세포물질에 내재해 있을 때 생리학적으로 손상되지 않은 상태로 존재하기 때문에 생명공학과 의학에서의 계획적인 응용으로 특별한 이득을 제공할 수 있다. 적어도 하나의 세포는 손상되지 않은 세포물질 표면이나 내부에 내재된다. 특히, 줄기 세포는 줄기 세포의 조직-특이 분화를 일으켜 조직에 이식될 수 있다. 종양의 퇴화나 성장은 억제될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라 프로브와 캐리어가 전이 배치에서 접촉하고 있으면, 프로브 위치 선정의 정확도와 세포 전이 속도와 관련된 이득을 얻을 수 있다. 또, 프로브와 캐리어의 상호간 접촉은 세포 배지가 캐리어 위에 배치되어 있는 경우 유리하게 제공될 수 있다. 이 경우 세포 배지의 세포들은 위치 지정 중인 프로브에 의하여 손상 없이 옮겨진다(이하 참조). 프로브와 캐리어 중 어느 하나 위에 전이에 앞서 미리 세포물질이 배치되어 있는 프로브와 캐리어가 세포 전이를 위하여 캐리어의 표면 위 세포물질의 팽창범위 이내인 거리에 배치된다면, 세포물질 표면에 정확하게 놓거나 세포물질 내에 정확하게 삽입할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면 프로브와 캐리어의 상대적 위치는 세포 전이 전 및/또는 동안에 바뀔 수 있다. 만약 캐리어와 프로브 사이의 전이 배치가 바뀌면, 세포 전이의 선택과 속도가 유리하게 영향을 받을 수 있다.

삭제

프로브와 캐리어의 상대 속도는 바람직하게는 자연적 세포 이동의 속도(1㎛/h 내지 1mm/h)와 같거나 낮게 선택된다.

프로브와 캐리어의 상호 정렬로, 프로브가 캐리어 상에서 세포물질과 우선적으로 접촉하지 않고, 특정한 세포가 세포물질로부터 선택된 후에 선택된 세포와 프로브와의 일시적인 접촉이 독점적으로 일어난다면, 선택된 세포와 깨진 프로브 사이의 접촉 없이 접촉 형성 후 거리가 늘어날 수 있다. 본 발명자들은 세포 기관들이 놀랍게도 자유 공간(예를 들면 50㎛)에서 조차 연결을 유지할 수 있다는 것과 자연적 세포 이동에 의해 그러한 것을 극복할 수 있다는 것을 발견했다. 이 변형으로 다른 세포들은 캐리어 표면에 남아있는 반면 선택된 세포만이 전이된다. 이 실시예는 역으로 실시될 수 있는데, 예를 들면 프로브 표면에 있는 여러 개의 세포들 중 오직 하나를 캐리어로 전이시킬 수 있다.

게다가 프로브와 캐리어의 상관적인 이동(relative movement)은 세포 전이의 가속화를 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 캐리어로부터 프로브로 전이하는 동안 프로브는 세포의 이동 방향과 반대로 세포 아래로 밀린다. 또한 역으로, 캐리어로 전이하는 동안 프로브는 세포 이동과 반대로 끌어당겨질 수 있다. 동시에 프로브를 캐리어 표면에 있는 세포물질 안으로 투입할 수 있다. 상관적인 이동은 프로브가 세포나 세포물질을 손상 없이 옮기거나 세포나 세포물질로부터 손상 없이 떼어내는 식으로 일어난다. 프로브는 프로브를 위한 공간이 만들어지게 세포들이 프로브의 표면에 의해 서로 밀어내거나 서로 분리되도록 작동되어서, 세포들은 이동 또는 분리 동안 물리적, 화학적 상태가 변화되지 않고 유지된다. 세포들의 손상 없는 이동은 특히 프로브의 이동 중 세포들이 프로브 몸체와 직접 접촉을 하고 있거나 또는 세포물질 내에 더욱 깊이 놓여있는 세포들의 공간적 위치가 변형되거나 변경될 때 달성된다. 그렇지만, 세포들은 예를 들면 메신저 물질이나 물질 분비와 같은 화학적 신호를 방출하지 않는다.

이것은 선택된 세포가 움직이는 방향과 반대로 프로브를 세포물질 내로 기계적 도입을 하는 것을 가능하게 한다. 세포들 사이의 접착 접촉을 자연적인 방법, 즉, 세포들에 영향을 주거나 파괴하지 않는 방법으로 떼어내기 위해 진행 속도를 충분히 낮게 한다면 캐리어 표면에 남아있는 세포들은 세포물질을 통과하는 프로브의 이동 중 손상되지 않고 유지되어 변화하는 환경에서 재건될 수 있다.

만약 세로 방향으로 신장하는 형태의 프로브가 본 발명의 세포 전이를 위해 사용된다면, 프로브가 세로 방향으로 신장하는 형태인 프로브의 일직선에 평행한 방향으로 캐리어와 상관적으로 움직이게 되는 것이 유리하다. 동시에 세포들의 손상 없는 이동에 관한 이익을 얻을 수 있다. 이동은 프로브의 앞쪽에서만 일어나야 하는데, 프로브의 앞쪽은 남아있는 표면과 비교할 때 매우 작은 표면 부위를 구성한다. 또한, 이 실시예의 장점은 주사기, 캐뉼러 또는 모세관을 사용하는 종래의 주입 기술과 양립할 수 있다는 것이다. 프로브는 세포나 세포 부유물의 조작을 위해 사용할 수 있는 장치와 결합될 수 있다. 특히, 프로브로 물질을 세포물질 내로 투입하는 것이 가능하다. 펌프나 그와 같은 종류 및 공지된 유체 공급 매커니즘은 이 목적을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라 프로브는 생리학적 기준 속도(physiological reference rate)보다 느리거나 동일한 진행 속도로 움직이는데 생물학적 세포의 생리학적 결합 속도(physiological binding rate)로 정해진다(세포들의 이동 또는 결합 속도). 이 진행 속도의 조정으로 프로브는 자연적으로 주어진 합성물에서 세포들을 통해 손상 없이 움직일 수 있다. 진행 속도는 조직에서 일어나는 계속적인 세포 운동에 맞추어진다. 예를 들면 면역세포(예를 들면 대식세포)의 특별한 형태가 조밀한 조직을 통해서조차 본 세포의 이동에 의해 움직여진다고 알려져 있다. 또, 본 발명자들은 놀랍게도 이 이동하는 움직임이 상기 진행 속도의 조정동안 면역세포보다 상당히 크고 서브-밀리미터 내지 센티미터 범위의 거시적 치수를 가지는 프로브를 사용할 수 있게 한다는 것을 확증했다. 프로브가 움직이는 동안 거대분자 결합들(예를 들면 인테그린과 카테린 족의 세포막 쪽 거대분자)은 연속적으로 세포들 사이에서 분리되고 프로브 표면과 같은 곳에 다시 연결된다.

생리학적 기준 속도는 공지되어 있고(G. Fuhr et al. In "Biol. Chem. ", 1998, vol. 379, pp.1161-1173) 동물이나 사람 세포에서 측정될 수 있다. 관심있는 결합 속도는 합성체 표면에서 각각의 세포들의 접착 패턴의 역학관계를 측정함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 특별한 효과는 프로브의 진행속도가 0.1㎛/h 내지 1mm/h, 바람직하게는 1㎛/h 내지 500㎛/h의 속도 범위에서 선택될 때 얻어질 수 있다. 이에 따라, 속도 범위는 주로 인테그린과 카테그린 족의 세포막 쪽 거대분자에 의해 조정되는 거대분자 결합의 형성과 분해의 결합비율이다. 바람직한 속도 범위는 특히 섬유아세포, 대식세포, 림프구, 연골 세포 또는 종양세포의 세포 이동 속도에 상당한다. +/-1㎛까지의 고도의 정밀도를 가지는 프로브의 위치는 이러한 극소의 진행속도를 정하는 중에 조정될 수 있다. 상기 범위 내에서 진행속도는 조직 안과 표면에서 활발하고 내생적인 세포 이동 속도에 따라 정해진다. 프로브의 운동은 프로브 표면에 인접한 환경에서 세포의 영구적인 구축과 재건을 초래하고, 그 결과 세포들의 이동이 영구적으로 작용하는 추진력에 의해 촉진된다.

응용에 의하면, 특히 순진행(net advance)이나 순후퇴로 되는 이동, 불연속적인 이동이나 일부분으로 나뉘는 이동, 진동, 등속 또는 가속 이동과 같은 프로브의 다양한 형태의 움직임이 유용하게 만들어질 수 있다.

서로 상관적인 캐리어와 프로브의 위치 지정 및/또는 이동이 이미지 기록 및 처리 결과에 따라 조절될 수 있을 때, 자연적 세포 이동과 관련하여 프로브의 목표하는 대강의 위치 지정 및/또는 반대 이동을 위한 이득들이 세포 전이가 가속되는 것과 같이 얻어질 수 있다. 만약에 예를 들어, 전이되도록 선택된 세포의 위치가 현미경 관찰에 의해 먼저 탐지되면 전이 위치를 조정하기 위한 시작 위치 지정이 빠른 이동으로 시작될 수 있다. 이동 탐지는 자연적인 세포 이동을 측정하는 것을 포함한다. 그것은 바람직하게 캐리어나 프로브의 구동장치를 위한 제어 신호의 생성을 가능하게 한다. 이 경우 예를 들면 제어 회로에 의해 세포 배지로부터 세포를 자동적으로 제거하는 것이나 세포를 두는 것이 단순화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 장점은 세포 전이가 다수의 세포들이 순차적으로 또는 병렬적으로 수행되는 전이를 포함한다는 것이다. 특히, 다음의 변형은 독립적으로 또는 조합하여 제공될 수 있다. 첫째, 캐리어에서 프로브로의 첫 번째 세포 전이에 이어 목표 기질이나 시험 장치에서와 같은 또 다른 캐리어에서 프로브로 또 다른 세포 전이가 일어날 수 있다. 둘째, 여러 세포들이 연달아 프로브로 이동하고 캐리어에 의해 같이 제거될 수 있다. 셋째, 여러 개의 세포가 동시에 프로브로 전이되게 프로브가 형성될 수 있다. 이 경우, 세포 조작의 속도와 관련하여 이득이 있을 수 있다.

장치와 관련하여 상기 언급된 목적은 캐리어로부터 또는 캐리어로의 세포 전이를 위한 프로브에 의해 해결되는데, 상기 프로브는 캐리어와 상관하여 위치 지정할 수 있는 프로브 몸체를 가지고, 캐리어와 마주하는 상기 프로브의 끝에는 픽업 도구가 마련되는데, 픽업 도구는 적어도 하나의 생물학적 세포의 접착을 유지할 수 있는 표면을 가지고 있다. 본 발명의 세포 전이의 실행에 있어서 프로브의 이점은 그러한 픽업 도구는 수동적으로 디자인되고 현미 외과적 요소와 같이 움직일 수 있는 부분이 필요하지 않다는 것이다. 상기 픽업 도구는 오직 하나의 독립적이고 세밀한 세포 운반체로 구성되는데, 세포 운반체로 또는 세포 운반체로부터 적어도 하나의 세포가 세포 전이 동안 이동한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 프로브 몸체는 세로 방향으로 신장하고, 바(bar)나 로드와 같이 세로로 긴 형태를 가질 수 있고, 프로브 몸체의 노는 끝에는 픽업 도구가 배치되고, 프로브 몸체의 반대 방향 끝은 구동장치에 부착될 수 있다. 유리하게, 이 형상은 세포 물질과 세포 전이의 광학적 측정을 할 때 시야를 가리는 것을 방지할 수 있다. 또한, 프로브 몸체 형태에 평행한 방향으로의 프로브의 진행 운동시 편리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 픽업 도구는 프로브 몸체의 부분으로서 형성된다. 이 경우, 프로브의 구조는 특히 단순하다.

또 다른 변형에 따라 프로브 몸체가 세로형상을 따라 신장하는 공동(cavity)을 가지면, 유체 용기(enveloping)를 제공하는 것과 같이 픽업 도구 위에 특별한 환경 조건을 만든다거나 또는 프로브 위에서 세포를 시험할 수 있는 부가적인 이득이 얻어질 수 있다. 공동을 가지는 프로브를 형성하기 위해 예를 들면, 프로브 몸체가 직선 축(모세관, 튜브, 속이 빈 바늘, 호스)을 따라 세로 방향으로 신장하고, 첫 번째 끝 위에는 픽업 도구가 제공되고, 두 번째 끝은 구동장치에 연결될 수 있고 필요에 따라 저장 장치에 연결될 수 있게 마련될 수 있다. 본 발명의 이 실시예는 종래의 주입 도구와 양립할 수 있다는 이점이 있다.

내부에 공간을 가지는 프로브 몸체에서 픽업 도구는 프로브 몸체(속이 빈 몸체) 안에 배치될 수 있다. 픽업 도구는 속이 빈 몸체 안에서 움직이기 쉽게 미끄러지게 배지될 수 있어서, 세포 전이동안 속이 빈 몸체의 한쪽 끝에서 내밀어지고 세포가 집어진 후 속이 빈 몸체 안으로 들어가질 수 있다.

픽업 도구는 일반적으로 적재면(carrying surface)을 형성하는데, 그것은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 오목하거나 볼록한 형태를 가진다. 오목한 형태는 남아 있는 프로브 몸체로부터 적재면의 공간을 제한하는 이점을 제공한다. 이는 프로브 몸체 표면에서의 원하지 않는 세포 이동을 방지할 수 있다. 오목한 픽업도구는 예를 들어 삽이나 스푼 형태로 디자인된다. 볼록한 형태는 세포물질을 통한 프로브의 손상 없는 이동을 위해 이롭다. 저장소로서의 둥근 곡면을 가지는 볼록한 픽업 도구는 바람직하게는 속이 빈 몸체 안에서 움직일 수 있는 픽업 도구와 함께 프로브 내에 제공된다.

대안으로, 픽업 도구가 세포 표면에서 측정을 하거나 세포물질 주위로부터 세포의 범위를 정하는 등의 추가적인 기능을 수행하기 위하여 사용되는 경우 더욱 복잡한 형태의 픽업 도구가 제공될 수 있다. 픽업 도구는 예를 들면 고리 모양으로 디자인될 수 있고, 그것에 의해 적재면은 고리의 안쪽에 마련된다.

바람직한 변형에 의하여 접시 모양이나 둥근 픽업 도구로 제공되는데, 그 안쪽은 적재면을 형성한다. 캐리어를 마주하는 이 픽업 도구 쪽에 통로가 제공되면, 적어도 하나의 세포가 접시나 반원형 형태의 내부 표면에 옮겨지자마자 픽업 도구는 캐리어 표면이나 캐리어 표면의 세포물질에 놓이고 나서 철수할 수 있다. 세포 전이는 고리 형태의 픽업도구에 의해 각 방향의 자연적인 세포 이동으로 짧은 기간 후 달성된다.

본 발명의 또 다른 변형에 의하면, 프로브 몸체의 끝에 있는 픽업 도구에는 적어도 하나의 스페이서가 설치되는데, 그 스페이서로 픽업 도구는 캐리어 위에 놓일 수 있게 마련된다. 돌출형, 핀형 또는 웹형의 스페이서는 두 가지 기능을 수행한다. 첫째, 캐리어 위에 프로브를 위치시키는 것의 정확도가 증가될 수 있다. 둘째, 스페이서는 세포가 픽업되거나 놓이게 되도록 세포의 적재면으로 작용한다. 스페이서나 스페이서들은 오직 하나의 세포만이 세포-적재면에 닿도록 하는 크기로 만들 수 있다. 따라서, 세포 전이의 선택성이 증가된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 픽업 도구의 적재면은 표면에서의 세포들의 접착 유지력을 향상시키는 하나의 물질(결합 물질)을 가지고 있다. 결합 물질은 프로브 몸체, 픽업 도구, 적어도 픽업 도구의 앞쪽(적재면) 또는 적어도 픽업 도구의 앞쪽에서의 코팅을 형성한다. 결합 물질은 예를 들면 섬유결합소이나 콜라겐 또는 nm 내지 ㎛범위의 전형적 크기를 갖는 표면 주름을 포함한다. 본 발명의 이 실시 태양은 세포 전이동안 결합 속도의 증가에 관한 이득이 있다.

결합 물질은 ㎛이하 범위의 특정 구조적 크기를 가지는 표면 주름을 가질 수도 있어서, 프로브에 대한 세포 물질의 결합이 활성화된다. 접착 강화 물질의 사용은 종래의 주입 바늘과 비교할 때 본 발명 도구의 필수적이고 근본적인 차이점이다.

본 발명의 또 다른 이점은 종래의 샘플링을 위한 생체 검시 바늘과 대조적으로 단단한 유리 합성물이나 금속 물질의 사용에 대한 제한을 받지 않는 프로브를 포함한다. 프로브는 오히려 유연한 물질, 바람직하게는 적어도 프로브 몸체의 노는 끝과 특히 픽업 도구는 변형될 수 있는 탄성적으로 변형이 가능한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 픽업 도구는 유연한 합성 층, 필름 또는 세포막(예를 들면, 투석 필름, 폴리우레탄)을 포함할 수 있는데, 그것은 적어도 하나의 세포가 픽업될 때까지 캐리어 위에 본 발명의 세포 전이를 위해 위치된다.

상기 언급된 프로브 표면이나 안에서 세포 시험을 위해 프로브 안에는 바람직하게는 적어도 하나의 센서가 마련된다. 상기 적어도 하나의 센서는 세포 물질이나 프로브 몸체 안에서 세포나 물질의 화학적 또는 물리적 특성을 탐지하기 위해 설치될 수 있다. 만약 임피던스 센서와 같은 적어도 하나의 센서가 프로브 몸체의 공동 내에 배치되면, 이는 주입이나 생체 검시를 모니터하는데 도움을 준다.

또한, 프로브는 적어도 하나의 전기 전도체를 가질 수 있는데, 그것은 프로브의 앞쪽으로 움직인다. 그 전도체는 예들 들면 프로브 안에서 녹을 수 있고 측정하는 전극을 형성할 수 있다. 세포 물질에서 분광 측정을 할 수 있도록 적어도 하나의 안내등(light guide)이 제공될 수 있다.

본 발명에 따르면, 픽업 도구는 적어도 픽업 도구의 앞쪽에 둥근 표면을 가질 수 있는데, 그것은 세포 전이동안 캐리어와 마주한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 프로브의 앞쪽은 둥근 표면의 각각의 영역에서 10㎛보다 큰 부분 곡률 반지름을 가진다. 따라서 둥근 표면은 전형적으로 처리되는 세포물질 내의 세포 형태, 특히 조직에서의 세포 형태보다 더 크다. 따라서 프로브의 운동 중에 손상될 가능성은 줄어든다. 부분 곡률 반지름으로 특별한 이익을 얻을 수 있는데, 부분 곡률 반지름은 20㎛보다 크고, 바람직하게는 0.1mm보다 크다. 세포 배지에 적용하기 위한 곡률 반지름은 5mm 미만이고, 바람직하게는 2mm 미만이다.

다른 변형에 따르면, 픽업 도구는 투명한데, 이는 세포 전이의 광학적 관찰을 용이하게 한다.

본 발명의 또 다른 과제는 세포 물질을 처리하기 위한 세포 조작기(특히 예를 들면 주입, 생체 검시 및/또는 시험 장치와 같은 작동 기구)인데, 세포 조작기는 적어도 하나의 개량된 프로브, 적어도 하나의 세포나 세포 배지와 같은 세포물질을 수용하는 캐리어, 그리고 프로브 또는 캐리어의 전이 배치를 조정하기 위한 적어도 하나의 구동장치를 포함한다. 세포 조작기는 구동장치를 가지는 프로브와 캐리어가 서로에 대해 상관적으로 위치될 수 있는 특별한 장점을 가지고 있고, 필요에 따라 더욱 높은 정확성과 재현성이 있게 이동될 수 있다.

구동장치는 바람직하게는 상대 속도에서 프로브 및/또는 캐리어의 이동에 순응하는데, 상대속도는 상기한 세포의 생리학적 기준 속도보다 느리거나 같다. 이러한 특성은 캐리어와 세포가 세포 전이동안 서로에 대해 상관적으로 움직일 때는 물론이고, 캐리어와 상관하여 정지해 있는 프로브로 전이 위치를 조정할 때에도 중요하다. 캐리어에서의 세포 물질에 대한 손상도 서로 상대적인 프로브와 캐리어의 위치 지정으로 피할 수 있다.

만약 구동장치가 압전기를 포함하면, 프로브 운동의 정확성과 재현성 면에서 유리한 점이 있다. 또한, 구동장치는 마그네틱 구동장치로 형성될 수 있는데, 추진력이 있는 무접촉 전이와 관련하여 편리함을 준다. 더욱이, 구동장치는 스프링이 장착된 구동장치를 포함할 수 있는데, 이는 특히 프로브의 단순한 구조와 관련하여 유리한 점을 제공하고, 또는 프로브 물질의 팽창 또는 수축 운동이 이용되는 열 구동장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 세포 조작기는 프로브, 캐리어, 구동장치를 정렬하기 위한 위치지정장치 및/또는 프로브, 캐리어 또는 세포들의 위치나 움직임을 탐지하기 위한 탐지장치를 구비한다.

본 발명의 더욱 상세한 설명과 이점이 첨부된 도면을 참조하여 아래에 설명된다:

도 1은 본 발명의 세포 전이를 실행하기 위한 프로브와 캐리어의 조합을 나타내는 개략도이다.

도 2는 본 발명의 세포 조작기의 전체적인 개략도이다.

도 3은 본 발명의 방법의 실시예에 따른 세포 전이 단계의 순서를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 방법의 실시예를 설명하는 흐름도이다.

도 5는 본 발명의 방법의 또 다른 실시예에 따른 세포 전이 단계의 순서를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 프로브의 또 다른 태양을 나타낸다.

도 7은 고리 모양의 픽업 도구를 가지는 본 발명의 프로브를 사용하는 세포 전이 단계의 순서를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 방법의 또 다른 실시예에 따른 세포 전이 단계의 순서를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 세포 조작기의 일태양을 더욱 상세하게 나타낸 것이다.

본 발명은 아래에서 대표적인 예를 들어 실시예로 설명되는데, 캐리어에서 프로브로의 자연적인 세포 이동과 세포조작기의 기능을 설명한다. 자연적인 세포 이동과 그 특성 그리고 그것의 조작은 상세하게 알려져 있는 한 설명하지 않는다. 이 목적을 위해 앞에서 언급한 L. P. Cramer에 의해 출판된 참고문헌이 마련되어 있다. 만약 설명된 실시예 참조가 대부분 캐리어에서 프로브로의 세포 전이로 이루어졌다면, 본 발명은 반대 방향인 프로브에서 캐리어로의 운동 또한 그에 따라 이루어질 수 있다고 강조되어 있다.

도 1은 본 발명의 세포 전이 방법을 실시하기 위한 기본적인 구성요소인 프로브(10)와 캐리어(80)를 개략적으로 나타내는데, 그것들은 자연적인 세포 이동에 의해 하나의 세포(21)가 예를 들면 세포 배지와 같은 캐리어(80)의 표면으로부터 프로브(10) 위로 이동할 수 있게 상호 전이 배치에 배열된다. 프로브(10)는 프로브 몸체(11)를 포함하고, 프로브의 노는 끝(12)에는 픽업 도구(15)가 형성되어 있다. 캐리어(80)는 예를 들면 세포 배양 접시인데 그 바닥에는 세포 배지가 형성되어 있거나 또는 배양 시스템에서의 기질이다.

캐리어(80)에서 프로브(10)로의 세포(21)의 이동은 세포막 기관의 접착 접촉이 캐리어(80)로부터 먼저 떨어지고 픽업 도구(15)의 적재면(16)에 다시 형성되게 일어난다. 세포 이동의 과정 동안 캐리어(80)와의 접착 접촉은 세포(21)가 픽업 도구(15)에 완전히 위치될 때까지 점차적으로 분리된다. 일반적으로 등방성 표면에서의 자연적인 세포 이동은 임의적이고 확률적이다. 본 발명을 실행하기 위해서는 세포가 프로브 위로 등방성 운동의 범위 내에서 임의로 이동한다면 충분할 수 있다. 실질적인 조건하에서 높은 세포 이동성으로 인해, 세포는 이 경우 또한 충분히 빠르게 프로브로 옮겨질 수 있다(예를 들면 1시간 내지 2시간 내에). 그렇지만 바람직하게는 프로브로의 직접적인 세포 이동 또는 전이 운동을 향상시키기 위한 수단을 필요로 한다.

세포의 프로브 몸체에서 원하지 않는 세포 이동을 피하기 위해서는 접착력을 줄이기 위한 코팅이나 처리가 프로브 몸체 표면과 필요하다면 내부에 제공될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 거대분자들로 (예를 들면 폴리헤마)로 밀봉(silanising)하거나 코팅이 실시된다.

도 2의 개략도에 따른 본 발명의 세포 조작기(100)는 프로브(10), 구동장치(50), 위치지정장치(60), 탐지장치(70), 세포 배지(20)와 유체 덮개(81)를 가지는 캐리어(80), 및 제어장치(61)를 포함한다. 유체 덮개(81)는 예를 들어 부유물과 배양액을 포함하는데, 그것은 유리하게 본 발명의 세포 전이를 방해하지 않는다.

구동장치(50)의 목적은 프로브(10)와 캐리어(80)의 전이 배치를 조정하고 필요하다면 세포 전이동안 프로브(10)에 추진력을 주기 위한 것이다. 구동장치(50)는 예를 들면 피에조크리스탈을 포함하는데, 그것으로 프로브(10)는 공지된 마이크로 조작기 시스템과 유사하게 100nm 미만의 정확도를 가지고 다른 공간 방향으로 위치되거나 움직여질 수 있다. 프로브(10)가 작동하는 경로는 0.1mm 내지 몇 센티미터 사이가 될 수 있다. 또한, 구동장치(50)(파선으로 나타내어졌다)는 세포물질에서 캐리어(80)의 운동을 위해 설치될 수 있다.

구동장치(50)는 위치지정장치(60)와 연결되어 있다. 위치지정장치(60)는 캐리어(80)에 대하여 기계적으로 안정되고 마이크로미터 단위로 정확하게 고정될 수 있는 요소이다. 위치지정장치는 조작 기간 동안(몇 시간, 며칠 또는 몇 주라도) 캐리어에 대한 프로브의 안정된 위치를 보장하는 일을 한다. 이는 배양시스템(도 8을 보시오) 위에 세 군데의 조정할 수 있는 마운트를 설치하거나 예를 들면 뇌로 세포를 주입하는 경우의 해골의 뼈 표면에 세 군데의 조정할 수 있는 고정기구를 설치하여 달성될 수 있다. 위치지정장치(60)는 또 더 긴 거리와 더 빠른 속력의 운동을 프로브나 캐리어를 위하여 제공하는데, 프로브와 캐리어의 전이 배치를 조정하기 전이나 후가 바람직하고, 이를 위해 예를 들면 서브모터를 포함한다.

위치지정장치(60)는 또한 제어장치(61)와 측정 및 디스플레이 장치(62)에 연결되어 있다. 제어장치(61)는 전체적인 시스템을 제어하는데 쓰이고 프로세서나 컴퓨터를 포함한다. 현재 및 계획된 위치들은 센서들(작동기에서의 변형계, 원자력 현미경 또는 유사한 방식의 레이저 빔을 이용한 사분원 탐지기)을 통해 조정될 것이다. 그 정보는 소프트웨어에 기초하여 처리되고 현재 및 계획된 운동이 의도한 파라미터들로 모니터에 나타나는 방식으로 디스플레이된다. 현미경 확대와 줌 기능을 가지는 카메라 시스템은 이 목적을 위해 탐지장치(70)로 제공될 수 있다.

프로브(10)는 샘플 저장기(나타나지 않음)에 연결될 수 있는데, 그것은 샘플을 프로브(10)로 이동시키기 위한 수송 시스템을 포함한다. 세포 물질로 전이되는 세포는 예를 들면 세포 부유물 내에 저장된다. 수송 시스템은 정밀한 주입펌프와 같은 공지된 공급 매커니즘이다. 주입하려는 세포들을 꺼내기 위한 샘플 저장소로 는 헤밀턴 주입기나 저-사각-공간(low dead volume)을 가지는 3-방식 시스템을 통해 연결된 컨테이너가 될 수 있다. 기계적 압축을 이용하여 상기 수송 시스템은 예를 들면 세포 부유물을 주입 도구(프로브(10)) 속으로 민다. 그 때문에 매우 극소한 부피가 옮겨진다(수㎛/min의 속도). 세척 용액으로 헹구는 과정 또한 실시될 수 있다(1 내지 수백㎛/s의 속도). 이것은 프로그램 가능한 주입 펌프를 통해 실행될 수 있다.

도 3에 따르면, 프로브(10)의 픽업 도구(15)는 속이 빈 채널(31)을 가지는 모세관처럼 생긴 프로브 몸체(11)의 끝에 삽과 같은 형태로 형성되어 있다. 프로브 몸체(11)의 끝은 픽업 도구(15)가 볼록한 적재면(16)과 그것으로부터 돌출되는 에지(17)를 가지는 슬라이드나 삽 모양을 형성하도록 비스듬하게 잘린다. 프로브(10)는 모든 공간의 방향과 특히 프로브 몸체(11)(이중 화살표 참조)의 세로축을 따라서 구동장치(50) 및 위치지정장치(60)(도 2 참조)와 함께 이동될 수 있다.

프로브 몸체(11)는 예를 들면 유리, 비활성 금속(예를 들면 백금) 또는 비활성 합성물질(예를 들면 폴리이미드)을 포함한다. 통로(32)에서 속이 빈 채널(31)의 안쪽 지름(a)과 프로브 몸체(11)의 바깥 끝쪽 지름(b)은 전형적으로 a는 10㎛ 내지 100㎛, b는 10.5㎛ 내지 200㎛ 범위에서 선택된다. a = 0.1㎛내지 10㎛ 범위의 더 작은 크기는 특히 작은 세포나 합성 입자들의 전이를 위해 선택될 수 있고 또는 a = 100㎛ 내지 5mm의 더 큰 크기는 배아 줄기 세포 등의 전이를 위하여 선택될 수도 있는데, 이것에 의해 프로브 몸체(11)의 벽 두께에 부합하는 b의 크기가 그에 상응하여 더 커진다.

프로브(10)에는 임피던스 센서(33)가 제공될 수 있다. 임피던스 센서(33)는 두 개의 반원형 전극(임피던스 전극)을 포함하는데, 그것들은 예를 들면 증기 코팅에 의해 도구(15)의 앞쪽 표면에 배치된다. 또는, 임피던스 전극들은 프로브 몸체(11)의 바깥쪽 끝에 배치될 수 있다. 임피던스 센서(33)의 전극들은 프로브 몸체(11)를 따라 전기 연결 라인(도면에 나타나지 않음)에 의해 제어장치에 연결되어 있다. 세포(21)가 속이 빈 채널(31)을 통해 나갈 때마다 임피던스 신호가 생성되는데, 그것은 임피던스 전극들 사이에서 임피던스를 디튜닝(detuning)함으로써 지나가는 세포의 크기와 전기적 성질을 알려준다.

적재면(16)은 접착 강화 코팅을 했다. 이 연결하는 코팅은 바람직하게는 단지 적재면(16)에만 제공되는 반면, 남아있는 프로브 몸체(11)의 표면은 바람직하게는 이동을 최소화하고 필요하다면 대체된 세포들 사이에서 미끌어지는 것을 최소화하기 위해 접착력을 최소화하여 코팅된다. 연결하는 코팅은 예를 들면 섬유결합소를 포함한다. 생물학적 거대분자(예를 들면 폴리헤마, PTFE)로 밀봉하거나 코팅하는 것은 접착력을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 또한 속이 빈 채널의 안쪽 표면은 이런 식으로 접착력을 줄이는 코팅이 될 수 있다. 앞쪽 가장 자리(도 (B) 참조)에 적재면(16)은 만곡부를 가지고 있다. 앞쪽 가장 자리의 길이에 상응하여 세포의 이동이 원하는 대로 된다.

모세관 형상의 프로브 몸체의 단면 형태는 바람직하게는 둥근 것이다. 대안으로, 납작해진 타원 형태가 제공될 수 있는데, 그것은 측면 운동의 주된 방향이 프로브 몸체(11)의 세로축에 수직한 운동 방향으로 되게 하는 것을 가능하게 한다.

도 3은 프로브(10)를 사용하여 캐리어(80)에서 목표 기질(80')로 세포 전이하는 각각의 상태를 세 개의 부분 이미지 A-C로 나타낸 것이다(각각의 경우가 부분적으로 나타나 있다). 캐리어(80) 상에 위치한 것은 여러 개의 세포들을 가지고 있는 세포 배지(20)인데, 그 중 하나의 세포(21)는 목표 기질(80’)로 전이된다. 캐리어 위에는 유체 덮개가 제공될 수 있다(도 2 참조). 상기 세포(21)는 예를 들면 세포 물질(20)에서 발견되는 줄기 세포이다.

먼저 세포(21)는 픽업 도구(15)에 도달하여 자신의 세포 이동에 의해 픽업 도구로 이동해 가기 전까지는 기질(80)에서 확률적인 세포 이동을 나타낸다. 이 세포 전이는 적재면(16)에서의 접착 강화 코팅(위를 보시오) 및/또는 세포 이동과 반대 방향으로 프로브(10)를 전진 이동시키는 것에 의해 일어날 수 있다. 세포(21)의 접착 접촉의 자연적인 변동을 통해 세포들은 픽업 도구(15)로 서서히 재배치된다. 세포(21)가 프로브 위로 완전히 배열되자마자(부분 이미지 (B)), 프로브(10)는 증가된 속도로 캐리어(80)로부터 물러날 수 있다. 구체적인 적용에 따라 더 많은 수 송이 목표 기질(80’)로 일어나는데, 거기에서 세포(21)는 그 확률적인 운동으로 프로브를 다시 떠난다.

프로브(10)로부터 목표 기질(80’)로의 세포(21)의 이동은 목표 기질(80’) 위에 이미 적어도 하나의 세포가 존재하는 경우에는 세포들의 자연적 집합 경향에 의해 유리하게 이미 일어난다. 대안으로, 예를 들어 신호 분자, 영양분, 호르몬 또는 화학주성적으로 효과적인 물질들 같은 분자 끌개(attractor)는 지향성 전이를 촉진하기 위해 목표 기질(80’) 위에 배치될 수 있다.

세포 전이의 작동 방법은 도 4에서 더욱 상세하게 예를 드는 방식으로 설명된다. 세포 배지(20)에서의 이미지 분석 후 원하는 세포(21)(예를 들면 섬유아 세포 또는 줄기 세포)가 선택된다. 다음으로 선택된 세포(21) 근처에서 프로브(10)의 위치를 지정하고, 캐리어(80) 위에서 세포 이동의 광학적 측정 및 분석을 하고, 세포 이동과 관련하여 프로브(10)를 정교하게 조정하고 트랙킹한다. 세포 접촉이 프로브로 재배치된 것이 확인되자마자 프로브 트랙킹 이동 방향은 세포의 전이가 촉진되도록 조정된다. 세포가 프로브(10)로 완전히 전이된 것이 확인된 후, 캐리어(80)로부터 프로브(10)의 되돌아오는 이동이 실행된다. 이미지 분석과 탐지 단계는 탐지장치(70)(도 2 참조)를 이용하여 실행된다.

도 5는 A에서 C까지의 부분 이미지로 변형된 프로브(10)를 이용한 세포 전이를 설명한다. 모세관 형태의 프로브 몸체(11)의 속이 빈 채널(31) 내에 위치된 것은 둥근 픽업 도구(15)인데, 그것의 표면은 적재면(16)을 형성한다. 픽업 도구(15)는 예를 들면 15㎛의 지름을 가진다. 픽업 도구(15)는 구동장치(도 2 참조)를 이용하여 모세관 형태의 프로브 몸체(11) 안으로 이동될 수 있다(도 2 참조).

부분 이미지 (A)에 따르면, 프로브(10)는 프로브(10)의 앞쪽 끝이 세포 배지(20)의 표면 위의 일정 거리에 위치할 때까지 배양액(81)에 담기고 세포 배지(20)를 가지는 기질(80)로 움직인다. 다음으로, 픽업 도구(15)는 캐리어(80)의 표면에 착상할 때까지 속이 빈 채널(31)의 노는 끝으로부터 움직여 나온다. 이 진행 운동으로 세포물질의 손상 없는 이동이 픽업 도구(15)의 경로를 따라 위치할 수 있게 일어난다. 자연적으로 내재된 운동으로 세포(21)는 적재면(16)으로 이동해 간다. 세포(21)가 픽업 도구(15) 위에 완전히 위치하면, 프로브(10)는 캐리어(80)로부터 들어 올려질 수 있다. 세포 배지(20)의 남아있는 세포에 손상 없이 되돌아가는 동작이 다시 일어난다. 올려진 상태에서 배양액(81)은 픽업 도구(15) 둘레에서 유리하게 유체 방울을 형성한다(부분 이미지 (B)). 세포는 이것에 의해 보호된다. 목표 기질(80’)로 이동하는 동안 픽업 도구(15)는 진행한 위치에 남아있거나 들어가 질 수 있다. 목표 기질(80’)에서 프로브(10)는 부유액(81’)에 담겨져 있다(부분 이미지 (C)). 위에 언급된 과정과 유사하게, 세포(21)는 픽업 도구(15)를 충분히 근접시킨 후 목표 기질(80’)로 전이될 수 있다.

도 3 및 도 5에 나타낸 과정과 유사하게 세포들은 조직 표면이나 내부에 배치될 수 있다.

도 6은 본 발명에 따라 사용되는 프로브(10)의 두 가지 변형 실시예에 관한 것으로 픽업 도구(15)와 프로브 몸체(11)의 협조(상호관계)를 설명한다. 부분 이미지 (A)에 따라, 프로브 몸체(11)는 모세관 형상이고, 그것의 끝은 단면으로 나타낸다. 모세관 형상의 내부(속이 빈 채널(31))는 유체로 차있다. 픽업 도구(15)는 모세관 내부에서 피스톤처럼 움직인다. 부분 이미지 (B)에서 개방된 슬라이드에 상응하는 원리가 나타나는데, 그것은 모세관의 끝에 예를 들면 도 3과 유사하게 형성되어 있고 거기에서 마찬가지로 피스톤처럼 움직인다. 두 가지 경우에서 프로브 위의 적어도 하나의 세포(21)는 유체 방울(81)로 덮여 있다.

본 발명의 세포 전이로 피스톤(15)은 배지로부터 세포들을 집어낼 수 있도록 도 6에서와 같이 나오거나 들어가질 수 있다. 대안으로, 본 발명에 따라 제공되는 활동적인 세포 이동은 처음에 속이 빈 채널(31) 내부로 그리고 또 속이 빈 채널 내에서 피스톤(15) 표면 위로 일어날 수 있다. 목표 기질에 저장될 때 피스톤(15)은 손상 없는 이동을 위하여 모세관(11)으로부터 세포를 꺼내는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 중요한 적용은 조직으로부터 세포를 손상 없이 제거하는 것을 포함한다(상처 없는 생체 검시). 본 발명의 특별한 이점은 픽업되는 세포들보다 큰 크기를 가지는 더 큰 도구들도 예를 들면 진단 목적을 위하여 세포 물질을 제거하기 위하여 사용될 수 있다는 것이다. 도 7은 예를 들어 본 발명에 따라 사용되는 고리 모양의 적재면(16)을 가지는 픽업 도구의 두 가지 변형을 나타낸다.

도 7의 부분 이미지 (A)와 (B)에 따라, 픽업 도구(15)는 둥근 표면의 단면에 상응하는 단면을 가진다. 적재면(16)은 둥근 표면의 내부에 형성된다. 적재면(16)의 내부 에지(17)는 통로를 형성하는데, 그것으로 프로브(10)는 본 발명의 세포 전이를 위한 캐리어(80) 위에 놓여 있다. 부분 이미지 (A)에 따라, 픽업 도구(15)는 원하는 세포(21) 위에 생리학적 기준 속도로 천천히 내려진다. 그러면 세포의 자연적인 세포 이동으로 캐리어(80)로부터 적재면(16)으로 움직일 것이다. 이 전이가 끝나자마자(부분 이미지 (B)), 프로브(10)는 캐리어(80)로부터 제거된다.

도 7의 부분 이미지 (C)는 스페이서(18)의 사용을 나타내는데, 스페이서와 함께 픽업 도구(15)는 캐리어(80)의 표면에 놓여질 수 있다. 스페이서(18)는 픽업 도구(15)를 놓는 것과 각각의 세포(21)의 선택적 이동을 쉽게 한다.

픽업 도구(15)는 상기 언급된 재료들 중 하나를 포함하고, 지름 10㎛ 내지 10mm, 높이 0.5mm 내지 10mm의 범위를 가질 수 있다.

도 8은 세포 전이를 위한 픽업 도구(15)가 반드시 세포 배지 표면에 놓여질 필요는 없다는 것을 나타낸다. 오히려 부분 이미지 (A)에 따르면, 먼저 픽업 도구(15)와 세포(21) 사이의 거리 d로 전이 배치를 하는 것이 가능하다. 거리 d는 예를 들면 수백 nm에서 수 마이크로미터(예를 들면 5㎛) 범위에서 선택될 수 있다. 그러면 세포 전이를 시작하기 위해 세포(21)와 적재면(16)의 단시간 접촉(5초 내지 수 분 동안)이 부분 이미지 (B)에 따라 일어난다. 본 발명자들은 세포 표면 각각의 위치에서 접착 유지가 가능하고, 세포 전이가 거리 d에 걸쳐서 일어날 수 있다는 것을 발견했다. 도시된 예에서, 픽업 도구(15)는 바람직하게는 투명 소재로 형성되어 접착 및 세포 전이 절차를 광학적으로, 예를 들면 현미경으로 관찰될 수 있다. 상의 뒤틀림 없는 관찰을 위해 픽업 도구(15)는 예를 들면 평평한 판으로 형성된 평면 표면을 가진다.

도 9에서 세포 조작기(100)를 생명공학(조직공학)을 위한 인비트로 시스템의 예로 상세하게 나타낸다. 목표는 마이크로 모세관(프로브(10))을 사용하여 하나 이상의 세포(22)를 세포 저장소(40)로부터 세포조직 결합(20) 내로 주입하는 것이다. 프로브(10)는 도관 시스템을 통해 세포 저장소(40)에 연결되어 있다. 그것에 의하여, 프로브(10)는 헤밀턴 주사기(세포 부유물(22)용 수송 시스템(41))와 연결되어 있는데, 그것은 프로세서나 컴퓨터(나타내지 않음)에 의해 작동한다. 전체 시스템은 작업 플랫폼(63)에 위치하는데, 그것은 위치지정 장치(60)를 통해 캐리어(배양접시(80))에 견고하게 연결되어 있기 때문에 조직 결합(20)과 관련하여 움직여질 수 없다.

작업 플랫폼(63)의 기본적인 조정은 위치지정장치(60)로 일어난다. 프로브(10)를 위한 진행 시스템 또는 구동장치(50)는 피에조 튜브인데, 그것은 주어진 방식으로 팽창하거나 수축할 수 있고 그렇게 함으로써 프로브(10)를 조직 결합(20) 속에 도입하거나 각각 철수한다. 목표 세포 영역(23)(점-결합된 링)이 도시되어 있는데, 그곳으로 세포(22)가 삽입된다. 모세관의 프로브(10)의 샤프트에 위치한 것은 단일 세포 탐지 시스템(33)인데, 그것으로 삽입되는 세포들의 수가 결정될 수 있다(여기서 광학 시스템으로 나타난다).

도 9에 따른 세포 조작기(100)는 다음과 같이 작동된다. 첫 번째 단계에서 위치지정 장치(60)는 목표 조직(20)에 견고하게 연결된다. 이는 배양 접시(80)나 유기체의 표면이나 뼈 구조의 적합한 부분 각각에 위치지정장치를 고정하여 된다. 두 번째 단계에서 마이크로 주입 도구(10)는 목표 조직이나 세포 시스템(20) 바로 앞에서 그 끝으로 배치되도록 작업 플랫폼(63)에 고정되어 대충 사전 조정된다. 다음 단계에서 모세관 형상의 프로브(10)는 영양분 용액, 생리학적 용액 또는 다른 적합한 유체로 채워지고 목표 조직과 접촉할 때까지 목표 조직으로 안내된다. 그 다음으로 목표 영역(23)에 도달될 때까지 마이크로 주입 도구가 예를 들면 1㎛/h 내지 수백㎛/h 미만의 속력으로 프로그램되어 있는 진행을 한다. 이 때나 그 전에 주입되는 세포들은 마이크로 주입 도구 내 저장소로부터 헹궈지고 우묵한 부분을 지날 때 탐지기로 탐지되어서, 헤아려지고 필요하다면 특징이 부여된다. 상기 언급된 저속도에서 세 공간 방향 전부로 주입 도구를 움직이는 것에 의해, 시스템은 새로운 목표 영역으로 안내될 수 있어서 사전에 예측할 수 있는 방식으로 세포들이 조직에서 삼차원적으로 위치된다. 적어도 하나의 세포의 전이는 목표 조직 내에서 자연적으로 내재된 움직임에 의해 원하는 위치에서 일어나고, 부유액에 의해 발생하는 압력에 의해 지지될 수도 있다. 주입이 끝나면 마이크로 주입 도구는 목표 조직으로부터 다시 제거된다. 역시 “생리학적 기준 속도”로 지정되는 저속도는 주입 도구 끝에 있는 조직의 세포들을 세포 접착 접촉을 떼어내게 하여 손상되는 것 없이 세포들을 정연하게 이동시킨다.

상기 발명의 상세한 설명, 청구범위, 도면에 드러나는 본 발명의 특징들은 본 발명을 다양한 구성으로 실시하기 위하여 개별적으로도 또는 조합하여서도 중요할 수 있다.

본 발명은 인비트로 세포 배양, 생명공학에서의 조직 공학, 약리학과 의학 치료를 위한 조직 모델의 제공에 바람직하게 제공될 수 있다.

Claims (44)

1. 자연적인 세포 이동을 나타내는 적어도 하나의 세포(21)의 전이가 캐리어(80)와 프로브(10) 사이에서 제공되는 세포 전이 방법에 있어서, 전이 배치에서 프로브와 캐리어가 서로 상대적으로 위치하도록 하고, 상기에서 세포(21)의 전이가 자연적인 세포 이동에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는 세포 전이 방법.
2. 제 1항에 있어서, 세포(21)가 캐리어(80)에서 프로브(10)로 전이되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 세포(21)가 캐리어(80) 위에 배치되어 있는 다수의 세포로 이루어진 합성물질로부터 프로브(10)로 전이되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포(21)의 특성들이 프로브에 의하여 탐지되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 세포(21)를 가지는 프로브(10)가 캐리어(80)로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 세포(21)가 프로브(10)에서 캐리어(80)로 전이되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 세포(21)가 프로브(10)에 의해 캐리어(80) 위에 배치되어 있는 다수의 세포로 이루어진 세포 물질 내로 운반되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 전이 배치로의 프로브(10)와 캐리어의 위치 지정은 프로브(10)가 캐리어(80)에 접촉되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 전이 배치로의 프로브(10)와 캐리어(80)의 위치 지정은 프로브(10)가 캐리어(80)로부터 캐리어(80) 위로 적어도 하나의 세포(21)가 팽창하는 거리 이하만큼 떨어지도록 되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 서로 상대적으로 움직이는 프로브(10)와 캐리어(80)에 의하여 전이 배치가 변경되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 전이배치로의 프로브(10)와 캐리어의 위치 지정은 프로브(10)가 캐리어(80) 위에 배치된 세포물질(20)로부터 떨어져 있고, 세포(21)가 캐리어(80) 또는 프로브(10)와 일시적으로 접촉이 되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 프로브(10)와 캐리어(80)가 세포 전이동안 프로브(10)의 바람직한 공급 방향과 동일한 미리 정해진 방향으로 서로 상대적으로 움직이게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 프로브(10)는 세로로 신장하는 형태를 가지고 세로 방향 이 바람직한 공급 방향인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 프로브(10)와 캐리어(80)가 접촉을 형성하기 위하여 또는 세포 전이하기 위하여 세포 이동의 생리학적 기준 속도 이하의 진행 속도로 서로 상대적으로 움직이게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 프로브(10)와 캐리어(80)가 0.1㎛/h 내지 1mm/h 범위의 진행 속도로 서로 상대적으로 움직이게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 세포 전이에 앞서 전이되는 세포(21)의 위치 결정이 캐리어(80)나 프로브(10)에서 제공되고, 서로 상대적인 프로브(10)와 캐리어(80)의 위치 지정 또는 이동이 광학적 위치 결정에 의존하여 되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 세포 전이에 앞서 또는 세포 전이동안 전이되는 세포(21)의 이동 탐지가 캐리어(80)나 프로브(10)에서 제공되고, 그리고 서로 상대적인 프로브(10)와 캐리어(80)의 위치 지정 또는 이동이 이동 탐지에 의존하여 되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항에 있어서, 다수의 세포들이 캐리어(80)와 프로브(10) 사이에서 동시에 또는 연속적으로 전이되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 1항에 있어서, 세포 전이가 동물이나 사람의 생체 외(in vitro conditions)에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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