KR100965209B1 - 알부민 함유 제제를 살균하는 방법 - Google Patents

알부민 함유 제제를 살균하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스, 박테리아(마이코플라스마(mycoplasmas), 우레아플라스마(ureaplasmas), 나노박테리아(nanobacteria), 클라미디아(chlamydia), 리케차(rickettsias)와 같은 세포내 및 세포간 박테리아를 포함), 효모(yeast), 곰팡이(mold), 진균(fungi), 프리온(prions) 또는, 단독으로나 조합으로, TSEs를 야기하는 작은 발생원(agents) 및/또는 단세포 기생충이나 다세포 기생충과 같은 하나 이상의 활성 박테리아 오염체 또는 병원체(pathogenes)의 수준을 감소시키기 위한 알부민(albumin) 함유 제제를 살균하는 방법을 개시하고 있다. 이들 방법들은 혈장 단백과 같은 알부민 함유 제제를 조사(照射)로 살균하는 것을 포함한다.
Figure R1020047002869
혈장 단백, 알부민 함유 제제, 감마선, 살균

Description

알부민 함유 제제를 살균하는 방법{Methods For Sterilizing Preparations Containing Albumin}
본 발명은 바이러스, 박테리아(마이코플라스마(mycoplasmas), 우레아플라스마(ureaplasmas), 나노박테리아(nanobacteria), 클라미디아(chlamydia), 리케차(rickettsias)와 같은 세포내 및 세포간 박테리아를 포함), 효모(yeast), 곰팡이(mold), 진균(fungi), 프리온(prions) 또는, 단독으로나 조합으로, TSEs를 야기하는 작은 발생원(agents) 및/또는 단세포 기생충이나 다세포 기생충과 같은 하나 이상의 활성 박테리아 오염체 또는 병원체(pathogenes)의 수준을 감소시키기 위한 알부민(albumin) 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 혈장단백질(plasma protein fraction, PPF) 제품과 같은, 알부민 함유 제제를 조사(照射)에 의해 살균하는 방법에 관한 것이다.
알부민은 용해성이 높은, 타원형 단백질(MW 66,500)로서, 혈장의 교질 삼투압(colloid osmotic pressure)의 70-80%를 차지한다. 따라서, 알부민은 순환 혈액의 양을 조절하는데 중요하다. 정맥내에 주입될 때, 5% 알부민은 주입된 양과 거의 동일한 양만큼 순환하는 혈장량을 증가시킬 것이다. 이 여분의 체액은 혈액농도(hemoconcentration)를 떨어뜨리고 혈액 점성도를 감소시킨다. 부피 팽창의 정도 및 기간은 초기 혈액량에 따른다. 혈액량이 감소된 환자를 치료할 때, 주입된 알부민의 효과는 수 시간 동안 지속될 수 있다. 정상 혈액량을 가진 사람에서, 혈액희석(hemodilution)은 아주 짧은 시간 동안 지속된다.
알부민은 또한 운반 단백질이며 순환시에 자연적으로 발생하는 물질과, 치료물질 및 독성 물질과 결합한다.
알부민은 세포외 물을 통하여 분배되며 신체 알부민 풀(pool)의 60% 이상이 혈관외 체액 격벽에 위치된다. 70kg인 사람에서의 총 신체 알부민은 대략 350g이다; 알부민은 15-20일의 순환 수명을 가지며, 매일 약 15g씩 교체된다.
말초신경 부종(peripheral edema)을 방지하거나 없애는데 필요한 최소 알부민 수준은 알려져 있지 않다. 이는 환자마다 다르지만, 거의 데시리터(deciliter)당 2.5g에 이른다는 몇가지 증거가 있다. 이 농도는 20㎜Hg의 혈장 삼투압(5.2g/㎗의 총 단백질 농도와 등가)을 제공한다.
혈장 단백을 포함하는 알부민을 함유한 제제가 종종 치료적으로 인간 및 동물에 제공된다. 예를 들어, 알부민 함유 제제는 하나 이상의 다음의 징후에 대해서 인간에게 자주 투여된다: 쇼크(shock)가 있거나 없는 혈량저하증(hypovolemia); (영양실조(malnutrition), 화상, 큰 손상, 선천성 무알부민증(congenital analbuminemia), 간질환, 감염, 악성종양 또는 내분비 질환으로 인한) 알부민의 불충분한 생산으로 인한 저알부민증(hypoalbumenimia), (화상, 큰 손상, 췌장염(pancreatitis), 갑상선항진증(thyrotoxicosis), 물집증(pemphigus) 또는 신장증(nephrosis)으로 인한) 과도한 이화작용(excessive catabolism), (출혈(hemorrhage), 과도한 신장배출(excessive renal excretion), 화상 삼출물(burn exudates), 삼출성 장병증(exudative enteropathy) 또는 탈락 피부질환(exfoliative dermatoses)으로 인한) 신체로부터의 알부민 손실 및/또는 ( 대수술(major surgery), 복수 경화증(cirrhosis with ascites), 또는, 여러가지 염증질환(inflammatory conditions)으로 인한) 신체의 알부민 재분배; 심폐우회로 (cardiopulmonary bypass)수술 전 또는 심폐우회수술 동안; 및 화상이나 경화증의 치료.
치료용으로 많은 다른 알부민 함유 제제들로는, 예를 들어, 알부미나(Albuminar)®(센테온/아벤티스 베링사(社)(Centeon/Aventis Behring)), 부미네이트(Buminate)®(백스터 라보라토리사(社)(Baxter Laboratories)), 플라스부민(Plasbumin)®(바이엘 바이오로지칼사(社)(Bayer Biological), 알부테인(Albutein)®(알파 테라튜틱사(社)(Alpha Therapeutic)), 알부민(인간)(이뮤노-유.에스.)(Albumin(Human)(Immuno-U.S.))과 알부마크(Albumarc)®(미국적십자사(社)(American Red Cross)) 및 휴먼 세럼 알부민(Human Serum Albumin)(스위스 적십자)를 포함하거나, 상용으로 구매가능하다. 다양한 혈장단백 제품들로는 또한, 예를 들어, 플라스마-플렉스(Plasma-Plex)®(센테온/아벤티스 베링사(社)), 프로테네이트(Protenate)®(백스터 라보라토리사(社)), 플라스마네이트(Plasmanate)®(바이엘 바이오로지칼사(社)), 플라스메테인(Plasmatein)®(알파 테라튜틱사(社))을 포함하는 혈장단백 제품을 포함하거나 상용으로 구매가능하다.
알부민은 또한 치료용으로 의도된, 자연 단백질 또는 재조합 단백질의 제제 에 안정제(stabilizer)로서 사용된다. 예를 들어, 알부민은 (백스터-하이랜드/임뮤노 (Baxter-Hyland/Immuno)사(社)의 리콤비네이트(Recombinate)®와 같은) 혈우병(hemophilia) A에 대한 인자 VIII, (벨렉스 라보라토리(Berlex Laboratories)사의 베타세론( Betaseron®)과 같은) 다발성 경화증(multiple sclerosis)에 대한 인터페론 베타-1b(interferon beta-1b), 암겐(Amgen)사의 에포겐(Epogen®)과 같은 빈혈에 대한 적혈구생성인자(erythropoietin), 겐자임(Genzyme)사의 세레다제(Ceredase®)와 같은 고셔병(Gaucher disease)에 대한 효소인 베타-글루코세레브로시다아제(β-glucocerebrosidase)의 변형된 형태인 알글루세라제(alglucerase) 및 파마시아 및 업죤(Pharmacia & UpJohn)사의 바이엘 또는 아트나티브(ayer or Atnativ®)의 트롬베이트 III(Thrombate III)와 같은 유전적 결핍(hereditary deficiency)에 대한 항 트롬빈III(antithrombin III). 이러한 제제에서, 알부민은 총 단백질 함량의 99%이상으로 구성될 수 있다.
알부민은 또한 틱-본 뇌염(Tick-Born Encephalitis, TBE) 바이러스 백신 및 홍역(Measles), (메르크(Merck)사의 MMRII ®와 같은) 볼거리 및 루벨라 생바이러스 백신(Mumps and Rubella Virus Vaccine Live), (파스퇴르-메리에욱스(Pasteur-Merieux)사의 키론 및 이모백스(Chiron and Imovax®)의 랩아버트(RabAvert)와 같은) 광견병 백신(Rabies Vaccine) 및 (에반스/메데바(Evans/Medeva)사의 에반스 폴리오 백신(Evans Polio Vaccine)과 같은) 오랄 폴리오 백신(Oral Polio Vaccine)과 같은 백신 제제에서의 안정제로서 발견된다. 이러한 제제에서, 알부민은 또한 총 단백질 함량의 99%이상으로 구성될 수 있다.
알부민 함유 제제는, 요망 제품을 생산하는 (재조합이나 다른 경우) 세포의 배양액을 포함하며, 세포 배양 및 백신 생산을 위한 배지에 영양제로서 또한 사용된다. 이러한 제제들은, 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 일빈 사이언티픽(Irvine Scientific), 인터젠(Intergen) 및 밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical)사(社)들로부터 상용으로 구매가능한 형태이다.
인간용, 가축용, 진단 및/또는 실험 용도로 제제된 많은 알부민 함유 제제들은 다양한 바이러스, 박테리아(미코플라스마, 우레아플라스마, 나노박테리아, 클라미디아, 리켓챠와 같은 세포내 및 세포간 박테리아를 포함), 효모, 곰팡이, 진균, 프리온 또는, 단독으로나 조합으로, TSEs를 야기하는 작은 발생원 및/또는 단세포 기생충이나 다세포 기생충과 같은 원치않으며 잠재적으로 위험한 생물학적 오염체들 또는 병원체들을 포함할 수 있다. 따라서, 생물학적 물질에 있는 어떤 생물학적 오염체 또는 병원체가 제품이 사용되기 전에 불활성되어야 하는 것이 가장 중요하다. 이는 특히 물질이 환자에 직접 투여될 때, 예를 들어, 혈액수혈, 혈액요소 대치 치료법, 장기 이식 및 정맥내, 근육내 또는 주사나 삽입의 다른 형태에 의하여 치료되거나 고쳐지는 인간 치료의 다른 형태들에서 중요하다. 이는 또한 여러 형태의 혈장 및/또는 혈장 유도체 또는 타 생물학적 재료를 포함하고 미코플라스마, 프리온, 박테리아, 바이러스 및 타 생물학적 오염체들 또는 병원체들을 포함하는 배지에서 또는 세포 배양이나 재조합 세포들을 통해 제조되는 여러 생물학적 물질들에 대해서 중요하다.
생물학적 물질을 생산하는 대부분의 공정들은 상기 물질로부터 생물학적 오염체(들) 또는 병원체(들)의 제거나 불활성보다는 하나 이상의 생물학적 오염체 또는 병원체에 대한 생물학적 물질을 스크린(screen)하거나 검사하는 방법들을 포함하고 있다. 생물학적 오염체 또는 병원체에 대하여 양성검사된 물질들은 사용될 수 없다. 스크린 공정(screening procedures)의 예로는 혈액 기증자(donors)로부터의 인간 혈액에서 특정 바이러스에 대한 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 공정은 항상 신뢰할 수 없고, 특히 매우 적은 수로 있는 특정 바이러스를 검출할 수 없다. 이는 거짓 음성결과와 관련된 귀결로 인해 검사의 가치와 확실성을 떨어뜨린다. 거짓 음성결과는 어떤 경우, 예를 들어 후천성 면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)의 경우에 생명을 위협할 수 있다. 더욱이, 어떤 경우에는 물질이 오염되었는지의 여부를 결정하는데 몇달은 아니지만 몇주가 걸린다. 따라서, 생물학적 물질을 제조하는 동안 및/또는 후에 오염체들 또는 병원체들을 죽이거나 불활성시키는 기술을 적용하는 것이 요망될 것이다.
또한, 지금까지, 잠재적인 혈액 기증자나 감염된 물질을 스크린하는데 적합한 생물학적 물질내의 프리온을 식별하기 위한 신뢰할 수 있는 어떠한 검사나 시험이 없다. 이는 생물학적 물질의 요망 활동을 여전히 유지하면서 생물학적 물질내의 프리온을 파괴하는 효과적인 수단에 대한 필요를 높이게 한다.
바이러스를 불활성화시키는 기술들의 능력을 측정하기 위한 수행 실험에서는, 실제적인 관심 바이러스들이 거의 사용되지 않았다. 이는 검사를 하는 작업자들에 대한 안전성 문제와, 오염 기기 및 일회용 쓰레기와 관련된 어려움 및 비용의 결과이다. 대신에, 동일한 군(family) 및 계열(class)의 모델 바이러스들이 사용된다.
일반적으로, 불활성화 시키기가 가장 어려운 바이러스들은 단백질로 된 외부 껍질을 갖는 바이러스들로서, 이들 중에서도, 불활성화 시키기가 가장 어려운 바이러스들은 가장 작은 크기의 바이러스들임을 알고 있다. 이들 바이러스의 작은 크기는 작은 게놈과 관련되어 있기 때문에 이는 감마선 조사 및 대부분의 다른 방사선 형태들에도 사실임이 드러났다. 분자에 대한 방사선의 직접적인 효과의 크기는 분자의 크기에 직접 비례하는데, 표적 분자 클수록, 그 효과도 더 크다. 결과적으로, 바이러스 게놈이 더 작을수록, 상기 바이러스를 불활성화시키는데 필요로 하는 방사선량이 더 커짐을 감마선 조사로 알 수 있었다.
인간 및 동물 유도의 생물학적 물질 모두에 대한 관심 바이러스들 중에 가장 작고, 따라서 가장 불활성화 시키기가 어려운 바이러스는 파르보바이러스(Parvoviruses) 및 약간 더 큰 단백질 코팅된 간염바이러스 (Hepatitis virus)의 군에 속한다. 인간에서는, 파르보바이러스(B19)와 A형 간염이 관심 발생원이다. 돼지 유도된 물질에서, 가장 작은 해당 바이러스는 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvoviruses)이다. 이 바이러스는 인간에가 해가 없으므로, 인간 B19 바이러스에 대한 모델 바이러스로서 자주 선택된다. 이 모델 파르보바이러스의 불활성에 대한 검증은 사용된 방법이 B19 바이러스 및 A형 간염을 죽이는지, 및 확장하여, HIV, CMV, B형 간염과 C형 간염 및 다른 바이러스들과 같이 다소 강한 바이러스들을 또한 죽이는지에 대한 적절한 증거이다.
더 최근의 노력은 제품에 오염체를 제거하거나 불활성화시키기 위한 방법에 집중되고 있다. 이러한 방법들은 열처리, 여과(filtration) 및 제품에 대한 화학적 불활성제(inactivants)나 민감제(sensitizers)의 첨가를 포함한다.
미식품의약국의 현재 표준은 알부민 함유 제제의 열처리가 민감한 생물학적 물질에 손상을 끼칠 수 있는 대략 60℃에서 최소 10시간동안 가열되는 것을 요구한다. 실제로, 열 불활성은 소정의 생물학적 물질에 대한 생물학적 활성의 50%이상을 파괴시킬 수 있다.
여과는 물리적으로 오염체들을 제거하기 위해 제품을 여과하는 것을 포함한다. 불행하게도, 이 방법은 고분자량을 갖는 제품을 또한 제거할 수 있다. 또한, 어떤 경우에, 작은 바이러스들은 필터에 의하여 제거될 수 없다.
화학적 민감성 공정은 바이러스의 DNA/RNA에 결합하고 UV나 다른 방사선에 의하여 활성화되는 유독물질의 첨가를 포함한다. 이 방사선은 바이러스의 DNA/RNA에 결합하고, DNA/RNA의 백본에서 화학적 결합을 깨뜨리며, 또는 바이러스가 더 이상 복제할 수 없는 식으로 가교하거나 착화되는 반응성 중간물 및/또는 자유 라디칼을 생성한다. 결합되지 않은 민감제는, 돌연변이되거나 발암되지는 않더라도, 독성이 있고 환자에게 투여될 수 없기 때문에 민감제가 제품에서 세척되는 것을 이 공정은 필요로 한다.
제품을 감마선으로 조사하는 것은 제품을 살균하는 또 다른 방법이다. 감마선이 높은 총 선량으로 주어질 때 바이러스 및 박테리아들을 파괴하는데 효과적이다(케슬리 등(Keathly et al.), "Is There Life After Irradiation? Part 2," BioPharm July-August, 1993, 및 레이트만(Leitman), Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease," Transfusion Science 10:219-239 (1989)). 그러나, 이 영역에서 출간된 문헌은 감마선이 혈액, 혈액제품, 단백질 및 단백질 함유 제품과 같은 방사선 민감성 제품에 손상을 끼칠 수 있다고 밝히고 있다. 특히, 고방사선 선량이 적혈구, 혈소판 및 과립백혈구에 해로움을 보였다(레이트만). 미국특허 제4,620,908호는 단백질 제품의 생존성을 유지하기 위해 단백질 제품이 조사전에 동결되어야만 한다고 밝히고 있다. 이 특허는 "단백질 물질이, 예를 들어, 실온에 있으면서, 감마선 조사가 가해지면, 상기 물질은 또한 완전히 파괴될 것이다, 즉 물질의 활성이 실제적으로 무효하게 될 정도로 낮아지게 될 것이다"고 결론짓고 있다. 불행히도, 단클론 항체(monoclonal antibodies, Mab)와 같은 많은 민감성 생물학적 물질들은 조사용으로 동결된 후에 환자에 투여되기 전에 해동되면 생존성과 활성이 손실될 수 있다.
상술한 어려움으로 인해, 알부민 함유 제제에 대한 악영향없이 생물학적 오염체 또는 병원체들의 수준을 감소시키는데 효과적인 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 대한 필요가 있게된다.
따라서, 본 발명의 목적은 알부민 함유 제제에 불리하게 영향을 끼치지 않고 활성 생물학적 오염체 또는 병원체의 수준을 감소시킴으로써 알부민 함유제제를 살균하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적, 특성 및 잇점들은 아래의 바람직한 실시예에 대한 상세한 설명에 설정되어 있으며, 부분적으로는 명세서에서 명백해지거나 본 발명의 실시예에 의하여 알 수 있다. 본 발명의 이들 목적 및 이점들은 작성된 명세서 및 청구의 범위에서 구체적으로 지적한 조성물들 및 방법들에 의하여 알게되고 달성될 것이다.
이들 및 다른 목적들에 따르면, 본 발명의 제 1 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 적어도 하나의 안정제를 유효양으로 상기 알부민 함유 제제에 첨가하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 유효 수준까지 상기 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 유효 수준까지 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (ⅰ) 알부민 함유 제제에 (a) 상기 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키고, (b) 상기 알부민 함유 제제에 적어도 하나의 안정제를 첨가하며; 그리고 (c) 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화 공정을 적용하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 안정화 공정 및 조사율은 상기 방사선으로부터 상기 알부민 함유 제제를 보호하는데 함께 유효한 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (ⅰ) 알부민 함유 제제에 (a) 상기 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키고, (b) 상기 알부민 함유 제제에 적어도 하나의 안정제를 첨가하며; 그리고 (c) 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 안정화 공정을 적용하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 안정화 공정은 임의의 순서로 실행될 수 있으며 상기 방사선으로부터 상기 알부민 함유 제제를 보호하는데 함께 유효한 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 알부민을 함유하는 알부민 함유 제제와 방사선으로 살균한 다음에 장래의 사용을 위해 알부민 함유 제제를 보존하는데 유효한 양의 적어도 하나의 안정제를 포함하는 알부민 함유 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 잔여용매 함량이 방사선으로 살균한 다음에 장래의 사용을 위해 알부민 함유 제제를 보존하는데 유효한 수준으로 감소되는 알부민 함유 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 알부민을 함유하는 알부민 함유 제제와 잔여용매 함량을 감소시키는 적어도 하나의 안정제를 제공하고, 상기 안정제의 양과 상기 잔여용매 함량의 수준은 방사선으로 살균한 다음에 장래의 사용을 위해 알부민 함유 제제를 보존하는데 함께 유효하다.
본 발명은 또한 알부민 함유 제제의 총 단백질 농도가 방사선으로 살균한 다음에 장래의 사용을 위해 알부민 함유 제제를 보존하는데 유효한 알부민 함유 제제를 제공한다.
도 1A, 도 1B 및 도 1C는 잔여용매 함량의 수준을 가변하며 휘발성 안정제의 유무상태에서 조사된 혈장단백을 도시한 것이다.
도 2A 내지 도 2F는 스크래피 감염성(scrapie infectivity)에 대하여 조사되고 검사된 햄스터 적용 스크래피(균주 263K)로부터 10%의 뇌 균등질을 갖는 1:100으로 넣은(spiked) 휴먼 알부민(25%)을 도시한 것이다.
도 3A 및 도 3B는 10 또는 40kGy의 총선량으로 조사된 동결건조된 (5% 유로키나아제(urokinase)를 함유한) 알부민을 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 사전에 아르곤이 살포되거나 살포되지 않고 조사된 알부민 샘플들을 도시한 것이다.
도 5A 내지 도 5F는 18.1, 23 및 30.4kGy의 총선량으로 조사되고 응집 및 조 각에 대한 SDS-PAGE에 의하여 그리고 이합체화(dimerization) 및 중합화(polymerization)에 대한 HPLSEC에 의하여 검사된 알부민 용액(25%)의 샘플들을 도시한 것이다.
도 6A는 감마선으로 조사한 다음에 PPV-넣은(spiked) 혈장단백에서 바이러스 양의 감소를 도시한 그래프이다. 도 6B 및 도 6C는 조사된 혈장단백의 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한 겔들이다.
도 7은 알부민 함유 제제에서의 인자 Ⅷ와 감마선으로 조사한 다음에 인자 Ⅷ의 활성도를 도시한 그래프이다.
A. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 과학적 용어들은 당업자들이 일반적으로 알고 있는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 되어있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("한(a)", "한(an)" 및 "상기(the)")들은 문맥을 명확히 나타내지 않는 한 복수개의 인용을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "알부민 함유 제제"는 혈액 단백질 알부민인 원래의 시퀀스(sequence)와 변형된 시퀀스를 모두 갖는 재조합(recombinant) 및 트랜스제닉(transgenic) 알부민 또는 상기 알부민의 변이(varient)나 유도체를 포함하는 살아있는 장기로부터 도출되거나 얻은 임의의 제제를 말한다. 알부민 함유 제제의 대표적인 예로는 알부미나(Albuminar)®(센테온/아벤티스 베링사(社)(Centeon/Aventis Behring)), 부미네이트(Buminate)®(백스 터 라보라토리사(社)(Baxter Laboratories)), 플라스부민(Plasbumin)®(바이엘 바이오로지칼사(社)(Bayer Biological), 알부테인(Albutein)®(알파 테라튜틱사(社)(Alpha Therapeutic)), 알부민(인간)(이뮤노-유.에스.) (Albumin(Human)(Immuno-U.S.))와 알부마크(Albumarc)®(미국적십자사(社) (American Red Cross)), 및, 예를 들어, 플라스마-플렉스(Plasma-Plex)®(센테온/아벤티스 베링사(社)), 프로테네이트(Protenate)®(백스터 라보라토리사(社)), 플라스마네이트(Plasmanate)®(바이엘 바이오로지칼사(社)), 플라스메테인 (Plasmatein)®(알파 테라튜틱사(社))을 포함하는 혈장단백 제품을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "살균"은 본 발명에 따라 치료된 알부민 함유 제제에서 발견된 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체의 수준에서의 감소를 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 물질"은 살아있는 장기에서 도출되거나 얻은 임의의 물질을 말한다. 생물학적 물질의 대표적인 예들로 아래에 물질들을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 세포; 조직; 혈액 또는 혈액 조성물; 재조합 단백질과 트랜스제닉 단백질을 포함하는 단백질 및 단백질성 물질(proteinaceous materials); 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 알파-갈락토시다아제(alpha-galactosidase) 및 이듀로노데이트-2-설파타제 (iduronodate-2-sulfatase)와 같은 소화효소를 포함하는 효소; 단일 및 다중 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린(immunoglobulins) ; 식물성 제제(botanicals); 음식 등. 생물학적 물질의 바람직한 예로는 인대(ligaments); 힘줄(tendons); 신경; 탈회 골기질(demineralized bone matrix), 이식(grafts), 관절(joints), 대퇴골(femurs), 대퇴골두(femoral heads) 등을 포함하는 뼈; 치아; 피부 이식; 골수세포 현탁액(bone marrow cell suspensions)을 포함하는 전체 또는 처리된 골수(bone marrow); 심장판막(heart valves); 연골(cartilage); 각막(corneas); 동맥 및 정맥(arteries and veins); 심장, 간, 폐, 신장, 장(intestines), 췌장, 팔다리 및 손가락과 같은 이식을 위한 장기를 포함하는 장기; 지질(lipids); 탄수화물(carbohydrates); 천연성(native), 비섬유성(afibrillar), 아테로메릭(atelomeric), 가용성 및 불용성, 재조합 및 트랜스제닉, 본래의 시퀀스 및 변형된 시퀀스 모두를 포함하는 아교질(collagen); NO-카르복시 키토산(carboxy chitosan)(NOCC)을 포함하는 키틴(chitin) 및 그 유도체; 줄기 세포(stem cells), 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 이식에 대한 랑게르한스 세포(Langerhans cells)와 다른 세포의 섬(islet); 적혈구; 단핵구를 포함하는 백혈구; 및 혈소판(platelets)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어"생물학적 오염체 또는 병원체"는 알부민 함유제제와 직접 또는 간접적인 접촉시에, 알부민 함유제제에 또는 그 수취인에 해로운 영향을 끼칠 수 있는 생물학적 오염체 또는 병원체를 말한다. 이러한 다른 생물학적 오염체 또는 병원체는 일반적으로 알부민 함유 제제내에서 발견되거나 알부민 함유 제제를 감염시키는 당업자에게 공지된 다양한 바이러스, 박테리아(미코플라스마, 우레아플라스마, 나노박테라아, 클라미디아, 리켓챠와 같은 세포내 및 세포간 박테리아를 포함), 효모, 곰팡이(molds), 진균(fungi), 프리온(prions) 또는, 단독으로나 조합으로, TSEs의 원인이 되는 유사발생원 및/또는 단세포 기생충이나 다세포 기생충을 포함한다. 다른 생물학적 오염체 또는 병원체들의 예로는 인간 면역결핍 바이러스와 다른 레트로바이러스(retroviruses), 헤르페스 바이러스(herpes viruses), 필로바이러스(filoviruses), 씨로코바이러스(circoviruses), 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 씨토메갈로바이러스(cytomegaloviruses), 간염바이러스(A형, B형 및 C형 간염과 그 변이), 폭스바이러스(pox viruses), 토가바이러스(toga viruses), 엡스타인-바 바이러스(Ebstein-Barr viruses) 및 파르보바이러스(parvoviruses)와 같은 바이러스; 대장균(Escherichia), 바씰루스(Bacillus), 캄필로박터(Campylobacter), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 포도상구균(Staphalococcus)과 같은 박테리아; 나노박테리아(nanobacteria); 말라리아원충종(Plasmodium species)을 포함하는 파동편모충(Trypanosoma) 및 말라리아 기생충(malarial parasites)과 같은 기생충; 효모; 곰팡이; 진균; 미코플라스마 및 우레아플라스마; 클라미디아; 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)와 같은 리켓챠; 및 스크래피(scrapie), 전염성 밍크 뇌병증(transmissible mink encephalopathy), (일반적으로 뮬사슴(mule deer)과 엘크(elk)에서 관찰되는) 만성소모성질환(chronic wasting disease), 고양이 해면상뇌증(feline spongiform encephalopathy), 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy)(광우병), 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeld-Jakob disease)(변이 CJD 포함), 가족성 불면증(Fatal Familial Insomnia), 저스만 스트라우슬러 쉥크병(Gerstmann-Straeussler-Scheinker syndrome), 구루(kuru)병 및 알퍼스 증후군(Alpers syndrome)과 같은 포유동물에서의 전염성 해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathies , TSEs)으로 잘 알려진 하나 이상의 질병상태의 원인이 되는 유사한 발생원과 프리온을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성 생물학적 오염체 또는 병원체"는 알부민 함유제제에 및/또는 그 수취인에, 2차 생물학적 오염체 또는 병원체 또는 원래의 단백질(야생형 또는 돌연변이) 또는 항체와 같은, 단독으로 또는 서로 다른 인자와 조합으로, 해로운 영향을 야기할 수 있는 생물학적 오염체 또는 병원체를 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈액 구성성분"은 전혈(whole blood)과 구별될 수 있으며, 적혈구, 백혈구 및 혈소판(platelets)과 같은 세포혈액 구성성분; 혈액응고인자, 효소, 알부민, 플라스미노겐(plasminogen), 피브리노겐(fibrinogen) 및 면역글로불린(immunoglobulins)과 같은 혈액 단백질; 및 혈장(plasma), 혈장단백(plasma protein fraction, PPF), 냉동침강물(cryoprecipitate), 혈장분획제제(plasma fractions) 및 혈장함유 조성물(plasma-containing compositions)과 같은 액체 혈액 구성성분을 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 이상의 구성성분을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 혈액 구성성분"은 적혈구, 백혈구, 줄기세포 및 혈소판과 같은 세포들을 포함하는 전혈에 대한 하나 이상의 구성성분을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈액 단백질"은 전혈에서 일반적으 로 발견되는 하나 이상의 단백질을 말한다. 인간을 포함하는 포유동물에서 발견되는 혈액 단백질의 실예들로는, 인자 VII 및 인자 IX와 같은 비타민 K-의존성 그리고 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrands factor)와 같은 비타민 K-비의존성(non-vitamin K-dependent) 모두의 응고 단백질(coagulation proteins); 알부민; 고밀도 지질단백질(lipoproteins)과 저밀도 지질단백질을 포함하는 지질단백질; 보체 단백질(complement proteins); 면역글로불린(IgA, IgM, IgG 및 IgE)과 같은 글로불린 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 혈액 단백질의 바람직한 그룹으로는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈(prothrombin)), 인자 III (조직인자), 인자 V (프로악셀레린(proaccelerin)), 인자 VI (악셀레린(accelerin)), 인자 VII (프로콘베르틴(proconvertin), 혈청 프로트롬빈 전환(serum prothrombin conversion)), 인자 VIII (항혈우병 요소(antihemophiliac factor) A), 인자 IX (항혈우병 요소 B), 인자 X (스튜어트-프로워 인자(Stuart-Prower factor)), 인자 XI (혈장 트롬보플라스틴 선행물(plasma thromboplastin antecedent)), 인자 XII (하게만 인자(Hageman factor)), 인자 XIII (프로트랜스글루타미다제(protransglutamidase)), 폰 빌레브란드 인자(von Willebrands factor, vWF), 인자 Ia, 인자 IIa, 인자 IIIa, 인자 Va, 인자 VIa, 인자 VIIa, 인자 VIIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa 및 인자 XIIIa를 포함한다. 혈액 단백질의 또 다른 바람직한 그룹으로는 헤모글로빈 및 여러 성장인자와 같은 적혈구내에서 발견되는 단백질과 이들 단백질의 유도체를 포함한다. 혈액 단백질의 또 다른 바람직한 그룹으로는 플라스마-플렉스(Plasma-Plex)®(센테온/아벤티스 베링사(社)), 프로테네이트(Protenate)®(백스터 라보라토리사(社)), 플라스마네이트(Plasmanate)®(바이엘 바이오로지칼사(社)), 플라스메테인(Plasmatein)®(알파 테라튜틱사(社))와 같은 상용으로 구매가능한 혈장단백 제품에서 발견되는 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "액체 혈액 구성성분"은 혈장(응고전에 발견되는 인간 및 동물의 비세포 부분인 체액) 및 혈청(응고후에 발견되는 인간 및 동물의 전혈의 비세포 부분인 체액)과 같은 전혈의 비세포 구성성분인 하나 이상의 체액을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적으로 호환가능한 용액(compatible solution)"은 알부민 함유 제제가 용액내에서 현탁되거나 용해됨으로 해서 노출되고, 생존을 유지하는, 즉, 본래의 생물학적 및 병리학적 특징을 보유하는 용액을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적으로 호환가능한 버퍼용액(buffered solution)"은 용액내에 물질(들)의 무결성을 유지하는데 적합한 pH 및 삼투압 성질(osmotic properties)(예를 들어, 긴장성(tonicity), 몰랄삼투압(osmolality) 및/또는 삼투압(oncotic pressure))을 갖는 생물학적으로 호환가능한 용액을 말한다. 적합한 생물학적으로 호환가능한 용액은 일반적으로 pH가 4 내지 8.5이며 등장성(isotonic)이거나 단지 적당히 저장성(hypotonic)또는 고장성(hypertonic)이다. 생물학적으로 호환가능한 버퍼용액은 공지되어 있고 당업 자들에게 용이하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정제(stabilizer)"는 물질의 안정적이고 효과적인 사용을 하도록 충분한 수준으로 조사된 알부민 함유 제제에 대한 손상을 줄이는 화합물이나 물질을 말한다. 안정제의 실예들로는 항산화제(antioxidants); 스핀 트랩(spin traps)을 포함하는 자유라디칼 제거제(free radical scavengers); 조합 안정제, 즉, I 형 및 II 형 광동역학적 반응(photodynamic reactions) 모두를 억제하는데 효과적인 안정제; 및 결합되는 분자를 안정화시키는 헤파린(heparin)과 같은 리간드(ligands)를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 안정제의 바람직한 예들로는 에탄올; 아세톤; 6,8-디메르캅토(dimercapto)-옥탄산(octanoic acid) (리포산(lipoic acid))과 그 유도체 및 (알파(alpha), 베타(beta), 디하이드로(dihydro), 비스노(bisno) 및 테트라놀(tetranor) 리포산) 유사체를 포함하는 지방산(fatty acids), 치옥트산(thioctic acid), 6,8-디메르캅토-옥탄산, 디하이드로로포에이트(dihydrolopoate) (DL-6,8-디티올옥탄산 메틸 에스터(DL-6,8-dithioloctanoic acid methyl ester)), 리포아미드(lipoamide), 비소놀 메틸 에스터(bisonor methyl ester)와 타트라놀-디하이드리포산(tatranor-dihydrolipoic acid), 퓨란 지방산(furan fatty acids), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic aicd) 및 팔미틴산(palmitic acids) 및 이들의 염과 그 유도체; 후라보노이드(flavonoids), 페닐프로파니오드(phenylpropaniods), 및 퀘르세틴(quercetin)과 같은 후라보놀(flavenols), 루틴(rutin) 및 그 유도체, 아피게닌(apigenin), 아미노후라본(aminoflavone), 카테킨(catechin), 헤스페리딘(hesperidin) 및, 나린긴(naringin); 베타-카로틴(beta-carotene)을 포함하는 카로틴(carotenes); Co-Q10; 크산토필(xanthophylls); 글리세롤(glycerol), 만니톨(mannitol)과 같은 폴리하이드릭 알콜(polyhydric alcohols); 크실로오스(xylose), 글루코스(glucose), 리보스(ribose), 만노스(mannose), 과당(fructose) 및 트레할로스(trehalose)와 같은 설탕(sugars); 히스티딘(histidine), N-아세틸시스테인(acetylcysteine) (NAC), 글루탐산(glutamic acid), 트립토판(tryptophan), 소듐 카프릴레이트(sodium caprylate), N-아세틸 트립토판(acetyl tryptophan)과 메티오닌(methionine)과 같은 아미노산 및 그 유도체; 소듐 아지드(sodium azide)와 같은 아지드(azides); 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide Dismutase, SOD) 및 카탈라제(Catalase)와 같은 효소; 1,3-디메틸요산(dimethyluric acid) 및 디메틸시오유레아(dimethylthiourea)와 같은 요산(uric acid) 및 그 유도체; 알로퓨리놀(allopurinol); 글루타티온(glutathione) 및 환원된 글루타티온 및 시스테인(cysteine)과 같은 티올(thiols); 셀레늄(selenium)과 같은 미량원소(trace elements); 비타민 A, 비타민 C(그 비타민 유도체와 소듐 아스코르베이트(sodium ascorbate)와 같은 염 및 팔미토일 아스코르브산(palmitoyl ascorbic acid) 포함) 및 비타민 E(및 그 유도체와 토코페롤 아세테이트(tocopherol acetate) 및 알파-토코트리에놀(alpha-tocotrienol)과 같은 염)와 같은 비타민들; 크로마놀-알파-C6(chromanol-alpha-C6); 6-하이도록시(hydroxy)-2,5,7,8-테트라메틸크로마(tetramethylchroma)-2 카르복실산(carboxylic acid) (트로록스(Trolox)) 및 유도체; 젤라틴(gelatin) 및 알부민과 같은 외인성 단백질(extraneous proteins); 트리스(tris)-3-메틸(methyl)-1-페닐(phenyl)-2-피라졸린(pyrazolin)-5-원(one)(MCI-186); 시티올론(citiolone); 퓨에르세틴(puercetin); 크리신(chrysin); 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) (DMSO); 피페라진 디에탄설폰산(piperazine diethanesulfonic acid, PIPES); 이미다졸(imidazole); 메톡시솔라렌(methoxypsoralen, MOPS); 1,2-디시안(dithiane)-4,5-디올(diol); 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA) 및 부틸 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT)과 같은 환원 물질; 콜레스테롤(cholesterol); 프로뷰콜(probucol); 인돌 유도체(indole derivatives); 티메로잘(thimerosal); 라자로이드(lazaroid) 및 트릴라자드 메실레이트(tirilazad mesylate); 프로안테놀(proanthenols); 프로안소시아니딘(proanthocyanidins); 황산 암모늄(ammonium sulfate); 페골고타인(Pegorgotein) (PEG-SOD); N-테르트-부틸-알파-페닐니트론(N-tert-butyl-alpha-phenylnitrone, PBN); 4-하이드록시(hydroxy)-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 (tetramethylpiperidin)-1-옥실(oxyl) (Tempol); 아스코르베이트(ascorbate), 유레이트(urate) 및 트로록스(Trolox) C (Asc/urate/Trolox C)의 혼합물; 각 아미노산이 D나 L 형태일 수 있는 글리실글리신(glycylglycine) 및 카노신(carnosine)과 같은 단백질과 펩티드; 디소민(diosmin); 퓨퓨로갈린(pupurogalin); 프로필 갈레이트(propyl gallate), 소듐 포름알데히드 설폭시레이트(sodium formaldehyde sulfoxylate)와 실리마린(silymarin)을 포함하나 이에 국한되지 않는 갈릭산(gallic acid) 및 그 유도체를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특히 바람직한 예들로는 I형 및 II형 광동역학적 반응 모두를 억제하는데 유효한 하나의 안정제 또는 안정제들의 조합 및 가스로서 사용되거나 및 증발, 저압 및 유사한 방법에 의하여 용이하게 제거될 수 있는 휘발성 안정제를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "잔여용매 함량"은 알부민 함유 제제에 자유롭게 이용가능한 액체의 양 또는 비율을 말한다. 자유롭게 이용가능한 액체란 알부민 함유 제제의 하나 이상의 비액체 구성성분에 결합되지 않거나 착화되지 않는 살균된 알부민 함유 제제에 있는 물 또는 유기용매(예를 들어, 에탄올, 이소프로파놀(isopropanol), 아세톤, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 액체를 말한다. 자유롭게 이용가능한 액체는 세포사이의 물을 포함한다. 본 명세서에서 인용된 물과 관련된 잔여용매 함량은 미식품의약국(FDA)이 승인한, 변형된 칼 피셔방법(Karl Fischer method) (메이어 및 보이드(Meyer and Boyd), Analytical Chem., 31:215-219, 1959; 메이 등(May et al.), J. Biol. Standardization, 10:249-259, 1982; Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No. 89D-0140, 83-93; 1990) 또는 근적외 분광분석법(near infrared spectroscopy)에 의하여 결정된 수준을 말한다. 다른 용매들의 잔여수준의 양은 어떤 용매가 사용되는 가에 따라 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 수단에 의하여 정해질 수 있다. 잔여용매 대 용질의 비는 용매내에 용질의 농도를 반영한 것으로 또한 고려될 수 있다. 이렇게 표현될 때, 용질의 농도가 더 클수록, 잔여용매의 양은 더 줄어든다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "민감제(sensitizer)"는 바이러스, 박테리아, 프리온 및/또는 기생충 오염체를 선택적으로 표적으로 하고, 방사선에 의하여 상기 오염체들이 불활성에 더 민감하게 하여, 민감제가 없는 상태에서 보다 방사선의 더 낮은 선율 또는 선량의 사용 및/또는 방사선의 더 짧은 조사시간을 허용하게 하는 물질을 의미한다. 적절한 민감제의 실예들로는 솔라렌(psoralen)과 그 유도체 및 유사체(3-카보에톡시 솔라렌(carboethoxy psoralens) 포함); 인액틴(inactines)과 그 유도체 및 유사체; 할로겐 치환체(halogen substituent) 및 제 4 차 암모늄 이온(quaternary ammonium ion) 또는 포스포늄 이온(phosphonium ion)과 같은 물 용해 부분(water solubilization moiety)을 포함하는 안젤리신(angelicins), 켈린(khellins) 및 쿠마린(coumarins); 핵산 결합 화합물; 브롬화된 헤마토포르피린(brominated hematoporphyrin); 프탈로시아닌(phthalocyanines); 퓨퓨린(purpurins); 포르포린(porphorins); 디헤마토포르피린 에스터(dihematoporphyrin ester)의 할로겐화된 또는 금속 원자치환된 유도체, 헤마토포르피린 유도체, 벤조포르피린 유도체(benzoporphyrin derivatives), 하이드로디벤조포르피린 디말레이아미드(hydrodibenzoporphyrin dimaleimade), 하이드로디벤조포르피린(hydrodibenzoporphyrin), 디시아노 디설폰(dicyano disulfone), 테트라카베톡시(tetracarbethoxy) 하이드로디벤조포르피린, 및 테트라카베톡시 하이드로디벤조포르피린 디말레이아미드; 할로겐 또는 금속 원자로 변형될 수 있는 독소루비신(doxorubicin) 및 다우노마이신(daunomycin); 네트롭신(netropsin); BD 펩티드, S2 펩티드; S-303 (ALE 화합물); 하이페리신(hypericin), 메틸렌 블루(methylene blue), 에오신(eosin), 플루오레세인(fluoresceins) (및 그 유도체), 플라빈(flavins), 메로시아닌(merocyanine) 540과 같은 염료(dyes); 베르갑텐(bergapten)과 같은 광활성 화합물(photoactive compounds); 및 SE 펩티드를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 프리온에 결합됨으로써, 방사선에 의한 불활성에 대하여 민감도를 증가시키는 원자들이 또한 사용될 수 있다. 이러한 원자의 실예들로는 프리온 단백질에 결합하고, 상기 프리온 단백질에서의 다른 원자들보다 Z 번호 더 높아서, 상기 프리온 단백질이 조사, 특히 감마선 조사동안 에너지를 흡수할 확률을 증가시키는 구리이온일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어"단백질성 물질(proteinaceous material)"은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 살아있는 유기체로부터 도출되거나 얻은 임의의 재료를 말한다. 단백질성 물질은 원래의 상태에서나 다음의 공정/정화 및/또는 유도에서 자연적으로 발생된 물질이거나, 화학적 합성이나 재조합/트랜스제닉 기술에 의하여 생산되고, 선택적으로, 가공/정화 및/또는 유도된 인위적으로 생산된 물질일 수 있다. 단백질성 물질의 실예로는 세포배양으로부터 생산된 단백질 또는 펩티드; 우유 및 다른 유제품, 복수(ascites); 호르몬(hormones); 성장인자(growth factors); 헤파린 및 인슐린 또는 식물성분에서 추출되거나 격리된 약제를 포함하는 물질; 신선한, 동결된 및 동결건조된 혈장과 혈장단백(plasma protein fraction); 피브리노겐 및 그 유도체, 피브린(fibrin), 피브린 I, 피브린 II, 용해성 피브린 및 피브린 단량체(fibrin monomer), 및/또는 피브린 실란트 제품(fibrin sealant products); 전혈(whole blood); 단백질 C; 단백질 S; 알파-1 항트립신(anti-trypsin) (알파-1 프로테아제 억제제(protease inhibitor)); 부틸-콜린에스테라제(butyl-cholinesterase); 쿠마린 약물(와파린(warfarin))과 같은 항응고제(anticoagulants); 스트렙토키나제(streptokinase); 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator, tPA); 적혈구생성인자(erythropoietin, EPO); 유로키나제(urokinase); 뉴포젠(neupogen); 항-트롬빈-3(anti-thrombin-3); 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase); (태아) 소혈청(bovine serum)/말혈청(horse serum); 고기(meat); 항혈청(anti-sera), 단클론 항체(monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal antibodies) 및 유전적으로 조작되거나 생산된 항체를 포함하는 면역글로불린(immunoglobulins); 알부민; 알파-글로불린(alpha-globulins); 베타-글로불린; 감마-글로불린; 응고 단백질(coagulation proteins); 보체 단백질(complement proteins); 및 인터페론(interferons)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어"방사선(radiation)"은 조사된 알부민 함유 제제의 적어도 일부 구성성분을 살균하기에 충분한 에너지의 복사를 말한다. 방사선의 종류는 (ⅰ) 소립자(중성자, 전자 및/또는 양성자와 같은 아원자 입자의 광선); (ⅱ) 전자기파(무선파, 가시광선(단색 및 다색 모두) 및 비가시광선, 적외선, 자외선, x-선 및 감마선과 그 혼합); 및 (ⅲ) 음파 및 압력파를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 이러한 방사선은 종종 감마선과 같은 (조사된 물질에서 이온을 산출할 수 있는) 이온화 방사선, 및 가시광선과 같은 비이온화 방사선으로서 기술된다. 이러한 방사선의 소스(sources)는 변할 수 있으며, 일반적으로, 특정 방사선 소스의 선택은 충분한 방사선이 살균에 유효한 적절한 시간 및 적절한 비율로 주어진다면 중요하지 않다. 실제로, 감마선은 주로 코발트나 세슘의 동위원소에 의하여 산출되나, UV와 X-레이는 각각 UV 및 X선을 방출하는 기기에 의하여 산출되며, 전자들이 기기를 통한 전자의 생산과 관계되는 "E빔" 조사로 알려진 방법으로 종종 물질들을 살균하는데 사용된다. 단색 및 다색 모두의 가시광선은 기기에 의하여 산출되고, 실제로, 동일한 기기나 다른 기기에 의하여 산출되는 적외선 및 자외선(UV)과 같은 비가시 광선과 조합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어"보호하다"는 조사를 한 다음에 물질의 안전하고 효과적인 사용을 하기 위해 충분한 수준으로, 그렇지 않은 경우에는 상기 물질의 조사로 인해 초래될 수 있는, 조사되는 알부민 함유 제제에 대한 어떤 손상을 줄이는 것을 말한다. 다르게 말하면, 물질이나 공정은 상기 물질이 있거나 상기 공정을 실행함으로써 상기 물질이나 공정이 없는 상태에서 보다 조사로 인하여 물질에 손상을 덜하게 한다면 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 "보호한다". 따라서, 알부민 함유 제제는 재료를 "보호하는" 물질 또는 잇따른 공정이 있는 상태에서 조사 후에 안전하고 효과적으로 사용될 수 있으나, 물질이 없거나 상기 공정을 실행하지 않는 상태에서는 동일한 조건하에서 조사한 후에 안전하고 효과적으로 사용될 수 없다.
B. 상세한 바람직한 실시예
본 발명의 제 1 바람직한 실시예는 물질을 살균하기 위한 유효시간동안 상기 물질을 살균하고 방사선으로부터 상기 물질을 보호하기 위한 유효율의 방사선으로 상기 알부민 함유 제제를 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 적어도 하나의 안정제를 유효양으로 상기 알부민 함유 제제에 첨가하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 유효 수준까지 상기 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 (ⅰ) 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 유효 수준까지 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하는 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 (ⅰ) 알부민 함유 제제에 (a) 상기 알 부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키고, (b) 상기 알부민 함유 제제에 적어도 하나의 안정제를 첨가하며; 그리고 (c) 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화 공정을 적용하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 안정화 공정 및 조사율은 상기 방사선으로부터 상기 알부민 함유 제제를 보호하는데 함께 유효한 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 (ⅰ) 알부민 함유 제제에 (a) 상기 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소시키고, (b) 상기 알부민 함유 제제에 적어도 하나의 안정제를 첨가하며; 그리고 (c) 상기 알부민 함유 제제의 온도를 감소시키는 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 안정화 공정을 적용하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 알부민 함유 제제를 살균하기 위해 유효시간동안 유효율로 방사선을 상기 알부민 함유 제제에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 안정화 공정은 임의의 순서로 실행될 수 있으며 방사선으로부터 상기 알부민 함유 제제를 보호하는데 함께 유효한 방사선에 민감한 알부민 함유 제제를 살균하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 소정의 방법에 따르면, 안정제가 방사선으로 알부민 함유 제제를 조사하기 전에 첨가된다. 이 안정제는 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하는데 유효한 양으로 상기 알부민 함유 제제에 바람직하게 첨가된다. 안정제의 적절한 양은, 사용되는 특정 안정제 및/또는 조사되는 특정 알부민 함유 제제의 성질 및 특징 및/또는 장래의 사용과 같은, 사용되는 본 발명의 특정 방법의 소정의 특성에 따라 변할 수 있으며, 당업자가 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 소정의 방법에 따르면, 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량은 방사선으로 알부민 함유 제제의 조사전에 감소된다. 잔여용매 함량은 방사선으로부터 알부민 함유 제제를 보호하는데 유효한 수준으로 바람직하게 감소된다. 잔여용매 함량의 적절한 수준은 조사되는 특정 알부민 함유 제제의 성질 및 특징 및/또는 장래의 사용과 같은, 사용되는 본 발명의 특정 방법의 소정의 특성에 따라 변할 수 있으며, 당업자가 경험적으로 결정할 수 있다. 특정한 값보다는 특정한 범위내로 잔여용매 함량을 유지하는 것이 바람직한 알부민 함유 제제가 있을 수 있다.
용매가 물이면, 특히 하나 이상의 소화효소로 된 제제가 고체상태로 있으면, 잔여용매 함량은 일반적으로 15% 미만, 대표적으로는 약 10% 미만, 더 대표적으로는 약 9% 미만, 가장 대표적으로는 약 8% 미만, 바람직하게는 약 3.0% 미만, 더 바람직하게는 약 2.0%미만, 더욱더 바람직하게는 약 1.0% 미만, 더욱더 바람직하게는 약 0.5% 미만, 더욱더 바람직하게는 약 0.2% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.08%미만이다.
용매는 바람직하게는 비수용성 용매, 더 바람직하게는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있는 비수용성 용매, 및 가장 바람직하게는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있고, 조사시에 라디칼을 형성하는 경향이 있는 용해되는 산소나 다른 가스(들)를 전혀 또는 거의 가지지 않는 비수용성 용매이다. 휘발성 비수용성 용매들이 특히 바람직하고, 더욱더 바람직하기로 휘발성 비수용성 용매는 에탄올 및 아세톤과 같은 안정제인 비수용성 용매이다.
본 발명의 소정의 실시예에서, 용매는 물과 비수용성 용매나 에탄올 및/또는 아세톤과 같은 용매의 혼합물일 수 있다. 이러한 실시예에서, 비수용성 용매는 바람직하게는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있는 비수용성 용매이며, 가장 바람직하게는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있고 조사시에 자유 라디칼을 형성하는 경향이 있는 용해되는 산소나 다른 가스(들)를 전혀 또는 거의 가지지 않는 비수용성 용매이다. 휘발성 비수용성 용매들이 특히 바람직하고, 더욱더 바람직하기로 휘발성 비수용성 용매는 에탄올 및 아세톤과 같은 안정제인 비수용성 용매이다.
바람직한 실시예에서, 잔여용매가 물이면, 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량은 물에 용해될 수 있는 비수용성 용매에서의 알부민 함유 제제를 용해시키거나 현탁시킴으로써 감소된다. 바람직하게, 이러한 비수용성 용매는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있는 비수용성 용매이며, 가장 바람직하게는 조사시에 자유 라디칼을 형성하지 않는 경향이 있고 조사시에 자유 라디칼을 형성하는 경향이 있는 용해되는 산소나 다른 가스(들)를 전혀 또는 거의 가지지 않는다.
알부민 함유 제제가 액체상태이면, 잔여용매 함량의 감소는 용질 농도를 증가시키는 등의 어떤 여러가지 수단에 의하여 수행될 수 있다. 이런 식으로, 용매에 용해된 알부민 함유 제제에서 단백질의 농도는 일반적으로 적어도 약 0.5%, 대표적으로는 적어도 약 1%, 대개는 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 더 바람직하게는 적어도 약 15%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 25%, 가장 바람직하게는 적어도 약 50%로 증가될 수 있다.
본 발명의 소정의 실시예에서, 특정 알부민 함유 제제의 잔여용매 함량은 특정지점에서 보다는 범위내에 놓이는 것으로 발견될 수 있다. 특정 알부민 함유 제제의 바람직한 잔여용매 함량의 이러한 범위는 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
어떤 동작 이론에 속박되기를 바라지는 않지만, 잔여용매 함량에서의 감소는 알부민 함유 제제의 자유도를 감소시키고, 자유 라디칼 생성에 대한 표적 수를 감소시키며, 이들 자유 라디칼의 용해도를 제한시킬 수 있다. 따라서 유사한 결과들은 공융점(eutectic point) 아래로 또는 응결점 아래로 알부민 함유 제제의 온도를 낮춤으로써, 또는 마찬가지로 알부민 함유 제제의 자유도를 감소시키는 유리화에 의하여 달성될 수 있다. 이들 결과들은 그렇지 않는 경우에 허용될 수 있는 것보다 더 높은 방사선율 및/또는 방사선량의 사용을 허용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명한 방법들은 알부민 함유 제제에 허용될 수 없는 손상, 즉 알부민 함유 제제의 안전하고 유효한 사용을 하지 못하게 하는 손상을 생기게 하지 않는 임의의 온도에서 실행될 수 있다. 바람직하기로, 본 명세서에서 설명한 방법들은 조사되는 알부민 함유 제제의 공융점 또는 응결점 아래와 같이, 실온에서 또는 실온보다 아래에서 실행된다.
본 발명의 방법에 따르면, 손상의 "허용가능한 수준"은, 특정 알부민 함유 제제의 성질 및 특징 및/또는 사용되는 다이펩티드 안정제, 및/또는 조사되는 알부민 함유 제제의 장래 사용과 같이, 사용되는 본 발명의 특정 방법(들)의 소정의 특 징들에 따라 변할 수 있으며, 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다. 따라서 손상의 "허용될 수 없는 수준"은 살균되는 알부민 함유 제제의 안전하고 효과적인 사용을 하지 못하게 하는 수준의 손상일 수 있다. 주어진 알부민 함유 제제에서 손상의 특정 수준은 당업자에게 알려져 있는 어떤 방법 및 기술들을 이용하여 결정될 수 있다.
알부민 함유 제제의 잔여용매 함량은 알부민 함유 제제에 허용될 수 없는 수준의 손상을 야기함이 없이 알부민 함유 제제로부터 용매를 줄이는 당업자에게 알려진 어떤 방법 및 기술들에 의하여 감소될 수 있다. 이러한 방법들로는 증발, 농축, 원심분리 농축, 유리화(vitrification) 및 분무건조(spray-drying)를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소하기 위한 특히 바람직한 방법은 동결건조(lyophilization)이다.
알부민 함유 제제의 잔여용매 함량을 감소하기 위한 또 다른 특히 바람직한 방법은 유리화로서, 알부민 함유 제제의 공융점을 올리기 위해 용질의 추가 또는 설탕(sucrose)과 같은 용질을 추가한 다음에 물과 같은 잔여용매를 제거하기 위해 알부민 함유 제제에 점진적인 감압을 가하는 것을 포함하는, 당업자에게 알려져 있는 어떤 방법 및 기술들을 이용하여 수행될 수 있다. 그런 후 결과적으로 생성된 유리질 물질은 감소된 잔여용매 함량을 갖게 될 것이다.
본 발명의 소정의 방법에 따르면, 살균되는 알부민 함유 제제는 당업자에게 알려져 있고 이용가능한 어떤 수단에 의하여 고체표면상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 살균되는 알부민 함유 제제는 생물학적 또는 비생물학적 기판상에 코팅 또는 표면으로서 있을 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 방사선은 처리되는 알부민 함유 제제의 살균을 위한 임의의 유효 방사선일 수 있다. 방사선은 E-빔 방사선을 포함하는 소립자일 수 있다. 바람직하게 방사선은 x-레이, 적외선, 가시광선, UV광선 및 여러 전자기 복사 파장의 합성을 포함하는 전자기 방사선일 수 있다. 특히 바람직한 방사선의 형태는 감마선이다.
본 발명의 방법에 따르면, 알부민 함유 제제는, 물질에 허용될 수 없는 수준의 손상을 야기하지 않으면서, 알부민 함유 제제의 살균을 위해 유효율의 방사선으로 조사된다. 적절한 조사율은, 조사되는 특정 알부민 함유 제제의 성질과 특징, 관여되는 방사선의 특정 형태 및/또는 불활성되는 특정 생물학적 오염체 또는 병원체와 같이, 사용되는 본 발명의 소정의 특정 방법에 따라 변할 수 있다. 적절한 조사율은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다. 바람직하기로, 조사율은 살균 과정의 시간동안 일정하다. 이것이 비실용적이거나 그렇지 않고 필요가 없다면, 가변적이거나 불연속적인 조사를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 조사율은 제품의 회복과 동작을 완성하는데 필요로 하는 시간의 가장 유리한 조합을 산출하도록 최적화될 수 있다. 저선율(≤3kGy/hr) 및 고선율(≥3kGy/hr) 모두가 이러한 결과를 달성하기 위해 본 명세서에서 설명된 방법에 이용될 수 있다. 조사율은 바람직하게 알부민 함유 제제를 살균하면서 알부민 함유 제제의 회복을 최적화하도록 선택될 수 있다. 조사율을 감소시키는 것은 알부민 함유 제제에 대한 손상을 줄이도록 할 수 있으나, 특별히 요망하는 총 선량을 달성하는데 필요로 하는 조사시간이 또한 더 길어지게 될 것이다. 따라서 고선율이, 물류 문제(logistical issue) 및 비용을 최소화하기 위한 것과 같이, 어떤 상황에서는 바람직할 수 있으며, 조사로부터 알부민 함유 제제를 보호하기 위해 본 명세서에서 설명된 방법에 따라 사용될 때 가능해 질 수 있다.
특히 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 조사율은 많아야 약 3.0kGy/hr, 더 바람직하게는 약 0.1kGy/hr 내지 약 3.0kGy/hr사이, 더욱 바람직하게는 약 0.25kGy/hr 내지 약 2.0kGy/hr사이, 더욱더 바람직하게는 약 0.5kGy/hr 내지 약 1.5kGy/hr사이, 가장 바람직하게는 약 0.5kGy/hr 내지 약 1.0kGy/hr사이이다.
특히 본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 조사율은 적어도 약 3.0kGy/hr, 더 바람직하게는 적어도 약 6kGy/hr, 더욱 바람직하게는 적어도 약 16kGy/hr, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 30kGy/hr, 가장 바람직하게는 적어도 약 45kGy/hr이다.
본 발명의 방법에 따르면, 살균되는 알부민 함유 제제는 알부민 함유 제제의 살균을 위한 유효시간동안 방사선으로 조사된다. 조사율과 조합되는, 적절한 조사시간은 알부민 함유 제제에 가해지는 적절한 조사선량이다. 적절한 조사시간은 방사선의 특정 형태 및 관여되는 방사선율 및/또는 조사되는 특정 알부민 함유 제제의 성질 및 특징에 따라 변할 수 있다. 적절한 조사 시간은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 살균되는 알부민 함유 제제는 물질에 대한 허용될 수 없는 수준의 손상을 야기하지 않으면서, 알부민 함유 제제의 살균에 유효한 총선량까지 방사선으로 조사된다. 적절한 방사선의 총 선량은 조사되는 특정 알부민 함유 제제의 성질 및 특징, 관여되는 방사선의 특정 형태 및/또는 불활성되는 특정 생물학적 오염체 또는 병원체와 같이 사용되는 본 발명의 방법에 대한 소정의 특징들에 따라 변할 수 있다. 적절한 방사선의 총 선량은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다. 바람직하게, 방사선의 총 선량은 적어도 25kGy, 더 바람직하게는 적어도 45kGy, 더욱 바람직하게는 적어도 75kGy, 더욱더 바람직하게는 적어도 100kGy 이상, 예를 들어 150kGy 또는 200kGy 이상이다.
두께와 방사선 소스으로부터의 거리와 같이, 조사되는 알부민 함유 제제의 특정한 기하학적 배열은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 소정의 방법에 따르면, 적어도 하나의 민감성 화합물의 유효량이 , 예를 들어, 알부민 함유 제제에 있는 생물학적 오염체(들) 또는 병원체(들)에 대한 조사의 효과를 강화시키는 반면에, 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 알부민 함유 제제에 대한 조사의 해로운 영향을 최소하기 위해, 조사전에 알부민 함유 제제에 선택적으로 첨가될 수 있다. 적절한 민감제(sensitizers)들은 당업자에게 알려져 있으며, 솔라렌(psoralens)과 그 유도체 및 인액틴(inactines)과 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 알부민 함유 제제에 대한 조사는 살균되는 알부민 함유 제제에 해가 되지 않는 어떤 온도에서 발생될 수 있다. 한 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 실온에서 조사된다. 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 감소된 온도에서, 즉, 0℃, -20℃, -40℃, -60℃, -78℃ 또는 -196℃와 같은, 실온보다 낮은 온도에서 조사된다. 본 발명의 이러한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 바람직하게 알부민 함유 제제의 응결점이나 공융점에서 또는 응결점이나 공융점 아래에서 조사된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 상승된 온도, 즉, 37℃, 60℃, 72℃ 또는 80℃와 같이 실온보다 높은 온도에서 조사된다. 어떠한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 상승된 온도의 사용은 생물학적 오염체(들) 또는 병원체(들)에 대한 조사의 효과를 강화할 수 있고 이에 따라 더 낮은 방사선 총 선량을 사용하게 한다.
더 바람직하기로, 알부민 함유 제제에 대한 조사는 방사선으로부터 제제를 보호하는 온도에서 행해진다. 적절한 온도는 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 소정의 실시예에서, 조사가 실행되는 온도는 특정지점에서라기 보다는 어떤 범위내에 놓이는 것으로 발견될 수 있다. 특정 알부민 함유 제제의 조사에 대한 바람직한 온도의 이러한 범위는 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 알부민 함유 제제의 조사는 살균되는 알부민 함유 제제에 해가되지 않는 어떤 압력에서 행해질 수 있다. 한 바람직한 실시예에 따르면, 하나 이상의 소화효소로 된 제제가 상승된 압력에서 조사된다. 더 바람직하기로, 알부민 함유 제제는 음파의 적용 또는 휘발성의 이용으로 인한 상승된 압력에서 조사된다. 어떠한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 상승된 압력의 사용은 생물학적 오염체(들) 또는 병원체(들)에 대한 조사의 효과를 강화할 수 있고, 하나 이상의 안정제에 의하여 주어지는 보호를 강화하며, 이에 따라 더 낮은 방사선 총 선량을 사용하게 한다. 적절한 압력은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 따르면, 살균되는 알부민 함유 제제의 pH는 약 7이다. 그러나, 본 발명의 일부 실시예에서, 알부민 함유 제제는 pH가 7 미만이며, 바람직하게는 6이나 6미만, 더 바람직하게는 5나 5미만, 더욱더 바람직하게는 4나 4미만, 가장 바람직하게는 3이나 3미만일 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 알부민 함유 제제는 pH가 7 이상, 바람직하게는 8이나 8이상, 더 바람직하게는 9이나 9이상, 더욱더 바람직하게는 10이나 10이상, 가장 바람직하게는 11이나 11이상일 수 있다. 본 발명의 소정의 실시예에 따르면, 살균되는 제제의 pH는 제제에 포함된 효소(들)의 등전압점(isoelectric point)이나 등전압점 부근이다. 적절한 pH 수준은 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 방법에 따르면, 알부민 함유 제제의 조사는 처리되는 알부민 함유 제제에 해가되지 않는 어떤 분위기에서 행해질 수 있다. 한 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 저산소 분위기나 불활성 분위기에서 유지된다. 불활성 분위기가 사용될 때, 분위기는 바람직하게는 헬륨이나 아르곤과 같은 희귀가스, 더 바람직하게는 고분자량의 희귀가스, 및 가장 바람직하게는 아르곤으로 구성된다. 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제는 조사되는 동안 진공하에서 유지된다. 특히 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, (동결건조된, 액체 또는 동결된) 알부민 함유 제제는 조사전에 진공이나 불활성 분위기(바람직하게는 헬륨이나 아르곤과 같은 희귀가스, 더 바람직하게는 고분자량의 희귀가스, 및 가장 바람직하게는 아르곤)하에서 저장된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 액체 알부민 함유 제제는, 동결건조와 같은 용매의 감소 바로 전단계나 전단계 없이 조사전에, 액체에 용해되는 가스, 특히 산소량을 줄이기 위해 낮은 압력하에서 유지된다. 이러한 탈기(degassing)는 당업자에게 알려진 어떤 방법에 의하여 실행될 수 있다.
알부민 함유 제제가 상기 제제내에 용해되거나 제제와 관련된 산소나 다른 가스들을 포함하는 또 다른 바람직한 실시예에서, 제제 내에 또는 제제와 관련된 이들 가스의 양은 처리되는 제제를 보유하고 있는 (강체의 또는 유연한) 용기내에 제어된 감압과 같이, 당업자에게 알려져 있고 이용가능한 어떤 방법 및 기술들에 의해서 또는 대략 동일한 부피의 용기에 제제를 둠으로써 감소될 수 있다.
본 발명의 소정의 실시예에서, 치료되는 알부민 함유 제제가 조직이면, 적어도 하나의 안정제가 바람직하게는 압력하에서, 상승된 온도에서 또는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxid)와 같은 침투 증강제(penetration enhancer)가 있는 상태에서 안정제(들)을 함유한 용액에 조직을 담그는 것을 포함하는 당업자에게 알려져 있고 이용가능한 어떤 방법 및 기술들에 따라 도입된다. 조직에 적어도 하나의 안정제를 도입하는 다른 방법들로는 바람직하게는 압력하에서 및/또는 상승된 온도에서 안정제를 포함하는 가스를 적용, 상기 조직에 직접 안정제(들) 또는 안정제(들)을 함유하는 용액의 주입, 상기 조직을 감소된 압력하에 위치한 다음 안정제(들) 및 이들 방법들의 2이상의 조합을 포함한 가스나 용액을 도입하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 하나 이상의 안정제들이 또한 이러한 방법에 따라 조직에 도입될 수 있다.
본 명세서에 설명된 하나 이상의 특성들의 조합이, 생물학적 오염체(들) 또는 병원체(들)에 대한 조사공정의 적절한 효과를 유지하면서, 조사에 의하여 야기된 알부민 함유 제제에 대한 원하지 않는 효과를 더 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 안정제의 사용이외에, 특정한 알부민 함유 제제가 또한 동결건조되고, 감소된 온도에서 유지되며 바람직하지 않은 효과를 더 최소화하기 위해 조사전에 진공하에 유지될 수 있다.
조사에 대한 특정 생물학적 오염체 또는 병원체의 민감도는 D37값으로 알려져 있는 샘플에서 발생원의 거의 37%를 불활성시키거나 죽이는데 필수적인 선량을 결정함으로써 주로 계산된다. 알부민 함유 제제의 요망되는 구성성분은 요망되는 생물학적 또는 병리학적 특징의 거의 37%를 제거하는데 필요로 하는 방사선량과 도일한 값 D37을 가지는 것으로 또한 고려될 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제의 살균은 상기 알부민 함유 제제의 D37값에서의 오염체 감소없이 생물학적 오염체 또는 병원체의 D37값을 감소시키는 조건하에서 실행된다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제의 살균은 상기 알부민 함유 제제의 D37값을 증가시키는 조건하에서 실행된다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따르면, 알부민 함유 제제의 살균은 생물학적 오염체 또는 병원체의 D37값에서 감소와 상기 알부민 함유 제제의 D37값의 부수적인 증가를 초래하는 조건하에서 행해진다.
실시예
아래의 실시예들은 본 발명의 예이지만 이에 제한되지 않는다. 당업자에 의하여 통상 직면하게 되는 다른 적절한 변형 및 적용들이 다양하며 전체가 본 발명의 기술사상 및 범위내에 있다. 다르게 언급되지 않은 한, 모든 조사는 60Co 소스를 사용하여 수행되었다.
실시예 1
실험에서, 휘발성 안정제의 유무상태에서 및 잔여용매 함량의 수준을 달리하며 혈장단백을 조사(照射)하였다(실온에서 1.9kGy/hr로 45kGy).
방법
유리 바이알에, 소량의 에탄올 및 아세톤을 함유한 물 9%나 어떠한 에탄올 및 아세톤도 함유하지 않은 물 ~1% 중 하나를 갖는 상용으로 구매가능한 혈장단백(2㎎/㎖)으로 된 샘플들을 제조하였다. 샘플들을 감마선으로 조사하였고(1.9kGy/hr로 총 선량 45kGy 및 실온) 그런 후 구조적 무결성을 검사하였다. SDS-PAGE, HPLSEC 및 역상 HPLC에 의하여 구조적 무결성을 측정하였다.
SDS-PAGE를 위해서, 아래의 방법에 따라 3개의 12.5% 겔들을 제조하였다: 4.2㎖ 아크릴아마이드(acrylamide); 2.5㎖ 4X-Tris(pH 8.8); 3.3㎖ 물; 100㎕ 10% APS 용액; 및 10㎕ TEMED. 그리고 1X 러닝버퍼(Running Buffer)(물 1ℓ에 15.1g 트리스 기제(Tris base); 72.0g 글리신(glycine); 5.0g SDS, 5배 희석)를 갖는 전기영동장치에 두었다. 조사된 샘플들과 대조샘플들(1㎎/㎖)을 에핀도르프 튜브(Eppindorf tubes)에서 샘플버퍼(Sample Buffer)(+/- 베타(beta)-ME)로 희석한 후 수 분간 원심분리시켰다. 각각 희석된 샘플(~10㎍)에서 20㎕를 검사하였다.
역상 HPLC를 위해서, 각 샘플들을 10㎎/㎖의 최종농도로 물에 용해시켰다. 그런 후 이 용액들을 요망농도까지 순차적으로 0.1% 트리풀루오르 아세트산(trifluoroacetic acid)에 희석시켰다. 각 샘플에서 10㎍을 아쿠아포어(Aquapore) RP-300(C-8) 2.1x 30㎜ 마이크로보어(Microbore) HPLC에 적재하였다: 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems 130A) 분리장치(Separation System), 유량 0.2㎖/min, 용매 A: 0.1% 트리풀루오르 아세트산; 용매 B: 70% 아세토니트릴(acetonitrile), 30% 물, 0.085% 트리풀루오르 아세트산.
HPLSEC를 위해서, 각 샘플을 0.4㎍/㎕로 희석하였고 그 희석된 샘플에서 50㎕를 20㎍의 분석농도를 위해 유량 1㎖/min의 페노메넥스-바이오셉(Phenomenex-Biosep) S3000(분자범위 5kDa-700kDa)에 적재하였다: 2㎎/㎖ 저장용액 중 20㎕ + 80㎕ 용출버퍼(elution buffer)(50mM NaPi + 100mM NaCl pH6.7); 유량 1ml/min.
결과
샘플들 모두가 45kGy로 조사하자 다소 알부민의 분해를 보였으며, 소량의 에탄올 및 아세톤을 함유하는 9% 물을 갖는 샘플은 실질적으로 어떠한 휘발성 안정제도 없고 적은 물을 함유하는 샘플보다 분해가 덜하고 구조적 회복이 더 큼을 보였다. 그러나, 양 샘플들의 구조적 회복은 알부민의 연이은 사용으로 충분하였다.
더 구체적으로, 도 1A에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 소량의 에탄올 및 아세톤을 함유하는 9% 물을 갖는 샘플로부터 알부민 단량체(monomer)의 양호한 회복을 명시하고 있다. 유사하게, 도 1B에 도시된 바와 같이, HPLSEC는 또한 소량의 에탄올 및 아세톤을 함유하는 9% 물을 갖는 샘플에서 응집이 덜함을 나타내고 있다. 도 1C에 도시된 바와 같이, 역상 HPLC는 조사된 샘플과 대조샘플 사이에 어떠한 상당한 차이가 없음을 나타내었다.
실시예 2
인간 혈청(25%)을 햄스터 적용된 스크래피(균주 263K)로부터 10% 뇌 균질화(brain homogenate)로 1:100 넣었다(spiked). 샘플을 와동(vortexing)하여 혼합하고, 스크래피를 넣은(scrapie-spiked) 알부민의 4-6㎖ 분취량(aliquots)을 10㎖ 혈청 바이알에 분배하였다. 한 바이알은 동결된 대조샘플로서 -80℃로 저장하였다. 3개의 바이알들을 상용 조사기기에 두었다. 한 바이알(0kGy 대조샘플)은 박테리아 성장을 방지하기 위해 냉동시켰다. 나머지 바이알들을 실온(20-25℃)에서 0.4kGy/hr 비율로 26 또는 50kGy 총선량까지 조사시켰다. 각 바이알에 부착된 선량계(線量計)와 상기 바이알에 근접 배치된 외부 선량계로 방사선량을 측정하였다. 조사된 샘플과 0kGy 대조샘플을 스크래피 감염성에 대하여 검사하였다.
12마리 햄스터에 0.05㎖ 샘플의 뇌내 접종을 한 후, 관찰을 위해 6개월까지 가두어둠으로써 감염성을 검사하였다. 3개의 임상 종점(clinical endpoints)인 비틀거림, 뒤로가기 불능(failure-to-rear) 및 사망을 검사하였다. 조사되지 않은 대조샘플에 비하여 고선량으로 처리된 샘플로 접종된 그룹에서는 각 임상 증후가 나타나는데 적어도 8 내지 10일 지연되었다. 희석 시리즈 모드(R.Rowher, 출간되지 않은 데이터)를 제한하는데 있어 감염된 대다수의 동물들에 대한 잠복기의 선량 반응으로 구성된 노모그램(nomogram)과 상기 데이터를 비교하였다. 이 노모그램은 접종된 log10LD50으로 (비틀거림으로써 확인된 바와 같은) 발병(發病)과 날짜를 상호연관시킨다.
다음과 같은 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 고성능 크기배제 크로마토그래피(high performance size exclusion chromatography)에 의하여 생물학적 물질(알부민)에 대한 방사선의 효과를 측정하였다.
SDS-PAGE를 마이티 스몰 미니버티칼 유닛(Mighty Small MiniVertical Unit) SE250/SE260의 8% 폴리아크릴아미드 겔에서 실시하였다. 샘플들을 PBS에 1:100으로 희석시켰고 그런 후 5% 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 있거나 없는 라에믈리 샘플버퍼(Laemmli Sample Buffer)(바이오-래드(Bio-Rad)사(社))에 1:1로 희석하였다. 샘플 적재량은 통로당 12.5㎍이였다. 분자량 마커는 로우 레인지 스탠다드(Low-Range-Standard)(바이오-래드사)였다. 125볼트에서 30분간 전기영동을 실시하였다. 50% 메탄올, 10% 아세트산에서 0.1% 쿠마시 블릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250으로 겔을 염색하였고, 5% 메탄올, 9% 아세트산으로 탈색하였다.
130A 분리장치(어플라이드 바이오시스템사)에 있는 7.8 x 300㎜ Bisosep SEC 컬럼(Phenomenex, Torrence, CA)상에서 HPSEC를 실행하였다. 0.22㎛ 필터로 사용하기 전에 0.05M 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 0.1M 소듐 클로라이드(sodim chloride)(pH 6.7)의 용출버퍼를 필터하였다. 알부민 용액을 용출버퍼에서 최종 농도 1.25㎎/㎖로 희석시켰고 25㎕(31.25㎍ 단백질)를 주입하였다. 유량은 1㎖/min이였다. 280㎚에서의 흡수도에 의하여 검출하였다.
결과
조사되지 않은 대조샘플에 대해서, 발병(비틀거림)에 대한 중앙의 잠복기는 75일이었다. 조사된 샘플에 대해서, 발병에 대한 중앙의 잠복기는 총 선량 25kGy로 조사한 샘플에 대해서는 88일이었고, 총 선량 50kGy로 조사한 샘플에 대해서는 90일이었다. 노모그램과 비교하면 log10 역가에 대한 측정값이 조사되지 않은 대조샘플에 대해서는 6.5이고, 25kGy 및 50kGy로 각각 조사된 샘플에 대해서는 4.8 및 4.6을 보였다. 이들 측정을 기초로, 조사된 샘플들에 대한 중앙 감소인자는 25kGy 및 50kGy로 각각 조사된 샘플들에 대해서 1.7 및 1.9였다. 이들은 중앙 감소값의 추정을 나타낸 것이나, 이 실험에 의하여 예측된 최대가능한 감소를 말하는 것이 아니다. 이를 위해, 대조그룹의 95% 신뢰구간(CI)의 최소값과 방사선 처리된 그룹의 95%CI의 최대값을 비교해야 한다. 이 계산은 95%CI 내에 있는 역가의 최대감소 인자를 산출할 것이다. 50kGy 그룹에 대해서 이 값은 3.5logs 감소였다.
방사선에 대한 생물학적 오염체 또는 병원체의 감수성은 종종 D37 값으로 표현된다. 이는 생물학적 오염체 또는 병원체의 수를 조사전 수의 37%까지 줄이는데 필요로 하는 방사선의 선량을 나타낸다. 따라서 D37이 낮을수록, 특정한 생물학적 오염체 또는 병원체가 방사선의 영향을 더 받게 된다. 스크래피 프리온의 D37은 실험적으로 대략 47kGy로 측정되었다(로워(Rohwer), Nature, 308, pp5960, pp.658-662,1984).
본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여, 스크래피 프리온의 D37은 뜻밖에도 단지 4.5kGy임을 알았다. 따라서 상기 방법 및 이 실험에 사용된 제제를 사용하여 프리온의 D37을 줄였다. 그러므로 본 실험에서 사용된 인간 알부민의 상용 치료제 25% 용액인 생물학적 물질의 무결성을 유지하면서, 스크래피 프리온의 파괴를 증가시켰다.
처리되는 알부민 함유 제제의 필수적인 생물학적 및 병리학적 특징을 유지하면서 스크래피 프리온의 파괴를 증가시켰다. 이 특정 생물학적 물질은 25% 용액의 인간 알부민으로서 총 선량 25, 50 및 100 kGy까지 감마선으로 사전 조사 및 사후 조사 모두를 검사하였다. 겔 전기영동에 의하여 도시된 바와 같이(도 2A - 2B), 알부민은 50kGy까지의 방사선량에도 대부분이 손상되지 않았으며, 단지 소량의 조각과 응집이 있었고 알부민의 단량체형(monomeric form)의 양이 약간의 감소되었다. 알부민 샘플들이, 임의의 아스코르베이트 및/또는 햄스터를 포함하는지에 무관하 게, 모든 알부민 샘플들에 대해서 결과들이 유사하였다. 더 높은 선량에서는, 주로 알부민의 증가된 중합체 형태로 있는, 알부민 샘플들에서 변화는 미미하였다.
HPSEC를 사용하여 더 상세한 분석을 하였다. 도 2C 내지 도 2F에 도시된 바와 같이, 감마선 조사로, 알부민 단량체의 양이 줄었고(10.5분에서 피크), 이합체(dimer)의 양은 증가되었으며(9분), 중합체(polymer)의 양도 증가되었다(7.2분). 이들 변화들은 아스코르베이트가 있을 때 모두 최소화되었다. 12.6분 및 15.3분에서의 나머지 피크들은 각각 아스코르베이트와 N-아세틸 트립토판 안정제의 피크들이다.
실시예 3
이 실험에서, 약 4℃에서 1.847kGy의 비율로 총 선량 10 또는 40kGy까지 동결건조된 알부민(95% 유로키나아제 함유)을 조사하였다.
TSK겔 G4000SWxl 30㎝ x 7.8㎜ 컬럼, 분리범위 20kDa - 7,000kDa, 용출버퍼 0.1M 소듐 포스페이트/0.1M 소듐 설페이트(pH 6.5), 유량 1㎖/min를 사용하여 겔 여과(gel filteration)에 의하여 샘플들을 분석하였다.
도 3A에 도시된 바와 같이, 동결건조시키고 10kGy이나 40kGy의 총 선량을 조사했을 때 알부민에서는 어떠한 변화도 없었다. 반대로, 도 3B에 도시된 바와 같이, 액체 알부민 샘플들은 총 선량 40kGy로 조사했을 때 상당한 붕괴를 보였다.
실시예 4
이 실험에서, 알부민 용액(25%) 샘플들을 제조하였고 상기 샘플들 중 절반에 아르곤을 살포하였다.
샘플들을 0.91, 0.92 또는 1.01 kGy/hr 비율로 각각 총 선량 18.1, 23 및 30.4kGy까지 조사하였다. 응집 및 조각에 대해서는 SDS-PAGE에 의하여 그리고 이량체화 및 중합화에 대해서는 HPLSEC에 의하여 조사된 샘플들을 분석하였다.
도 4A 및 도 4B에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE는, 심지어 30.4kGy의 총 선량까지 조사된 샘플들에 대해서도, 단지 소량의 조각(감소된 겔상에 66kDa 밴드 아래의 이중선) 및 응집(감소되지 않은 겔상에 116kDa 밴드)을 보였다.
HPLSEC는 아래의 피크들을 보였다:
총 선량(kGy) 중합체(w/Ar) 이량체(w/Ar) 중합체(Ar없음) 이량체(Ar없음)
0(대조) 4.0% 1.8% 4.4% 2.7%
18.1 5.1% 5.6% 5.1% 6.6%
23 6.2% 7.0% 6.0% 8.7%
30.4 7.2% 8.3% 7.3% 9.8%
HPLSEC에 의하여 도시된 바와 같이, 조사전에 아르곤이 살포된 샘플에서는 이량체가 적은 것을 알 수 있다.
실시예 5
이 실험에서는, -20℃에서 방사선의 총 선량을 가변하며(10, 30 또는 50kGy) 혈장단백을 조사(照射)하였다.
방법
유리 바이알에, 상용으로 구매가능한 혈장단백의 샘플들을 소량의 에탄올과 아세톤을 함유한 9% 물의 환원된 용매 수준으로 제조하였다. 샘플들을 -20℃에서 1.608kGy로 총 선량 10, 30 또는 50kGy까지 조사한 후 구조적 무결성을 검사하였다. SDS-PAGE 및 HPLSEC에 의하여 구조적 무결성을 측정하였다.
SDS-PAGE를 위해서, 아래의 방법에 따라 4개의 12.5% 겔들을 제조하였다: 4.2㎖ 아크릴아마이드(acrylamide); 2.5㎖ 4X-Tris(pH 8.8); 3.3㎖ 물; 100㎕ 10% APS 용액; 및 10㎕ TEMED. 그리고 1X 러닝버퍼(물 1ℓ에 15.1g 트리스 기제(Tris base); 72.0g 글리신(glycine); 5.0g SDS, 5배 희석)가 있는 전기영동장치에 두었다. 조사된 샘플들과 대조샘플들(1㎎/㎖)을 에핀도르프 튜브에서 샘플버퍼(+/- 베타-ME)으로 희석한 후 수분간 원심분리시켰다. 각각 희석된 샘플(~10㎍)에서 20㎕를 검사하였다.
HPLSEC를 위해서, 각 샘플에서 31㎍을 50mM Na2HPO4(pH 6.7), 100mM NaCl에서의 유량이 1㎖/min인 Applied Biosystems 130A 분리장치에 있는 Biosep SEC S3000 7.7x 300㎜ 컬럼에 적재하였다.
결과
도 5A 및 도 5B에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은, 심지어 방사선의 총 선량 50kGy까지, 조사된 샘플로부터 알부민 단량체의 정량적 회복을 명시하고 있다. 유사하게, 도 5C 내지 도 5F에 도시된 바와 같이, HPLSEC는, 심지어 방사선의 총 선량 50kGy까지, 임의의 조사된 샘플에서 응집에서의 어떠한 증가도 보이지 않는다.
실시예 6
이 실험에서, 어린 햄스터의 신장(BHK) 세포를 20%(부피/부피) 태아소혈청(FBS)을 포함하는 배지에서 성장시키고 천천히 적응시켜 상기 세포를 결 국 (정상적인 FBS 요건의 5%인) 0.25% FBS만으로 성장시킬 수 있다. 그런 후 FBS를 줄임에 따라, 배지를 -20℃ 온도에서 1.608kGy/hr로 총 선량 50kGy까지 조사하였거나 조사하지 않은 상용의 혈장단백으로 보충시켰으며, 상기 혈장단백은 배지의 0.3% 중량/부피(600㎎)가 되었다.
결과
조사하지 않은 혈장단백을 포함하는 배지상에서 성장된 BHK 세포와 총 선량 50kGy까지 조사한 혈장단백을 포함하는 배지상에서 성장된 BHK 세포 사이에 어떠한 관찰가능한 차이도 없었다.
실시예 7
이 실험에서, 돼지 파보바이러스(Porcine Parvovirus, PPV)를 포함하는 혈장단백을 -80℃에서 총 선량을 가변하며 조사하였다.
방법
2.5mM NaCl에 20% PEG8000을 사용하여 PPV 스톡 #7을 제조하였다. PEG버퍼(0.1M NaCl, 0.01M Tris(pH 7.4), 1mM EDTA)에 PEG 침전된 바이러스 펠렛(pellet)을 재현탁시켰다.
방법 1
PK-13 배지 또는 PPV 스톡 #7 50㎕를 2㎖의 휘튼 바이알(Wheaton vials)에 첨가시키고 40℃에서 하룻밤동안 건조시켰다. 일단 액체를 건조시키고 바이알을 막고나서 -80℃에서 5.202kGy/hr로 총 선량 10, 30 또는 45kGy까지 조사한 후에 상용의 혈장단백 50㎎를 첨가하였다.
방법 2
상용의 혈장단백 50㎎을 휘튼 바이알에 넣고 용해될 때까지 PK-13 배지 150㎕ 또는 희석된 PPV 스톡 #7(100㎕ PK-13 배지 + 50㎕ PPV) 150㎕로 혼합시켰다. 바이알을 막은 후 -80℃에서 5.202kGy/hr 비율로 총 선량 10, 30 또는 45kGy까지 조사하였다.
TCID 50 분석
PK-13 배지(DMEM ATCC#3020002, 10% FBS Gibco#26140079, 1% Pen/Step/L-GLutamine Gibco#10378016) 850㎕를 각 바이알에 첨가하여 부피를 1㎖가 되게하였다. 그런 후 13㎜ 필터(벡톤 디켄슨사(社)(Becton Dickenson) #4454)와 3㎖ 주사기를 사용하여 샘플들을 필터하였다.
PK-13 세포(ATCC#CRL-6489)를 PK-13 성장배지에 두고 96웰 플레이트에서 감염전 날에 40% 합류(confluency)로 살포하였다. 세포들이 70-80% 합해질 때, (PK-13 배지 또는 희석된 PPV 스톡 #7을 포함하는) 원하는 조사된 샘플 50㎕를 4웰에 첨가하였다.
SDS-PAGE
조사후에, HPLC 물(10㎎/㎖)에 샘플의 저장용액을 제조하고나서 희석시켰다(2㎎/㎖). 그런 다음 샘플들을 (DTT가 있거나 없는) 2x 샘플버퍼로 1:1 희석시킨 후 방법 1의 샘플에 대해서는 5㎍(10㎕) 그리고 방법 2의 샘플에 대해서는 10㎍(10㎕)을 겔에 적재하였다.
결과
방법 1에 따라 -80℃에서 조사된 PPV 처리된 혈장단백은 총 선량 45kGy(0.084 log/kGy)을 써서 3.9logs의 바이러스 사멸을 나타냈다. 방법 2에 따라 -80℃에서 조사된 PPV 처리된 혈장단백은 5.54logs(0.123 log/kGy)의 바이러스 사멸을 나타냈다. 이들 결과가 도 6에 그래프로 도시되어 있다. 조사된 혈장단백은 PK-13에 어떠한 세포변형효과를 초래하지 않았다.
또한 SDS-PAGE를 써서 -80℃에서 조사된 PPV 처리된 혈장단백을 검사하였다. 이들 결과들이 도 6B 및 도 6C에 도시되어 있다.
실시예 8
이 실험에서, 알부민과 인자Ⅷ를 함유한 동결된 제제를 조사(照射)하였다.
방법
알부민과 인자Ⅷ를 함유한 샘플들을 동결시키고 총 선량 45kGy까지 감마선으로 조사하였다.
결과
도 7에 도시된 바와 같이, 대조(조사되지 않은)샘플의 인자Ⅷ 활성과 동결건조되고 총 선량 45kGy까지 감마선으로 조사된 샘플의 인자Ⅷ 활성 사이에는 어떠한 차이도 없었다.
실시예 9
이 실험에서는, 조건을 바꾸어가며 혈장단백(95-98% 인간혈청 알부민 함유)을 조사하였다.
방법
생물학적 거대분자의 단기간 및 장기간 안정성을 측정하는데 가장 감도가 좋고 직접적인 접근법인 시차주사열량계(Differential Scanning Calorimetry, DSC)를 사용하여 PPF의 구조적 무결성 및 안정성을 나타내었다. 동일한 용매 조건/제제하에 조사된 PPF와 조사되지 않은 샘플들(트래벌 콘트롤(travel control))을 비교함으로써 이들 물리화학적 특성에 대한 조사효과를 측정하였다. 결과들은 PPF제품의 손상을 최소화하는 감마선 조사처리를 위한 최적의 조건들을 선택하기 위한 열동역학적 및 구조적 근거를 제공한다. 감마선 조사를 위한 최적의 조건들(pH, 이온세기, 온도, 선량, 선율)은 요망결과를 얻기 위해 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF 사이의 차이에 따라 선택될 수 있다.
안정제(4mM N-아세틸 티립토판(AT) 또는 4mM 카프릴레이트(caprylate)(CA) 또는 4mM AT와 4mM CA의 조합)가 있는 상태에서 60℃에서 10시간 동안 5% PPF 용액의 열 저온살균(Heat pasteurization)을 실행하였다. 요구되는 가열동안 PPF 안정성을 증가시키기 위해 조사되지 않은 PPF와 조사된 PPF 모두에 안정제를 첨가하였다. -80℃에서 5kGy/hr 선율로 총 선량 50kGy까지 조사를 실행하였다. 조사된 PPF는 약 1% 습도를 함유하였다.
열적 불안정에 대한 지표로서 알부민 응집체의 형성을 (ⅰ) 370㎚에서의 광산란; (ⅱ) 환원된 및 환원되지 않은 상태하에서 실행된 SDS PAGE; 및 (ⅲ) HPLC에 의하여 감시하였다. pH 7.0으로 맞추어진 1x PBS 버퍼에 PPF 분말을 용해시켰고, 단백질 농도를 50㎎/㎖로 맞추었다. 온도조절 수조(thermostatic water-bath)에서 마개를 씌운 폴리프로필렌 튜브 안에 있는 샘플들을 60℃로 가열하였다. 주사 열량계를 사용하여 저온살균 전후의 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 변성 온도(Tmax)와 변성 엔탈피(ΔHcal)를 비교함으로써 PPF의 구조적 안정성 및 무결성을 측정하였다.
결과
조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 구조적 안정성 비교
(a)환원된 상태와 (b)환원되지 않은 상태하에서 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 SDS PAGE는 알부민의 감마선 조사로 야기된 분해 및/또는 알부민의 티올(thiol) 관련된 중합화에 대하여 조사된 물질과 조사되지 않은 물질 사이에 어떠한 상당한 차이가 없었음(PAGE 밴드의 세기에서 단지 약간의 변화만 있음)을 보였다.
DSC 실험으로부터 얻은 열량 분포형(profiles)에서의 관찰된 차이는 조사된 샘플의 제 3 차 구조의 안정성에 있어 변화를 나타냈다. 표명되어야만 하는 주요 차이들은 조사된 PPF에서의 변성 전이의 협동성(cooperativity) 감소와 조사되지 않은 물질에 대한 엔탈피와의 비교에서와 같이 조사된 PPF 변성의 엔탈피에서의 감소와 연관있었다.
조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 초과열용량의 비교 디컨볼루션(deconvolution) 분석은 변성전이의 최대 온도에서의 감소가 구조적 안정성이 다른 알부민 분자의 추가 집단과 관련있음을 나타내었다. 단백질의 고안정성 및 저안정성 비율 모두의 발생은 주로 본래 단백질의 제 3 차 구조를 안정화시키는 내부 상호작용의 네트워크에서의 감소로 해석되는 변성 전이의 협동성에 있어 감소로 나타났다. 조사되지 않은 PPF에 대하여 열량 분포형을 변화시키는 조사된 PPF에 대한 변성전이의 협동성에서의 손실은 원래 분자의 전체집단의 분자간 손상으로서 간주되기보다는, 오히려 조사에 의해 치료되었던 일부 분자의 안정성의 변화로서 간주하여야 한다. 조사된 PPF에 대한 변성전이의 탈협동은 분자에 충분한 손상을 의미하지 않는 반면에, 알부민의 불안정화는 열 저온살균의 또 다른 단계에 대하여 중요해진다; 즉, 열적 안정성(Td)이 60℃미만인 알부민의 불안정화 비율은 열처리에 의하여 변성으로부터 보호되어야만 한다.
감마선 조사후 알부민의 회복에 대한 PPF 분말에서 수분량의 영향
수분량을 달리하며 -20℃에서 45kGy, 1.8kGy/hr로 조사한 PPF 분말의 열량측정 스캔은, PPF 분말에 있는 수분량이 8.6%에서 액체상태까지 증가함에 따라, 열량측정 곡선 아래 영역이 감소함을 보였으며, 이는 감마선 조사후 본래 구조를 갖는 알부민 분자의 집단에 있어 감소로 해석된다. 액체상태에서 조사된 PPF가 가장 큰 손상을 나타낸다.
다른 선율(1.8kGy/hr 또는 6.7kGy/hr)과 수분량(9% 또는 1%)으로 감마선 조사후 알부민 구조의 회복은 조사 온도(-80℃, -20℃ 또는 20℃)의 함수로서 변하였다. 알부민 회복의 정량값은 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 엔탈피 비(比)로 계산될 수 있다. 총 변성 엔탈피에서의 감소는 더 높은 수분량을 갖는 PPF 분말에 대한 조사가 분자의 회복을 감소시켰음을 나타내었다. 이 결과는 이러한 조건들 하에서 감마선 조사에 의하여 PPF의 손상이 자유 라디칼의 생산에 유래한 2차 효과와 아마도 관련있음을 나타낸다.
감마선 조사후 알부민 회복에 대한 온도의 영향
알부민 구조의 회복은 조사 온도가 감소함에 따라 증가되는 PPF 조사의 온도에 크게 의존한다. -80℃에서, 저수분량 샘플들의 구조적 회복은 고수분량 샘플들의 구조적 회복보다 더 양호하였다.
PPF에 대한 상용 안정제의 영향
시차주사열량계, SDS PAGE, 크기배제 크로마토그래피에 의하여 인간 PPF의 열적 안정성에 대한 CA 및 AT의 영향을 조사하였다.
4mM AT가 있는 상태에서, 알부민의 변성이 발생되는 온도(Tm)는 65.4에서 67.6℃로 증가되었다. 유사하게, 4mM CA가 있는 상태에서, 최대 열용량 온도(Tmax)는 65.4에서 72.03℃로 증되었다. 그러나, 4mM AT와 4mM CA 모두가 있는 상태에서는, Tm이 65.4에서 70.5℃로, 단지 4.6℃만큼 변함으로써 알부민의 열적 안정성에서의 증가를 초래한다.
크기들은 동일한 용매 조건하에서 약간 더 작지만, CA와 AT 모두는 조사된 PPF에 대하여 유사한 안정화 효과를 가진다. 4mM에서 CA와 AT는 큰 덩어리의 단백질 변성을 방지하지만, 조사된 단백질의 경우에서는, 60℃까지 가열될 때, 탁도(turbidity)를 갖는 고분자량 응집체(aggregates)의 10-15% 올리고머화(olygomerization)가 불가피해질 수 있다.
8mM까지 CA의 농도를 증가시킴으로써 알부민의 열적 안정성에 있어 상당한 증가, 즉, 4mM CA농도에서 65.4℃에 비하여 82℃에서 변성을 초래하였다. 이는, 4mM보다 더 큰 농도에서, 카프릴레이트(caprylate)는 알부민이, 주로 항바이러스 저온살균으로 사용되는 온도인 60℃에서, 변성화에 저항하도록 알부민을 충분히 안정화시킬 수 있는 능력을 가진 것을 나타낸다.
HPLC 분석은 저온살균전에 CA가 있는 상태에서 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF 모두가 본질적으로 단량체임을 보였다. 가열 후, 열에 의하여 산출된 고분자량 응집체의 양은 조사되지 않은 물질의 고분자량 응집체의 양보다 조사된 PPF의 경우에 더 많았다. 조사된 PPF에서 유도된 응집체의 백분율은 CA 단독으로 있는 상태보다 AT와 CA 모두가 있는 상태에서 거의 2배 낮았으며, 이는 PPF에서 CA외에 AT가 있는 상태는 열적 안정성을 크게 증가시키지 않지만, 60℃에서 10h 가열하는 동안 알부민 응집을 억제시킴을 의미한다. PPF에서 알부민의 열에 의한 응집은 PBS 용액에서 보다는 비완충(unbuffered) PPF용액에서 더 분명하였다.
생성된 응집체의 변성과 성질을 검사하기 위해 환원된 상태하에서 실행된 SDS PAGE는 고분자량 응집체에 상응하는 밴드들이 사라짐을 보였다. 이는 감마선 조사된 알부민을 10시간 주기 내내 60℃로 열처리함으로써 분자간 S-S 결합 형성을 통해 안정적인 단백질 착체가 발생하였음을 나타낸 것이다. 응집된 분자들은 0.22㎛ 필터를 통한 여과에 의하여서는 본래의 단량체형과 분리될 수 없다. 분자간 응집이 발생하는 정도는 PPF 용액의 pH와 이온세기 및 그 농도에 따른다.
염산(hydrochloric acid)을 첨가함으로써 단백질 용액이 낮은 pH값(6.5-4.5)으로 되거나 PPF 용액이 저온살균전에 pH 7.0로 적절히 맞추어지지 않았을 때는, 60℃에서 열처리되는 첫번째 10분간 점진적으로 중합되었다. 알부민에 결합되는 CA의 친화도는 7.0에서 5.5로 pH를 떨어뜨릴 때 약간 증가되었지만, 60℃에서 요구되는 열처리동안 단백질에서의 변화를 최소화하기에는 주어진 안정제의 농도(4mM)로 충분하지 않았다.
-20℃ 및 -80℃에서 조사된 샘플들에 대하여 60℃에서 저온살균 전후에 실행된 PPF에 대한 열분석도(thermogram)는 -80℃에서 PPF 분말을 조사하였을 때 모든 (감마 조사 및 저온살균)처리 후에 알부민 분자의 손상이 줄었음을 보였다.
실시예 10
이 실험에서, 조건을 바꾸어가며 혈장단백(95-98% 인간혈청 알부민 함유)을 조사하였다.
방법
동결건조된 PPF 분말에 대한 감마선 조사 조건은 -80℃, 50kGy, 5.02kGy/hr이였다.
결과
환원된 조건과 환원되지 않은 조건하에서 SDS PAGE는 PPF에 아스코르베이트를 100mM 농도로 첨가함으로써 아스코르베이트 없이 조사된 PPF에 비하여 감마선 조사된 물질의 밴드세기에서 상당한 향상을 야기하였음을 보였다. 이는 아스코르베이트가 있는 상태에서 감사선 조사에 대한 단백질의 분해가 아스코르베이트가 없는 상태에서보다 덜 하였음을 나타낸다.
100mM 아스코르베이트가 있는 상태에서 저온살균전에 조사된 물질과 조사되지 않은 물질로 실행된 HPLC분석은 조사된 단백질과 조사되지 않은 단백질이 폴리펩티드 사슬의 화학적 무결성 뿐만 아니라 단량체형 및 다중체형의 집단에 대하여 실제적으로 동일함을 나타내었다.
3가지 형태의 열적 안정성을 평가하기 위해 (a)아스코르베이트가 있는 상태와 (b)아스코르베이트가 없는 상태 그리고 (c)아스코르베이트가 단독으로 있는 상태에서 조사되지 않은 PPF와 조사된 PPF에 대한 열량측정 스캔을 하였다. pH 7.0인 PBS 버퍼용액에서 PPF 열량측정을 실행하였고, 모든 실험에서 사용된 단백질 농도는 4.4㎎/㎖였다. 100mM 아스코르베이트가 있는 상태에서 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF에 대한 열량측정 스캔의 비교는 감마선 조사후 PPF의 회복면에서 상당한 향상을 나타낸다. 아스코르베이트가 있는 상태에서 열로 인한 변성의 열량 분포형이 아스코르베이트가 없는 상태에서의 열량 분포형과는 다르지만, 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF에 대해서는 매우 유사하다.
얻은 결과들은 (a)100mM 농도의 아스코르베이트는 감마선 조사동안 구조적 손상에 대하여 알부민을 보호하고, (b)아스코르베이트는 산화반응에 촉매작용을 하는 금속이 있는 상태에서 70℃로 가열될 때 화학적 변화(추측상 산화)를 보이며, (c)가능성 있게 자유 라디칼과의 상호작용으로 인해 야기되는, 조사동안의 아스코르베이트에서의 변화는 열량분석에 의하여 정량적으로 측정될 수 있고 자유 라디칼 손상에 대하여 단백질을 보호하는데 필수적인 아스코르베이트의 최적농도에 대한 정확한 결정을 할 수 있음을 나타낸다.
아스코르베이트 유무상태에서 저온살균된 감마선 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF에 대한 SDS PAGE 밴드의 세기 비교는 알부민이 100mM 아스코르베이트가 있는 상태에서 조사되고 저온살균되었을 때 아스코르베이트가 없는 상태에서 보다 분해가 덜 되었음을 보였다.
100mM 아스코르베이트를 포함한 pH 7.0의 100mM 소듐 등가용액(sodium equivalent solutions)에 (a)가열되지 않은 PPF와 (b)저온살균된 PPF에 대한 열량측정 스캔은 60℃에서 10시간 내내 조사된 PPF를 가열한 것은 단백질 구조에 있어 어떠한 변화도 야기하지 않았음을 보였으며, 상기 단백질 구조는 열 저온살균후 조사되지 않은 알부민의 단백질 구조와 유사하다. 양 단백질에 대한 변성전이의 최대온도는 동일하였으며, 이는 양 단백질들이 유사한 구조적 안정성을 가진 것을 나타낸다. 저온살균 전후에 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민 모두의 열량 분포형태에서의 작은 차이는 아스코르베이트가 있는 상승된 온도에서 단백질 안정성의 증가에 기인한 것이었다. 아스코르베이트가 있는 상태에서, 열 변성에 대한 단백질의 안정성은 3.8℃만큼 증가되었다. 이러한 안정성은 60℃에 달하는 가열에 대하여 단백질 구조의 추가적인 보호를 제공한다.
열용량의 발열피크(exothermic peaks)의 최대온도에서 조사된 물질과 조사되지 않은 물질 사이에 주요한 차이가 있었다. 발열 효과는 감마선 조사의 결과로서 산화된 형태로의 아스코르베이트의 변환과 관계있었다. 감마선이 조사된 아스코르베이트에서, 가열에 의하여 야기된 변환과정은 43℃에서 처리되는 반면에, 조사되지 않은 아스코르베이트에서, 변환과정은 50℃에서 최대가 된다. 이는 아스코르베이트를 감마선에 조사시킴으로써 산화된 형태로의 변환에 조사된 아크로베이트가 조사되지 않은 아크로베이트보다 더 민감하게 하는 화학적 구조에서의 변화를 야기한다.
분해 전이에 대한 엔탈피의 비교로 인해 수행되는 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민의 구조적 무결성에 대한 정량적 측정은 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민 사이의 차이가 15%미만이였음을 보였다. 이는 아스코르베이트가 없는 상태에서 관찰되었던 것보다 더 양호하였으며, 저온살균후 조사된 PPF의 회복은 거의 70%로 측정되었다.
아스코르베이트의 유무상태에서 저온살균후에 조사된 PPF와 조사되지 않은 PPF의 HPLC 분석은, 저온살균후에 PPF에 있는 단량체/다량체 집단의 정량측정을 하게 하고, 아스코르베이트가 없는 상태에서 60℃에서 10.5시간동안 조사되지 않은 PPF의 저온살균이 거의 12.4%의 응집체의 생산을 야기함을 보였다. 응집체의 양은 감마선 조사된 PPF의 저온살균시에 36.3%까지 증가되었다. 100mM 아스코르베이트가 있는 상태에서 PPF의 저온살균은 S-S 가교된 응집체 집단을 거의 14% 내지 22.8%만큼 줄였다.
실시예 11
이 실험에서, 조건을 바꾸어가며 페이스트-유도된(paste-derived) 인간혈청 알부민을 조사하였다.
방법
알부민을 현저히 포함하는 분획 Ⅴ의 페이스트 침전물을 물에 재구성하고, 인간혈청을 산출하기 위해 처리하였다. 최종 용액은 pH 7.0의 비완충용액에 97%의 알부민 함량을 갖는 20㎎/㎖ 단백질을 포함하였다. 재구성된 페이스트로부터 알부민의 총 수율은 ~30-35%였다. 마개로 막은 유리 바이알에 있는, 분획 Ⅴ의 페이스트 침전물을 -80℃에서, 1.8kGy/hr로 총 선량 50kGy까지 조사시켰다. 동일 조건하에서 트래벌 대조샘플(travel control samples)을 저장하였다. 알라닌(alanine) 선량계로 방사선율을 측정하고 공정에 따라 온도인자에 의하여 조정하였다. 저온살균전에 상용의 안정제인 카프릴레이트(CA) N-아세틸트립토판(AT)을 4mM 농도의 알부민 용액에 첨가하였다. 60℃에서 10시간 내내 연속가열하는 저온살균을 실시하였다.
결과
페이스트로부터 정제된 알부민의 SDS PAGE는 정제된 알부민이 안정제의 유무상태에서 ~96% 순도를 가짐을 보였다. 50kGy의 감마선 조사는 알부민 분자의 고분자량 집단 및 저분자량 집단 모두를 생성하였으며, 이는 폴리펩티드 사슬 및 이들의 회합의 S-S가교된 응집체로의 분해에 기인한 것이다. S-S가교된 응집체는 환원된 조건하에서 저 분자량 조각들로 변환된다. 양 이들 집단들은 너무 작았으며, 총 단백질의 ~8%였다. 저온살균은 밴드의 세기를 변화시키지 못했으며, 이는 10시간 가열하는 동안 화학적 분해가 없었음을 나타내었다. 감마선 조사된 단백질에 대한 저온살균의 가장 현저한 결과는, 겔상에 고분자량 응집체로서 나타나는, 분자간의 가교결합을 야기시켰다는 것이었다. 이 응집된 상태는 조사되지 않은 알부민인 경우에는 관찰되지 않았다.
AT 및 CA가 있는 상태에서 저온살균 전후의 감마선 조사를 한 다음의 알부민 샘플의 HPLC 분석은 감마선 조사가 단량체형을 이용하여 이량체와 다량체 집단에서 약간의 증가를 유도하였음을 보였다. HPLC의 비환원된 조건하에서 S-S가교에 의하여 안정화된 조각난 폴리펩티드에 의하여 다량체를 형성하였다(SDS PAGE 참조). 60℃에서 10시간 동안의 저온살균은 조사된 알부민에서 고분자량 응집체의 형성에 대한 알부민 분자집단에서의 상당한 재배열을 야기한다.
AT 및 CA가 없는 상태에서 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민 모두에 대한 DSC 분석은 조사된 알부민의 주요 부분에 대한 안정성이 조사되지 않은 단백질과 유사하게 유지되었음을 보였다. 그러나, 조사된 알부민은 분자들 중 일부분이 본래 알부민 보다 더 낮은 안정성을 가졌다.
조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민에 대한 초과 열용량함수의 디컨볼루션 분석은 다음과 같이 나타났다. 조사되지 않은 알부민의 열용량 함수가 변성전이에 대한 간단한 2단계 모델에 맞추어지는 반면에, 조사되지 않은 알부민은 더 복잡한 행동을 보였다. 열적 안정성에 있어 서로 다른, 적어도 2개의 개별적인 알부민 분자의 집단으로 구성되었다. 한 집단은 조사되지 않은 알부민에 대한 열적 안정성에 있어 유사한 분자들로 표현되었으며, 다른 집단은 탈안정화된 분자와 연관되었다. 조사된 알부민의 마지막 부분은 저온살균 온도(60℃)에서 변성에 가장 민감하였으며 S-S가교 응집체의 생산을 초래할 수도 있다. 상용 안정제 AT 및 CA를 첨가함으로써 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민 모두의 안정성이 증가되었다.
안정제가 있는 상태에서, 조사되지 않은 분자의 90%이상이 60℃ 이상에서 열적 안정성을 가졌고 이에 따라 60℃에서 저온살균시에 열손상을 면하였다. 대부분의 조사된 분자들은 CA 및 AT가 있는 상태에서 또한 안정화되었지만, 60℃ 아래에서도 여전히 안정성을 갖는 일부(10-15%) 분자들이 있었다. 이 부분은 저온살균시에 비가역적으로 변성되는 것으로 예측될 수 있다.
저온살균 전후에 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민의 DSC 분석은 60℃ 아래에서 열적 안정성을 가졌던 부분은 가열동안 변성된 형태로 변환되었음을 보였다. 조사된 알부민의 변성전이 피크는 저온살균 후에 더 상호협동적이게 되었으며, 이는 변성된 형태로 변환된 알부민 집단의 저안정성 부분을 이용하여 본래의 구조가 풍부해짐을 나타낸다.
감마선 조사 및 저온살균을 한 다음에 알부민의 집단회복을 측정하기 위해 HPLC를 사용하였다. 피크피트 프로그램(PeakFit program)을 사용하여 이들 형태의 피크 백분율로부터 단량체, 다량체 및 저분자량 조각들의 집단들을 측정하였다. 조사후 집단(mass) 손실은 소량의 폴리머(~2%) 형성과 주로 관련있었다.
단백질의 구조적 무결성에 대한 마커로서 안정에 대한 엔탈피의 DSC 분석을 기초로 감마선 조사와 저온살균 후에 알부민의 제 3 차 구조적 회복에 대한 백분율을 측정하였다. 감마선 조사된 페이스트로부터 도출된 알부민의 회복은 81-82%였고, 이는 조사된 PPF 분말로부터 도출된 알부민에 대하여 사전 측정된 알부민의 회복 78-80%에 가까웠다. 상용 안정제 CA 및 AT를 4mM 농도로 따로 또는 복합적으로 첨가하였을 때 알부민의 회복에 있어 어떠한 현저한 차이도 관찰되지 않았다.
감마선 조사된 알부민의 저온살균은 60℃에서 10시간 동안 분자들의 탈안정화된 집단의 변성으로 인해 단백질 구조의 추가적인 ~10% 손실을 초래한다. 이는 조사되지 않은 알부민에 대해서는 2%인 것과 대조되었다.
침전물에 의하여 손상된 분자들을 제거하기 위해 10mM Na-Ac 버퍼에 pH 4.9로 저온살균 및 연이은 투석(dialysis)후에 조사된 알부민에 대한 HPLC 분석은, 투석 및 원심분리에 의한 불용해성 물질의 제거 후에, 저온살균에 의해 유도된 가교된 응집체의 양이 현저히 줄어들었음을 보였다. 그러나 이러한 접근의 단점은, 70%의 응고된 물질의 우선적인 제거에도 불구하고, 원래의 단백질의 상당량이 pH 4.0에서 투석동안 제거된다는 것이었다.
제거능력 및 에탄올/물 용해도를 기초로 보호 첨가제를 선택한다. 유기 및 수용성 용액에서 다른 용해도를 갖는 첨가제의 능력은 페이스트(유기 모액체(organic mother liquid))에 있는 단백질을 보호하는데 필수적이며, 상기 페이스트에서 본질적으로 용해될 수 있는 반면에, 용해되지 않는 수용성 용액에서는 재구성시에 제거를 용이하게 한다.
유기 환경에서 균일한 분포 및 용해를 위해 0℃에서 알부민에 제거제(scavengers)와 안정제를 첨가하였다. 첨가제를 함유한 페이스트를 동결시키고 -80℃에서 조사시켰다. 그런 후 조사된 페이스트와 조사되지 않은 페이스트로부터 알부민을 정제하였다.
여러 제거제가 있는 상태에서 -72℃에서 50kGy(4.6kGy/hr)로 조사된 페이스트 유도 알부민의 SDS PAGE는 조사에 의하여 전체 물질의 ~10% 파쇄를 초래하였으 며, 이는 제거제가 있다고 해서 향상되지 않았다.
DSC를 기초로 한 여러 안정제들이 있는 상태에서 분획 Ⅴ알부민의 구조적 회복에 대한 비교는 라우르산(Lauric acid)(91%) 및 비타민 E(87.3%)가 있는 상태에서 알부민의 최상의 회복이 관찰되었음을 보였다. 그러나, 알부민의 회복이 높아진 것 같지만, 이들 수치는 모든 경우에 있어서 단백질의 총 수율이 제거제가 없는 단백질과 비교하면 ~40%이므로 완전한 임상상(picture)을 반영하지 못했다. 첨가제의 존재로 불용성 응집체의 형성에 대한 알부민의 용해도를 크게 변화시켰다.
실시예 12
이 실험에서는, SDS의 유무상태에서 알부민을 조사시켰다.
결과
100μM SDS가 있는 상태는 64℃에서 80.5℃까지 PBS 버퍼(pH 7.0)에서 측정된 알부민의 열적 안정성을 증가시켰다. 이러한 낮은 농도에서, 강한 변성제(denaturant)로서 잘 알려진, SDS는 20℃ 이상에서 안정화시키는 알부민 구조에 대한 반대효과를 가졌다. 이는 SDS가, 라우르산과 같은 지방산의 친화성과는 비교되는, 알부민에 대하여 특이적 결합 친화성을 가지는 것을 나타내었다.
SDS 없이 조사된 알부민에 SDS 첨가는 감마선 조사시에 손상되지 않은 알부민 집단에만 안정을 야기한다. 알려진 바와 같이, 78%의 단백질이 SDS 결합 능력을 가지고 있는 반면에, 25%의 분자들은 조사후에 이 능력을 상실하였고 안정화될 수 없었다. 리간드 결합검사는 원래의 결합성을 상실한 분자들로부터 조사에 의하여 손상되지 않았던 본래 분자들의 집단과 용이하게 식별 및 구분이 가능하게 하였다. 결합성을 상실한 알부민 분자들의 부분은, 저온살균후에 변성물질의 집단을 산출하며, 60℃에서의 열처리에 견디지 못할 것이다. 저온살균된 물질의 열용량 피크는 저온살균전에 관찰되었던 저안정성 집단이 결핍되었으며, 조사되지 않은 단백질의 열용량 피크와 형태가 유사하였다. 이 관찰은 또한 본래의 알부민이 알부민의 원래 형태와 변성된 형태 사이를 식별할 수 있는 방법(예를 들어, 본래 형태와만 상호작용하는 리간드 결합된 매트릭스)에 의하여 저온살균 후에 조사된 부분과 구별될 수 있음을 보였다.
100μM SDS의 유무상태에서 조사된 알부민의 DSC 분석은 부분적인 열용량의 사전변성값에 있어 상당한 차이를 보였으며, 이는 SDS의 존재로 단백질이 조사동안 변성된 상태로의 변형을 방지함을 나타낸다. SDS가 없는 상태에서 조사된 알부민은, 열동역학적 기준에 따라, SDS가 있는 상태에서 조사된 단백질보다 더 많은 변성된 물질을 포함하였다.
저온살균 전후에 SDS가 없는 상태에서 조사된 동일한 알부민 샘플들에 대한 HPLC 분석은 60℃에서 10.5시간동안 (SDS없이 조사된) 이들 샘플의 저온살균이 가교결합된 응집체를 형성하는 것으로 나타났다. 이들 고분자량(MW) 응집체는, 조사동안 이미 변성되었고 열적 안정성이 저온살균동안 60℃보다 더 낮은, 분자 집단으로부터 유도되었다. 감마선 조사동안 손상되지 않았고 이에 따라 SDS에 의하여 안정화 될 수 있는 알부민 분자들은 열 저온살균동안 무결성을 유지하였다.
이들 샘플들에 대한 SDS PAGE 분석은, 만일 알부민이 감마선 조사에 의하여 손상되고 변성된 형태로 변환되면, 변성된 분자들이 10시간의 저온살균동안 S-S 가교결합된 응집체를 형성함을 보였다. 지배적으로 본래 형태로 있었든, 조사되지 않은 알부민은 저온살균동안 응집을 보이지 않았다.
본 실험은 SDS가 있는 상태에서는, 60℃이상에서 단순히 알부민의 열적 안정성을 증가시킬 때, 저온살균동안 알부민 회복을 향상시킬 뿐만 아니라, 조사동안 SDS가 있는 상태에서는 감마선 조사후에도 알부민의 회복을 향상시킬 수 있음을 보였다.
변성을 일으키지 않으며 알부민에 대한 최대 보호효과를 갖는 최적의 SDS 농도를 결정하기 위해, 동결된 및 동결 건조된 2개의 제제에 여러 농도의 SDS가 있는 상태에서의 단백질의 회복을 연구하였다. 다음의 조사 조건을 사용하였다: 50kGy, 4kGy/hr, -72℃.
다음과 같은 SDS 함유 샘플들을 제조하였다: 분획 Ⅴ페이스트로부터 정제된 알부민에 SDS를 첨가하였다. SDS(288.38Da)와 알부민(66470Da)의 MW를 기초로 몰비를 계산하였다. -53℃에서 ~10% 수분량(정확하게 측정되지 않음)으로 샘플들을 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플을 드라이아이스 상에서 50kGy, 1.42kGy/hr로 조사시켰고 조사 후에 pH 7.0, PBS 버퍼속의 분말로부터 재구성하였다. 실험의 특정 목적에 따라, 재구성된 샘플들을 특정 생물학적 측정에 필요로 하거나 PBS 버퍼에 대하여 투석되는 농도로 희석시켰다.
5% 알부민에 대한 또 다른 실험세트를 행하였다. 이 알부민은 상용의 안정제, 각각 4mM 농도의 AT 및 CA가 있는 상태를 제외하고는 페이스트 유도된 알부민으로부터의 구조적 특징에 있어서 어떠한 차이도 보이지 않았다. SDS를 제품에 첨 가시키고 드라이아이스상에 동결된 상태에서 50kGy, 1.415kGy/hr로 조사시켰다.
저온살균 전후 SDS의 유무상태에서 5% 알부민의 조사된 샘플과 대조 샘플에 대한 SDS PAGE 분석은 몰비가 1:10인 SDS가 있는 상태에서는 SDS가 없는 상태에서의 저온살균후에 관찰되곤 했던 S-S 가교결합된 응집체가 사라지게 하였음을 보였다. 몰비가 1:1인 SDS가 있는 상태에서는 응집체의 형성을 방지하는데 충분하지 못했다.
조사된 알부민 샘플의 HPLC 분석은 감마선 조사가 이량체 및 다량체 함량에 있어 단지 미미한 증가를 초래한 반면에, 60℃의 열처리로 분자간 S-S 가교결합을 통하여 형성된 상당한 양의 고분자량 응집체를 생산하였다는 것을 보여주었다. 몰비가 1:10인 SDS가 있는 상태에서의 알부민에 대한 HPLC분석은 SDS 알부민의 농도가 조사된 알부민이 응집되지 않게하여, 조사되지 않은 단백질과 실질적으로 식별되지 않게 함을 보였다.
SDS의 유무상태에서 액체제제에 조사된 알부민에 대한 DSC 분석은 조사동안 SDS의 존재가 알부민의 열적 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라, 더 중요하게는, 조사후에 단백질의 구조적 회복을 증가시킴을 보였다. SDS없이 조사된 알부민과 비교하면, SDS가 있는 상태에서 단백질의 회복은 90%까지 증가되었다. 열량측정 곡선상에 조사된 알부민의 열흡수 피크의 위치는 조사된 분자의 90% 이상이 60℃ 이상에서 안정성을 가지는 것을 나타내며, 이는 60℃에서의 저온살균시에 단백질의 보호가 중요해지는 것으로 예측된다.
저온살균한 다음에 조사된 알부민과 조사되지 않은 알부민에 대한 DSC 분석은 조사된 샘플의 SDS 저온살균을 하지 않은 상태에서는 거의 20% 알부민 변성이 발생한 반면에, SDS 저온살균을 한 상태에서는 단백질 구조에 영향을 끼치지 않았 음을 보였다. 알부민 구조에 대한 SDS의 안정적인 효과는 저온살균동안 조사된 단백질을 손상에 대하여 보호하였다.
여러 양의 SDS가 있는 상태에서 감마선 조사와 저온살균한 다음에 알부민의 구조적 회복에 대한 비교는 단백질/SDS 몰비가 1:1인 SDS가 있는 상태에서는 조사동안 단백질 회복이 약간 증가되었음을 보였다. 그러나, 이 농도로는 저온살균동안 조사된 알부민을 변성에 대하여 보호하지 못했다. 반대로, 단백질/SDS 몰비를 1:10으로 증가시켰을 때 안정성에 있어 증가로 인해 단백질을 감마선 조사 및 저온살균 모두에 대하여 보호하였다.
지금까지 본 발명을 충분히 설명하였으므로, 본 발명의 방법들은 본 발명의 범위 및 실시예로부터 벗어남이 없이 광범위하고 균등한 범위의 조건, 제제 및 다른 파리미터들로 실행될 수 있음을 당업자들이 알게 될 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 출판물들은 그 전체가 참조문헌으로 본명세서에 완전히 포함된다. 어떤 출판물에 대한 인용은 출원일 전에 개시를 위한 것이며 이러한 출판물이 종래기술이거나 본 발명이 종래 발명으로 인해 이러한 출판물에 선행하도록 권리가 부여되지 않는 승인으로서 해석되어서는 안된다.

Claims (97)

  1. 알부민 함유 제제에 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 이의 염 또는 에스테르, DMSO, 만니톨 또는 트레할로스를 포함하는 적어도 하나의 안정제를 첨가하는 단계; 및 알부민 함유 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는데 유효한 시간 동안 3.0kGy/hr 이상의 비율로 상기 제제를 감마 방사선으로 조사하는 단계를 포함하여 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  2. 혈장 단백 제제에 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 이의 염 또는 에스테르, DMSO, 만니톨 또는 트레할로스를 포함하는 적어도 하나의 안정제를 첨가하는 단계; 및 혈장 단백 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는데 유효한 시간 동안 3.0kGy/hr 이상의 비율로 상기 제제를 감마 방사선으로 조사하는 단계를 포함하여 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  3. 혈장 단백 제제에 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 이의 염 또는 에스테르, DMSO, 만니톨 또는 트레할로스를 포함하는 적어도 하나의 안정제를 첨가하는 단계와 감마 방사선으로부터 혈장 단백 제제를 보호하는데 유효한 수준까지 상기 제제의 온도를 감소시키는 단계; 및
    상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는데 유효한 시간 동안 3.0kGy/hr 이상의 비율로 상기 제제를 감마 방사선으로 조사하는 단계를 포함하여 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 감마 방사선으로부터 상기 제제를 보호하는데 효과적인 수준까지 상기 제제에 존재하는 잔여 용매를 감소시키는 단계를 더 포함하여 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 감마 방사선으로부터 상기 제제를 보호하는데 효과적인 수준까지 상기 제제의 온도를 감소시키는 단계를 더 포함하여 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 혈장 단백은 알부민을 포함하는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  9. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 혈장 단백은 응고 단백질, 지질 단백질 및 보체 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 더 포함하는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 응고 단백질은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 폰 빌레브란트 인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  11. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 혈장 단백은 헤모글로빈, 알파-글로빈, 베타-글로빈 및 감마-글로빈으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 생물학적 물질을 더 포함하는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 비율은 6.0kGy/hr 이상인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 비율은 18kGy/hr 이상인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 비율은 30.0kGy/hr 이상인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  15. 제 4 항에 있어서,
    상기 잔여 용매는 물인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  16. 제 4 항에 있어서,
    상기 잔여 용매는 유기 용매인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  17. 제 4 항에 있어서,
    상기 잔여 용매는 동결건조, 건조, 농축, 용질 첨가, 증발, 화학추출, 분무건조(spray-drying) 및 유리화(vitrification)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법에 의하여 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  18. 제 4 항에 있어서,
    상기 감소 후에 상기 제제에 존재하는 상기 잔여 용매의 함량은 10% 이하인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  19. 제 4 항에 있어서,
    상기 감소 후에 상기 제제에 존재하는 상기 잔여 용매의 함량은 5% 이하인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 25℃ 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  24. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 상기 제제의 응결점 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  25. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 상기 제제의 공융점 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  26. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 0℃ 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  27. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 -40℃ 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  28. 제 3 항에 있어서,
    상기 온도는 -60℃ 이하로 감소되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 감마 방사선은 상기 제제를 살균하는데 유효한 시간 동안 조사되는 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  30. 삭제
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  36. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정제는 DMSO인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정제는 만니톨인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정제는 트레할로스인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정제는 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 이의 염인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정제는 아스코르빈산(ascorbic acid)의 염인 상기 제제에서 적어도 하나의 생물학적 오염체 또는 병원체를 불활성화하는 방법.
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