MXPA04001637A

MXPA04001637A - Metodos para la esterilizar preparaciones que contienen albumina.

Info

Publication number: MXPA04001637A
Application number: MXPA04001637A
Authority: MX
Inventors: S Kent Randall
Original assignee: Clearant Inc
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2002-09-03
Publication date: 2005-07-25
Also published as: JP2005505552A; US7252799B2; CA2459413A1; KR100965209B1; US20030213920A1; CN1606457A; EP1432454A2; WO2003020325A3; WO2003020325A2; KR20040032972A

Abstract

Se describen metodos para esterilizar preparaciones que contienen albumina para reducir el nivel de uno o mas contaminantes biologicos o patogenos activos en el mismo, tales como virus, bacterias (que incluyen bacterias intercelulares e intracelulares tales como micoplasmas, ureaplasmas, nanobacterias, clamidias, riquetsias), levaduras, mohos, hongos, priones o agentes similares responsables, solos o combinados, de las TSE o de parasitos unicelulares o multicelulares. Estos metodos involucran esterilizar preparaciones que contienen albumina tales como fracciones de proteina plasmatica, con irradiacion.

Description

MÉTODOS PARA ESTERILIZAR PREPARACIONES QUE CONTIENEN ALBÚMINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para esterilizar preparaciones que contienen albúmina para reducir el nivel de uno o más contaminantes biológicos activos o patógenos en las mismas, tales como virus, bacterias (que incluyen bacterias intercelulares e intracelulares tales como micoplasmas, ureaplasmas, nanobacterias, clamidias y riquetsias), levaduras, mohos, hongos, priones o agentes similares responsables, solos o combinados, de las TSE o parásitos unicelulares o multicelulares. La presente invención se relaciona particularmente con métodos para esterilizar por irradiación preparaciones que contienen albúmina, tales como los productos de la fracción de proteína plasmática (PPF).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La albúmina es una proteína elipsoidal altamente soluble (p.m. 66,500), que constituye 70-80% de la presión osmótica coloidal del plasma. En consecuencia, la albúmina es importante para regular el volumen de sangre circulante. Cuando se inyecta por vía intravenosa, la albúmina 5% incrementará el volumen de plasma circulante en una cantidad aproximadamente igual al volumen suministrado por infusión. Este fluido adicional reduce la hemoconcentración y disminuye la viscosidad sanguínea. El grado y duración de la expansión de volumen dependen del volumen de sangre inicial. Cuando se trata a pacientes con volumen sanguíneo disminuido, el efecto de la albúmina admimstrada por infusión puede perdurar durante muchas horas. En personas con volúmenes sanguíneos normales, la hemodilución dura por un tiempo mucho más breve. La albúmina también es una proteína importante que se une a materiales que se presentan de manera natural, terapéuticos y tóxicos que se encuentren en circulación. La albúmina se distribuye a través del agua extracelular y más del 60% del - 2 - acumulado de albúmina corporal se localiza en el compartimiento de fluido extravascular. La albúmina corporal total de una persona de 70 kg es de aproximadamente 350 g; tiene una duración de vida circulante de 15-20 días con un recambio de aproximadamente 15 g al día. Se desconoce el nivel niínimo de albúmina sérico necesario para evitar o revertir edema periférico. Aunque indudablemente varía de un paciente a otro, existe cierta evidencia de que se encuentra cerca de los 2.5 g por decilitro. Esta concentración proporciona una presión oncótica plasmática de 20 mm Hg (el equivalente de una concentración de proteína total de 5.2 g/dl). Las preparaciones que contienen albúmina incluyen f acciones proteínas plasmáticas y con frecuencia se proporcionan terapéuticamente a humanos y animales. Por ejemplo, las preparaciones que contienen albúmina frecuentemente se administran a humanos para una o más de las siguientes indicaciones: hipovolemia, con o sin choque; hipoalbuminemia que puede resultar de una producción inadecuada de albúmina (debido a mala nutrición, quemaduras, daño mayor, analbuminemia congénita, hepatopatía, infección, cáncer o trastornos endocrinos), catabolismo excesivo (debido a quemaduras, daños mayores, pancreatitis, tirotoxicosis, pénfigo o nefrosis), pérdida de albúmina del cuerpo (debido a hemorragia, excresión renal excesiva, exudados de quemaduras, enteropatía exudativa o dermatosis exfoliativa) o una redistribución de albúmina dentro del cuerpo (debido a cirugía mayor, cirrosis con ascitis o diversas condiciones inflamatorias); antes o durante la cirugía de derivación cardiopulmonar y para el tratamiento de quemaduras o cirrosis. Están disponibles comercialmente o se utilizan una gran cantidad de preparaciones diferentes que contienen albúmina para uso terapéutico y que incluyen, por ejemplo, AlbuminarMR (Centeon/Aventis Behring), BuminateMR (Baxter Laboratories), PlasbuminMR (Bayer Biological), AlbuteinMR (Alpha Therapeutic), Albumin (Human) (Immuno-U.S.) y AlbumarcMR (Cruz Roja Americana) y albúmina sérica humana (Cruz Roja suiza). Los diversos productos de fracción proteínica plasmática también son o se han encontrado disponibles comercialmente y que incluyen, por ejemplo, Plasma-PlexMR (Centeon/Aventis Behring), ProtenateMR (Baxter Laboratories), PlasmanateMR (Bayer Biological) y PlasmateinMR (Alpha Therapeutic). - 3 - La albúmina también se utiliza como un estabilizante en preparaciones de proteínas, naturales o recombinantes diseñadas para uso terapéutico. Por ejemplo, la albúmina se encuentra actualmente como un estabilizante en preparaciones terapéuticas que contienen factor VIII para hemofilia A (tal como RecombinateMR de Baxter-Hyland/Immuno), interferón ß-lb para esclerosis múltiple (tal como BetaseronMR de Berlex Laboratories), eritropoyetina para anemia (tal como EpogenMR de Amgen), alglucerasa, una forma modificada de la enzima ß-glucocerebrosidasa, para enfermedad de Gaucher (tal como CeredaseMR de Genzyme) y antitrombina ?? para deficiencia hereditaria (tal como Thrombate IIIMR de Bayer o AtnativMR de Pharmacia y Upjohn). En tales preparaciones la albúmina puede constituir hasta de 99% del contenido de proteína total. La albúmina también se encuentra como un estabilizante en preparaciones de vacunas tales como vacuna del virus de encefalitis transmitida por ácaros (TBE) y vacunas atenuadas contra los virus del sarampión, paperas y rubéola (tal como MMRn^ de Merck), vacuna antirrábica (tal como RabAvertMR de Chiron e ImovaxMR de Pasteur-Merieux) y vacuna oral antipolio (tal como Evans Polio VaccineMR de Evans/Medeva). En tales preparaciones la albúmina nuevamente constituye más de 99% del contenido total de proteína. Las preparaciones que contienen albúmina también se utilizan como formulaciones nutrientes en medios para cultivo celular, que incluye el cultivo de células (recombinantes o de otro tipo) que producen los productos deseados y producción de vacunas. Tales preparaciones están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich, Irvine Scientific, üitergen y Valley Biomedical. Muchas preparaciones que contienen albúmina que se preparan para uso humano, veterinario, de diagnóstico o experimental pueden contener contaminantes o patógenos biológicos no deseados o potencialmente peligrosos tales como virus, bacterias (que incluye bacterias intercelulares e intracelulares tales como micoplasmas, ureaplasmas, nanobacterias, clamidias y riquetsias), levaduras, mohos, hongos, priones o agentes similares responsables, solos o combinados, de las TSE o de parásitos unicelulares o multicelulares. En consecuencia, es de importancia primordial que cualquier contaminante o patógeno biológico en el material biológico esté inactivado antes de que se utilice el producto. Esto es especialmente crítico cuando el material se va a administrar directamente a un paciente, por ejemplo, en transfusiones sanguíneas, tratamiento de sustitución del factor sanguíneo, transplantes de órganos y otras formas de tratamiento humano corregido o tratado por administración intravenosa, intramuscular u otras formas de inyección o introducción. También es crítico que los diversos materiales biológicos que se preparan en medios o vía cultivos de células o células recombinantes las cuales contienen diversos tipos de plasma o derivados de plasma u otros materiales biológicos y los cuales se pueden someter a contaminantes biológicos patógenos del tipo micoplasma, priones, bacterias virales y de otro tipo. La mayor parte de los procedimientos para producir materiales biológicos han involucrado métodos que criban o prueban los materiales biológicos en búsqueda de uno o más contaminantes biológicos o patógenos particulares en vez de la separación o inactivación de uno o varios de los contaminantes o uno o varios de los patógenos del material. Los materiales que proporcionan un resultado positivo para un contaminante biológico o patógeno simplemente no se utilizan. Los ejemplos de procedimientos de cribado incluyen la prueba para un viras particular en sangre humana de donadores de sangre. No obstante, tales procedimientos no siempre son confiables y no son susceptibles de detectar la presencia de algunos virus, particularmente en cantidades muy pequeñas. Esto reduce el valor de certidumbre de la prueba en vista de las consecuencias asociadas con un resultado negativo falso. Los resultados negativos falsos pueden poner en peligro la vida en ciertos casos, por ejemplo en el caso de síndrome de inmunodefíciencia adquirida (SE) A). Además, en algunos casos, puede requerir semanas, si no meses, determinar si el material está contaminado o no. Por lo tanto, sería deseable aplicar técnicas que destruyan o inactiven contaminantes o patógenos durante o después de la fabricación del material biológico. Además, hasta ahora, no existe una prueba o ensayo confiable para identificar priones dentro de un material biológico que está adecuado par eliminar por cribado donadores potenciales o material infectado. Esto sirve para resaltar la necesidad de un medio eficaz para destruir priones dentro del material biológico y aún así retener la actividad deseada de dicho material. - 5 - Al llevar a cabo experimentos para determinar la capacidad de tecnologías para inactivar el virus, rara vez se utilizan virus reales que generen preocupación. Esto es resultado de los problemas de seguridad para los trabajadores que llevan a cabo las pruebas y la dificultad y gastos relacionados con las instalaciones de contención y el desecho de desperdicios. En su lugar, se utilizan modelos de virus de la misma familia y clase. En general, se reconoce que los virus más difíciles de inactivar son aquellos con una cubierta exterior constituida de proteínas y que, entre estos, los más difíciles de inactivar son aquellos de tamaño más pequeño. Esto ha demostrado ser cierto para irradiación ? y la mayoría de otras formas de radiación pues el tamaño diminuto de estos virus se relaciona con un genoma pequeño. La magnitud de los efectos directos de la radiación sobre una molécula son directamente proporcionales al tamaño de la molécula, cuanto más grande sea la molécula objetivo, mayor será el efecto. Como corolario, se ha demostrado para la irradiación ? que cuanto menor sea el genoma viral, mayor será la dosis de irradiación requerida para inactivarlo. Entre los virus de preocupación de materiales biológicos tanto de humanos como derivados de animales, el más pequeño y por lo tanto el más difícil de inactivar pertenece a la familia de los parvovirus y el virus de hepatitis recubierto con proteína, ligeramente más grande. En los humanos los agentes de preocupación son el parvovirus B 19 y el de la hepatitis A. En materiales derivados de cerdos el virus correspondiente más pequeño es el parvovirus porcino. Puesto que este virus es inocuo en humanos, con frecuencia se selecciona como un modelo de virus para el parvovirus humano B19. Se considera que la demostración de inactivación de este modelo de parvovirus es una prueba adecuada de que el método utilizado destruirá al virus B19 humanos y al de la hepatitis A y, por extensión, que también destruirá a virus más grandes y menos difíciles tales como el de VIH, CMV, de hepatitis B y C, y otros. Los esfuerzos más recientes se han enfocado en métodos para eliminar o inactivar contaminantes en los productos. Tales métodos incluyen tratamiento por calor, filtración y la adición de inactivantes químicos o sensibilizantes al producto. Las normas actuales de la Food and Drug Administration de Estados Unidos exigen que cuando se realice el tratamiento térmico de preparaciones que contienen - 6 - albúmina se calienten a aproximadamente 60°C por un mínimo de 10 horas, lo que puede dañar los materiales biológicos sensibles. En realidad, la inactivación por calor puede destruir 50% o más de la actividad biológica de algunos materiales biológicos. La filtración involucra filtrar el producto con el fin de eliminar físicamente los contaminantes. Desafortunadamente este método también elimina productos que tienen un peso molecular elevado. Además, en algunos casos, no se pueden separar por filtración los virus pequeños. El procedimiento de sensibilización química involucra la adición de agentes nocivos que se unen al ADN/ARN del virus y los cuales se inactivan ya sea por UV u otra radiación. Esta radiación produce intermediarios reactivos o radicales libres los cuales se unen al ADN/ARN del virus, rompen los enlaces químicos en la estructura principal del ADN/ARN y reticulan o forman complejos de manera tal que el virus ya no se pueda replicar. Este procedimiento requiere que el sensibilizante no unido se lave de los productos puesto que los sensibilizantes son tóxicos, si no mutagénicos o carcinogénicos y no se pueden adrninistrar a un paciente. Irradiar el producto con radiación ? es otro método para esterilizar un producto. La radiación ? es eficaz para destruir virus y bacterias cuando se administra en una dosis total alta (Keathly et al., "Is There Life After Irradiation? Parte 2," BioPharm Julio-Agosto, 1993, y Leitman, USe of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusión Graft-vs-Host Disease," Transfusión Science 70:219-239 (1989)). La literatura publicada en esta área no obstante describe que la radiación ? puede ser dañina a productos sensibles a radiación, tales como sangre, productos sanguíneos, proteínas y productos que contienen proteínas. En particular, se ha demostrado que dosis elevadas de radiación son perjudiciales para eritrocitos, plaquetas y granulocitos (Leitman). La patente de E.U..A No. 4,620,908 describe que los productos proteínicos deben ser congelados antes de irradiación con el fin de mantener la viabilidad del producto proteínico. Esta patente concluye que "si se aplica irradiación ? mientras el material de proteína está, por ejemplo, a temperatura ambiente, el material también será destruido completamente, esto es, la actividad del material se volverá tan baja que será virtualmente ineficaz". Desafortunadamente, muchos materiales biológicos sensibles, tales como los anticuerpos monoclonales (Mab) pueden perder viabilidad y actividad si se someten a congelamiento para propósitos de irradiación y después se vuelven a calentar antes de su administración a un paciente. En vista de las dificultades discutidas en lo anterior, aún permanece la necesidad de métodos para esterilizar preparaciones que contengan albúmina que sean eficaces para reducir el nivel de contaminantes biológicos o patógenos activos sin un defecto adverso sobre la preparación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para esterilizar preparaciones que contienen albúmina al reducir el nivel de contaminantes biológicos o patógenos activos sin perjudicar la preparación. Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se establecerán en la descripción detallada de las modalidades preferidas que siguen y en parte serán evidentes de la descripción o se pueden aprender por la práctica de la invención. Estos objetivos y ventajas de la invención se llevarán a cabo y se obtendrán por las composiciones y métodos que se indican particularmente en la descripción escrita y las reivindicaciones de la misma. De acuerdo con ese y otros objetivos, una primera modalidad de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contienen albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) agregar a una preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante en una cantidad eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación a la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar el material. Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz y por un tiempo eficaz para esterilizar a la preparación que contiene albúmina.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a irradiación, que comprende: (i) reducir la temperatura de una preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación a la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina. Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina la cual es sensible a radiación, que comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina un procedimiento de estabilización que se selecciona del grupo que consiste de: (a) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina, (b) agregar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante, y (c) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz y por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina, en donde el procedimiento de estabilización y la tasa de irradiación son juntas eficaces para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina. Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmma que es sensible a radiación, que comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina por lo menos dos procedimientos estabilizantes que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina, (b) agregar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante y (c) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz y por un tiempo eficaz para estebilizar la preparación que contiene albúmina, en donde el procedimiento de estabilización se puede llevar a cabo en cualquier orden y son eficaces, juntos, para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina. La invención también proporciona una preparación que contiene albúmina, que comprende albúmina y por lo menos un estabilizante en una cantidad eficaz para conservar la preparación para su uso propuesto después de la esterilización con radiación. - 9 - La invención también proporciona una preparación que contiene albúmina en la cual se ha reducido el conteindo de solventes residual a un nivel eficaz para conservar la preparación para su uso propuesto después de esterilización con radiación. La invención también proporciona una preparación que contiene albúmina la cual comprende albúmina y por lo menos un estabilizante en el cual se ha reducido el contemdo de solventes residual y en el que la cantidad de estabilizante y el nivel de contenido de solvente residual son juntos eficaces para conservar la preparación para su uso propuesto utilizando esterilización con radiación. La invención también proporciona una preparación que contiene albúmina en donde la concentración de proteína total de la preparación es eficaz para conservar a la preparación para uso propuesto después de esterilización con radiación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A, IB y 1C muestran las fracciones de proteína plasmática que se irradian a diversos niveles de contenido de solvente residual y en presencia o ausencia de estabilizantes volátiles. Las figuras 2A-2F muestran albúmina humana (25%) a la que se le ha agregado 1:100 con homogeneizado de cerebro 10% de encefalopatía espongiforme ovina adaptada a hámster (cepa 263K) que se ha irradiado y ensayado para determinar la infectividad de la encefalopatía espongiforme ovina. Las figuras 3A y 3B muestran albúmina liofilizada (que contiene urocinasa 5%) irradiada a una dosis total de 10 a 40 kGy. Las figuras 4A-4B muestran muestras de albúmina irradiada con o sin purgado previo con argón. Las figuras 5A-5F muestran muestras de solución de albúmina 25% irradiadas a una dosis total de 18.1, 23 y 30.4 kGy y sometidas a ensayos por SDS-PAGE para determinar agregación y fragmentación y por HPLSEC para dimerización y polimerización. La figura 6A es una gráfica que muestra la reducción de la carga viral en - 10 - fracciones de proteína plasmática a las que se les ha agregado PPV después de irradiación ?. Las figuras 6B-6C son geles que muestran los resultados del análisis por SDS-PAGE de las fracciones de proteína plasmática irradiada. La figura 7 es una gráfica que muestra la actividad del factor VIH en una preparación que contiene albúmina y factor VIH después de irradiación ?.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS A. Definiciones A menos que se indique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente se pretende que tengan el mismo significado al comprendido habitualmente por una persona habitualmente experta en la técnica pertinente. Como se utiliza en la presente, las formas singulares de los términos en inglés "a", "an" y "the" incluyen una referencia al plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Como se utiliza en la presente, se pretende que el término "preparación que contiene albúmina" signifique cualquier preparación derivada u obtenida de un organismo vivo que contenga la proteína sanguínea albúmina, recombinante y transgénica, tanto en la secuencia nativa como la modificada o una variante o derivado de la misma. Los ejemplos ilustrativos de preparación que contienen albúmina incluyen, pero no se limitan a Albuminar R (Centeon/Aventis Behring), BuminateMR (Baxter Laboratories), PlasbuminMR (Bayer Biological), AlbuteinMR (Alpha Therapeutic), Albumin (Human) (Immuno-U.S.) y AlbumarcMR (Cruz Roja Americana) y productos de fracción de proteína plasmática que incluyen, por ejemplo, Plasma-PlexMR (Centeon/Aventis Behring), ProtenateMR (Baxter Laboratories), PlasmanateMR (Bayer Biological) y PlasmateinMR (Alpha Therapeutic). Como se utiliza en la presente, el término "esterilizar" se pretende que signifique una reducción en el nivel de por lo menos un contaminante biológico o patógeno activo encontrados en la preparación que contiene albúmina que es tratada, de acuerdo con la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término "material biológico" se pretende - 11 - que signifique cualquier sustancia derivada u obtenida de un organismo vivo. Los ejemplos ilustrativos de materiales biológicos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: células; tejidos; sangre o componentes sanguíneos; proteínas que incluyen proteínas recombinantes y transgénicas así como materiales proteináceos; enzimas, que incluyen enzimas digestivas tales como tripsina, quimiotripsina, a-galactosidasa, y yoduronodato-2-sulfatasa; inmunoglobulinas que incluyen monoinmunoglobulinas y poliinmunoglobulinas; sustancias botánicas; alimentos y similares. Los ejemplos preferidos de materiales biológicos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: ligamentos; tendones; nervios que incluyen matriz ósea desmineralizada, injertos, articulaciones, fémures, epífisis femorales, etc.; dientes; injertos cutáneos; médula ósea que incluye suspensiones de células de médula ósea, completas o procesadas; válvulas cardíacas; cartílago; córneas, arterias y venas; órganos que incluyen órganos para transplante tales como corazones, hígados, pulmones, ríñones, intestinos, páncreas, extremidades y dedos; lípidos; carbohidratos; colágeno que incluye las formas nativa, afibrilar, atelomérica, soluble e insoluble, recombinante y transgénica tanto de la secuencia nativa como de la modificada; quitina y sus derivados que incluyen quitosana NO-carboxi ( OCC); hemocitoblastos, islotes de células de Langerhans y otras células para transplante que incluyen células alteradas genéticamente; eritrocitos; leucocitos que incluye a monocitos y plaquetas. Como se utiliza en la presente, el término "contaminante biológico o patógeno" se pretende que signifique un contaminante biológico o patógeno que, ante el contacto directo o indirecto con una preparación que contiene albúmina, pueda tener un efecto perjudicial en la preparación que contiene albúmina o a quien reciba la misma. Tales contaminantes biológicos o patógenos adicionales incluyen varios virus, bacterias (que incluye bacterias intercelulares e intracelulares tales como micoplasmas, ureaplasmas, nanobacterias, clamidias y riquetsias), levaduras, mohos, hongos, priones o agentes similares responsables, solos o combinados, de las TSE o de parásitos unicelulares o multicelulares conocidos por los expertos en la técnica y que generalmente se encuentran o infectan en preparaciones que contienen albúmina. Los ejemplos de contaminantes biológicos o patógenos adicionales incluyen, pero no se limitan a los siguientes: virus tal como el virus de inmunodeficiencia humana u otros retrovirus, herpesvirus, filovirus, - 12 - circovirus, paramixovirus, citomegalovirus, virus de hepatitis (que incluye hepatitis A, B y C y variantes de las mismas), virus pox, virus toga, virus de Ebstein-Barr y parvovirus; bacterias tales como Escherichia, Bacillus, Campylobacter, Streptococcus y Staphalococcus; nanobactenas; parásitos tales como Trypanosoma y los parásitos del paludismo, que incluyen a la especie Plasmodium; levaduras; mohos; hongos; micoplasmas y ureaplasmas; clamidias; riquetsias tales como Coxiella bumetti; y priones y agentes similares responsables, solos o combinados, de uno o más estados de enfermedad conocidos como encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) en mamíferos tal como la encefalopatía espongiforme ovina, encefalopatía transmitible de mink, enfermedad de desperdicio crónico (observada generalmente en Cariacu (Cariacus macrotis) y alce (Alces alces)), encefalopatía espongiforme felina, encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas), enfermedad de Jakob o encefalopatía espongiforme humana (que incluye la variante de CJD), insomnio familiar mortal, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker y, kuru y síndrome de Alpers. Como se utiliza en la presente, el término contaminante biológico o patógeno activo" se pretende que signifique un contaminante biológico o patógeno que sea capaz de provocar un efecto perjudicial, solo o combinado con otro factor, tal como un segundo contaminante biológico o patógeno o una proteína nativa (de tipo silvestre o mutante) o anticuerpo, en la preparación que contiene albúmina o un receptor de la misma. Como se utiliza en la presente, el término "componentes sanguíneos" se pretende que signifiquen uno o más de los componentes que se pueden separar de sangre completa y que incluyen, pero que no se limitan a los siguentes: componentes sanguíneos celulares tales como eritrocitos, leucocitos y plaquetas; proteínas sanguíneas tales como factores de coagulación sanguínea, enzimas, albúminas, plasminógeno, fíbrinógeno e inmunoglobulinas; y componentes sanguíneos líquidos tales como plasma, f acción proteínica plasmática (PPF), crioprecipitado, f acciones plasmáticas y composiciones que contienen plasma. Como se utiliza en la presente, el término "componente sanguíneo celular" se pretende que signifique uno o más de los componentes de la sangre completa que comprenden células, tales como eritrocitos, leucocitos, hemocitoblastos y plaquetas. - 13 - Como se utiliza en la presente, el término "proteína sanguínea" se pretende que signifique una o más proteínas que normalmente se encuentran en sangre completa. Los ejemplos ilustrativos de proteínas sanguíneas encontradas en mamíferos, incluyendo los humanos, incluyen, pero no se limitan a las siguientes: proteínas de coagulación tales como las dependientes de vitamina K, tales como el factor VII y factor IX, y las no dependientes de vitamina K tal como el factor VIH y el factor de von Willebrands; albúmina; lipoproteínas que incluyen lipoproteínas de alta densidad y lipoproteínas de baja densidad; proteínas de complemento; globulinas tales como inmunoglobulinas IgA, IgM, IgG e IgE; y similares. Un grupo preferido de proteínas sanguíneas incluyen al factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), factor G? (factor tisular), factor V (proacelerina), factor VI (acelerina), factor VII (proconvertina, conversión de protrombina sérica), factor VITí (factor A antihemoñlico), factor IX (factor B antihemoñlico), factor X (factor de Stuart-Prower), factor XI (antecedente de tromboplastina plasmática), factor ?? (factor Hageman), factor ?G? (protransglutamidasa), factor de von Willebrands (vWF), factor la, factor Ha, factor Hía, factor Va, factor Vía, factor Vlla, factor Vffla, factor Ka, factor Xa, factor Xla, factor XHa y factor XHIa. Otro grupo preferido de proteínas sanguíneas incluyen proteínas que se encuentran dentro de los eritrocitos tales como hemoglobina y diversos factores de crecimiento y derivados de estas proteínas. Otro grupo preferido adicional de proteínas sanguíneas incluyen proteínas que se encuentran en productos de fracciones proteínicas plasmáticas disponibles comercialmente tales como Plasma-Plex R (Centeon/Aventis Behring), ProtenateMR (Baxter Laboratories), PlasmanteMR (Bayer Biological) y PlasmateinMR (Alpha Therapeutic). Como se utiliza en la presente, el término "componente sanguíneo líquido" se pretende que signifique uno o más de los componentes fluidos, no celulares de sangre completa, tales como plasma (la porción no celular y fluida de la sangre completa de humanos o animales como se encuentra antes de la coagulación) y suero (la porción no celular fluirá de la sangre completa de humanos o animales como se encuentra después de la coagulación). Como se utiliza en la presente, una "solución biológicamente compatible" se pretende que signifique una solución a la cual se le puede exponer una preparación que - 14 - contiene albúmina, por ejemplo al ser suspendida o disuelta en la misma y permanecer viable, es decir, retener sus características biológicas y fisiológicas esenciales. Como se utiliza en la presente, el término "una solución amortiguada biológicamente compatible" se pretende que signifique una solución biológicamente compatible que tiene un pH y propiedades osmóticas (por ejemplo tonicidad, osmolalidad o presión oncótica), adecuada para mantener la integridad de uno o varios de los materiales en la misma. Las soluciones amortiguadas biológicamente compatibles adecuadas típicamente tiene un pH entre 4 y 8.5 y son isotónicas o solo moderadamente hipotónicas o hipertónicas. Las soluciones amortiguadas biológicamente compatibles son conocidas y están disponibles fácilmente para los expertos en la técnica. Como se utiliza en la prseente el término "estabilizante" se pretende que signifique un compuesto o material que reduce el daño a la preparación que contiene albúmina que es irradiada a un nivel que es insuficiente para impedir el uso seguro y eficaz del material. Los ejemplos ilustrativos de estabilizantes incluyen, pero no se limitan a los siguientes: antioxidantes, eliminadores de radicales libres, que incluyen trampas de spin; estabilizantes de combinación, es decir, estabilizantes los cuales son eficaces para inactivar las reacciones fotodinámicas tipo I y tipo ?; y ligandos tales como heparina que estabilizan las moléculas a las cuales se unen. Los ejemplos preferidos de estabilizantes incluyen, pero no se limitan a los siguientes: etanol; acetona; ácidos grasos que incluye ácido 6,8-dimercaptooctanoico (ácido lipoico) y sus derivados y análogos (ácido a, ß, dihidro, bisno y tetranor lipoico), ácido tioctico, ácido 6,8-dimercaptooctanoico, dihidrolopato (éster metílico del ácido DL-6,8-ditioloctanoico), lipoamida, bisonormetiléster y ácido tetranor-dihidrolipoico, ácidos grasos de fürano, ácidos oleico y linoleico y palmítico y sus sales y derivados, flavonoides, fenilpropanoides y flavenoles tales como quercetina, rutina y sus derivados; apigenina, aminoflavona, catequina, hesperidina y naringina; carotenos, que incluyen caroteno ß; Co-Q10; xantófilos; alcoholes polihídricos tales como glicerol, manitol; azúcares tales como xilosa, glucosa, ribosa, mañosa, fructosa y trihalosa; aminoácidos y derivados de los mismos, tales como histidina, N-acetilcisteína (NAC), ácido glutámico, triptofano, caprilato de sodio, N-acetiltriptofano y metionina; azidas tales como azida de sodio; enzimas tal como superóxido dismutasa (SOD) y catalasa; ácido úrico - 15 - y sus derivados tales como ácido 1,3-dimetilúrico y dimetiltiourea; alopurinol; tioles tales como glutation y glutation reducido y cisterna; elementos en trazas, tales como selenio; vitaminas tales como vitamina A, vitamina C (que incluye sus derivados y sales tales como ascorbato de sodio y ácido palmitoil ascórbico) y vitamina E (y sus derivados y sales tales como acetato de tocoferol y a-tocotrienol); cromanol-a-C6; ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) y derivados; proteínas extrañas tales como gelatina y albúmina; tris-3-metil-l-fenil-2-pirazolin-5-ona (MCI- 186), citiolona; puercetina; crisina; sulfóxido de dimetilo (DMSO); ácido piperazindietansulfónico (PIPES); imidazol; metoxipsoraleno (MOPS); l,2-ditian-4,5-diol; sustancias reductoras tales como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT); colesterol; probucol; derivados de indol; timerosal; lazaroide y mesilato tirilazado; proantenoles; proantocianidinas; sulfato de amonio; Pegorgotein (PEG-SOD); N-terbutil-a-fenilnitrona (PBN); 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-l-oxilo (Tempol); mezclas de ascorbato, urato y Trolox C (Asc/urato/Trolox C); proteínas y péptidos tales como glicilglicina y carnosína en las cuales cada aminoácido puede estar en la forma D o L; diosmina; pupurogalina; ácido gálico y sus derivados que incluyen pero que no se limitan a galato de propilo, formaldehído sulfoxilato de sodio y silimarina. Los ejemplos particularmente preferidos incluyen estabilizantes solos o combinaciones de estabilizantes que son eficaces para inactivar las reacciones fotodinámicas tanto tipo I como tipo ? y estabilizantes volátiles, los cuales se pueden aplicar como un gas o se pueden separar fácilmente por evaporación, presión baja y métodos similares. Como se utiliza en la presente, el término "contenido de solvente residual" se pretende que signifique la cantidad o proporción de líquido disponible libremente en la preparación que contiene albúmina. Un líquido disponible libremente significa el líquido, tal como agua o un solvente orgánico (por ejemplo etanol, isopropanol, acetona, polietilenglicol, etc.), presente en la preparación que contiene albúmina que se esteriliza y que no está unido o que forme complejos con uno o más de los componentes no líquidos de la preparación que contiene albúmina. El líquido disponible libremente incluye agua intracelular. El contenido de solvente residual relacionado como agua se hace referencia en la presente a niveles determinados por la aprobación de la FDA, determinados por el método modificado de Karl Fischer (Meyer y Boyd, Analitical Chem, 57:215-219, 1959; mayo, et al, J. Biol. Standardization, 10:249-259, 1982; Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Expediente No. 89D-0140, 83-93; 1990) o por espectroscopia infrarroja cercana. La cuantiñcación de los niveles o concentraciones residuales de otros solventes se puede determinar por métodos bien conocidos en la técnica, dependiendo del tipo de solvente que se utilice. La proporción de solvente residual respecto al soluto también se puede considerar como un reflejo de la concentración del soluto dentro del solvente. Cuando se expresa de esta manera, cuanto mayor sea la concentración del soluto, menor será la cantidad del solvente residual. Como se utiliza en la presente, el término "sensiblizante" se pretende que signifique una sustancia que se dirige selectivamente a contaminantes virales, bacterianos, priones o parásitos, volviéndolos más sensibles a inactivación por radiación y por lo tanto se permite el uso de una tasa o dosis de radiación menor o un tiempo de irradiación más corto en comparación con la ausencia del sensiblizante. Los ejemplos ilustrativos de sensibilizantes adecuados incluyen, pero no se limitan a los siguiente: psoraleno y sus derivados análogos (que incluye 3-carboetoxipsoralenos); inactinas y sus derivados y análogos; angelicinas, quelinas y coumarinas las cuales contienen un sustituyente halógeno y una porción de solubilización de agua, tal como ión de amonio cuaternario o ión fosfonio; compuestos que unen ácido nucleico; hematoporfirina bromada; ftalocianinas; purpurinas; porforinas; derivados halogenados o sustituidos con átomos metálicos de ésteres de dihematoporfirina, derivados de hematoporfirina, derivados de benzoporñrina, hidrodibenzoporfirina dimaleünida, hidrodibenzoporfirina, dicianodisulfona, tetracarbetoxi hidrodibenzoporfirina y tetracarbetoxi Wdrodiberizoporfirina dipropionamida; doxorrubicina y daunomicina, la cual se puede modificar con halógenos o átomos metálicos; netropsina; péptido BD, péptido S2; S-303 (compuesto ALE); colorantes tales como hipericina, azul de metileno, eosina, fluoresceínas (y sus derivados), flavinas, merocianina 540; compuestos fotoactivos tales como bergapteno; y péptido SE. Además, átomos los cuales se unen a priones y de esta manera incrementan su sensibilidad a inactivación por radiación también se pueden utilizar. Un ejemplo ilustrativo de tal átomo sería el ión cobre, el cual se une a la proteína prión y, con un número Z mayor que el de - 17 - otxos átomos en la proteína, incrementa la probabilidad de que la proteína prión absorbe energía durante la irradiación, particularmente irradiación ?. Como se utiliza en la presente, el término "material proteináceo" se pretende que signifique cualquier material derivado u obtenido de un organismo vivo que comprende por lo menos una proteína o péptido. Un material proteináceo puede ser un material que se presente de manera natural, ya sea en su estado nativo o después de procesamiento/purificación o formación de derivados, o un material producido artificialmente, producido por síntesis química o tecnología recombinante/transgénica y, opcionalmente, procesado/purificado o derivatizado (formando un derivado). Los ejemplos ilustrativos de materiales proteináceos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: proteínas y péptidos producidos a partir de cultivo celular; leche y otros productos lácteos; ascitis; hormonas; factores de crecimiento; materiales que incluyen sustancias farmacéuticas extraídas o aisladas de tejido animal, tal como heparina e insulina; o material vegetal; plasma que incluye la fracción proteiníca plasmática fresca, congelada y liofilizada; fibrinógeno y derivados del mismo, fibrina, fibrina I, fibrina ?, fibrina soluble y monómero de fibrina, o productos sellantes de fibrina; sangre completa; proteína C; proteína S; a-1 -antitripsina (a- 1 -inhibidor de proteasas); butil-colinesterasa, anticoagulantes tales como medicamentos cumarínicos (warfarina); estreptocinasa; activador plasminógeno tisular (tPA); eritropoyetina (EPO); urocinasa; neupogen; antitrombina-3; a-glucosidasa; suero bovino (fetal)/suero equino; carne; inmunoglobulinas que incluye antisueros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos sometidos a ingeniería genética o producidos; albúmina; a-globulinas; ß-globulinas; ?-globulinas; proteínas de coagulación; proteínas de complemento e interferones. Como se utiliza en la presente, el término "radiación" se pretende que signifique radiación de energía suficiente para esterilizar por lo menos algunos de los componentes de la preparación irradiada que contiene albúmina. Los tipos de radiación incluyen, pero no se limitan a los siguientes: (i) corpuscular (corrientes de partículas subatómicas tales como neutrones, electrones o protones); (ii) electromagnéticas (que se originan en un campo electromagnético variable tales como las ondas de radio, luz visible (monocromática y policromática) y luz invisible; radiación infrarroja, ultravioleta, rayos X - 18 - y rayos ? y mezclas de los mismos); y (iii) ondas de sonido y presión. Tal radiación con frecuencia se describe ya sea como radiación ionizante (capaz de producir iones en materiales irradiados), tales como rayos ?, o bien radiación no ionizante, tal como la luz visible. Las fuentes de tal radiación pueden variar, en general, la selección de la fuente específica de radiación no es crítica con la condición de que se suministre radiación suficiente en un tiempo apropiado y a una tasa apropiada para llevar a cabo la esterilización. En la práctica, la radiación ? habitualmente se produce por isótopos de cobalto o cesio mientras que la radiación UV y los rayos X se producen por máquinas que emiten radiación UV y rayos X, respectivamente y los electrones con frecuencia se utilizan para esterilizar materiales en un método conocido como irradiación de "haz E" que involucra su producción por medio de una máquina. La luz visible, monocromática y policromática es producida por máquinas y, en la práctica, se puede combinar con luz visible tal como infrarroja y UV que se producen por la misma máquina o por una máquina diferente. Como se utiliza en la presente, el término "proteger" se pretende que significa reducir cualquier daño a la preparación que contiene albúmina que es irradiada, que de otra manera resultaría en irradiación de dicho material a un nivel que es insuficiente para impedir el uso inocuo y eficaz del material después de la irradiación. En otras palabras, una sustancia o procedimiento "protege" de la radiación a una preparación que contiene albúmina si la presencia de la sustancia o la realización del proceso resulta en menos daño al material por irradiación en comparación con la ausencia de la sustancia o procedimiento. De esta manera, la preparación que contiene albúmina se puede utilizar de manera segura y eficaz después de irradiación en presencia de una sustancia o después de la realización de un procedimiento que "protege" al material, pero que no se utilizaría de manera segura y eficaz después de irradiación bajo condiciones idénticas pero en ausencia de dicha sustancia o de la realización de dicho procedimiento.

Modalidades preferidas particularmente Una primera modalidad preferida de la pésente invención se relaciona con método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a - 19 - radiación, que comprende irradiar con radiación a la preparación que contiene albúmina, durante un tiempo eficaz para esterilizar el material a una tasa eficaz para esterilizar el material y proteger al material de la radiación. Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) agregar a una preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante en una cantidad eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar el material. Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina. Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) reducir la temperatura de una preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina. Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a la radiación, que comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina un procedimiento estabilizante que se selecciona del grupo que consiste de: (a) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina, (b) agregar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante, y (c) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina, en donde el procedimiento de estabilización y la tasa de - 20 - irradiación son eficaces juntas para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina. Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona con un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, que comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina por lo menos dos procedimientos estabilizantes que se seleccionan del grupo de: (a) reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina, (b) agregar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante, y (c) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar con radiación a la preparación que contiene albúmina a una tasa eficaz y por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina, en donde el procedimiento de estabilización se puede llevar a cabo en cualquier orden y juntos son eficaces para proteger de radiación a la preparación que contiene albúmina. De acuerdo con algunos métodos de la presente invención, se agrega un estabilizante antes de irradiación con radiación a la preparación que contiene albúmina.

Este estabilizante preferiblemente se agrega a la preparación que contiene albúmina en una cantidad que es eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina.

Las cantidades adecuadas de estabilizante pueden variar en base en ciertas características de uno o varios métodos particulares de la presente invención que se utilicen, tales como el estabilizante particular que se utilice o la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúmina que es irradiada o su uso propuesto, y se puede determinar empíricamente por los expertos en la técnica. De acuerdo con ciertos métodos de la presente invención, el contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina se reduce antes de irradiación con radiación a la preparación que contiene albúmina. El contenido de solvente residual preferiblemente se reduce a un nivel que es eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina. Tales niveles o concentraciones de contenido de solvente residual pueden variar en base en ciertas características de uno o varios de los métodos particulares de la presente invención que se utilicen, tales como la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúmina que es irradiada, o su uso - 21 - propuesto y se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Puede haber preparaciones que contengan albúmina para las cuales sea deseable mantener el contenido de solvente residual dentro de un intervalo particular, en vez de un valor específico. Cuando el solvente es agua, y particularmente cuando la preparación de una o más enzimas digestivas está en una fase sólida, el contenido de solvente residual generalmente es menor de 15%, típicamente menor de aproximadamente 10%, y de manera más típica menos de aproximadamente 9%, incluso de manera más típica menos de aproximadamente 8% y habitualmente menos de aproximadamente 5%, preferiblemente menos de aproximadamente 3.0%, y de manera más preferible menos de aproximadamente 2.0%, e incluso de manera mucho más preferible menos de aproximadamente 1.0%, de modo aún más preferible menos de aproximadamente 0.5%, de manera aún mucho más preferible menos de aproximadamente 0.2% y la manera mucho más preferible es menor de aproximadamente 0.08%. El solvente preferiblemente puede ser un solvente no acuoso, de manera más preferible un solvente no acuoso que no sea susceptible a formación de radicales libres cuando se somete a irradiación, y de manera más preferible un solvente no acuoso que no sea susceptible a la formación de radicales libres cuando se somete a irradiación y que tiene poco o nulo oxígeno disuelto u otros gases que sean susceptibles de formación de radicales libres cuando se someten a irradiación. Los solventes no acuosos volátiles son los que se prefieren de manera particular, e incluso se prefieren de manera más particular solventes no acuosos que sean estabilizantes, tales como etanol y acetona. En algunas modalidades de la presente invención el solvente puede ser una mezcla de agua y uno o varios solventes no acuosos tales como etanol o acetona. En tales modalidades, uno o varios de los solventes no acuosos preferiblemente es un solvente no acuoso que no es susceptible a la formación de radicales libres cuando se somete a radiación y de manera más preferible un solvente no acuoso que no es susceptible a la formación de radicales libres cuando se somete a irradiación y que tiene poco o nulo oxígeno disuelto u otros gases que sean susceptibles de formación de radicales libres cuando se somete a irradiación. Los solventes no acuosos volátiles se prefieren - 22 - particularmente, incluso se prefieren de manera más particular solventes no acuosos que son estabilizantes, tales como etanol y acetona. En una modalidad preferida, cuando el solvente residual es agua, el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina se reduce al disolver o suspender la preparación que contiene albúmina en un solvente no acuoso que sea capaz de disolver agua. Preferiblemente, tal solvente no acuoso no es susceptible a la formación de radicales libres cuando se somete a irradiación o tiene poco o nada de oxígeno disuelto o de otros gases que sean susceptibles a la formación de radicales libres cuando se someten a irradiación. Cuando la preparación que contiene albúmina está en una fase líquida, el contenido de solvente residual se puede llevar a cabo por cualquiera de numerosos medios, por ejemplo al incrementar la concentración de soluto. De esta manera, la concentración de proteína en la preparación que contiene albúmina disuelta dentro del solvente se puede incrementar a generalmente por lo menos aproximadamente 0.5%, típicamente por lo menos aproximadamente 1%, habitualmente por lo menos aproximadamente 5%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 10%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 15%, de manera incluso más preferible por lo menos aproximadamente 20%, de manera aún mucho más preferible por lo menos aproximadamente 25%, y la manera más preferible, de por lo menos aproximadamente 50%. En algunas modalidades de la presente invención, el contemdo de solvente residual de una preparación particular que contiene albúmina se puede encontrar dentro de un intervalo, en vez de estar en un punto específico. Tal intervalo para el contenido de solvente residual preferido de una preparación particular que contiene albúmina se puede determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Aunque no se desea unirse a alguna teoría de operabilidad, se considera que la reducción en el contenido de solvente residual reduce los grados de libertad de la preparación que contiene albúmina, reduce el número de objetivos para generación de radicales libres y puede limitar la solubilidad de dichos radicales libres. Por lo tanto, se obtendrían resultados similares al disminuir la temperatura de la preparación que contiene - 23 - albúmina, por debajo de su temperatura eutéctica o por debajo de su temperatura de congelamiento, o por vitrificación o de igual manera al reducir los grados de libertad de la preparación que contiene albúmina. Estos resultados pueden permitir el uso de una tasa o dosis de radiación mayor que de otra manera no sería aceptable. De esta manera, los métodos que se describen en la presente se pueden llevar a cabo a cualquier temperatura que no resulte en daño inaceptable para la preparación que contiene albúmina, es decir, daño que de otra manera impediría el uso inocuo y eficaz de la preparación que contiene albúmina. Preferiblemente, los métodos que se describen en la presente se realizan a temperatura ambiente o por debajo de la temperatura ambiente, por ejemplo debajo de la temperatura eutéctica o la temperatura de congelamiento de la preparación que contiene albúmina que es irradiada. De acuerdo con los métodos de la presente invención, un "nivel aceptable" de daño puede variar en base en ciertas características de uno o varios de los métodos particulares de la presente invención que se utilicen, tales como la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúrnina o del estabilizante dipeptídico que se utilice, del uso propuesto de la preparación que contiene albúmina que es irradiada y se puede determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Un "nivel inaceptable" por lo tanto sería un nivel de daño que puede impedir el uso inocuo y eficaz de la preparación que contiene albúmina que es esterilizada. El nivel particular de daño en una preparación dada que contiene albúrnina se puede determinar utilizando cualquiera de los métodos y técnicas conocidos por los expertos en el arte. El contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina se puede reducir por cualquiera de los métodos y técnicas conocidos por los expertos en la técnica para reducir el solvente de una preparación que contiene albúminas y producir un nivel inaceptable de daño a la preparación que contiene albúmina. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a evaporación, concentración, concentración centrífuga, vitrificación y secado por aspersión. Un método particularmente preferido para reducir el contenido de solvente residual de una preparación que contiene albúmina es liofilización. Otro método particularmente preferido para reducir el contenido de solvente - 24 - residual de una preparación que contiene albúmina es vitrificación, lo cual se puede llevar a cabo por cualquiera de los métodos y técnicas conocidos por los expertos en la técnica que incluyen la adición de soluto o de solutos adicionales, tales como sacarosa, para incrementar la temperatura eutéctica de la preparación que contiene albúmina, seguido por una aplicación gradual de presión reducida la preparación que contiene albúmina con el fin de eliminar el solvente residual, tal como agua. El material vitreo resultante después tendrá un contenido reducido de solvente residual. De acuerdo con algunos métodos de la presente invención, la preparación que contiene albúmina que se va a esterilizar se puede inmovilizar sobre una superficie sólida por cualquier medio conocido y disponible para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la preparación que contiene albúmina que se va a esterilizar puede estar presente como un recubrimiento o superficie sobre un sustrato biológico o no biológico. La radiación utilizada en los métodos de la presente invención puede ser cualquier radiación eficaz para la esterilización de la preparación que contiene albúmina que es tratada. La radiación puede ser corpuscular, que incluye radiación de haz E. Preferiblemente, la radiación es radiación electromagnética, que incluye rayos X, infrarrojo, luz visible, radiación UV y mezclas de diversas longitudes de ondas de radiación electromagnética. Una forma particularmente preferida de radiación es la radiación ?. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la preparación que contiene albúmina se irradia con la radiación a una tasa eficaz para la esterilización de la preparación que contiene albúmina, mientras no produzca un nivel inaceptable de daño a dicho material. Las tasas de irradiación adecuadas pueden variar en base en ciertas características de los métodos de la presente invención que se utilicen, tales como la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúmina que es irradiada, la forma particular de radiación involucrada o los contaminantes biológicos o patógenos particulares que se inactiven. Las tasas de irradiación adecuadas se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Preferiblemente, la tasa de irradiación es constante para la duración del procedimiento de esterilización. Cuando esto no es práctico o no se desea por algún otro motivo, se puede utilizar irradiación variable o discontinua.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, la tasa de irradiación se puede optimizar para producir la combinación más ventajosa de recuperación de producto y tiempo requerido para completar la operación. Se pueden utilizar las tasas bajas (< kGy/hora) como altas (>3 kGy/hora) en los métodos que se describen en la presente para obtener tales resultados. La tasa de irradiación preferiblemente se selecciona para optimizar la recuperación de la preparación que contiene albúmina mientras se esteriliza la preparación que contiene albúmina. Aunque la reducción en la tasa de irradiación puede servir para disminuir el daño a la preparación que contiene albúmina, también resultará en tiempos de irradiación más prolongados necesarios para obtener una dosis total deseada particular. Por lo tanto, una tasa de dosis más alta se puede preferir en algunas circunstancias, de manera que se minimicen los peligros logísticos y costos, y puede ser posible cuando se utilice de acuerdo con los métodos que se describen en la presente para proteger de irradiación a una preparación que contiene albúmina. De acuerdo con una modalidad preferida particularmente de la presente invención, la tasa de irradiación es no mayor de aproximadamente 3.0 kGy/hora, de manera más preferible entre aproximadamente 0.1 kGy/hora y 3.0 kGy/hora, e incluso de manera más preferible entre aproximadamente 0.25 kGy/hora y 2.0 kGy/hora, de manera incluso más preferible entre aproximadamente 0.5 kGy/hora y 1.5 kGy/hora y de manera mucho más preferible entre aproximadamente 0.5 kGy/hora y 1.0 kGy/hora. De acuerdo con otra modalidad preferida particularmente de la presente invención, la tasa de irradiación es por lo menos aproximadamente 3.0 kGy/hora, de manera más preferible de por lo menos aproximadamente 6 kGy/hora, e incluso de manera más preferible de por lo menos aproximadamente 16 kGy/hora, e incluso de manera más preferible por lo menos aproximadamente 30 kGy/hora, y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 45 kGy/hora o mayor. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la preparación que contiene albúmina y que se va a esterilizar se irradia con radiación durante un tiempo eficaz para la esterilización de la preparación que contiene albúmina. Combinado con la tasa de irradiación, el tiempo de irradiación apropiado resulta en una dosis de irradiación apropiada que se aplica a la preparación que contiene albúmina. Los tiempos de irradiación adecuados pueden variar en base en la forma y tasa particulares de radiación involucrada así como la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúmina que se va a irradiar. Los tiempos adecuados de irradiación se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la preparación que contiene albúmina que se va a esterilizar es irradiada con radiación hasta una dosis total eficaz para la esterilización de la preparación que contiene albúmina, mientras no produzca un nivel inaceptable de daño a dicho material. Las dosis totales adecuadas de radiación pueden variar en base en ciertas características de los métodos de la presente invención que se utilicen, tales como la naturaleza y características de la preparación particular que contiene albúmina que es irradiada, la forma particular de radiación involucrada con los contaminantes biológicos o patógenos particulares que se inactiven. Las dosis de radiación total adecuadas se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Preferiblemente, la dosis total de radiación de por lo menos 25 kGy, de manera más preferible de por lo menos 45 kGy, e incluso de manera más preferible por lo menos 75 kGy, y de manera aún mucho más preferible por lo menos 100 kGy o mayores, tales como 150 kGy o 200 kGy o mayores. La geometría particular de la preparación que contiene albúmina y que se va a irradiar, tal como el espesor y la distancia desde la fuente de radiación, se puede determinar empíricamente por un experto en la técnica. De acuerdo con algunos métodos de la presente invención, una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto sensibilizante se puede agregar opcionalmente a la preparación que contiene albúmina antes de irradiación, por ejemplo, para mejorar el efecto de la irradiación sobre uno o varios contaminantes biológicos o patógenos en la misma, mientras se utilizan los métodos que se describen en la presente para minimizar los efectos perjudiciales de irradiación sobre la preparación que contiene albúmina. Se conocen por los expertos en la técnica los sensibilizantes adecuados e incluyen psoralenos y sus derivados e inactinas y sus derivados. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la irradiación de la preparación que contiene albúminas se puede llevar a cabo a cualquier temperatura que no - 27 - sea perjudicial para la preparación que contiene albúmina que se esteriliza. De acuerdo con una modalidad preferida, la preparación que contiene albúminas se irradia a temperatura ambiente. De acuerdo con una modalidad preferida alternativa, la preparación que contiene albúmina se irradia a temperatura reducida. Es decir, una temperatura inferior a la temperatura ambiente, por ejempldo, 0°C, -20°C, -40°C, -60°C, -78°C o -196°C. De acuerdo con esta modalidad de la presente invención, la preparación que contiene albúmina preferiblemente se irradia en o por debajo de la temperatura de congelamiento o eutéctica de la preparación que contiene albúmina. De acuerdo con otra modalidad preferida alternativa, la preparación que contiene albúmina se irradia a temperatura elevada, es decir, una temperatura por encima de la temperatura ambiente, tal como 37°C, 60°C, 72°C u 80°C. Aunque no se desea unirse a teoría alguna, el uso de temperatura elevada puede incrementar el efecto de irradiación sobre uno o varios contaminantes biológicos o patógenos y por lo tanto permite el uso de una dosis total menor de irradiación. De manera más preferible, la irradiación de la preparación que contiene albúmina se produce a una temperatura que protege de la radiación a la preparación. Se pueden determinar empíricamente las temperaturas adecuadas, por los expertos en la técnica. En algunas modalidades de la presente invención, la temperatura a la cual se realiza la irradiación se puede encontrar que se encuentra dentro de un intervalo, en vez de en un punto específico. Tal intervalo por la temperatura preferida para irradiación de una composición particular que contiene albúmina se puede determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. De acuerdo con los métodos de la presente invención, la irradiación de la preparación que contiene albúmina se puede llevar a cualquier presión que no sea perjudicial para la preparación que contiene albúmina que se va a esterilizar. De acuerdo con una modalidad preferida, la preparación de una o más enzimas digestivas se irradia a temperatura elevada. De manera más preferible, la preparación que contiene albúmina se irradia a presión elevada debido a la aplicación de ondas sónicas o el uso de una sustancia volátil. Aunque no se desee unirse a teoría alguna, el uso de presión elevada puede mejorar el efecto de irradiación sobre uno o varios contaminantes biológicos o patógenos e - 28 - incrementar la protección proporcionada por uno o más estabilizantes, y por lo tanto permite el uso de una dosis de radiación total menor. Se pueden determinar las presiones adecuadas empíricamente por los expertos en la técnica. Generalmente, de acuerdo con los métodos de la presente invención, el pH de la preparación que contiene albúmina que experimenta esterilización, es de aproximadamente 7. No obstante, en algunas modalidades de la presente invención, la preparación que contiene albúmina puede tener un pH menor de 7, preferiblemente menor o igual a 6, de manera más preferible menor que o igual a 5, incluso de manera más preferible menor que o igual a 4, y de manera mucho más preferible menor que o igual a 3. En modalidades alternativas de la presente invención, la preparación que contiene albúmina puede tener un pH mayor de 7, preferiblemente mayor que o igual 8, y de manera más preferible mayor que o igual 9, incluso de manera más preferible mayor que o igual a 10, y de manera mucho más preferible mayor que o igual a 11. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, el pH de la preparación que experimenta esterilización está en o cerca de la temperatura isoeléctrica de una o varias de las enzimas contenidas en la preparación. Los niveles de pH adecuados se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. De manera similar, de acuerdo con los métodos de la presente invención, la irradiación de la preparación que contiene albúmina se puede llevar a cabo bajo cualquier atmósfera que no sea perjudicial para la preparación que contiene albúmina que se trate. De acuerdo con una modalidad preferida, la preparación que contiene albúmina se mantiene en una atmósfera con baja concentración de oxígeno o en una atmósfera inerte. Cuando se utiliza una atmósfera inerte, la atmósfera preferiblemente está constituida de un gas noble, tal como helio o argón, de manera más preferible un gas noble de peso molecular elevado y de manera mucho más preferible argón. De acuerdo con otra modalidad preferida, la preparación que contiene albúmina se mantiene bajo vacío mientras es irradiada. De acuerdo con una modalidad preferida particularmente de la presente invención, una preparación que contiene albúmina (liofilizada, líquida o congelada) se almacena bajo vacío o una atmósfera inerte (preferiblemente un gas noble, tal como helio o argón, de manera más preferible un gas noble de peso molecular mayor, y de manera más preferible argón), - 29 - antes de la irradiación. De acuerdo con una modalidad preferida alternativa de la presente invención, se mantiene bajo baja presión a una preparación líquida que contiene albúmina para disminuir la cantidad de gas, particularmente oxígeno, disuelto en el líquido antes de la irradiación, ya sea con o sin una etapa anterior de reducción de solvente, tal como liofilización. Tal proceso de eliminación de gas se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otra modalidad preferida, cuando la preparación que contiene albúmina contiene oxígeno u otros gases disueltos dentro o asociados con la misma, la cantidad de estos gases dentro, o asociados con la preparación se puede reducir por cualquiera de los métodos y técnicas conocidos y disponibles por los expertos en la técnica, tal como la reducción controlada de presión dentro de un recipiente (rígido o flexible) de retención de la preparación para ser tratada o al colocar la preparación en un recipiente de un volumen aproximadamente igual. En algunas modalidades de la presente invención, cuando es tejido la preparación que contiene albúmina que se va a tratar, se introduce por lo menos un estabilizante de acuerdo con cualquiera de los métodos y técnicas conocidos y disponibles para un experto en la técnica, que incluyen remojado del tejido en una solución que contiene uno o varios estabilizantes, preferiblemente bajo presión a temperatura elevada o en presencia de un mejorador de penetración, tal como sulfóxido de dimetilo. Otros métodos de introducción de por lo menos un estabilizante en un tejido incluyen, pero no se limitan a aplicación de un gas que contiene los estabilizantes, preferiblemente bajo presión o a una temperatura elevada, inyección de uno o varios de los estabilizantes o una solución que contiene uno o varios de los estabilizantes directamente en el tejido, colocación del tejido bajo presión reducida y después introducción de un gas o una solución que contenga uno o varios de los gases y combinaciones de dos o más de estos métodos. Se pueden introducir también uno o más sensibilizantes dentro del tejido, de acuerdo con tales métodos. Se apreciará que la combinación de una o más de las características descritas en la presente se pueden utilizar para minimizar adicionalmente los efectos indeseables para la preparación que contiene albúmina, causada por irradiación, y al mismo tiempo se - 30 - mantiene la eficacia adecuada del procedimiento de irradiación sobre uno o varios de los contaminantes biológicos o uno o varios patógenos. Por ejemplo, además del uso de un estabilizante, una preparación particular que contiene albúmina también puede ser liofilizada, mantenida a temperatura reducida y mantenida bajo vacío antes de irradiación para minimizar adicionalmente los efectos indeseables. La sensibilidad de un contaminante biológico o patógeno particular a radiación habitualmente se calcula al determinar la dosis necesaria para inactivar o destruir a la totalidad de 37% de la gente en una muestra, el cual se conoce como el valor D37. Los componentes deseables de una preparación que contiene albúmina también se pueden considerar que tienen un valor D37 igual a la dosis de radiación necesaria para eliminar al 37% de las características biológicas y fisiológicas deseables. De acuerdo con algunos métodos preferidos de la presente invención, la esterilización de una preparación que contiene albúmina se lleva a cabo bajo condiciones que resultan en una disminución en el valor de D37 del contaminante biológico o patógeno sin una disminución concomitante en el valor de D37 de la preparación que contiene albúmina. De acuerdo con otros métodos preferidos de la presente invención, la esterilización de una preparación que contiene albúmina se lleva a cabo bajo condiciones que resultan en un incremento en el valor de D3 de la preparación que contiene albúmina. De acuerdo con los métodos más preferidos de la invención, la esterilización de una preparación que contiene albúmina se lleva a cabo bajo condiciones que resultan en una disminución en el valor de D37 del contaminante biológico o patógeno y un incremento concomitante en el valor de D37 de la preparación que contiene albúmina.

Ejemplos Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, de la presente invención. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas son de una variedad encontrada normalmente por los expertos en la técnica y se encuentran completamente dentro del espíritu y alcance de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, toda la irradiación se lleva a cabo utilizando una fuente de 60Co.

EJEMPLO 1 En este experimento se irradian fracciones de proteína plasmática (45 kGy a 1.9 kGy/h a temperatura ambiente) a niveles variables de contenido de solvente residual y en presencia o ausencia de estabilizantes volátiles. Método En frascos de vidrio, se preparan muestras de una fracción de proteína plasmática disponible comercialmente (2 mg/ml) que tiene ya sea agua 9% que contiene cantidades pequeñas de alcohol y acetona y agua ~1% que sustancialmente no contiene etanol o acetona. Las muestras se irradian con radiación ? (dosis total de 45 kGy a 1.9 kGy/h y temperatura ambiente) y después se realizan ensayos para determinar integridad estructural. La integridad estructural se determina por SDS-PAGE, HPLSEC y CLAR en fase inversa. Para SDS-PAGE, se preparan tres geles 12.5% de acuerdo con la siguiente receta: 4.2 mi de acrilamida; 2.5 mi de 4X-Tris (pH 8.8); 3.3 mi de agua; 100 µ? de solución de APS 10% y 10 µ? de TEMED, y se colocan en una unidad de electroforesis con un amortiguador de corrimiento IX (15.1 g de base Tris; 72.0 g de glicina; 5.0 g de SDS en 1 1 de agua, diluido 5 veces). Se irradia y se diluyen muestras control (1 mg/ml) con amortiguador de muestra (+/- ß-??) en tubos Eppendorf y después se centrifuga durante varios minutos. Se realizan ensayos en 20 µ? de cada muestra diluida (-10 µg). Para CLAR de fase inversa, cada muestra se disuelve en agua hasta una concentración final de 10 mg/ml. Estas diluciones después se diluyen de manera seriada en ácido trifluoroacético 0.1% hasta la concentración deseada. Se cargan 10 µg de cada muestra en un sistema Aquapore RP-300 (C-8) 2.1 x 30 mm Microbore CLAR: Applied Biosystems 130A Separation System, con una velocidad de flujo de 0.2 ml/min. El solvente A está constituido de ácido trifluoroacético 0.1%; el solvente B es acetonitrilo 70%, agua 30% y ácido trifluoroacético 0.085%. Para HPLSEC, cada muestra se diluye a 0.4 µg/µl y 50 µ? del mismo se cargan en equipo Phenomenex-Biosep S3000 (intervalo molecular 5kDa-700kDa) para una - 32 - concentración de análisis de 20 g; y 20 µ? de una solución concentrada de 2 mg ml + 80 µ? de amortiguador de elusión (50 mM NaP¡ + 100 mM NaCl pH 6.7); velocidad de flujo 1 ml/min. Resultados Ambas muestras presentan cierta descomposición de albúmina cuando se somete a irradiación a 45 kGy, la muestra que tiene agua 9% contiene cantidades pequeñas de etanol y acetona muestra menos descomposición y mayor recuperación estructural en comparación con la muestra que contiene menos agua y sustancialmente sin estabilizantes volátiles. No obstante, la recuperación estructural de ambas muestras es suficiente para el uso subsecuente de la albúmina. De manera más específica, como se muestra en la figura 1A, el análisis por SDS-PAGE demuestra una mejor recuperación del monómero de albúmina a partir de la muestra que tiene agua 9% que contiene cantidades pequeñas de etanol y acetona. De manera similar, como se muestra en la figura IB, HPLSEC también indica menos agregación en la muestra que tiene agua 9% que contiene cantidades pequeñas de etanol y acetona. Como se muestra en la figura 1C, la CLAR en fase inversa no muestra una diferencia significativa entre las muestras irradiadas y el control.

EJEMPLO 2 A una muestra de albúmina humana (25%) se le agrega una concentración conocida 1:100 con homogeneizado de cerebro 10% de encefalopatía esponjiforme ovina adaptada de hámster (cepa 263K). La muestra se mezcla al someterla a remolino y se suministran 4 alícuotas de 6 mi de albúmina a la que se le ha agregado una concentración del agente causal de la encefalopatía esponjiforme ovina, en frascos de suero de 10 mi. Un frasco se almacena a -80°C como un control congelado. Se toman tres frascos de una instalación de irradiación comercial. Se refrigera un frasco (el control de 0 kGy) para evitar crecimiento bacteriano. Los frascos restantes se irradian a temperatura ambiente (20-25°C) a una tasa de 0.4 kGy/h hasta una dosis total de 26 a 50 kGy. Se determina la dosis de radiación por dosímetros unidos a cada fiasco y por dosímetros externos colocados en - 33 - proximidad cercana a los f ascos. Las muestras irradiadas y el control de 0 kGy se someten a ensayo para determinar la infectividad del agente causal de encefalopatía esponjiforme ovina. Se determina la infectividad por inoculación intracerebral de 0.05 mi de muestra en 12 hámster, la cual después se mantiene hasta por 6 meses para observación. Se determinan tres criterios de valoración clínicos: oscilación, falla en retroceder y muerte. Existe un retraso de por lo menos 8-10 días en la apariencia de cada síntoma clínico en el grupo inoculado con la muestra tratada a la dosis más elevada en comparación con el control no irradiado. Se comparan los datos con un nomograma construido a partir de la respuesta de dosis del tiempo de incubación para un tiempo más grande de animales infectados en el modo de serie de dilución limitante (R. Rowher, datos no publicados). Este nomograma correlaciona los días respecto al inicio de enfermedad (como se evidencia por la oscilación) con el logaritmo10 de la DL50 inoculada. Se determina el efecto de la radiación en el material biológico (albúmina) por electroforesis en gel en SDS-PAGE y la cromatografía de exclusión de tamaño de alta resolución, como sigue. Se lleva a cabo la prueba de SDS-PAGE en geles de poliacrilamida 8% en un equipo Mighty Samll Mini Vertical Unit SE250/SE260. Las muestras se diluyen 1:100 en PBS y después 1:1 en amortiguador de muestra de Laemmli (Bio-Rad) con o sin ß-mercaptoetanol 5%. La carga de muestra es de 12.5 µg por carril. Los marcadores de peso molecular son los estándares de Low-Range (Bio-Rad). Se lleva a cabo electroforesis durante 30 minutos a 125 volts. Los genes se tiñen con azul brillante de Coomassie R-250 0.1% en metanol 50%, ácido acético 10% y se destiñen con metanol 5% y ácido acético 9%. Se realiza HPSEC en columnas 7.8 x 300 mm Biosep SEC (Phenomenex, Torrence, CA) en un sistema de separación de 130A (Applied Biosystems). El amortiguador eluyente de fosfato de sodio 0.05 M, cloruro de sodio 0.1 M (pH 6.7) se filtra antes de su uso con filtros de 0.22 µ??. Se diluyen soluciones de albúmina a una concentración final de 1.25 mg/ml en amortiguador eluyente y se inyectación 25 µ? (13.25 µg de proteína). La velocidad de flujo es de 1 ml/min. La detección se realiza por - 34 - absorbancia a 280 nm. Resultados Para el control no irradiado, la mediana del tiempo de incubación para el inicio de la enfermedad (oscilación) es de 75 días. Para las muestras irradiadas, la mediana de tiempo de incubación para el inicio de la enfermedad es de 88 días para la muestra irradiada a una dosis total de 25 kGy y 90 días para la muestra irradiada a 50 kGy. La comparación con el nomograma proporciona valores calculados para los títulos logaritmo10 como 6.5 del control no irradiado y 4.8 y 4.6 para las muestras irradiadas a 25 kGy y 50 kGy, respectivamente. En base en estos cálculos, la mediana de los factores de reducción para las muestras irradiadas es de 1.7 y 1.9 para muestras irradiadas a 25 kGy y 50 kGy, respectivamente. Este cálculo representa la mediana de los valores de reducción, pero no permite calcular la reducción posible máxima predicha por este experimento. Para hacer esto, debe compararse el valor mínimo con un intervalo de confianza de 95% (CI) del grupo control, con el valor máximo de CI 95% de los grupos tratados con radiación. Este cálculo proporcionará el factor de reducción máxima de los títulos que se encuentra dentro de CI 95%. Para el grupo de 50 kGy, este valor es una reducción de 3.5 unidades logarítmicas. La susceptibilidad de contaminantes biológicos o patógenos a radiación con frecuencia se expresa por su valor D37. Esto representa la dosis de radiación necesaria para reducir el número de contaminantes biológicos o patógenos a 37% de su número previo a irradiación. De esta manera, cuanto menor sea el número D37, más susceptible será un contaminante biológico o patógeno particular a los efectos de la radiación. Se ha determinado experimentalmente que la D37 del prion causal de encefalopatía esponjiforme ovina es de aproximadamente 47 kGy (Rohwer, Nature, 308, 5960, pp. 658-662, 1984). Utilizando la metodología que se describe en la presente, se ha encontrado inesperadamente que la D37 del prion causal de encefalopatía esponjiforme ovina es de sólo 4.5 kGy. Por lo tanto, la D37 del prion causal se disminuye utilizando los métodos y formulación empleada en este experimento. De esta manera, se obtiene una destrucción aumentada del prion causal de encefalopatía esponjiforme ovina y al mismo tiempo se mantiene la integridad del material biológico, una solución 25% terapéutica comercial de albúmina humana utilizada en este experimento.

La destrucción aumentada del prion causal de encefalopatía espongiforme ovina se obtiene mientras se mantienen las características biológicas y fisiológicas esenciales de la preparación que contiene albúmina que es tratada. Este material biológico particular, una solución 25% de albúrnina humana, se examina antes y después de la irradiación con radiación ? a dosis totales de 25, 50 y 100 kGy. Como se muestra por electroforesis en gel (figuras 2A-2B), la albúmina está principalmente intacta a dosis de radiación de hasta 50 kGy, en donde sólo una cantidad pequeña experimenta fragmentación y agregación y una ligera disminución en la cantidad de la forma monomérica de albúmina. Estos resultados son similares para la totalidad de las muestras de albúrnina sin importar si contienen algún ascorbato o hámster. Las dosis más elevadas, se observan cambios menores en las muestras de albúmina, principalmente en forma de una polimerización aumentada de albúmina. Se realiza un análisis más detallado utilizando HPSEC. Como se muestra en las figuras 2C-2F, con irradiación, la cantidad de monómero de albúmina disminuye (máximo a 10.5 min), se incrementa la cantidad de dímero (9 min) y se incrementa la cantidad de polímero (7.2 min). Todos estos cambios se minimizan en presencia de ascorbato. Los picos restantes a 12.6 y 15.3 min son aquellos de ascorbato y el estabilizante de N-acetiltriftofano, respectivamente.

EJEMPLO 3 En el experimento se irradia albúrnina liofilizada (que contiene urocinasa 5%) a una tasa de 1.847 kGy/h a aproximadamente 4°C hasta una dosis total de 10 a 40 kGy. Las muestras se analizan por filtración en gel utilizando una columna TSKgel G4000SWxi 30 cm x 7.8 mm, intervalo de separación de 20 kDa - 7,000 kDa, amortiguador de elusión fosfato de sodio O.lM/sulfato de sodio 0.1M (pH 6.5), con una velocidad de flujo con 1 ml/min. Como se muestra en la figura 3A, no hay cambio en la albúmina cuando se Hofiliza y se irradia ya sea a 10 kGy o 40 kGy de dosis total. En contraste, como se muestra - 36 - en la figura 3B, las muestras de albúmina líquida muestran una degradación importante cuando se irradian a una dosis total de 40 kGy.

EJEMPLO 4 En este experimento se preparan muestras de solución de albúmina (25%) y la mitad de las muestras se purgan con argón. Las muestras se irradian a una tasa de 0.91, 0.92 o 1.01 kGy/h hasta una dosis total de 18.1, 23 y 30.4 kGy, respectivamente. Las muestras irradiadas se ensayan por SDS-PAGE para agregación y fragmentación por HPLSEC para dimenzación y polimerización. Como se muestra en las figuras 4A-4B, SDS-PAGE muestra únicamente una cantidad pequeña de fragmentación (doblete por debajo de la banda de 66 kDa sobre gel reducido) y agregación (banda de 116 kDa sobre gel no reducido), incluso para muestran irradiadas a una dosis en total de 30.4 kGy. La HPLSEC muestra los siguientes picos: Como se muestra por HPLSEC, se observa menos dimenzación en muestras que se han purgado con argón antes de irradiación.

EJEMPLO 5 En este experimento se hradian f agmentos de proteína plasmática a -20°C para hacer variar la dosis total de radiación (10, 30 ó 50 kGy). Método En frascos de vidrio, se preparan muestras de una fracción de proteína plasmática disponible comerciabnente con una concentración reducida de solvente de agua 9% que contiene cantidades pequeñas de etanol y acetona. Las muestras se irradian con radiación ? a -20°C a 1.608 kGy/h hasta una dosis total de 10, 30 ó 50 kGy y después se realizan ensayos para determinar integridad estructural. Se determina la integridad estructural por SDS-PAGE, HPLSEC. Para SDS-PAGE, se preparan cuatro geles 12.5% de acuerdo con la siguiente receta: 4.2 mi de acrilamida; 2.5 mi de 4X-Tris (pH 8.8); 3.3 mi de agua; 100 µ? de solución APS 10% y 10 µ? de TEMED, y se colocan en una unidad de electroforesis con un amortiguador de corrimiento IX (15.1 g de base Tris; 72.0 g de glicina; 5.0 g de SDS en 1 1 de agua, diluido 5 veces). Las muestras irradiadas y el control (1 mg/ml) se diluyen con amortiguador de muestra (+/- ß-??) en tubos Eppendorf y después se centrifuga durante varios minutos. Se ensayan 20 µ? de cada muestra diluida (~10 µg). Para HPLSEC, se cargan 31 µg de cada muestra en una columna Biosep SEC S3000 7.7 x 300 mm en un equipo Applied Biosystems 130A Separation System, con una velocidad de flujo de 1 ml/min con Na2HP04 50 mM (pH 6.7) y NaCl 100 mM. Resultados Como se muestra en la figura 5A-5B, el análisis por SDS-PAGE demuestra la recuperación cuantitativa del monómero de albúmina a partir de las muestras irradiadas, incluso hasta una dosis total de 50 kGy de radiación. De manera similar, como se muestra en las figuras 5C-5F, la prueba HPLSEC no indica incremento en la agregación de cualquiera de las muestras irradiadas, hasta una dosis total de 50 kGy de radiación.

EJEMPLO 6 En este experimento, se hacen crecer células de riñon de hámster bebé (BHK) obtenida de American Type Culture Collection en medio que contiene 20% (volumen/volumen) de suero bovino fetal (FBS) y se aclimatan lentamente de manera que finalmente son capaces de crecer únicamente con FBS 0.25% (el cual es 5% de su requerimiento normal de FBS). Después de que se ha reducido FBS, el medio se suplementa con una fracción de proteína plasmática comercial, no irradiada o irradiada a - 38 - una temperatura de -20°C a 1.608 kGy/h hasta una dosis total de 50 kGy de radiación, de manera que la f acción de proteína plasmática es de 0.3% peso/volumen del medio (600 mg). Resultados No hay diferencias observables entre el crecimiento de células BHK en medio que contiene fracción de proteína plasmática no irradiada y células BHK que crecen en medio que contiene la f acción proteínica plasmática que se ha irradiado hasta una dosis total de 50 kGy.

EJEMPLO 7 En este experimento, se irradian fracciones de proteína plasmática que contienen parvovirus porcino (PPV) a-80°C a dosis totales variables de radiación. Método Se prepara el concentrado #7 de PPV utilizando PEG8000 20% en NaCl 2.5 M. El sedimento de virus precipitado por PEG se resuspende en amortiguador PEG (NaCl 0.1M, Tris 0.01 M (pH 7.4), EDTA 1 mM). Método 1 Se agregan 50 µ? de medio PK-13 o de concentrado #7 de PPV a 2 mi de frascos Wheaton y se permite que sequen durante la noche a 40°C. Se agregan 50 mg de una fracción proteínica plasmática comercial, una vez que el líquido ha secado y los frascos se tapan y se irradian a -80°C a una tasa de 5.202 kGy/h hasta una dosis total de 10, 30 y 45 kGy. Método 2 50 mg de una fracción de proteína plasmática comercial se colocan en un frasco Wheaton de 2 mi y después se mezclan con 150 µ? de medio PK-13 o 150 µ? de concentrado #7 de PPV diluido (100 µ? de medio PK-13 + 50 µ? de PPV) hasta que se disuelve. Los frascos se tapan y después se irradian a -80°C a una tasa de 5.202 kGy/h hasta una dosis total de 10, 30 ó 45 kGy. Ensayo de TCIDS0 Se agregan 850 µ? de medio PK-13 (DMEM ATCC#3020002, 10% FBS Gibco#26140079, 1% Pen/Step L-GLutamine Gibco#10378016) a cada frasco para llevar el volumen a 1 mi. Las muestras después se esterilizan por filtración utilizando filtros de 13 mm (Becton Dickenson #4454) y jeringas de 3 mi. Se mantienen células PK-13 (ATCC#CRL-6489) en medio de crecimiento PK-13 y se siembran a 40% de confluencia el día antes de la infección, en placas de 96 pozos. Cuando las células se encuentran a 70-80% de confluencia se agrega a 4 pozos 50 µ? de la muestra irradiada deseada (que contiene medio PK-13 o concentrado #7 de PPV diluido). SDS-PAGE Después de la irradiación, se preparan soluciones concentradas de las muestras en agua para CLAR (10 mg/ml) y después se diluyen (2 mg/ml). Las muestras después se diluyen 1:1 con amortiguador de muestra 2x (con o sin DTT) y después se carga sobre geles: 5 µg (10 µ?) para muestras del método 1 y 10 µ (10 µ?) para muestras del método 2. Resultados Las fracciones de proteína plasmática tratada con PPV irradiadas a -80°C de acuerdo con el método 1 muestran una inactivación o destrucción viral de 3.9 unidades logarítmicas utilizando una dosis total de 45 kGy (0.084 unidad logarítmica/kGy). Las fracciones de proteína plasmática tratadas con PPV irradiadas a -80°C de acuerdo con el método 2 muestran una destrucción viral de 5.54 unidades logarítmicas (0.123 unidades logarítminas/kGy). Estos resultados se muestran gráficamente en la figura 6. Las fracciones de proteína plasmática irradiada no provocan algún efecto citopático en las células PK-13. Las fracciones de proteína plasmática tratada con PPV irradiadas a -80°C también se ensayan utilizando SDS-PAGE. Estos resultados se muestran en las figuras 6B-6C.

EJEMPLO 8 En este experimento se irradian preparaciones congeladas que contienen - 40 - albúmina y factor VIH. Método Las muestras que contienen albúmina y factor VE se congelan y se someten a radiación ? hasta una dosis total de 45 kGy. Resultados Como se muestra en la figura 7, no hay diferencia entre la actividad FVIH de la muestra control (no irradiada) y la actividad de FVIII de la muestra congelada y sometida a irradiación ? a 45 kGy.

EJEMPLO 9 En este experimento se irradian fracciones de proteína plasmática (que contiene 95-98% de albúmina sérica humana) bajo condiciones variables. Métodos Se caracteriza la integridad y estabilidad estructurales de PPF utilizando calorimetría de exploración diferencial (DSC), el cual es el enfoque más sensible y directo para medir la estabilidad a corto y largo plazo de macromoléculas biológicas. Los efectos de la irradiación en estas características físico químicas se evalúan por comparación de la PPF irradiada con una muestra no irradiada (desplazamiento control) bajo condiciones de solvente/formulación idénticas. Los resultados proporcionan una base termodinámica y estructural para la selección de condiciones óptimas para tratamiento por irradiación ? con daño mínimo del producto PPF. Las condiciones óptimas para irradiación ? (pH, fuerza iónica, temperatura, dosis, tasa de dosis) se pueden seleccionar de acuerdo con la diferencia entre PPF irradiada y no irradiada para obtener el resultado deseado. La pasteurización por calor de una solución 5% de PPF ser realiza a 60°C durante 10 horas en presencia de un estabilizante (ya sea N-acetiltriptofano (AT) 4 mM o caprilato (CA) 4 mM o una combinación de AT 4 mM y CA 4 mM). Se agregan estabilizantes a PPF no irradiado e irradiado (después de irradiación ?) para aumentar la estabilidad de PPF durante el calentamiento requerido. La irradiación se realiza a -80°C utilizando una tasa de dosis de 5 kGy/h hasta una dosis total de 50 kGy. La PPF irradiada - 41 - contiene aproximadamente 1% de humedad. La formación de agregados de albúmina como un indicador de inestabilidad térmica se vigila por: (i) dispersión de luz a 370 nm; (ii) SDS PAGE realizada bajo condiciones reductoras y no reductoras; y (iii) CLAR. Se disuelve polvo de PPF en un amortiguador PBS lx se ajusta el pH 7.0 y se ajusta la concentración de proteína a 50 mg/ml. Las muestras se calientan a 60°C en tubos de polipropileno tapados, en un baño maría termostático. Se utiliza calorimetría de exploración para determinar la estabilidad estructural e integridad de PPF al comparar la temperatura de desnaturalización (Tmax) y la entalpia de desnaturalización (AHcal) de PPF irradiada y sin irradiar antes y después de la pasteurización. Resultados Comparación de la estabilidad estructural de PPF irradiada y no irradiada La prueba de SDS PAGE de PPF irradiada y no irradiada bajo condiciones reducida (a) y no reducida (b) muestra que no existen diferencias significativas (únicamente ligeros cambios en la intensidad de las bandas de PAGE) entre el material no irradiado y el irradiado hasta por 50 kGy en términos de irradiación ? que induce degradación o polimerización de albúmina asociada con tiol. Las diferencias observadas en los perfiles calorimétricos obtenidos a partir de los experimentos de DSC indican un cambio en la estabilidad de la estructura terciaria de la muestra irradiada. Las diferencias principales se pueden explicar por asociación con una disminución en la cooperatividad de la transición de desnaturalización de PPF irradiada y una disminución en la entalpia de su desnaturalización, en comparación con la del material no irradiado. El análisis de desconvolusión comparativo de la capacidad térmica en exceso de PPF irradiada y no irradiada muestra que una disminución en la temperatura del máximo de la transición de desnaturalización se relaciona con poblaciones adicionales de moléculas de albúmina, las cuales son diferentes en su estabilidad estructural. La generación de fracciones de alta estabilidad y de baja estabilidad de la proteína aparecen como una disminución en la capacidad de cooperación de la transición de desnaturalización, lo que habitualmente se interpreta como una disminución en la red de interacciones internas que estabilizan la estructura terciaria de la proteína nativa. La pérdida en la capacidad de cooperación de la transición de desnaturalización de PPF irradiada, la cual cambia el perfil calorimétrico con respecto a la no irradiada, no debe considerarse como daño intermolecular o como la población completa de moléculas nativas, sino más bien debe observarse como un cambio en la estabilidad de algunas de las moléculas las cuales son dirigidas por irradiación. Aunque la descooperación de la transición de desnaturalización de PPF irradiada no indica un daño significativo a las moléculas, la desestabilización de albúmina se vuelve importante respecto a la etapa posterior de pasteurización por calor, es decir, la fracción desestabilizada de moléculas de albúmina cuya estabilidad térmica (Td) es menor de 60°C deben ser protegidas de la desnaturalización por el tratamiento térmico. Efecto del contenido de humedad en el polvo de PPF en la recuperación de albúmina después de irradiación ? Las exploraciones calorimétricas de los polvos de PPF con diferentes contenidos de humedad irradiados a 45 kGy, 1.8 kGy/h a-20°C muestran que, conforme se incrementa el contenido de humedad de PPF en polvo de 8.6% hasta el estado líquido, el área debajo de las curvas calorimétricas disminuye, lo cual se interpreta como una disminución en la población de moléculas de albúmina con estructura nativa después de irradiación ?. La PPR irradiada en estado líquido muestra el mayor daño. La recuperación de estructura de albúmina después de irradiación ? a tasas de dosis diferentes (1.8 kGy/h o 6.5 kGy(h) y contenidos de humedad (9% ó 1%) varía como una función de la temperatura de irradiación (-80°C, -20°C ó 20°C). El valor cuantitativo de la recuperación de albúmina se puede calcular como la proporción de las entalpias de PPF irradiada y no irradiada. Una disminución en la entalpia total de desnaturalización indica que la irradiación de PPF pulverizada con un mayor contenido de humedad disminuye la recuperación de la molécula. Estos resultados indican que el daño a PPF por irradiación ? bajo estas condiciones probablemente se asocie con efectos secundarios los cuales se originan de la producción de radicales libres. Efecto de la temperatura en la recuperación de albúmina después de irradiación ? La recuperación de la estructura de albúmina depende en gran medida de la temperatura de irradiación de PPF, que se incrementa conforme disminuye la temperatura de irradiación. A -80°C, la recuperación estructural de las muestras con bajo contenido de humedad es mejor en comparación con las muestras con una mayo humedad. Efecto de los estabilizantes comerciales en PPF Se investigaron los efectos de CA y AT sobre la estabilización térmica de PPF humana mediante calorimetría de exploración diferencias, SDS PAGE y cromatografía por exclusión de tamaño. En presencia de AT 4 mM, la temperatura a la cual se produce la desnaturalización de albúmina (Tm) se incrementa de 65.4 a 67.6°C. De manera similar, en presencia de CA 4 mM, se incrementa la temperatura de capacidad térmica máxima (Tmax) de 65.4 a 72.03°C. No obstante, la presencia tanto de AT 4 mM como de CA 4 mM induce un incremento en la estabilidad ténnica de albúmina de sólo 4.6°C, cambiando Tm de 65.4 a 70.5°C. Tanto CA como AT tienen efectos estabilizantes similares sobre la PPF irradiada, aunque las magnitudes son ligeramente menores bajo condiciones de solvente equivalente. CA y At, a 4 mM impiden la desnaturalización masiva de la proteína, pero en el caso de proteína irradiada, no se puede evitar 10-15% de oligomerización de agregados de peso molecular elevado con turbidez, cuando se calienta hasta 60°C. Al incrementar la concentración de CA hasta 8 mM genera un incremento importante en la estabilidad térmica de albúmina, es decir, la desnaturalización a 82°C en comparación con 65.4°C a una concentración de CA de 4 mM. Esto demuestra que las concentraciones mayores de 4 mM, el caprilato tiene la capacidad de estabilizar suficientemente la albúmina para volverla resistente a la desnaturalización a 60°C, temperatura la cual se utiliza habitualmente para pasteurización antiviral. El análisis por CLAR demuestra que antes de la pasteurización tanto de PPF irradiada como no irradiada en presencia de CLAR es esencialmente monomérica. Después del calentamiento, la cantidad de agregados de peso molecular elevado producido por calentamiento es mayor en el caso de PPF irradiada en comparación con el material no irradiado. El porcentaje de agregados inducidos en PPF irradiada es casi dos veces menor en presencia tanto de CA como AT en comparación con CA solo, lo que indica que aunque - - la presencia de AT además de CA en PPF no incrementa significativamente su estabilidad térmica, no inhibe la agregación de albúmina durante el calentamiento por 10 h a 60°C. La agregación inducida por calor de albúmina en PPF es más pronunciada en solución de PPF no amortiguada en comparación con el amortiguador de PBS. Se realiza SDS PAGE bajo condiciones reducidas para probar la degradación y la naturaleza de los agregados producidos y se demuestra que las bandas que corresponden a los agregados de peso molecular elevado desaparecen. Esto indica que la albúmina irradiada con radiación ?, expuesta a tratamiento por calor a 60°C durante un período de tiempo 10 h resulta en complejos de proteína estables a través de formación de enlaces S-S intermoleculares. Las moléculas agregadas no se pueden separar de la forma monomérica nativa por filtración a través de un filtro de 0.22 um. El grado con el cual se produce la agregación íntermolecular depende del pH y la fuerza iónica de la solución de PPF así como de su concentración. Cuando una solución de proteína se lleva a valores de pH bajos (6.5-4.5) por adición de ácido clorhídrico o cuando la solución de PPF no se ajusta apropiadamente al pH 7.0 antes de pasteurización, se polimeriza progresivamente durante los primeros 10 minutos de exposición a 60°C. Aunque la afinidad de la unión de CA a albúmina se incrementa ligeramente al disminuir el pH de 7.0 a 5.5, no es suficiente a la concentración dada del estabilizante (4 mM) para minimizar los cambios en la proteína durante el calentamiento requerido a 60°C. Los termogramas para PPF realizados antes y después de la pasteurización a 60°C para muestras irradiadas a -20°C y -80°C muestran que el daño de la molécula de albúmina después de ambos tratamientos (irradiación ? y pasteurización) es menor cuando se irradia polvo de PPF a -80°C.

EJEMPLO 10 En este experimento se irradian fracciones proteínicas plasmáticas (que contienen 95-98% de albúmina sérica humana) bajo condiciones variables. Métodos - - Las condiciones de irradiación ? del polvo de PPF liofílizado son son: - 80°C, 50 kGy, 5.02 kGy/h. Resultados La prueba de SDS PAGE bajo condiciones reducidas y no reducidas muestra que la adición de ascorbato a PPF a una concentración de 100 mM induce mejoras significativas en la intensidad de la banda del material sometido a irradiación ? en comparación con el material irradiado sin ascorbato. Esto indica que la degradación de la proteína bajo radiación ? en presencia del ascorbato es menor que sin ascorbato. El análisis por CLAR realizado con materiales irradiados y no irradiados antes de la pasteurización en presencia de ascorbato 100 mM muestra que la proteína irradiada y no irradiada prácticamente son idénticas en términos de la integridad química de la cadena polipeptídíca así como las poblaciones de las formas monoméricas y multiméricas. Las exploraciones calorimétricas de la PPF no irradiada e irradiada en presencia (a) y en ausencia de ascorbato (b) así como con ascorbato solo (c) se utilizan para evaluar la estabilidad térmica de estas formas. Las mediciones calorimétricas de PPF se realizan en una solución de amortiguador de PBS, pH 7.0, la concentración de proteína utilizada en todos los experimentos es de 4.4 mg/ml. La comparación de las exploraciones calorimétricas para PPF no irradiada e irradiada en presencia de ascorbato 100 mM muestra una mejora importante en términos de su recuperación después de irradiación ?. Aunque el perfil calorimétrico de la desnaturalización inducida por calor en presencia de ascorbato es diferente a la que se observa sin ascorbato, son muy similares para la PPF irradiadas y no irradiadas. Los resultados que se obtienen muestran que: (a) ascorbato en una concentración de 100 mM protege contra daño estructural en albúmina durante la irradiación ?; (b) el ascorbato muestra cambios mecánicos (probablemente oxidación) al calentar a 70°C en presencia de metales los cuales catalizan la reacción de oxidación; y (c) cambios en el ascorbato durante la irradiación, los cuales probablemente son causados por interacciones por radicales libres, las cuales se pueden calcular cuantitativamente por análisis calorimétrico y pueden permitir la determinación precisa de la concentración óptima de ascorbato la cual es necesaria para proteger a la proteína contra el daño por radicales libres. Una comparación de la intensidad de las bandas de SDS-PAGE de PPF irradiada con radiación ? y sin irradiar, las cuales han sido pasteurizadas en presencia y ausencia de ascorbato, muestran que la albúmina experimenta menos degradación cuando se ha irradiado y se pasteuriza en presencia de ascorbato 100 mM en comparación a lo que se obtiene en ausencia de ascorbato. Las exploraciones calorimétricas para PPF no calentada (a) y pasteurizada (b) en soluciones equivalentes de sodio 100 mM, pH 7.0 que contiene ascorbato 100 mM, muestran que el calentamiento de PPF irradiada durante 10 h a 60°C no induce ningún cambio en la estructura de proteína, la cual es similar a la de la albúmina no irradiada después de pasteurización por calor. La temperatura del máximo de las transiciones de desnaturalización para ambas proteínas es el mismo, lo que indica que tienen estabilidad estructural similar. La diferencia pequeña en la forma de los perfiles calorimétricos de la albúmina irradiada como no irradiada antes y después de la pasteurización se debe a un incremento en la estabilidad de la proteína a temperatura elevada en presencia de ascorbato. En presencia de ascorbato, la estabilidad de la proteína contra la desnaturalización por calor se incrementa en 3.8°C. Esta estabilización proporciona protección adicional de la estructura de protección contra el calentamiento extendido a 60°C. La diferencia principal entre el material irradiado y no irradiado está en la temperatura de los máximos de los picos exotérmicos de la capacidad calorífica. El efecto exotérmico se relaciona con la conversión del ascorbato a la forma oxidada como un resultado de la irradiación ?. En el ascorbato sometido a irradiación ?, el procedimiento de conversión inducido por calentamiento avanza a 43 °C mientras que el ascorbato no irradiado, el procedimiento tiene un máximo a 50°C. Esto indica que la exposición de ascorbato a irradiación ? genera cambios en su estructura química que vuelven al ascorbato irradiado más susceptible en comparación al ascorbato no irradiado para conversión a la forma oxidada. Un cálculo cuantitativo de la integridad estructural de la albúmina irradiada y no irradiada, como se colige a partir de la comparación de las entalpias de la transición de - - desnaturalización, muestran que la diferencia entre ellas es de menos de 15%. Esto es mucho mejor que lo que se ha observado en presencia de ascorbato, en donde la recuperación de PPF irradiada después de pasteurización se calcula cercana a 70%. El análisis por CLA de PPF irradiada y no irradiada después de pasteurización en presencia o ausencia de ascorbato, lo que permite el cálculo cuantitativo de las poblaciones monoméricas/multiméricas en PPF después de pasteurización muestran que, en ausencia de ascorbato, la pasteurización de PPF sin irradiar a 60°C durante 10.5 horas genera una producción de aproximadamente 12.4% agregados. La cantidad de agregados se incrementa hasta 36.3% después de la pasteurización de PPF sometida a irradiación ?. La pasteurización de PPF en presencia de ascorbato 100 mM reduce la población de agregados reticulados S-S en casi 14% a 22.8%.

EJEMPLO 11 En este experimento, se irradia albúmina sérica humana derivada de pasta, bajo condiciones variables. Métodos El precipitado de pasta de la f acción V que contiene predominantemente albúmina se vuelve a diluir o reconstituir en agua y se procesa para proporcionar albúmina humana. La solución final contiene 20 mg/ml de proteína con un contenido de albúmina de 97% en solución no amortiguada, a pH 7.0. El rendimiento total de la albúmina para la pasta diluida es de -30-35%. El precipitado de pasta de la fracción V se irradia a -80°C, 1.8 kGy/h hasta una dosis total de 50 kGy en frascos de vidrio tapados. Las muestras de control de desplazamiento se almacenan bajo condiciones idénticas. La tasa de dosis de radiación se mide por dosímetros de alanina y se corrige por el factor de temperatura, de acuerdo con el procedimiento. Se agregan estabilizantes comerciales de caprilato (CA) y N-acetiltriftofano (AT) a la solución de albúmina a concentraciones de 4 mM antes de la pasteurización. La pasteurización se realiza a 60°C durante 10 h de calentamiento continuo. Resultados La prueba de SDS PAGE de albúmina purificada a partir de la pasta muestra - - que la albúmina purificada tiene una pureza de —96% en presencia y ausencia de los estabilizantes. La irradiación ? a 50 kGy producen poblaciones de peso molecular tanto elevado como bajo de moléculas de albúmina, las cuales se originan de la degradación de la cadena polipeptídica y su asociación en agregados reticulados S-S. Esto último convierte a los fragmentos de peso molecular bajo condiciones reducidas. Ambas poblaciones son más bien pequeñas, constituyendo ~8% de la proteína total. La pasteurización no cambia la intensidad de la banda, indicando la ausencia de degradación química durante 10 h de calentamiento. La consecuencia más importante de la pasteurización para proteína sometida a irradiación ? es que provoca reticulado intermolecular, el cual aparece como agregado de peso molecular elevada sobre el gel. Este estado agregado no se observa en el caso de albúmina no irradiada. El análisis por CLAR de las muestras de albúmina después de irradiación ? antes y después de pasteurización en presencia de AT y CA muestran que la irradiación induce un ligero incremento en la población de dímeros y multímeros a costa de la forma monomérica. Los multímeros se forman por los péptidos fragmentados (véase SDS PAGE) estabilizados por enlaces cruzados S-S bajo condiciones no reducidas de CLAR. La pasteurización a 60°C durante 10 h genera un rearreglo importante en la masa molecular de albúmina hacia la formación de agregados de peso molecular elevado en la albúmina irradiada. El análisis por DSC de albúmina irradiada y no irradiada en ausencia de AT y CA muestra que la estabilidad térmica de la fracción principal de la albúmina irradiada permanece similar a la de la proteína no irradiada. No obstante, la albúmina irradiada tiene cierta fracción de moléculas las cuales tienen estabilidad menor en comparación con la albúmina nativa. El análisis de desconvolución del exceso de la función de capacidad térmica de albúmina irradiada y no irradiada se muestra en lo que sigue. Aunque la función de la capacidad térmica de albúmina no irradiada se ajusta a un modelo sencillo de dos estados de transición de desnaturalización, la albúmina no irradiada muestra un comportamiento más complejo. Consiste de por lo menos dos poblaciones independientes de moléculas de albúmina, las cuales difieren en su estabilidad térmica. Una población está representada por - - moléculas las cuales son muy similares en estabilidad térmica en relación a la albúmina no irradiada, la otra se asocia con moléculas desestabilizadas. La última fracción de albúmina irradiada es más sensible a la desnaturalización a la temperatura de pasteurización (60°C) y puede ser la responsable de la producción de los agregados reticulados S-S. La adición de estabilizantes comerciales AT y CA incrementa la estabilidad de la albúmina tanto irradiada como no irradiada. En presencia de los estabilizantes, más de 90% de la molécula no irradiada tiene una estabilidad térmica superior a 60°C y por lo tanto se evita el daño por calor cuando se somete a pasteurización a 60°C. Aunque la mayor parte de las moléculas irradiadas también se estabilizan en presencia de CA y AT, existe cierta parte (10-15%) de las moléculas que aún presentan estabilidad por debajo de 60°C. Se puede esperar que esta fracción sea desnaturalizada irreversiblemente cuando se lleve a cabo la pasteurización. El análisis por DSC de la albúmina irradiada y no irradiada antes y después de pasteurización muestra que la fracción la cual tiene estabilidad térmica por debajo de 60°C se convierte a la forma desnaturalizada durante el calentamiento. El pico de transición de desnaturalización de la albúmina irradiada se vuelve más cooperativo después de pasteurización, lo que indica un enriquecimiento de la estructura nativa a costa de la fracción de baja estabilidad de la población de albúmina, la cual se convierte a la forma desnaturalizada. Se utiliza CLAR para determinar la recuperación de masa de albúmina después de irradiación ? y pasteurización. Se calculan las poblaciones de monómeros, multímeros y fragmentos de peso molecular bajo a partir de los porcentajes de pico de estas formas utilizando el programa PeakFit. La pérdida de masa después de irradiación se relaciona principalmente con la formación de cantidades pequeñas de polímeros (-2%). El porcentaje de recuperación de estructura terciaria de albúmina después tanto de irradiación ? como de pasteurización se determina en base en el análisis DSC de la entalpia de estabilización como un marcador de la integridad estructural de la proteína. La recuperación de la albúmina derivada de la pasta sometida a irradiación ? es de 81-82%, el cual es cercano al 78-80% calculado previamente para la albúmina derivada a partir de polvo PPF irradiado. No se observa diferencia significativa en la recuperación de albúmina - - cuando se agregan los estabilizantes comerciales CA y AT por separado o en un complejo, a una concentración de 4 mM. La pasteurización de albúmina irradiada ? induce una pérdida adicional de ~10% de esteructura proteínica debido a desnaturalización de la población desestábilizada de moléculas durante el calentamiento por 10 horas a 60°C. Esto se combina con el 2% para la albúmina no irradiada. El análisis por CLAR de albúmina irradiada después de pasteurización y diálisis subsecuente a pH 4.9 en amortiguador Na-Ac 10 mM para eliminar las moléculas dañadas por precipitación muestra que, después de la diálisis y separación del material insoluble por centrifugación, la cantidad de los agregados reticulados inducidos por pasteurización se reduce de manera significativa. No obstante, la desventaja de esta solución es que, pese a la eliminación preferencial de 70% de material agregado, también se elimina una cantidad significativa de proteína intacta durante la diálisis a pH 4.9. Se seleccionan aditivos protectores en base en su capacidad de eliminación y la solubilidad en etanol/agua. La capacidad de los aditivos para tener solubilidad diferente en soluciones orgánicas y acuosas es necesaria para proteger a la proteína en pasta (aguas madres orgánicas), cuando son esencialmente solubles, y al mismo tiempo se facilita su separación cuando se vuelven a disolver en una solución acuosa en donde no son solubles. Los eliminadores y estabilizantes se agregan a la pasta en albúmina a 0°C para distribución uniforme y disolución en el ambiente orgánico. La pasta que contiene los aditivos se congela y prepara para irradiación a -80°C. La albúmina después se purifica a partir de la pasta irradiada y no irradiada. La prueba de SDS-PAGE sobre albúmina derivada de pasta irradiada a -72°C a 50 kGy (4.6 kGy/h) en presencia de eliminadores diferentes muestra que la irradiación induce fragmentación de ~10% del material total, lo cual no mejora por la presencia de los eliminadores. Una comparación de la recuperación estructural de la fracción V de albúmina en presencia de diferentes estabilizantes basados en DSC muestra que la mejor recuperación de albúmina se observa en presencia de ácido láurico (91%) y vitamina E (87.3%). No obstante, aunque la recuperación de albúmina parece ser elevada, estas - 51 - cantidades no reflejan la imagen completa debido a que el rendimiento total de la proteína en todos los casos es de ~40% en comparación con el que se obtiene sin eliminadores. La presencia de los aditivos cambia de manera significativa la solubilidad de albúmina hacia la formación de agregados insolubles.

EJEMPLO 12 En este experimento se irradia albúmina en presencia o ausencia de SDS.

Resultados La presencia de SDS 100 µ? aumenta la estabilidad térmica de la albúmina, medida en amortiguador PBS (pH 7.0) a partir de 64°C a 80.5°C. En tales concentraciones bajas, SDS, bien conocido como un desnaturalizante fuerte, tiene el efecto opuesto sobre la estructura de albúmina, estabilizándola en más de 20°C. Esto indica que SDS tiene una afinidad de unión específica para albúmina, la cual es comparable con la de los ácidos grasos tal como el ácido láurico. La adición de SDS a albúmina la cual se irradia sin SDS induce la estabilización de únicamente la población de albúmina la cual no se ha dañado al someterla a irradiaión ?. Como se observó, 78% de la proteína retiene su capacidad para unir SDS, mientras que 25% de las moléculas pierden su capacidad después de irradiación y no pueden ser estabilizadas. La prueba de unión de ligando permite la identificación fácil y separación de la población de moléculas nativas las cuales no han sido dañadas por irradiación, de aquellas las cuales han perdido sus propiedades de unión nativas. Esta última f acción de moléculas de albúmina no sobrevivirá al tratamiento por calor a 60°C, produciendo la población del amterial desnaturalizada después de pasteurización. La capacidad calorífica pico del material pasteurizado que carece de una población de estabilidad baja la cual se observa antes de pasteurización, tiene una forma muy parecida al pico de capacidad térmica de la proteína no irradiada. Esta observación también demuestra que la albúmina nativa se puede separar de la fracción irradiada después de pasteurización por un método el cual es capaz de diferenciar entre las formas nativa y desnaturalizada de albúmina (por ejemplo, una matriz unida a ligando, la cual interactúa únicamente con la - - forma nativa). El análisis por DSC albúmina irradiada en ausencia y presencia de SDS 100 µ? muestra una diferencia signficativa en el valor de predesnaturalización de la capacidad calorífica parcial, lo que indica que la presencia de SDS protege a la proteína de la transformación al estado desnaturalizada durante la irradiación. La albúmina irradiada en ausencia de SDS contiene más material desnaturalizado, de acuerdo con este criterio termodinámico, en comparación con la proteína irradiada en presencia de SDS. El análisis por CLAR de la misma muestra de albúmina irradiada en ausencia de SDS antes y después de pasteurización muestra que la pasteurización de estas muestras (irradiadas sin SDS) a 60°C durante 10.5 horas, genera la aparición de agregados reticulados. Estos agregados con un peso molecular elevado derivados de la población de moléculas, las cuales ya han sido desnaturalizadas durante la irradiación y para las cuales la estabilidad térmica es menor de 60°C durante la pasteurización. Las moléculas de albúmina las cuales no han sido dañadas durante la irradiación ? y por lo tanto pueden ser estabilizadas por SDS mantienen su integridad durante la pasteurización con calor. El análisis por SDS PAGE de estas muestras demuestra que, si la albúmina es dañada por irradiación ? y se convierte a la forma desnaturalizada, las moléculas desnaturalizadas forman agregados reticulados S-S durante 10 horas de pasteurización. La albúmina no irradiada, la cual está predominantemente en la forma nativa, no muestra agregación durante la pasteurización. El experimento demuestra que la presencia de SDS puede mejorar la recuperación de albúmina no solo durante la pasteurización, cuando simplemente incrementa la estabilidad térmica de albúmina por encima de 60°C, sino su presencia durante la irradiación también puede mejorar su recuperación después de irradiación ?. Para determinar la concentración óptima de SDS la cual tiene el efecto protector máximo sobre albúmina aún sin desnaturalizarla, se estudia la recuperación de la pro teína en presencia de concentraciones diferentes de SDS, en dos formulaciones, congelada y liofilizada. Se utilizan las siguientes condiciones de irradiación: 50 kGy, 4 kGy/h, -72°C. Se preparan muestras que contienen SDS, como sigue: se agrega SDS a - - albúmina purificada de la pasta de la fracción V. Se calcula la proporción molar en base en el peso molecular de SDS (288.38Da) y de albúmina 66470Da). Las muestras se liofilizan a -53°C a -10% de contenido de humedad (no determinado con precisión). Las muestras liofilizadas se irradian a 50 kGy, 1.42 kGy/h en hielo seco ( — 72°C) y se reconstituyen o diluyen a partir del polvo en amortiguador PBS, pH 7.0 después de irradiación. Dependiendo del propósito particular del experimento, las muestras reconstituidas se diluyen a la concentración requerida para las mediciones biofísicas específicas o se dializan contra amortiguador PBS. Otro grupo de experimentos se realiza sobre albúmina 5%. Esta albúmina no muestra ninguna diferencia en las características estructurales de la albúmina derivada de pasta excepto en la presencia de los estabilizantes comerciales, AT y CA, cada uno en una concentración de 4 iriM. Se agrega SDS a los productos y las muestras se irradian a 50 kGy, 1.415 kGy/h en estado congelado sobre hielo seco. El análisis por SDS-PAGE de las muestras irradiadas y control de albúmina 5% en presencia y ausencia de SDS antes y después de la pasteurización muestran que la presencia de SDS en una proporción molar de 1:10 genera la desaparición de los agregados reticulados S-S, los cuales se utilizan para ser observados después de pasteurización en ausencia de SDS. La presencia de SDS en una proporción molar de 1 : 1 no es suficiente para proteger contra la formación de los agregados. El análisis por CLAR de las muestras de albúmina irradiadas muestra que la irradiación ? genera únicamente un incremento menor en el contenido de dímeros y multímeros, mientras que el tratamiento con calor a 60°C resulta en la producción de cantidades significativas de agregados de peso molecular elevado formados a través de reticulados S-S intermoleculares. El análisis por CLAR de albúmina en presencia de una proporción molar 1:10 de SDS muestra que esta concentración de albúmina y SDS protege completamente a la albúmina irradiada impidiendo la agregación, lo que la vuelve prácticamente indiferenciable de la proteína no irradiada. El análisis por DSC de albúmina la cual se ha irradiado en formulación líquida en ausencia y presencia de SDS muestra que la presencia de SDS durante la irradiación no solo incrementa la estabilidad térmica de la albúmina sino lo que es más importante, - - incrementa de manera significativa la recuperación estructural de la proteína después de irradiación. En comparación con la albúmina la cual se irradió sin SDS, la recuperación de la proteína en presencia de SDS se incrementa hasta 90%. La posición del pico de absorción de calor de la albúmina irradiada sobre la curva calorimétrica indica que más de 90% de las moléculas irradiadas tienen una estabilidad superior a 60°C, lo cual se espera sea importante para la protección de la proteína cuando se somete a pasteurización a 60°C. El análisis por DSC de la albúmina irradiada y no irradiada después de la pasteurización muestra que la ausencia de SDS de pasteurización de la muestra irradiada resulta en una desnaturalización de casi 20% de la albúmina, mientras que la presencia de pasteurización SDS no afecta la estructura de la proteína. El efecto estabilizante de SDS la estructura de albúmina protege a la proteína irradiada impidiendo el daño durante la pasteurización. Una comparación de la recuperación estructural de la albúmina después de la irradiación ? y pasteurización en presencia de cantidades diferentes de SDS muestra que la presencia de SDS en una proporción molar de proteína/SDS de 1:1 únicamente incrementa muy ligeramente la recuperación de proteína durante la irradiación. No obstante, a esta concentración no protege a la albúmina irradiada contra la desnaturalización durante la pasteurización. En contraste cuando la proporción molar de proteína/SDS se incrementa a 1:10, el incremento en la estabilidad protege a la proteína contra irradiación ? y pasteurización. Habiendo ahora descrito por completo esta invención, se entenderá por aquellos habitualmente expertos en la técnica que el método de la presente invención se puede llevar a cabo con una gama de condiciones, formulaciones y otros parámetros amplia y equivalente sin que por esto se aparten del alcance de la invención o de cualquier modalidad de la misma. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan completamente en la presente como referencia en su totalidad. La cita de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe considerarse como la admisión de que tal publicación es técnica anterior o que la presente invención no está intitulada para anteponerse a dicha publicación en virtud de la invención previa.

Claims

- 55 - REIVINDICACIONES

1. Un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, el método está caracterizado porque comprende: (i) agregar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un estabilizante en una cantidad eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar la preparación que contiene albúmina con una radiación adecuada a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina.

2. Un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, el método está caracterizado porque comprende: (i) reducir el contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar la preparación que contiene albúmina con una radiación adecuada a una tasa eficaz con tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina.

3. Un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, el método está caracterizado porque comprende: (i) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina a un nivel eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar la preparación que contiene albúmina con una radiación adecuada a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina.

4. Un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, el método está caracterizado porque comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina por lo menos un procedimiento estabilizante que se selecciona del grupo que consiste de: (a) reducir el contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina, (b) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina, y (c) agregar por lo menos un estabilizante a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar la preparación que contiene albúmina con una radiación adecuada a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina, en donde por lo menos un procedimiento estabilizante y la tasa de irradiación juntas son eficaces para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina.

5. Un método para esterilizar una preparación que contiene albúmina que es sensible a radiación, el método está caracterizado porque comprende: (i) aplicar a la preparación que contiene albúmina por lo menos dos procedimientos estabilizantes que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) reducir el contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina, (b) reducir la temperatura de la preparación que contiene albúmina, y (c) agregar por lo menos un estabilizante a la preparación que contiene albúmina; y (ii) irradiar la preparación que contiene albúmina con una radiación adecuada a una tasa eficaz por un tiempo eficaz para esterilizar la preparación que contiene albúmina, en donde por lo menos dos de los procedimientos estabilizantes son eficaces juntos para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina y además en donde por lo menos dos procedimientos estabilizantes se pueden realizar en cualquier orden.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el solvente es agua.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el contenido de agua residual se reduce por adición de un solvente orgánico.

8. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el solvente es un solvente orgánico.

9. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina se suspende en un solvente orgánico después de reducción del contenido de solvente residual.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es no mayor de aproximadamente 3.0 kGy/hora.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es no mayor de aproximadamente 2.0 kGy/hora.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es no mayor de aproximadamente 1.0 kGy/hora.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es no mayor de aproximadamente 0.3 kGy/hora.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es mayor de aproximadamente 3.0 kGy/hora.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es por lo menos de aproximadamente 6.0 kGy/hora.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es por lo menos de aproximadamente 18.0 kGy/hora.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es por lo menos de aproximadamente 30.0 kGy/hora.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la tasa eficaz es por lo menos de aproximadamente 45 kGy/hora.

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina se mantiene en una atmósfera con baja concentración de oxígeno.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, ó 5, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina se mantiene en una atmósfera que comprende por lo menos un gas noble.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el gas noble es argón. - 58 -

22. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina se mantiene en vacío.

23. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual se reduce por un método que se selecciona del grupo que consiste de liofílización, secado, concentración, adición de soluto, evaporación, extracción química, secado por aspersión y vitrificación.

24. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 15%.

25. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 10%.

26. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 3%.

27. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 2%.

28. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 1%.

29. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 0.5%.

30. El método de conformidad con la reivindicación 2, 4 ó 5, caracterizado porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 0.08%.

31. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque se agrega por lo menos un sensibilizante a la preparación que contiene albúmina antes de la etapa de irradiación de la preparación que contiene albúmina.

32. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina contiene por lo menos un contaminante biológico o patógeno que se selecciona del grupo que consiste de virus, bacterias, levaduras, mohos, hongos, priones o agentes similares responsables, solos o combinados, de las TSE y parásitos unicelulares o multicelulares.

33. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante es un antioxidante.

34. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante es un eliminador de radicales libres.

35. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante es un estabilizante de combinación.

36. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque por lo menos un estabilizante es un ligando.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el ligando es heparina.

38. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante reduce el daño debido a especies de oxígeno reactivas.

39. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante se selecciona del grupo que consiste de: ácido ascórbico o una sal o éster del mismo; glutatione; ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico; ácido úrico o una sal o éster del mismo; metionina; histidina; N-acetil-cisteína, ácido lipoico; sulfoxilato de formaldehído de sodio; ácido gálico o un derivado del mismo; galato de propilo y mezclas de dos o más de los mismos.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque las mezclas de dos o más estabilizantes adicionales se seleccionan del grupo que consiste de: mezclas de ácido ascórbico o una sal o éster del mismo y ácido úrico o una sal o éster del mismo; mezclas de ácido ascórbico, o una sal o éster del mismo y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico; mezclas de ácido ascórbico o una sal o éster del mismo, ácido úrico o una sal o éster del mismo y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico y mezclas de ácido úrico o una sal o éster del mismo; ácido lipoico; sulfoxilato de formaldehído de sodio; ácido gálico o un derivado del mismo; galato de propilo y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico.

41. El método de conformidad con la reivindicación 1, 4 ó 5, caracterizado porque al menos un estabilizante es un estabilizante dipeptídico.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado - 60 - porque el estabilizante dipeptídico se selecciona del grupo que consiste de glicina-glicina (Gly-Gly), carnosina y anserina.

43. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación corpuscular o radiación electromagnética o una mezcla de las mismas.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la radiación electromagnética se selecciona del grupo que consiste de ondas de radio, microondas, luz visible e invisible, luz ultravioleta, radiación de rayos X, radiación ? y combinaciones de las mismas.

45. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación ?.

46. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación de haz E.

47. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación es luz visible.

48. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación es luz ultravioleta.

49. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es radiación es rayos X.

50. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es luz visible policromática.

51. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es infrarroja.

52. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la radiación es una combinación de una o más longitudes de onda de luz visible y ultravioleta.

53. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la irradiación se conduce a temperatura ambiente.

54. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la irradiación se conduce a una temperatura inferior a la temperatura ambiente.

55. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la irradiación se conduce por debajo de la temperatura de congelamiento de la preparación que contiene albúmina.

56. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la irradiación se conduce por debajo de la temperatura eutéctica de la preparación que contiene albúmina.

57. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque la irradiación se conduce a una temperatura por encima de la temperatura ambiente.

58. Una composición caracterizada porque comprende por lo menos una preparación que contiene albúmina y por lo menos un estabilizante en una cantidad eficaz para conservar la preparación que contiene albúmina de su uso propuesto después de esterilización con radiación.

59. Una composición que comprende por lo menos una preparación que contiene albúmina, en donde el contenido de solvente residual de la preparación que contiene albúmina está en un nivel eficaz para conservar la preparación que contiene albúmina para su uso propuesto después de esterilización con radiación.

60. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 15%.

61. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 10%.

62. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 5%.

63. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 2%.

64. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 1%.

65. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 0.5%. - 62 -

66. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el contenido de solvente residual es menor de aproximadamente 0.08%.

67. La composición de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizada porque la preparación que contiene albúmina es convertida en vidrio o vitrificada.

68. La composición de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizada porque la preparación que contiene albúmina comprende además por lo menos una proteína que se selecciona del grupo que consiste de inmunoglobulinas monoclonales, inmunoglobulinas policlonales, glucosidasas, sulfatasas, urocinasa, trombina y factor VIH.

69. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 0.5%.

70. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 1%.

71. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 5%.

72. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 10%.

73. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 15%.

74. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 20%.

75. La composición de conformidad con la reivindicación 59, - 63 - caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 25%.

76. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es de por lo menos aproximadamente 50%.

77. La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la concentración de proteína de la preparación que contiene albúmina es eficaz para proteger de la radiación a la preparación que contiene albúmina.

78. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la preparación que contiene albúmina se suspende en un solvente orgánico después de reducción del contenido de solvente residual.

79. Un método para tratar choque hipovolémico, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

80. Un método para tratar quemaduras, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

81. Un método para mantener un volumen de fluido en un humano que ha experimentado derivación cardiopulmonar, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual ha sido esterilizada de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5.

82. Un método para tratar una falla hepática aguda, caracterizada porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

83. Un método para evitar el secuestro o retención de fluidos ricos en proteínas en un paciente que padece de una condición que se selecciona del grupo que consiste de peritonitis aguda, pancreatitis, mediastinitis y celulitis excesiva, el método está - 64 - caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que cnotiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

84. Un método para tratar m^oalbuniinemia caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

85. Un método para tratar hipoproteinemia con o sin edema, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

86. Un método para tratar el síndrome de malestar respiratorio adulto, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual ha sido esterilizada de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

87. Un método para tratar enfermedad hemolítica neonatal caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

88. Un método para tratar nefrosis aguda, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 4 ó 5.

89. Un método para evitar choque o hipotensión en un humano que experimenta diálisis renal, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

90. Un método para tratar choque debido a quemaduras, daño por compresión, emergencias abdominales, desihidratación, infección u otra causa cuando - 65 - existe predominantemente una pérdida de fluido plasmático y no eritrocitos, el método está caracterizado porque comprende administrar al humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5.

91. Un método para tratar choque debido a hemorragia, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5.

92. Una mejora en un método de cultivo de células, en donde la mejora comprende agregar al medio de crecimiento para las células una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.

93. Una mejora en un método para producir un producto de metabolismo celular al cultivar células, en donde la mejora comprende agregar al medio de crecimiento para las células una preparación que contiene albúmina la cual se ha esterilizado de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5.

94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el producto es una proteína.

95. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el producto es una proteína recombinante.

96. La composición de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizada porque la preparación contiene albúmina y comprende además por lo menos un material biológico que se selecciona del grupo que consiste de hemoglobina, antitrombina ??, polisacáridos, vacunas, colágeno, gelatina, tripsina, suero bovino fetal, transferrina, insulina, hormona del crecimiento humana, factor IX, fibrinógeno, factor XIII, factor XHIa, factor VE, factor VTÍa, factores de crecimiento, inmunotoxinas, proteínas morfogenéticas óseas, proteínas osteogénicas, citocinas, factor XI y plasma.

97. La composición de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizada porque la preparación que contiene albúmina comprende además por lo menos un tejido que se selecciona del grupo que consiste de válvulas cardíacas, piel, hueso, vasos sanguíneos, nervios, ligamentos y córneas.