CA2217437A1 - Films biodegradables a base de caseinate et leur procede de fabrication par irradiation - Google Patents

Abstract

L'emballage et même le suremballage des produits de consommation est une pratique courante dans les pays industrialisés. Comme ces emballages sont formé s essentiellement de polymères non-biodégradables, ils causent actuellement des problèmes environnementaux. Ces problèmes environnementaux sont retrouvés non seulement dans les pays industrialisés mais aussi dans les pays en voie de développement. Cette situation a favorisé le développement de différent films, plus écologiques, à partir d'éléments biodégradables à base de polysaccharides, de protéine et/ou de lipides. Nous avons mis au point un film protéique biodégrada ble formé a partir d'un sel de la caséine. D'origine laitière, la caséine est abond ante et pourrait même être récupérée des laits invendus. Le processus de polymérisation est induit par irradiation gamma. En effet, l'interaction de radicaux hydroxyl avec les tyrosines présentes dans la protéine crée une liaison covalente (bityrosine). L 'ajout d'agent plastifiant est indispensable afin de produire un film plus souple et mo ins friable. La présence de glycérol n'inhibe pas la formation de bityrosine. Elle protège la protéine de la dénaturation causée par l'irradiation, augmente le pouvoir déform ant et diminue la résistance à la rupture du film. Les essais de biodégradabilité, con duits dans nos laboratoires, ont démontré que le film produit par irradiation gamma es t accessible aux attaques enzymatiques de Pseudomonas fragi.

Description

CA 022l7437 l997-09-30 TITRE DE L'INVENTION
Films biodégradables à base de caséinate et leur procédé de fabrication par irradiation DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention est reliée à des films biodégradables faits à base de protéines, particulièrement à base de caséinate, et leur procédé de fabrication.

HISTORIQUE DE L'INVENTION
Les matériaux de plastique sont très présents dans notre environnement. On les retrouve un peu partout et ils ont considérablement contribué à améliorer lebien-être de l'homme. Les raisons justifiant leurs utilisations industrielles etdomestiques sont que les plastiques constituent des matériaux légers, résistants, chimiquement inertes et économiques à produire.
L'étendue et l'utilité que procurent les matériaux de plastique sont quasi incalculables. Malgré leurs bienfaits, ils causent aujourd'hui un grave problème de pollution environnementale qu'on ne peut plus se permettre d'ignorer. Le recyclage OU la réutilisation de certains composés de plastique n'améliorent que partiellement la situation, d'où l'intérêt de développer des films partiellement ou entièrement biodégradables.
Présentement, les consommateurs exigent une plus grande qualité et une prolongation de la durée de conservation de leur produits alimentaires. Parallèlement, ils demandent une réduction de la quantité des matériaux d'emballages utilisés. Le plastique représente l'une des principales composantes utilisées pour l'emballage de nos produits de consommation. En 1992, selon le plan vert du Canada, les emh~ ses représentaient environ 30% des déchets solides des municipalités canadiennes.
Comme les emballages et autres plastiques sont fondamentalement résistants aux attaques des bactéries présentes dans la nature, I'enfouissement souterrain et le déversement dans les océans ne sont plus des méthodes écologiquement acceptablespour se défaire de nos déchets de plastique. Alors, on doit s'orienter vers le recyclage, I'incinération, le compostage et la biodégradation. Suite à la sensibilisation des autorités fédérales face à ce problème, un protocole national sur l'emballage a été
3 o signé en avril 1990 qui vise à réduire de 50% les déchets provenant des emballages d'ici l'an 2000 (Ministère d'approvisionnements et services Canada).

Depuis quelques années, la population est davantage sensibilisée aux problèmes de pollution par les plastiques. Ceci a permis de développer des films de plastique à base d'amidon qui sont actuellement sur le marché (Gage, 1990). La présence d'amidon contribue à faciliter l'attaque microbienne via les systèmes enzymatiques. Le résultat ultime recherché par l'ajout d'amidon est la perte de l'intégrité structurelle qui se traduit par une diminution du poids moléculaire des films de plastique.
Présentement, une recherche active se poursuit afin de produire un film biodégradable qui ne serait pas dommageable pour la nature et qui posséderait les 10 caractéristiques des emballages de plastique. Alors, on doit s'orienter vers un composé qui serait initialement biodégradable, qui offrirait une résistance à ladénaturation thermique et qui démontrerait certaines propriétés des emballages de plastique.
La majorité des films considérés biodégradables sont formés simplement par la solubilisation de composantes dégradables dans un solvant approprié. Jusqu'à
maintenant, des recherches ont été entreprises sur les films à base de polysaccharides, de protéines et de lipides seuls ou en combinaison. Habituellement, les films alimentaires sont formés à partir de polymères de haut poids moléculaire afin de fournir une matrice sufffisamment résistante et adhérente. Les particularités de la matrice dépendront de la structure chimique du polymère, de la présence d'agentsplastifiants et de la façon dont le film est appliqué sur la surface des produits.
L'application des films d'enrobage à la surface des produits se fait par trempage, pulvérisation ou extrusion. Les principales propriétés recherchées chez les films d'emballage sont la résistance, la déformation, les propriétés de barrières aux gaz et à l'humidité et les possibilités de conditionnement.
Un polymère est obtenu par la polymérisation d'un monomère afin de former des chaînes polymériques continues eVou ramifiées. Dans le cas des composantes de plastique, cette polymérisation est généralement réalisée soit par la chaleur(thermoplastique) comme pour le poly-iminocarbonate (Li et Kohn, 1989), soit par une 3 o composante photosensible aux rayonnements ultra-violets comme pour la formation de l'acrylique et du méthacrylique (Ciardelli et al. ,1989). Il est également possible d'obtenir du polyuréthane par irradiation gamma (Shintani et Nakamura, 1991). A plus de 25kGy, I'effet de l'irradiation sur le polymère se limite principalement à lapolymérisation intermoléculaire avec peu ou pas de dégradation. La polymérisation CA 022l7437 l997-09-30 protéique peut être également réalisée par des procédés enzymatiques. En effet, des polymères de collagène (Ricard-Blum et Ville, 1988), de caséine aS" (Motoki et a/., 1987) et de fibrine (Kasai ef al., 1983) ont été obtenus de cette façon.
La force de cohésion d'un film est reliée à sa structure polymérique et chimique, 5 à la nature du solvant utilisé, à la présence d'agents plastifiants ou d'additifs et aux conditions environnantes durant la formation du film (Kester et Fennema, 1986).
Une relation directe existe entre la cohésion du film et la longueur et la polarité
des chaînes du polymère. Une distribution uniforme des groupements polaires le long des chaînes polymériques accroît la cohésion en augmentant la probabilité
10 d'interactions ioniques et de portages hydrogènes entre les chaînes (Banker, 1966).
Généralement, lorsqu'on accroît la structure cohésive d'un film, une baisse de sa flexibilité, de sa porosité et de sa perméabilité au gaz, à la vapeur et aux solutés est observée (Kester et Fennema,1986). Par exemple, la stabilité de la structure tertiaire d'une protéine affecte la formation d'un film et les propriétés résultantes du film c'est-à-dire que la flexibilité moléculaire contribue à la formation de films cohésifs (Graham etPhillips, 1980).
Les solvants utilisés pour la formation de films comestibles se limitent à l'eau, I'éthanol ou une combinaison des deux (Kester et Fennema, 1986). Des essais avecde l'ammoniac et de l'acide acétique ont été réalisés mais un problème d'odeur limite 20 leur utilisation. Après son évaporation, l'ammoniac démontre une odeur persistante très marquée sur le produit final (Gontard et al.,1992).
Les agents plastifiants sont habituellement regroupés dans la famille des polyols comme le glycérol, sucrose et autres. lls peuvent être introduits afin de donner de la flexibilité aux films donc d'améliorer leurs propriétés mécaniques. Le caractère

2 5 plastifiant est obtenu par une réduction des forces intermoléculaires affectant ainsi la structure du film et augmentant la mobilité des chaînes du polymère. Toutefois, le relâchement de la structure du film réduit l'habilité du film à agir comme barrière à la diffusion de plusieurs gaz et vapeurs (Gennadios et Weller, 1990; Peyron, 1991).Les conditions environnementales influencent la cohésion du film. Des 30 températures excessives lors de la période de séchage se traduisent par une évaporation prématurée du solvant. Ces conditions peuvent immobiliser prématurément les chaînes polymériques avant qu'elles puissent avoir l'opportunité
de se regrouper pour former un film continu et cohérent (Banker, 1966). Ceci peut engendrer certains défauts comme des micro-perforations ou une épaisseur non-uniforme qui vont inévitablement accroître la perméabilité du film.

Les films à base de polysaccharides Une grande diversité de polysaccharides a été évaluée expérimentalement pour 5 leur capacité à former des films. Entre autres, on pense à l'alginate, à la pectine, aux carraghénanes, à l'amidon et aux dérivés cellulosiques. Les polymères de polysaccharides démontrent une excellente imperméabilité à 1'O2; cependant ils offrent une barrière minimale à l'humidité dû à leur caractère hydrophile. Seuls les films à
base de dérivés cellulosiques présentent une imperméabilité remarquable à l'eau (Kanig et Goodman, 1962; Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991). Le principal inconvénient des polymères à base de polysaccharides est qu'ils démontrent une barrière très limitée aux microorganismes (Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991;
Torres et Karel, 1985). Des essais effectués avec du boeuf haché enrobé ont démontré une protection efficace contre l'oxydation mais aucune barrière contre la flore bactérienne de surface (Peyron,1991).

Les films à base de lipides et de cires Les films à base de lipides offrent une excellente imperméabilité à l'humidité àcause de leur faible polarité (Feuge, 1955, Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991).
Jusqu'à ce jour, une grande diversité de lipides ont été utilisés pour la confection de films comprenant les monoglycérides, les cires naturelles et les agents de surface.

Les monoglycérides Une caractéristique des monoglycérides à l'état solide est leur propriété
élastique. La majorité des lipides de ce type peuvent s'étendre jusqu'à 120% de leur longueur initiale avant cassure alors que le monostéarate de glycérol acétylé peut s'étendre jusqu'à 800% de sa longueur initiale avant cassure (Kester et Fennema,1986; Peyron,1991). C'est donc un produit qui peut s'étirer facilement et qui démontre une résistance face aux contraintes mécaniques. Ces particularités sont intéressantes pour la formation de films d'enrobage.

3 o La perméabilité à la vapeur d'eau des films produits à l'aide de monoglycérides acétylés est grandement inférieure aux films à base de polysaccharides mais elle est quand même supérieure à celle à base de dérives cellulosiques (Kanig et Goodman,1962). La résistance des monoglycérides acétylés au transport de l'humidité est très dépendante du gradient de pression de vapeur d'eau de chaque côté du film (Lovergren et Feuge, 1954). L'enrobage par les films d'acétoglycérides a permis de démontrer que ceux-ci apportaient une certaine protection contre la contamination microbienne de surface (Peyron, 1991 ) Les cires naturelles Les cires naturelles sont plus résistantes au transport de l'humidité que tous autres films lipidiques ou non-lipidiques. Par contre, les cires n'adhèrent pas très bien 10 aux surfaces très humides dues à leur caractère très hydrophobe (Kester et Fennema, 1988). Afin d'éviter tout processus de dégradation anaérobique lors de l'enrobage d'un aliment, il est parfois préférable d'ajouter des monoglycérides acétylés aux cires afin d'y apporter de la flexibilité et diminuer ainsi la résistance à la perméabilité de l'eau et des gaz (Kester et Fennema, 1986; Peyron,1991).

Les agents de surface Les agents de surface ou les lipides tensioactifs réduisent l'activité de l'eau (aw qui représente l'eau disponible) à la surface d'un produit alimentaire. lls ont la propriété
de réduire le taux de perte d'humidité au cours de l'entreposage. L'aw influence les mécanismes de détérioration des produits alimentaires. Un faible aw retarde la croissance microbienne de même que les réactions chimiques et enzymatiques de surface (Kester et Fennema, 1986). Alors, l'enrobage d'aliments avec un agent desurface devrait contribuer à modifier ces modes de détériorations en contrôlant la migration de l'eau à la surface des aliments.
La propriété de réduire l'évaporation est influencée par la structure de l'agentde surface utilisé. Les agents de surface les plus efficaces sont ceux qui possèdent une chaîne de 16 à 18 carbones. La présence d'une double liaison dans la chaîne de carbone diminue fortement les propriétés d'imperméabilisation de l'enrobage (Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991).

CA 022l7437 l997-09-30 Les films protéiques Les films protéiques offrent de meilleures propriétés mécaniques mais leurs perméabilités aux gaz et à l'humidité sont variables. Un traitement acide (vers le point isoélectrique) améliore la résistance au transport de l'humidité car ce traitement diminue la mobilité des chaînes de polymères (Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991).

Les protéines du lactosérum Le lactosérum (a-lactalbumine et ~-lactoglobuline principalement) ou protéines du petit-lait, forme un gel thermoirréversible, pH-dépendent et sensible à la chaleur 1 o (Schmidt et Morris,1984; Vuillemard et al., 1989). A titre d'exemple, le chauffage des protéines du lactosérum à des températures entre 70 et 85~C et à une concentration supérieure à 5%, forme un gel thermoirréversible. Ce gel se développe par la formation de nouvelles liaisons disulfures intermoléculaires (Vuillemard et al., 1989).
Le processus de gélification des protéines du lactosérum est fortement influencé par le pH du milieu pendant la période de chauffage car un pH 2 6,5 diminue les interactions intermoléculaires (Schmidt et Morris, 1984; Xiong, 1992). Des forces ioniques élevées semblent accroître la stabilité protéique probablement par une augmentation du pouvoir d'hydratation (solubilité) des protéines (Xiong, 1992).

Les protéines de soja Les protéines de soja forment essentiellement un hydrogel et sont très susceptibles à la dénaturation (Schmidt et Morris, 1984). Ces protéines sont composées de 4 sous-unités(2S, 7S, 11S et 15S), de poids moléculaires élevés (300 000 à 600 000) et possèdent des structures quaternaires fort complexes (Delisle, 1984). Généralement, la gélification des protéines de soja est un phénomène induit thermiquement par la préparation d'une solution contenant une concentration d'aumoins 7% de protéines et à des températures de 100~C ou plus. Des problèmes techniques ont limité l'utilisation des protéines de soja à des applications de produits laitiers comme le ~tofu" et différents fromages (Schmidt et Morris, 1984).

CA 022l7437 l997-09-30 Le gluten Les protéines du gluten, soit la gliadine et la gluténine, originent de la farine de blé. La gliadine est essentiellement hydrophobe et visqueuse alors que la gluténine est hydrophile et élastique. Les caractères élastiques et cohésifs du gluten sont dus, en grande partie, à la présence de ponts disulfures (Gennadios et Weller, 1990). Laconcentration de gluten de même que le pH des solutions protéiques sont les principaux facteurs affectant les propriétés mécaniques des films de gluten. Le pH et la concentration en éthanol affectent l'opacité, la solubilité et la perméabilité des films à la vapeur d'eau (Gontard et al, 1992). Les films à base de gluten demeurent une 10 voie très prometteuse mais leur perméabilité à l'eau limite actuellement leur exploitation (Gennadios et Weller, 1990; Gontard ef al., 1992) .

La zéine La zéine est une protéine isolée du mals. Elle est soluble dans l'éthanol. Elle forme des films avec de très bonnes propriétés de barrière à la vapeur d'eau mais son étude demeure encore limitée (Kanig et Goodman, 1962; Kester et Fennema, 1986).

La caséine La caséine bovine est une protéine abondante, économique et facilement accessible. La caséine seule représente approximativement 80% des protéines totales du lait de vache (Schmidt et Morris,1984). Elle peut être isolée du lait écrémé soit par acidification à l'acide minéral, soit par acidification par des cultures bactériennes mixtes (Vuillemard et al., 1989). Le coût d'achat de 4549 de caséine entière ou de caséinate se chiffre à environ 4.
C'est une phosphoprotéine à caractère amphiphile qui se lie fortement aux ions Ca2+ et Zn2+ (Schmidt et Morris, 1984; Vuillemard et al., 1989). Dû à leur caractère hydrophile, les films de caséine ne produisent pas une barrière effficace à l'humidité.
Par contre, elle peut agir comme agent émulsifiant et créer une émulsion caséine-lipide stable (Avena-Bustillos et Krochta, 1993). Les propriétés de barrières aux gaz et à l'humidité des films à base de caséine peuvent être améliorées par la polymérisation de la protéine avec du calcium (Ca+2) mais aussi en ajustant le pH du 30 milieu au point isoélectrique de la caséine. L'ajustement au point isoélectrique optimise les interactions protéines-protéines, modifie la configuration moléculaire et influencerait CA 022l7437 l997-09-30 les propriétés de transfert de masse (Krochta, 1991 et Avena-Bustillos et Krochta, 1 993).
Les protéines laitières, incluant la caséine, demeurent un choix prometteur pourla formation éventuelle de films comestibles afin de répondre aux revendications des environnementalistes sur les emballages (McHugh et Krochta, 1994).

Les films composites Les films comestibles peuvent être de nature hétérogène c'est-à-dire formés à partir d'un mélange de polysaccharides, de protéines eVou de lipides. Cette approche permet l'exploitation avantageuse des caractéristiques fonctionnelles de chacune des composantes du film. La préparation de films composites impose une émulsification du matériel lipidique dans une phase aqueuse. La technique de préparation de films hydrophobes influence ses propriétés de barrière. Un film formé
à partir d'une répartition dispersée du matériel hydrophobe offre de faibles propriétés de barrière à la vapeur d'eau, comparativement aux films avec une couche continue (Martin-Polo et al., 1992). Une répartition dispersée est due à la différence de polarité
entre le support (exemple: méthylcellulose) et le matériel hydrophobe (techniqued'émulsion).
Parfois, une période de chauffage est nécessaire afin de liquéfier les cires ou les lipides utilisés. Ceci peut créer une dénaturation thermique, des modifications structurelles des autres composantes (polysaccharides ou protéines) et selon le cas, I'évaporation d'une partie du solvant (Kester et Fennema, 1986; Peyron, 1991). Le pH
du milieu peut fortement influencer la solubilité d'une composante du film de même que sa concentration. Alors, le choix des composantes, leurs concentrations et les conditions du milieu sont cruciales pour la formation du film.
Un exemple de film composite est celui développé par Kamper et Fennema (1 984a et b). Leur film est composé d'esther cellulosique et d'un mélange d'acide gras (acides palmitique et stéarique). Le film démontre une perméabilité à la vapeur d'eau comparable aux films non-comestibles de polychlorures de vinyle (PCV) et de polyéthylènes à basse densité (PEBD).
3 o Les films composites protéines-lipides développés par Sian et Ishak (1990) à
partir de lait de fèves de soja démontrent une dépendance des films au pH du milieu.
Les films préparés à pH basique contiennent une plus grande proportion de protéines, de minéraux, d'hydrates de carbone et d'eau et moins de matières grasses que ceux formés à pH acide. Un pH basique cause une augmentation de la capacité
émulsifiante des protéines qui tend à disperser les globules de gras dans le lait. Ainsi, les films produits à pH basique, incorporeront moins de matières grasses. A pH acide (inférieur à la région isoélectrique), le contenu en humidité des films est très faible car 5 I'acidification favorise la précipitation des protéines et forme des complexes insolubles (Sian et Ishak, 1990).
Afin de répondre au besoin de réduire les déchets d'emballages, des recherches se poursuivent sur la formation de films de plastique en présence d'amidon. Ce sont des films composites mais non-comestibles. L'ajout d'amidon dans 10 les films de polyéthylène tend à produire une structure poreuse. Comme les liaisons covalentes entre l'amidon et le polyéthylène ne sont pas véritablement formées durant le conditionnement, I'incorporation d'amidon produit des discontinuités dans la matrice du film (Lim ef al., 1992). Les petites particules d'amidon produisent moins de discontinuités sévères dans la matrice que les grosses particules.
La présence d'amidon n'est certes pas sans effet sur les propriétés mécaniques des films de polyéthylène. A mesure que le contenu en amidon augmente, la force à
l'étirement, le pourcentage d'élongation et la transmission de la lumière diminuent, alors que l'épaisseur du film augmente. La perte des propriétés élastiques est moindre avec de petites particules d'amidon que des grosses (Lim et al. 1992).

Sélection de sul)slrdls pour la formation d'un film Selon les différentes études effectuées jusqu'à présent sur les films comestibles, il semble que les protéines laitières possèdent de bonnes propriétés pour la formation d'un film. Les sels de caséines semblent être un choix judicieux en raison de leur plus grande solubilité que la caséine native. Une quantité minimale de 2 5 protéines est nécessaire afin d'obtenir un film qui soit maniable tout en possédant une résistance et une déformation adéquate. Cette source de protéines est de plus, très accessible et peu coûteuse. En raison de ces considérations, nous avons arrêté notre choix sur des extraits de caséinate pour la formation d'un film protéique.

LA CASÉINE ET LES CASÉINATES
La caséine bovine se compose de quatre complexes protéiques majeurs, nommés aS, et2~ ~- et K-caséines Globalement, une molécule de caséine est constituée d'un noyau essentiellement hydrophobe composé d'a- et de ~-caséine et entouré de5 K-caséine en surface (Schmidt et Morris, 1984) La stabilité des micelles est assurée par les K-caséines et les phosphates de calcium colloldaux retrouvés en périphérie (Schmidt et Morris,1984) La caséine contient beaucoup de résidus proline distribués uniformément Cela lui confère une structure ouverte limitant ainsi la formation d'hélices alpha et de feuillets bêta (Modler, 1985) Cette conformation ouverte 10 démontre une certaine résistance à la dénaturation thermique et offre un accès facile aux attaques enzymatiques (Schmidt et Morris,1984; Vuillemard et a/., 1989, McHugh et Krochta, 1994) Les caséinates sont obtenues soit par l'acidification à l'acide minéral (HCI ou H2S04), soit par l'acidification par des cultures mixtes composées de Streptococcus 15 sous espèce lactis eVou cremoris, au point isoélectrique de la caséine (pH de 4,6) La neutralisation des précipités insolubles de caséines acides ou lactiques par des alcalis permet la resolubilisation en sel de sodium, de calcium, de potassium, de magnésium ou d'ammonium (Schmidt et Morris,1984; Vuillemard et a/., 1989; McHugh et Krochta, 1994) Les caséinates solubilisés sont par la suite déshydratés Les sels de caséines 2 o ainsi obtenus sont solubles à des pH supérieurs à 5,5 LE PROCESSUS DE POLYMÉRISATION
La polymérisation d'une solution protéique est possible par l'intermédiaire de radicaux hydroxyles (-OH) Ces radicaux sont formés par la radiolyse de l'eau, induite par la radiation gamma du Co60 (Fricke et Hart,1966) Les mécanismes réactionnels L'irradiation d'une solution protéique au Co60 en présence de protoxyde d'azote (100% N20), produit majoritairement des radicaux ~OH grâce à l'interaction de l'électron solvaté avec une molécule de N20 L'irradiation sous 100% de N2O produit environ 8% de radical hydrogène (.H) 3 o (Adams et al., 1971; Singh et Singh , 1983; Singh et Vadasz, 1983) Or, I'irradiation d'une solution d'albumine sérique bovine (ASB) sous une atmosphère de 100% N2O
ou sous 100% de N2 et en présence d'absorbeur radicalaire (par exemple alcool t-butylique, mannitol, acide urique) a démontré que le radical ~H n'est pas impliqué
dans la formation de liaisons covalentes ou dans le processus de fragmentation (Davies et al., 1987a).
Le N2O est un gaz très stable et généralement inerte à la température de la 5 pièce. Sa dissociation commence à plus de 300 degrés Celsius et devient alors un puissant agent oxydant (Merck & Co., Inc., 1960).
L'irradiation en présence d'oxygène (~2) produit des ions radicalaires superoxydes (-~2-) soit par l'interaction directe de e~aq avec une molécule d'O2, soit par l'interaction indirecte d'un radical ~H et d'une molécule ~2 10 TABLE 1: Mécanisme réactionnel de l'électron solvaté et du radical ~H avec l'oxygène du milieu e -a q + ~2 ' ~~2-~H + ~2 ' ~HO2 ' ~~2 + H

A pH neutre, le radical hydrodioxyle (-HO2) est rapidement déprotoné (PKa 4,8) pour former encore plus de radicaux superoxydes (Ferradini et Pucheault,1983 et Fridovich, 1983).
L'exposition aux radicaux ~OH seuls induit une polymérisation avec peu ou pas de fragmentation, alors que l'exposition simultanée aux radicaux ~OH + ~o2-(+ ~2) induit, à la fois, une polymérisation et une fragmentation. L'exposition à l'ion radicalaire ~~2- seul, n'a aucun effet sur le poids moléculaire (Davies, 1987). Dans un processus de polymérisation, on désire la création de liaisons covalentes et éviter la 20 fragmentation. Alors, I'utilisation unique de radicaux ~OH est essentielle pour la formation d'un polymère. Donc, I'irradiation sous atmosphère saturée en N2O est primordiale.

Interactions des acides aminés avec les radicaux libres Certains acides aminés sont plus susceptibles que d'autres à interagir avec les radicaux ~OH. C'est le cas des molécules de cystéine, d'histidine, de tryptophane et de tyrosine (Delincée, 1983; Yamamoto, 1977). Les molécules de tyrosines peuvent5 être formées par l'ajout d'un groupement hydoxyl (OH) sur une molécule de phénylalanine au cours du traitement d'irradiation. Tous les résidus d'acides aminés peuvent interagir avec les radicaux ~OH et devenir eux-même des radicaux. Toutefois, dans la majorité des cas, les radicaux d'acides aminés décroissent (perdent leur état radicalaire) sans même avoir interagi avec le milieu (Davies et al., 1987a).
L'exposition de protéines aux radicaux ~OH sous atmosphère de N20 produit, à la fois la formation d'une nouvelle liaison et une perte de résidu de tryptophane (Davies et al., 1987a). Par ailleurs, cette nouvelle liaison, qui forme la bityrosine, est de nature covalente et se forme entre deux résidus de tyrosine.
Le radical tyrosyl est formé par la soustraction d'un atome d'hydrogène sur la fonction hydroxyl du résidu tyrosine par le radical ~OH. Le radical tyrosyl ainsi formé
peut réagir avec un autre radical tyrosyl ou avec une molécule de tyrosine, pour former un composé biphénolique stable. Un effet ortho-orienteur est impliqué dans la formation de nouvelles liaisons biphénoliques, la forme 2,2'-biphénol apparaît comme la principale liaison produite (Prutz,1983).
ll est ainsi facile de constater que le couplage en position para (4 ou 4') des tyrosyls démontre un encombrement stérique par le résidu R. Alors l'énolisation des quinones, principalement formés dans la réaction de couplage, est limitée quand la position 4 ou 4' est impliquée. La forme phénoxy-phénol 0-2' est à l'état de trace alors que la forme peroxyde (0,0') n'est pas retrouvée (Prutz, 1983).
2 5 La formation de bityrosine est davantage une liaison intermoléculairequ'intramoléculaire et elle représente un important facteur dans le processus depolymérisation des protéines traitées aux radicaux ~OH (Davies,1987).
Près de 90% de la polymérisation protéique induite par le radical ~OH est attribuable à la formation de nouvelles liaisons covalentes intermoléculaires autres que 3 o les ponts disulfures. Le 10% restant, représente l'agrégation générée par les interactions noncovalentes et les ponts disulfures (Davies,1987).
Des études menées en présence d'inhibiteurs radicalaires (mannitol, alcool t-butylique avec ou sans la présence d'azote) ont démontré que le radical ~OH est le principal agent responsable de la destruction de résidus de tryptophane sous irradiation en présence de N2O (100%) (Davies ef al., 1987a). Les radicaux .H, ~~2-et e~aq ne sont pas impliqués directement dans un mécanisme de dégradation avec un résidu de tryptophane (Davies et al., 1987a). Le radical ~~2- et l'oxygène (~2) peuvent interagir sur les produits initialement transformés par le radical ~OH résultant ainsi d'un 5 effet d'amplification sur les dommages protéiques, c'est-à-dire, la perte de tryptophane et la formation de bityrosine (Davies et al.,1987a).
Les phénomènes de polymérisation induit par le radical ~OH et la fragmentation induite par les radicaux ~OH + ~o2-(+ ~2) ont été retrouvés sur 16 protéines différentes (Davies, 1987). Les modifications de la structure primaire comme la perte de 10 tryptophane et la formation de bityrosine sont également observées sur ces 16 mêmes protéines (Davies,1987; Davies et al.,1987a). Alors, il est probable que les effets des radicaux oxygènes sur les structures secondaires et tertiaires observées sur uneprotéine modèle comme l'ASB, puissent se généraliser à l'ensemble des protéines (Davies et Delsignore,1987).

L'INFLUENCE D'AGENTS PLASTIFIANTS
L'ajout d'un polyalcool (sucres ou glycérol) dans un milieu protéique, améliore la stabilité de la protéine et agit comme agent plastifiant lorsqu'il est présent dans un polymère protéique (Lee et Timasheff, 1981). Cet agent plastifiant est introduit à la structure du polymère et peut s'y associer afin de réduire la cohésion dans la structure pour l'étendre, la relâcher et l'adoucir, changeant ainsi les propriétés physico-chimiques du polymère (Banker, 1966). Le polyalcool va favoriser l'état natif ou replié de la protéine globulaire plutôt qu'un état dénaturé. Ces molécules génèrent des forces cohésives responsables de l'accroissement des forces de tension sur l'interface d'hydratation de la protéine (Arakawa et Timasheff, 1982; Gekko et 2 5 Morikawa, 1981).
Certains polyalcools peuvent agir comme des absorbeurs de radicaux .OH
donc inhiber le processus de polymérisation.
Davies et al. (1987a) ont démontré que les modifications de la séquence primaire en acides aminés de l'ASB sont inhibées à plus de 90% par l'ajout de 1 mM
30 de mannitol (polyalcool) durant l'exposition aux radicaux ~OH ou ~OH + ~2-(+~2) Un phénomène similaire est observé lors de l'irradiation de la caséine en présence de lactose (Umemoto et al., 1968). Accroître la concentration de mannitol de 10 à 100 mM
n'a qu'un faible effet sur le processus d'inhibition radicalaire (Davies et al., 1987a).

CA 022l7437 l997-09-30 Le mannitol est connu pour être un puissant antioxydant biologique. Il peut doncabsorber rapidement les radicaux ~OH. Par ce fait, il inhibe fortement la production de bityrosine et il protège efficacement contre la perte de tryptophane lors de l'exposition de protéine (ASB) aux radicaux ~OH (Davies et al., 1 987a).
Le glycérol étant considéré comme un polyalcool, une attention particulière devra être portée afin d'évaluer sa capacité antioxydante au moment de l'exposition aux radicaux ~OH.

Interaction protéine-polyalcool En général, la majeure partie des groupements hydrophobes se retrouvent isolés à l'intérieur de la protéine globulaire alors que les groupements hydrophiles sont localisés en surface. Par contre, une grande proportion de la surface protéique est considérée comme étant hydrophobe. Cette surface est occupée par des atomes ou des groupements fonctionnels impropres à la formation de ponts hydrogènes (Bull et Breese, 1968).
Certains résidus non-polaires situés en surface peuvent diffficilement migrer à
l'intérieur de la protéine dû à la compaction élevée de la structure tridimensionnelle de la protéine (Gekko et Morikawa, 1981). Par conséquent, I'eau et certains cosolvants tels que les composés polyhydriques (sucres, glycérol et autres polyalcools) doivent être exclus des régions non-polaires de la surface protéique. Cette exclusion dépend du caractère hydrophile du composé polyhydrique, c'est-à-dire que plus le composé
est hydrophile, plus il sera fortement exclus de la surface hydrophobe. Alors, I'hydratation préférentielle d'une protéine dans une solution aqueuse polyhydrique est le résultat d'un équilibre fragile entre trois forces: soit la répulsion et l'attraction entre la protéine et le composé polyhydrique et l'effet d'encombrement stérique (Gekko et Morikawa, 1981).

Mécanisme d'action du glycérol Le glycérol induit une stabilisation protéique en diminuant la tension de surface de l'eau entourant les protéines. L'interaction préférentielle d'une protéine dans une solution aqueuse de glycérol est due aux forces de répulsion entre le glycérol (composé à caractère hydrophile) et les régions non-polaires situées en surface de la protéine (Gekko et Morikawa, 1981).

Gekko et Timasheff (1981 ) ont démontré que le potentiel chimique (ou le coeffficient d'activité) d'une protéine augmente avec l'augmentation de la concentration en glycérol dans le milieu. Une augmentation du potentiel chimique d'un soluté
correspond à une diminution de sa solubilité dans ce milieu. Alors, la présence de 5 glycérol dans un milieu aqueux augmenterait l'hydrophobicité de la protéine. Ceci impliquerait des interactions thermodynamiques défavorables entre les protéines et le glycérol (Gekko et Timasheff, 1981). Ainsi les régions non-polaires de la protéine, situées en surface, vont interagir défavorablement avec le solvant eau-glycérol. Ces régions hydrophobes, en surface de la protéine, seront préférablement attirées vers 10 I'intérieur, soit vers les régions apolaires. Toutefois, les liaisons covalentes entre les acides-aminés de la protéine engendrent une forte compaction et un encombrement stérique, inhibant ainsi la migration vers l'intérieur de ces régions hydrophobes (Gekko et Timasheff, 1981). Alors, les molécules d'eau et de glycérol seront distribuées à
l'extérieur de la protéine conservant ainsi le potentiel chimique des composantes du solvant constant. Le phénomène d'interactions préférentielles des composantes d'un solvant s'exprime donc généralement par des variations du potentiel chimique (Gekko et Timasheff, 1981).
Le glycérol doit alors pénétrer à l'intérieur de l'enveloppe d'eau entourant la protéine de telle sorte qu'il occupe une partie intégrante de cette enveloppe solvatée.
2 o Ceci implique donc qu'il doit exister un équilibre fragile entre la répulsion des régions non-polaires, I'attraction des régions polaires situées en surface de la protéine et le phénomène d'attraction entre les molécules d'eau et de glycérol. Alors, les interactions entre le glycérol et la protéine sont essentiellement non-spéficiques . Ces effets sont valides seulement pour de grandes concentrations de glycérol soit de l'ordre de un à
2 5 quatre molaires(Gekko et Morikawa, 1981).

L'INFLUENCE DES TAMPONS
Les tampons engendrent des modifications importantes sur le taux de formation de bityrosine et de perte de tryptophane. Les tampons Tris et HEPES (acide

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonique) démontrent une protection 3 o significative contre la perte de tryptophane et la production de bityrosine alors que le tampon carbonate favorise la perte de tryptophane et augmente la production de bityrosine. Cette augmentation reflète davantage l'implication du carbonate lors des dosages plutôt qu'une réelle production de bityrosine (Davies et al., 1 987a). Le tampon CA 022l7437 l997-09-30 phosphate est celui qui présente le plus de similarité avec l'eau mais il faut considérer une contamination possible du fer dans tous les sels de phosphate. La présence de fer peut faussement démontrer une production de bityrosine lors des dosages (Davies et al., 1987a et Davies et Delsignore,1987).
Comme l'exposition aux radicaux ~OH d'une solution d'ASB sans tampon ne démontre pas de variation de pH (Davies et al., 1987a), la présence de tampon phosphate n'est pas justifiée eu égard aux risques d'être confronté au problème de contamination par le fer.

LA BIODEGRADABILITE
Tous les emballages de plastiques commerciaux ne sont pas biodégradables parce qu'ils ont des poids moléculaires trop élevés et leurs structures sont trop rigides pour être attaquées par les microorganismes. Le polyéthylène linéaire est le seul emballage de plastique possédant un potentiel pour la biodégradation lorsque sonpoids moléculaire est drastiquement réduit par la photodégradation (Klemchuk,1990).
La biodégradation est un processus par lequel bactéries, moisissures, levures et leurs enzymes consomment une substance comme source de nourriture de telle sorte que la forme originale de cette substance disparaît (Klemchuk, 1990). Sousconditions appropriées, un processus de biodégradation de deux à trois ans est une période raisonnable pour l'assimilation et la disparition complète du produit (Klemchuk, 1990).
Des essais faits avec des moisissures ont démontré que seuls les polyesters aliphatiques et les polyuréthanes aliphatiques sont biodégradables sous 85%
d'humidité relative à 28-30~C. Toutefois, ces polymères ne sont pas, jusqu'à
maintenant, commercialisés à grande échelle comme emballage (Klemchuk, 1990).
2 5 Des recherches sur la biodégradabilité des films de polyéthylène en présence d'amidon, avec des boues activées, ont été entreprises par l'équipe de Ndon (Ndon et a/., 1992). Leurs travaux ont permis de démontrer que la dégradation du carbone provenant de l'amidon présent dans le plastique est faible comparativement à la conversion du carbone provenant de l'amidon pur. Le taux de dégradation et l'étendue du retrait des molécules de carbone sont plus élevés sous des conditions aérobiques que sous des conditions anaérobiques. L'étude de la distribution des poids moléculaires des plastiques n'indique aucune dégradation du polyéthylène.

CA 022l7437 l997-09-30 Susceptibilité à la protéolyse Davies et al. (1987; 1987b) ont démontré que lorsque l'ASB était traitée avec des radicaux ~OH, celle-ci devenait plus susceptible à la protéolyse par les enzymes cellulaires. Selon les mêmes auteurs, le simple processus de dénaturation (dépliement ou augmentation de l'hydrophobicité) peut expliquer la forte augmentation de la susceptibilité à la protéolyse. Les réactions d'oxydation et de protéolyses semblent être reliées entre elles (Davies, 1987). En effet, il a été observé qu'Escherichia coli, des extraits cellulaires d'érythrocytes humains et de lapins et des réticulocytes de lapins reconnaissent tous et dégradent des protéines modifiées oxydativement. Toutefois, les mécanismes de reconnaissance et de dégradation des protéines modifiées par les enzymes cellulaires sont peu compris (Davies,1987).
La caséine est un excellent substrat protéique. Sa conformation ouverte lui procure un accès facile à l'attaque enzymatique et ce, avant même son exposition aux radicaux ~OH (Davies,1987).

Biodégradation par Pseudomonas Pseudomonas est reconnu comme étant un genre bactérien pouvant synthétiser une quantité d'enzymes très diverses. Étant psychrotrophique, il estresponsable de la putréfaction des aliments réfrigérés. ll peut toutefois décomposer certains produits chimiques comme les pesticides et résister à certains antiseptiques (composés d'ammonium quaternaire) et antibiotiques (Tortora et al., 1989). On leretrouve dans la majorité des sites naturels (eau-sol-air), des produits alimentaires (lait - produits laitiers - oeuf - viandes) et chez certains animaux (Palleroni, 1984).
Pseudomonas est un bâtonnet Gram-, chimioorganotrophe, aérobique et mobile avec un ou plusieurs flagelles polaires. ll peut croître entre 4 et 43~C mais ne tolère pas les 2 5 milieux acides (Palleroni, 1984). Certaines espèces de Pseudomonas sont chimiolithotrophes facultatifs.
La majorité des espèces des Pseudomonas dégradent la K-caséine avant que la population atteigne 104 UFC/ml. La ~-caséine est plus susceptible à la dégradation que l'a par la majorité des espèces. Ce phénomène est toutefois observé lorsque la 3 o population bactérienne est supérieure à 106-107 UFC/ml (Adams et al., 1976).L'utilisation de Pseudomonas pour la dégradation de composantes diverses est très intéressante vue sa résistance à différentes conditions de stress (par exemple:

température, source de carbone) et sa capacité de synthétiser une importante quantité
d'enzymes (Tortora et al., 1989).

SOMMAIRE DE L'INVENTION
Cette invention a pour objet un procédé de fabrication d'un film protéique

5 biodégradable comprenant des caséinates, celles-ci permettant la formation rapide, simple et peu coûteuse de films protéiques. Le glycérol agit comme agent plastifiant afin d'ajouter de la souplesse et faciliter la manipulation du film. Le procédé de polymérisation par irradiation améliore les propriétés mécaniques du film tout en assurant le processus de polymérisation par l'intermédiaire de radicaux hydroxyls.
10 L'irradiation d'un mélange caséinate-glycérol-eau permet l'obtention d'un film protéique avec de bonnes propriétés d'élasticité, de résistance et de déformation. Le glycérol améliore de façon inattendue la polymérisation des molécules sans nuire aux propriétés du film.
Le film lui-même est également un objet de la présente invention. Le film obtenu est stérile, viscoélastique, résistant à la rupture; il offre une barrière acceptable à l'eau, aux gaz et aux microorganismes. Il est biodégradable, non-toxique et même comestible.
Le procédé par lequel ce film est fabriqué est donc unique en ce qu'il est un bon compromis entre la préservation de la cohésion et de l'élasticité. La cohésion est en effet obtenue et ceci, non au détriment de la flexibilité, de la porosité et de la perméabilité aux gaz et à l'eau qui sont tous des paramètres connus pour être affectés par l'augmentation de la cohésion.

DESCRIPTION DE L'INVENTION
Une description explicite du matériel et des différentes techniques utilisées sera 2 5 présentée et illustrée par les figures qui suivent. Cette description n'a pas pour effet de réduire la portée de l'invention mais bien de l'exemplifier.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Schéma du montage utilisé pour la fabrication des films.
Figure 2: Courbe de relaxation et équation pour le calcul du coefficient de relaxation (Peleg, 1979).
Figure 3: Rapport F/E (rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film) en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380; et ce, pour des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5% P/P
Figure 4: Déformation à la rupture en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110,180 et 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5% P/P
Figure 5: Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5% P/P
Figure 6: Oxydation du tryptophane en fonction de la dose d'irradiation Figure 7: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110,180 et 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5% P/P
Figure 8: Rapport F/E (rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film) en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à
des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7.5% P/P
Figure 9: Déformation en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7.5% P/P
Figure 10: La viscoélasticité en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5%
P/P
Figure 11: Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P et 7,5% P/P
Figure 12: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P
et 7,5% P/P
Figure 13: Essai #1 de la croissance de Pseudomonas fragi en présence et en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié 20kGy CA 022l7437 l997-09-30 Figure 14: Essai #2 de la croissance de Pseudomonas fragi en présence et en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié 20kGy Figure 15: Essai #3 de la croissance de Pseudomonas fragi en présence et en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié 20kGy EXEMPLE 1: PRÉPARATION DES SOLUTIONS PROTÉIQUES
Dans ce projet de recherche, trois caséinates (voir compositions à la table 2) ont été initialement utilisées, soit deux caséinates de sodium (alanate-110 et 180) et 10 un caséinate de calcium (alanate-380, New Zealand Milk Products, Inc., Ca, USA). Le contenu en protéines est certifié supérieur à 91,0% et cette pureté a été vérifiée au laboratoire (LECO, FP-428, Ml, USA). Elle est de 94,099%, 94,526% et 93,575% pour les alanates 110, 180 et 380 respectivement. Ces résultats en contenu d'azote total seront retenus pour le calcul des concentrations en protéines (% P/P) au moment de la formulation des différentes compositions des solutions.

TABLE 2: Composition des trois caséinates (alanates) utilisées dans ce travail de recherche.
ÉLÉMENTS ALANATE 110 ALANATE 180 ALANATE 380 PROTÉINES 91.1 91.1 91.8 20(N x 6.38)%
MINÉRAUX (%) 3.6 3.5 3.8 HUMIDITÉ (%) 4.1 4.0 3.9 MATIERES 1.1 1.1 0.7 GRASSES(%) 25LACTOSE(%) 0.1 0.1 0.1 pH (5%A20~C) 6.6 6.6 7.0 Les valeurs des différentes composantes des trois caséinates proviennent des bulletins de produits fournis par la compagnie New Zealand Milk Products, Inc., Ca, USA.

CA 022l7437 l997-09-30 Avant la période d'irradiation, les caséinates sont solubilisées dans l'eau distillée préalablement filtrée par osmose inverse. La solubilisation est faite continuellement sous agitation magnétique et sans apport de chaleur. Deux concentrations sont utilisées soient 5,0% et 7,5% P/P de protéines. Une concentration inférieure à 5% génère des films d'épaisseurs inadéquates à la manipulation alors qu'une concentration supérieure à 7,5%, produit des films trop épais. Ces deux concentrations sont sélectionnées strictement pour être capables de valider les propriétés du film, elles ne sont autrement pas limitatives.
Selon la composition du milieu, une quantité de glycérol (pureté 2 95%; A & C, Montréal, Canada) peut être ajoutée à des concentrations de 1,0%,2,5% et 5,0% P/P.
Une concentration de glycérol supérieure à 5,0% P/P produit des films à l'état gel, donc diffficile à manipuler adéquatement.
Après solubilisation complète des protéines, un vide de 15 minutes, sous agitation magnétique, est appliqué; suivi immédiatement d'un barbottage au N2O
(LINDE, Union Carbide, Toronto, Canada) pendant une seconde période de 15 minutes sous agitation. Après l'étape de gazage, la solution est transférée dans des éprouvettes à bouchons vissables, sous flux de N2O. Les éprouvettes sont scellées à
la parafffine pour être ensuite irradiées.

EXEMPLE 2: IRRADIATION DES SOLUTIONS PROTÉIQUES
L'irradiation est effectuée dans un irradiateur au Co60 de type Gammacell 220 (NORDION INTERNATIONALE INC., localisé au Centre d'lrradiation du Canada (C.l.C.), Laval, Canada) à un débit de dose moyen de 2,18 kGy/h pour des doses d'irradiation de 4, 8,12,15, 20, 30 et 40 kGy.
Pour l'irradiation, les éprouvettes sont placées dans un bécher de verre qui, lui, est positionné au centre de la chambre d'irradiation. De cette façon, les éprouvettes se retrouvent dans la zone de 100% i 5% de la dose selon les courbes d'isodoses de l'irradiateur Gammacell 220.
Après chaque période d'irradiation, une attente de 20 à 30 minutes à la noirceurest allouée afin que les réactions radicalaires les plus longues soient complétées et éviter aussi une photodécomposition des biphénols (Lehrer et Fasman, 1967; Prutz, 1983).

EXEMPLE 3: FORMATION DU FILM
Avant et après chaque traitement d'irradiation, le pH (pH-mètre Corning, PS 15) et le degré Brix des solutions (réfractomètre Fisher, 13-946-70c, no 4754, Montréal, CANADA) sont vérifiés afin d'évaluer rapidement tout changement au cours 5 de l'irradiation.
La mesure du pH permet de s'assurer la constance du pH des solutions; et ce, avant et après chaque période d'irradiation. Le réfractomètre permet d'évaluer la quantité de solides solubles présents dans les solutions. Son emploi permet de voir toutes variations de la quantité de solides solubilisés avant et après irradiation.
Une homogénéisation des solutions par inversions successives est effectuée avant toutes les prises de résultats de façon à empêcher la formation d'un dépôtprotéique.
Après vérification du pH et du degré Brix, cinq millilitres (5ml) de la solutionprotéique est pipettée et déposée uniformément dans un support de polyméthacrylate (plexiglass). Une attention particulière est apportée afin d'éviter la formation de bulles d'air. Le support a un diamètre interne de 8,5cm donnant une surface de 56,7cm2 (voir Figure 1). Par la suite, le support est positionné le plus possible à niveau. Une période de séchage de 12 à 14 heures (soit toute la nuit) à la température de la pièce, est allouée afin d'obtenir le film. Cette méthode de formation de film est une adaptation de celle des équipes de recherche de Gontard (1992) et de Krochta (1991).
Après le temps de séchage, le film ainsi formé est retiré de son support et son épaisseur est déterminée à l'aide d'un appareil de mesure ~Digimatic Indicator"
(Mitutoyo, Japon).

EXEMPLE 4: PROPRIÉTÉS MÉCANIQUES
2 5 Tous les films ainsi produits sont coupés afin d'obtenir un échantillon de 4,0cm de diamètre. Par la suite, les échantillons sont humidifiés et équilibrés pendant 48 heures, à 25~C, dans un dessiccateur contenant une solution saturée de bromure de sodium (Gontard et al., 1992). Cette manipulation assure une atmosphère de 56%
d'humidité relative (Ganzer et Rebenfeld,1987) et ce taux d'humidité a été vérifié. Les échantillons humidifiés sont ensuite solidement immobilisés entre deux plaques de plexiglass exposant une surface de 3,2cm de diamètre pour la mesure des propriétés mécaniques.

CA 022l7437 l997-09-30 Pour tous les films expérimentés, deux propriétés mécaniques ont été
déterminées, soit la force de rupture et la déformation à la rupture. Pour certains films contenant du glycérol, une troisième propriété mécanique a été évaluée, soit la viscoélasticité. Ces trois propriétés sont mesurées à l'aide d'un texturomètre Voland (Stevens-LFRA Texture Analyser, modèle TA-1000, N.Y., USA) relié à une imprimante (Texture Technologies Corp., modèle L 6512, N.Y., USA). Un poinçon de deux millimètres (2mm) de diamètre est utilisé pour toutes les mesures. Quelques essais ont été faits avec un poinçon de 3mm de diamètre et les lectures dépass~ient la limite maximale de détection du texturomètre. Le calcul des résultats est toujours en fonction de la vitesse de descente du poinçon et de la vitesse de déroulement du papier de l'imprimante. Avant chaque utilisation, le texturomètre est calibré contre un standard de masse (100 à 10009) et la vitesse de l'imprimante est vérifiée en fonction du temps.
Pour les trois propriétés mécaniques, les tests ont été réalisés en triplicata. La moyenne obtenue, de même que sa déviation standard, ont été portées en graphique.

a) La force de rupture et la déformation à la rupture La force et la déformation à la rupture sont calculées simultanément pour tous les échantillons. La vitesse de descente du poinçon est 1,0 mm/s et celle de déroulement du papier de l'imprimante est de 50 cm/min. La poussée du poinçon est enregistrée en gramme et convertie en unité de force (N).

b) La viscoélasticité
La viscoélasticité d'un film est évaluée par la courbe de relaxation obtenue suite à l'application d'une force maintenue par le poinçon sur le film. La vitesse de descente du poinçon est de 1,0 mm/s et celle de déroulement du papier de l'imprimante est de 10 cm/min. Dans le cas présent, la déformation est de trois millimètres (3mm) et les forces mesurées aux temps 0 et 60 secondes sont retenues pour le calcul du coefficient de relaxation Y(1 min) (Peleg, 1979) selon l'équation définie à la figure 2.
Conformément à cette équation, le coefficient de relaxation Y(1 min) varie entre1 et 0. Un film à caractère élastique démontera un rapport Y(1 min) faible car les forces initiale et finale seraient alors, quasi identiques.
Durant la relaxation, I'énergie est dissipée créant ainsi des perturbations internes irréversibles. Une tension continuellement décroissante est requise pour maintenir l'échantillon dans son état déformé (Gontard et al., 1992).

CA 022l7437 l997-09-30 EXEMPLE 5: DOSAGES PAR FLUOROMETRIE
Une fraction de la solution protéique irradiée est conservée liquide afin de mesurer les taux de formation de bityrosine et de perte de tryptophane. Dans tous les cas, les dosages sont effectués l'intérieur des 24 heures suivant la période d'irradiation.
Avant d'effectuer les dosages, une dilution 1/100 est réalisée avec un tampon HEPES (A 8 C, Montréal, Canada) 20 mM, pH 7,0 (Davies et al., 1987a), afin d'éviter une saturation de l'appareil.
Les taux de formation de bityrosine et de perte de tryptophane sont suivis par 0 fluorescence (Davies et al., 1987a) à l'aide d'un spectrofluoroi"ètle (Spectrofluorometer 2070, Varian, CA, USA). Le spectrofluoromètre est muni d'unelampe au xénon (75W) et la capacité de la cellule est de 15,ul. Les détecteurs sont des photomutiplicateurs pour l'excitation et l'émission et le seuil de détectabilité est de 0,03 ppb de sulfate de quinine dans une solution de H2SO4 0,1 M (valeurs rapportées par Varian). Le spectrofluoromètre est relié à un HPLC (Liquid Chromatograph: VISTA
5500, Varian, CA, USA) qui lui, est raccordé à un système d'auto-injection (AutoSampler 9090, Varian, CA, USA). L'ensemble de ce système est en communication permanente avec un terminal informatique (COMPAQ/Deskpro 486/33M) qui permet l'acquisition et le traitement de données (Varian Star Workstation, Copyright 1989-1992, Varian Associates, Inc., CA,USA).
Lors des dosages, aucune colonne à séparation n'est utilisée mais seulement un débit fixe d'un millilitre par minute (1 ml/min). Le volume d'injection est de 90,ul et une torsade de 100,ul est utilisée pour recevoir l'injection. L'acquisition de données est d'une durée fixe de 90 secondes. L'évaluation des taux de formation de bityrosine ou de perte de tryptophane s'obtient par le calcul de l'aire sous la courbe en unité de surface arbitraire.
Comme les dosages sont purement qualitatifs, nous nous sommes concentrés principalement sur la stabilité et la capacité reproductive de l'appareil. Ainsi, plusieurs séries de dosages sur les trois caséinates utilisées et sur une solution de tryptophane (Sigma, Mississauga, CANADA) ont été faites aux longueurs d'onde d'excitation etd'émission du tryptophane. Pour trois concentrations différentes, les résultats ont démontré un coeffficient de variation inférieur à 4% entre les dosages et une variation égale ou inférieure à 8,5% entre les trois concentrations pour un même caséinate. La CA 022l7437 l997-09-30 variation entre les concentrations serait principalement justifiée par les manipulations predosages.
Des essais ont démontré qu'autant le tampon HEPES (20mM, pH 7,0), le glycérol (2,5%) ou un mélange des deux ne génèrent pas de signaux caractéristiques, véritablement supérieurs au bruit de fond, pour les différentes longueurs d'ondeutilisées et ce, pour des solutions irradiées et non-irradiées.
Pour toutes les différentes compositions des solutions, les taux de formation de bityrosine et de perte de tryptophane ont été mesurés en triplicata. La moyenne, de même que sa déviation standard, ont été portées en graphique.

a) Dosage de bityrosine Le taux de formation de bityrosine est mesurée aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 305nm et 415nm (i5nm) respectivement. Ces longueurs d'onde ont été déterminées à l'aide d'une solution de tyrosine (50ppm) irradiée (Sigma, Mississauga, CANADA). Le gain de l'appareil est ajusté à 1 et un facteur d'atténuation de 4 est appliqué. Comme nous n'avons pas trouvé de standards commerciaux de bityrosine, nos résultats ne pourront être interprétés que de façon qualitative.
b) Dosage de tryptophane Le taux de perte de tryptophane est suivi aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 255nm et 351 nm (~5nm) respectivement. Ces longueurs d'onde ont été
établies à l'aide d'une solution de tryptophane (50ppm) irradiée. Le gain de l'appareil est de 1 et un facteur d'atténuation de 32 est appliqué.
L'oxydation d'une solution de résidue de tryptophanes par les radicaux ~OH est directement reliée à la perte d'intensité du signal de fluorescence lors de son dosage (Davies ef al., 1987a).
Comme le dosage par fluorescence est beaucoup plus complexe avec des protéines qu'avec un seul acide aminé (Davies et al., 1987a), nous n'avons pas tenté
de convertir l'intensité de fluorescence en quantité de résidus tryptophane, mais seulement constater expérimentalement une perte éventuelle du signal.

CA 022l7437 l997-09-30 EXEMPLE 6: VÉRIFICATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ
La biodégradabilité a été vérifiée par Pseudomonas fragi car c'est une espèce bactérienne très utilisée en laboratoire mais aussi, parce que la souche Pseudomonas est reconnue comme étant une bactérie pouvant faire la synthèse d'une quantité très diverses d'enzymes (Tortora, G.J. et al., 1989). Les principales protéases synthétisées pour la biodégradation de la caséine sont des métalloprotéases et des serine protéases (Alichanidis et Andrews, 1977; Davies, 1987; Davies et al., 1987b).
Trois essais ont été effectués en triplicata:
1- échantillon de film + 0,85%-NaCI (témoin négatif) 2- P. fragi + 0,85%-NaCI (témoin) 3- échantillon de film + P. fragi + 0,85%-NaCI
Chaque milieu contient 99ml d'eau avec 0,85% PN de NaCI (Anachemia, Montréal, Canada) et selon le cas,1 ml d'inoculum ou un échantillon de film ou encore, les deux sont ajoutés. Les milieux sont incubés à 25 i 2~C et sont continuellement SOUS agitation (140 i 5rpm).
Un seul type de film a été choisi dans cette section. ll est composé de 5,0% P/Pde caséinate de calcium avec 2,5% P/P de glycérol et irradié à 20kGy. Les échantillons sont préparés selon les méthodes décrites dans les exemples 1 à 3. Une dose d'irradiation de 20kGy est considérée comme une dose de stérilisation.
Naturellement, une précaution particulière au maintien de la stérilité est appliquée.
L'inoculation des milieux se fait à partir d'une culture-mère dont le temps d'incubation est de 16 à 18 heures. Préalablement, la culture-mère a été inoculée à
deux reprises dans un bouillon nutritif (Nutrient Broth, Difco Laboratories, Detroit, USA) afin d'adapter la souche et la recueillir en phase de croissance exponentielle.
Un millilitre (1 ml) de la culture-mère ainsi obtenue est prélevée et diluée jusqu'à un facteur de 1/104 avec une solution saline (0,85%-NaCI). Trois centrifugations successives sont faites à 3000rpm pour 10 minutes, à 4~C. Après chaque centrifugation, neuf des dix millilitres sont retirés et remplacés par de l'eau physiologique, puis homogénéisés au vortex. L'inoculation des milieux se fait après la troisième centrifugation et dissolution. De par ces manipulations et dilutions, les dénombrements initiaux des milieux sont approximativement de 100 UFC/ml.
Le dénombrement bactérien se fait en duplicata sur milieu ~Trypsic Soya Agar"
(TSA, Ditco Laboratories, Detroit, USA). La méthode de dénombrement suivie est celle conseillée par la Direction Générale de la Protection de la Santé (DGPS; Santé et CA 022l7437 l997-09-30 bien-être social Canada, 1979). L'inoculum est déposé en surface des gélose par étalement. L'incubation se fait à 23~C i2 ~C et les décomptes bactériens sont vérifiés à 24 et 48 heures après la mise en plaque. Les décomptes se situant entre 30 et 300 ont été retenus.

EXEMPLE 7: ANALYSES STATISTIQUES
Les résultats obtenus sont analysés stalistiquement par l'analyse de variance et test de comparaison multiple de DUNCAN avec un P ~ 0,05. Alors que l'analyse stdlislique de STUDENT est utilisée seulement lors de l'analyse de variance et test de comparaison par paire avec un P< 0,05 (Snedecor et Cochran, 1978).

1 o RÉSULTATS
Cette section sera divisée en trois grandes parties. Dans la première partie, les résultats d'une série d'expériences seront présentés sur l'évaluation du comportement des trois caséinates utilisées en fonction de la dose d'irradiation. Après discussion de l'ensemble de ces résultats, une sélection d'une des trois caséinates sera faite pour la suite de l'expérimentation. Dans la deuxième partie, une seconde série d'expériences sera traitée sur le comportement du caséinate choisi en présence de glycérol et en fonction de la dose d'irradiation donnée. Finalement, dans la troisième partie, les mesures de la biodégradabilité seront présentées.

OBSERVATIONS ET ASPECT VISUEL DES FILMS
Avant d'élaborer sur les résultats, il serait souhaitable de situer le lecteur sur l'aspect physique et visuel des films. A première vue, les fiims non irradiés sont transparents et incolores de même que les films de caséinates, sans glycérol, irradiés de 4 à 12 kGy. Par contre, en absence d'un agent plastifiant, la friabilité de ces films est tellement grande que leur manipulation est impossible sans les abîmer. Ces observations s'appliquent pour les deux concentrations de protéines utilisées (5,0%
P/P et 7,5% P/P).
L'irradiation cause un jaunissement des films formés en présence de glycérol et ce taux de jaunissement semble être proportionnel à la dose d'irradiation reçue. La présence de glycérol tend à créer une certaine opacité et elle semble être 3 o proportionnelle au contenu en glycérol. Alors que pour une même concentration de glycérol, le contenu en protéines affecte l'aspect du film pour une même dose d'irradiation. A 2,5% P/P ou 5,0% P/P de glycérol, les films produits avec 7,5% P/P de protéines sont plus transparents que ceux produits avec 5,0% P/P. Donc le ratio glycérol/protéine semble être un facteur influant sur l'opacité des films.
Selon le contenu en protéines et en glycérol, l'épaisseur varie de 27 à 64 ,um 5 avec une variation égale ou inférieure à 8% (voir table 3). Un film d'enrobage doit être le plus mince possible et de préférence son épaisseur doit être égale ou inférieure à 50 ,um. Un film comestible avec une épaisseur trop élevée risquerait de nuire aux propriétés esthétiques du produit emballé ou de ses composantes.
Naturellement, le contenu en glycérol modifie la texture du film et avec une 10 concentration de 5,0% P/P, sa manipulation exige plus de délicatesse. Quelque soit la composition ou la dose d'irradiation donnée, aucun film, une fois formé, n'a dégagé
d'odeur perceptible.

TABLE 3: Variation de l'épaisseur des films selon leur composition en protéines avec ou sans glycérol sur l'ensemble des doses d'irradiation.

15 % P/PALANATE/ ÉPAISSEUR DOSE
% PP GLYCÉROL (,um) (kGy) 5,0%-110/0% 27 i 2 0 à 12 5,0%-180/0% 27 i 2 0 à 12 5,0%-380/0% 28 i 2 0 à 12 7,5%-110/0% 44i2 Oà 12 7,5%-180/0% 42 i 2 0 à 12 7,5%-380/0% 41 i 2 0 à 12 5,0%-380/1,0% 32 i 2 0 à 12 5,0%-380/2,5% 38 i 3 0 à 40 2 55,0%-380/5,0% 44 i 2 0 à 40 7,5%-380/2,5% 62 i 5 0 à 20 7,5%-380/5,0% 64 i 5 0 à 40 L'expression 5,0%-110/0% signifie 5,0% P/P de la protéine 110 avec 0% P/P
de glycérol.

CA 022l7437 l997-09-30 COMPARAISON DES TROIS PROTÉINES
Dans cette première partie, une comparaison de deux propriétés mécaniques et des caractéristiques de fluorescence ont été observées dans le but de sélectionner un des trois caséinates pour la poursuite des expériences.
En premier lieu, la force à la rupture en fonction de la dose d'irradiation seradiscutée; suivi de la déformation à la rupture en fonction de la dose et finalement, les dosages par fluorescence selon la dose reçue, seront présentés. Pour ces trois points de comparaisons, deux concentrations de protéines ont été étudiées en absence d'agent plastifiant.

a) La force à la rupture Comme il existe une relation directe entre la force de rupture et l'épaisseur dufilm, nous avons décidé de calculer le rapport de l'un sur l'autre. Ceci a été fait afin d'éviter d'éventuelles variations de force dues simplement à des variations de l'épaisseur. Ce rapport est représenté par le symbole F/E et exprime en N/~m.
A une concentration de 5,0% P/P, le rapport F/E varie de 14.7 à 17.4 pour les trois caséinates et pour l'ensemble des doses d'irradiation. ll n'y a pas de différence significative (P > 0,05) pour le rapport F/E, en fonction de la dose d'irradiation, entre les trois caséinates à cette concentration. Une seule exception pour la dose de 12kGy où il existe un écart significatif (P > 0,05) entre les caséinates de sodium (alanate 180) et de calcium (alanate 380) (voir table 4 et figure 3). Par contre, sans être clairement démarquée, le caséinate de calcium (alanate 380) démontre un rapport F/E supérieur aux deux caséinates de sodium pour les doses d'irradiation de 4, 8 et 12kGy (voir table 4).
Pour la concentration de 7,5%, le rapport F/E varie de 14.2 à 17.4 pour les trois caséinates et pour l'ensemble des doses d'irradiation. A cette concentration, lecaséinate de calcium (alanate 380) a un rapport F/E significativement supérieur (P ~
0,05) aux deux autres caséinates de sodium (alanates 110 et 180) lors de l'irradiation entre 4 et 12kGy (voir table 5 et figure 3). A 0 kGy, il n' y a pas de différence significative (P > 0,05) entre les caséinates de sodium (alanate 110) et de calcium (alanate 380). Alors, les films formés à partir de caséinate de calcium (alanate 380) exigent une force plus grande pour se rupturer comparativement à ceux produits àpartir des deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180) (voir table 5).

CA 022l7437 l997-09-30 Pour les trois caséinates, il n'y a pas de différence significative (P > 0,05) pour le rapport F/E entre les deux concentrations de protéines utilisées (5,0% et 7,5%) et ce, en fonction des doses d'irradiation (0 à 12kGy). Seules exceptions pour le caséinate de sodium (alanate 110) à 12kGy et le caséinate de calcium (alanate 380) à 8kGy ou la différence est considérée significative (P ~ 0,05).
Donc, l'irradiation du caséinate de calcium (alanate 380) à une concentration de 7,5% de protéines, crée un film plus résistant à la rupture que les deux autres protéines. Alors qu'à une concentration de 5,0%, il n'y a pas de différence significative (P > 0,05) entre les trois caséinates.

10 TABLE 4: Rapport F/E en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110,180 et 380 à une concentration de 5,0% P/P de protéines.

DOSE (kGy) F/Ex100 (N/IJm) F/Ex100 (N/,um) F/Ex100 (N/,um) o 16.9 i 0 4' a 16.2 i o.43a 16.8 i o.9Sa 4 14.6 i 0.12b 15.0 i o.34b 16.3 i 1.55b 8 16.0 i 1.6~ 2C 15.3 i o.74c 17.4 i 0.5sc 12 16.0 i 0.8' 2de 14.7 i0.24d 17.2 i 1.05e Le terme F/E exprime le rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

Table 5: Rapport F/E en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 7,5% P/P de protéines.

DOSE (kGy) F/Ex100 (N/,um) F/Ex100 (N/,um) F/Ex100 (N/,um) 250 15.6 i 0.9' ab 14.5 i 1.83a 17.4 i o.44b 4 14.9i0.4~2C 14.5i0,23C 16.4i0.05d CA 022l7437 l997-09-30 8 14.3 i o.o2e 14.2 i o.23e 16.3 i 0.25f 12 14.2 i o.329 14.3 i 0.53g 16.7 i 0.25h Le terme F/E exprime le rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

b) La déformation à la rupture A une concentration de 5,0 % P/P, la déformation est d'environ 2,3mm 0,1mm pour les trois caséinates et pourtoutes les doses d' irradiation . Il n'y a pas de variations considérées significatives (P > 0,05) pour les trois caséinates en fonction des doses d'irradiation à l'exception du caséinate de calcium entre les doses de 4 et 12kGy (voir table 6). A 7,5 % P/P de protéines, la déformation est d'environ 2,6mm 0,2mm pour l'ensemble des trois caséinates et des doses d'irradiation. Pour une même dose d'irradiation, il n'y a pas de différence significative (P > 0,05) entre les trois caséinates. Par contre, pour les caséinates de sodium (alanate 110) et de calcium (alanate 380), il existe un écart significatif (P > 0,05) entre les doses de 0 et 12kGy (voir table 7).
Pour les deux concentrations utilisées, il n'existe pas de différence significative (P > 0,05) entre les trois caséinates pour la capacité déformante en fonction des doses d'irradiation (voir figure 4). La déformation est supérieure de quelques dixièmes de millimètres pour une concentration de 7,5 % comparativement à 5,0% mais cet écart n'est pas considéré significatif (P > 0,05) (voir tables 6 et 7).

TABLE 6: Déformation à la rupture en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 5.0% P/P de protéines.

DOSE DÉFORMATION DÉFORMATION DÉFORMATION
(kGy) (mm) (mm) (mm) 0 2.4 i 0.2' a 2.3 i 0.22a 2.3 i 0.134a CA 022l7437 l997-09-30 4 2.3 i 0.1 2.3 i 0.1 2.2 i 0.1 8 2.3i0.11C 2.3i0.12C 2.3io.2 12 2.4 i 0.3 2.3 i 0.2 2.4 i 0.1 Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE 7: Déformation à la rupture en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 7,5% P/P de protéines.

DOSE DÉFORMATION DÉFORMATION DÉFORMATION
(kGy) (mm) (mm) (mm) 0 3.0 i o.51 a 2.6 i 0.2 2.7 i 0.14a 4 2.6 i 0.2 2.5 i 0.1 2.5 i o 145,b 8 2.7i0.1 1,2,C 2.7i0.1 3,C 2.6i0.245C
12 2.4 i 0.1 2.6 i 0.2 2.3 i 0.2 Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

La viscoélasticité n'a pas été évaluée pour ces films car la déformation appliquée pour mesurer ce paramètre est de trois millimètres (3mm) et selon la figure 4, la déformation à la rupture est inférieure à cette valeur.

c) Taux de formation de bityrosine Le taux réel de formation de bityrosine produit par l'irradiation est mesuré en soustrayant la valeur moyenne obtenue à 0 kGy de celles obtenues aux différentesdoses d'irradiation. En effet, un signal de fluorescence est perçue à 0 kGy. La présence initiale de bityrosine ou la contribution de d'autres composantes avoisinantes peuvent provoquer ce signal de fluorescence. Cette contribution est la conséquence de dosages protéiques avec ces multiples groupements fonctionnels à proximité les uns des autres.
On observe une augmentation de formation de bityrosine avec une augmentation de la dose d'irradiation pour les trois caséinates et ce, pour les deux concentrations utilisées.
A une concentration de 5,0 %, le taux de formation de bityrosine est significativement supérieur (P < 0,05) pour le caséinate de calcium (alanate 380) comparativement aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180) pour les doses de 4, 8 et 12kGy (voir table 8). De plus, à 12kGy, le second caséinate de sodium(alanate 180) a produit significativement plus (P ~ 0.05) de bityrosine que le premier (alanate 110).
Pour la concentration de 7,5 %, le caséinate de sodium (alanate 110) a produit significativement plus (P ~ 0,05) de bityrosine que les caséinates de sodium (alanate 2 o 180) et de calcium (alanate 380) et ce, aux doses de 4 et 1 2kGy (voir table 8 et figure 5), alors qu'à 8kGy, aucune différence jugée significative (P > 0,05) n'a été perçue entre les trois caséinates (voir table 9).
Il existe une différence significative (P < 0,05) entre les deux concentrations de protéines mais cette différence n'est pas démontrée pour toutes les doses d'irradiation.
2 5 En effet, le premier caséinate de sodium (alanate 110) a produit significativement (P
~ 0,05) plus de bityrosine à la concentration de 7,5 % pour la dose de 12kGy qu'à la concentration de 5,0 %. Le second caséinate de sodium (alanate 180) a produit significativement (P < 0,05) plus de bityrosine à la concentration de 5,0 % pour les doses de 4 et 8kGy qu'à la concentration de 7,5 %. Finalement, le caséinate de calcium (alanate 380) a produit significativement (P < 0,05) plus de bityrosine à la concentration de 5,0 % pour les doses de 4, 8 et 1 2kGy comparativement à la concentration de 7,5 % (voir tables 8 et 9).

~34~

TABLE8 Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 5,0% P/P de protéines.

DOSE (kGy) ALANATE-110 ALANATE-180 ALANATE-380 4 19354i1142~a 20730i7624a 28552i16217b 8 41071i4532~C 39651i20955C 66803i23918~d 12 62999i6593~e 66271i12875f 82504i165099 Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE9 Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 7,5% P/P de protéines.

DOSE (kGy) ALANATE-110 ALANATE-180 ALANATE-380 4 24429i1307~a 17067i5474~b 17192i7077~b 8 38741i5992~C 35287i18935C 39344i6873C
12 69305i7953d 64735i76g6~e 61076i6079' Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

CA 022l7437 l997-09-30 d) Dosage de tryptophane L'oxydation d'une solution de résidu de tryptophane par les radicaux ~OH est directement relié à la perte d'intensité du signal de fluorescence. La hgure 6 démontre l'influence de l'irradiation sur une solution de 500 PPM de tryptophane.
ll n'y a pas de perte régulière et continue du signal en fonction de la dose d'irradiation lors des dosages des caséinates. Même si parfois une différence significative (P ~ 0,05) est perçue entre les doses d'irradiation pour les troiscaséinates, dans aucun cas, il n'y a une baisse continue du signal. Cet état est perçu pour deux concentrations (voir tables 10 et 11 et figure 6).

TABLE 10: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 5,0% P/P de protéines.

DOSE (kGy) ALANATE-110 ALANATE-180 ALANATE-380 0 775511 i 30471 a 733889 i 32225 b 764770 i 26933 C
4 742878 i 35702d 712041 i 98166e 793769 i 16779f 8 710587 i 212239 741933 i 26155h 749959 i 8149'~h 12 712735 i 76793 i 695793 i 8417J 778002 i10064" k Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE 11: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue pour les alanates 110, 180 et 380 à une concentration de 7,5% P/P de protéines.

DOSE (kGy) ALANATE-110 ALANATE-180 ALANATE-380 0 1056499 i 5231 ' a 1022490 i 87655 b 1128405 i 220518 C
4 1021131 i 81832 d 1074262 i 50765 e 1101364 i 33659 f 8 1042411 i 851839 1040796 i 147925791100961 i 47139 h CA 022l7437 l997-09-30 12 ¦ 988217 i 75634i ¦ 1054722 i 1372867J ¦ 1108578 i 1405889 k Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

e) Sélection de la protéine Le comportement physico-chimique des solutions de protéines au cours du traitement à l'irradiation nous a permis de sélectionner l'extrait protéique le plus adéquat pour la fabrication d'un film. Pour ce faire, nous avons étudié: 1- les paramètres rhéologiques soit: la résistance jusqu'à la rupture et la déformation à la rupture 2- les paramètres chimiques soit: les taux de formation de bityrosine et de perte de tryptophane.
Les résultats obtenus pour le rapport F/E de le caséinate de calcium (alanate 380), à une concentration de 5,0%, sont légèrement supérieurs aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180) pour les doses de 4, 8 et 12kGy. Par contre, à une concentration de 7,5%, le rapport F/E du caséinate de calcium (alanate 380) est significativement supérieur (P ~ 0,05) aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180) à 4, 8 et 12kGy (voir tables 4 et 5 et figure 3).
Les résultats des mesures de la formation de bityrosine ont montrés qu'à une concentration de 5,0%, le caséinate de calcium (alanate 380) a démontré une production de bityrosine significativement supérieure (P ~ 0,05) aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180); et ce, à 4, 8 et 12 kGy. A la concentration de 7,5%, le premier caséinate de sodium (alanate 110) a produit significativement plus (P ~
0,05) de bityrosine aux doses de 4 et 12 kGy, alors qu'à 8kGy, les trois caséinates ont produit une quantité équivalente de bityrosine (voir tables 8 et 9 et figure 5).Au cours de l'irradiation des solutions protéiques, l'observation des solutions nous a permis de constater que la viscosité des caséinates de sodium (alanates 110 et 180) augmente avec la dose d'irradiation. Cet état est perceptible au moment des manipulations lorsque les solutions sont traitées à 8 et 12kGy. A l'opposé, la viscosité
du caséinate de calcium (alanate 380) est quasi inchangée en fonction des doses d'irradiation .

Selon les tables 6 et 7 et la figure 4, les films protéiques formés sans agent plastifiant possèdent une faible capacité de déformation. Alors, la présence d'un agent plastifiant devient ainsi indispensable pour l'obtention d'un film avec un pouvoir déformant plus adéquat.
Alors, en accord avec les résultats précédents, nous avons choisi le caséinate de calcium (alanate 380) pour poursuivre les essais avec un agent plastifiant, soit le glycérol.

L'EFFET DU GLYCÉROL SUR LE CASÉINATE DE CALCIUM
Dans cette deuxième partie, l'influence du glycérol comme agent plastifiant a été étudiée. Pour se faire, les trois propriétés mécaniques et les dosages de fluorescence ont été évalués pour fin de comparaison.
Sous certaines conditions de traitements, il est parfois diffficile et voir mêmeimpossible d'obtenir des films, entre autres, les films formés avec 5,0% de protéines et 5,0% de glycérol sans traitement radiatif.

a) La force à la rupture La figure 7 et les tables 12 et 13 montrent que pour les concentrations de 5,0%
et de 7,5%, le rapport F/E diminue avec l'augmentation du contenu en glycérol. Alors, une force moindre est nécessaire pour rupturer le film lorsque le contenu en glycérol augmente.
A une concentration de 5,0% de protéines avec 0% de glycérol, le rapport F/E
demeure élevé et stable (16.3 à 17.4) en fonction de la dose d'irradiation. A 1,0% de glycérol, le rapport varie entre 11.8 et 13.9 pour les doses de 0 à 12kGy et ces deux valeurs extrêmes sont considérées significativement différentes (P ~ 0,05) entre elles.
Par contre, le rapport F/E augmente significativement (P ~ 0,05) à 15 et 20kGy pour se situer 16.3 et 17.2 respectivement. A une concentration de 2,5% de glycérol, le rapport F/E croît significativement (P < 0,05) avec l'augmentation de la dose d'irradiation. ll passe de 5.6 à 12.1 et un maximum est atteint à la dose de 30kGy.
Pour la concentration de 5,0% de glycérol, le rapport F/E augmente aussi significativement (P ~ 0,05) en fonction de la dose d'irradiation. ll croît de 2.7 à 4.5 et atteint également son maximum à 30kGy. (voir table 12 et figure 7). Dans ces conditions, l'irradiation contribue à créer un film plus résistant.

Pour une concentration de 7,5% de protéines avec 0% ou 2,5% de glycérol, il y a peu de variation du rapport F/E pour les doses variant entre 0 à 1 2kGy. En effet, le rapport varie de 16.3 à 17.4 et de 10.4 à 11.2 pour 0% et 2,5% de glycérol respectivement. Par contre, à 2,5% de glycérol, le rapport F/E subi une hausse mais non significative (P > 0,05) pour les doses de 15 et 20kGy. A 5,0% de glycérol, le rapport F/E augmente significativement (P 5 0,05) avec l'augmentation de la dosed'irradiation. Il passe de 4.3 à 6.3 avec un maximum à 30kGy (voir table 13 et figure 5).
A une concentration de 5,0% de protéines, le rapport F/E diminue significativement (P 5 0,05 ) avec l'ajout de glycérol quelque soit sa concentration (1,0%, 2,5% et 5,0%) et ce, pour toutes les doses d'irradiation expérimentées. En présence de 7,5% de protéines, le même phénomène est observé pour les doses entre 0 et 20kGy.
A 5,0% de glycérol, on observe une hausse significative (P 5 0,05) de F/E avec I'augmentation du contenu en protéines et ce, pour toutes les doses d'irradiation. A
2,5% de glycérol, on observe le même phénomène sauf pour les échantillons traités à 15kGy.

TABLE 12 Rapport F/E en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu englycérol pour l'alanate 380 à une concentration de protéines de 5,0% P/P.

20DOSE (kGy) F/E x 100 F/E x 100 F/E x 100 F/E x 100 (N X ,um) (N X l~m) (N X ,um) (N X l~m) 5,0%/0% 5,0%/1,0% 5,0%/2,5% 5,0%/5,0%
0 16 8 i 0 91a 12 5 i 0 32,3,b 5.6 i 0.2 4 16.3 i 1.51d 13,9 i 1.33e 5,9 i 0,15f2,7 i 0,21~~
8 17.4 i o.51h 12.6 i 1.12,3,j 6.9 i 0.16i3.3 i 0,111,12,k 12 17.2 i 1 o1 1 11.8 iO.12m 7.0 i o.26n3 8 i 0 41113O
16,3 i 0.14P 10,5 i 0,47q3.6 i 0 311.12,13,r ~ 17.2 i 0,64S 10.1 i o.48,t4.0 i 0 313,u - - 12.1 i 0.19V4.5 i 0.314,w - - 10.7 i o,37,x3.2 i o.3~2Y

CA 022l7437 l997-09-30 Le terme F/E exprime le rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film. L'expression 5,0%/1,0% signifie 5,0% de protéines avec 1,0% de glycérol.
Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE 1 3: Rapport F/E en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration de protéines de 7,5% P/P.

DOSE (kGy) F/E x 1 00 F/E x 1 00 F/E x 1 00 (N X l~m) (N X ,um) (N X ~um) 7,5%/0% 7,5%12,5% 7,5%/5,0%
0 17.4i041a 11.0i1 o3b 4.3i024C
4 16.4i0.02d 11.2i053e 4.4i0.24' 8 16.3i0.22g 10.4i1.53h 4.6i0.14 12 16.7i0.22J 10.5i0.93k 5.8i0.251 12.5 i 1 43m 5.2 i 0.25n - 12.1 i0.13~ 5.7i0.155P
- - 6.3 i 0.17 - - 5.9 i 0.25 Le terme F/E exprime le rapport de la force de la rupture versus l'épaisseur du film. L'expression 7,5%/2,5% signifie 7,5% de protéines avec 2,5% de glycérol.
Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

b) La déformation à la rupture Selon la figure 8 et les tables 14 et 15, la présence de glycérol augmente fortement le pouvoir déformant des films.
A 5,0% de protéines, la dose d'irradiation et l'ajout de 1,0% de glycérol 5 n'apportent pas de changements importants au pouvoir déformant des films comparativement en absence de glycérol. La déformation varie de 2.2mm à 2.4mm etde 2.6mm à 2.9mm pour 0% et 1,0% de glycérol respectivement. Alors qu'à 2,5% et 5,0% de glycérol, la capacité déformante croit significativement (P ~ 0,05) avecl'augmentation de la dose d'irradiation. La déformation varie de 5.7mm à 7.4mm pour 2,5% de glycérol et de 7.6mm à 10.8mm pour 5,0% de glycérol. Un maximum est atteint entre 20 et 30kGy pour ces deux concentrations de glycérol (voir table 14 et figure 9). Donc, I'irradiation contribue à améliorer le pouvoir déformant des films. La différence entre la déformation et les trois concentrations de glycérol est considérée significative (P < 0,05) à toutes les doses d'irradiation.
Pour une concentration de 7,5% de protéines, la présence de 2,5% de glycérol n'apporte pas de différence significative (P > 0,05) dans la déformation en fonction des doses d'irradiation (0 à 20kGy). La déformation varie de 3.8mm à 4.2mm entre lesdoses de 0 et 20kGy. Par contre, la différence de déformation entre 0% et 2,5% de glycérol est considérée significative (P ~ 0,05) pour les doses de 0 à 12kGy. Avec I'ajout de 5,0% de glycérol, la déformation est significativement plus élevée (P < 0,05) qu'en présence de 2,5% ou en absence de glycérol. Les valeurs de déformation varient de 7.7mm à 11.6mm en fonction des doses d'irradiation avec une valeur maximale vers 15 à 20kGy (voir table 15 et figure 9).
A 2,5% de glycérol, la déformation à 5.0 % de protéines est significativement 2 5 supérieure (P ~ 0,05) qu'à 7,5 % de protéines pour les doses de 0 à 20kGy (voir tables 14 et 15).
Pour une concentration de 5,0 % de glycérol, il y a une différence significative(P ~ 0,05) de la déformation entre les deux concentrations de protéines. La déformation est supérieure à 7,5 % de protéines comparativement à 5,0 % pour les3 o doses de 4, 8, 15, 20 et 40kGy . Elle est significativement supérieure (P ~ 0,05) aux doses de 8, 15 et 40kGy. A 12 et 30kGy, la déformation à 7,5% de protéines est inférieure à celle obtenue à 5,0% (voir tables 14 et 15). Cependant, cette différence est significativement inférieure (P < 0,05) seulement à 1 2kGy.

Donc, la déformation en fonction de la dose est plus élevée en présence de 5,0% de glycérol et ce, pour les deux concentrations de protéines. L'effet de la dose d'irradiation sur la déformation est plus marquée en présence de 7,5 % de protéines et 5,0 % de glycérol. En présence de 2,5 % de glycérol et 5,0% de protéines, la 5 déformation subit une légère hausse en fonction de la dose mais celle-ci est considérée significative (P ~ 0,05).

TABLE 14: Déformation à la rupture en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéines de 5~0% P/P.

DOSE DÉFORMATION DÉFORMATION DÉFORMATION DÉFORMATION
(kGy) (mm) (mm) (mm) (mm) 5,0%/0% 5,0%/1,0% 5,0%12,5% 5,0%/5,0%
0 2.3iO.1'2a 2.6iO.13a 5.7iO.46b 42.2 i 0.11 C 2.9 i 0.14d 6.1 i 0.267e 8.5 i o.41~f 82.3 i 0.2129 2.8 i 0.13.45.h 6.6 i 0 178i 9.5 i 0.1~J
12 2.4i0.12k 2.6i0 135.k 7.0iO.389l 103iO31213m 2.9i0245n 6.2i0.267~ 9.6io61112P
~ 2.9i0.24q 7.3i039r 10.8i0713s - - 7.4i059.t 10.7i0213U
~ 5.9 i 0.26V 7.6 i o 314W

L'expression 5,0%/1,0% signifie 5,0% de protéines avec 1,0% de glycérol.
Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE 15: Déformation à la rupture en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéines de 7,5% P/P.

DOSE DÉFORMATION DÉFORMATION DÉFORMATION
(kGy) (mm) (mm) (mm) 7,5%/0% 7,5%12,5% 7,5%/5,0%
0 2.7i0.1'a 4.1 i0.43b 7.7i0.24C
4 2.5 i 0.11~2~d 3.8 i 0.33e 9.4 i o 55,6,f 8 2.6 i 0.21 29 4.0 i o.33h 11.0 i 0.17 12 2.3 i 0.22J 4.0 i o.33k 9.1 i 0.35' 3.9 i o.43m 11.6 i 0.67n - 4.2 i 0.23 ~ 1 1.2 i 0.67 P
- - 10.0i0.56 - - 8.3i0.34 L'expression 7,5%/2,5% signifie 7,5% de protéines avec 2,5% de glycérol.
Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

c) La viscoélasticité
Une particularité recherchée dans un film est son pouvoir élastique c'est-à-direun film possédant un faible coefficient de relaxation. Selon les résultats de relaxation, les films irradiés de caséinate de calcium (alanate 380) sont des produits viscoélastiques avec un coeffficient de relaxation variant entre 0,57 à 0,69 selon la composition des films (voir table 16 et figure 10).
Seul les films pouvant se déformer à plus de trois millimètres (3,0mm) peuvent 2 5 être étudiés car la viscoélasticité est mesurée suite à une déformation maintenue de 3,0mm. Dans le cas présent, trois compositions de milieux ont été retenues, soit 5,0%
de protéines avec 2,5 % et 5,0 % de glycérol et 7,5 % de protéines avec 5,0 % deglycérol.

CA 022l7437 l997-09-30 Pour une concentration de 5,0 % de protéines avec 2,5 % et 5,0 % de glycérol, I'irradiation a tendance à produire un film plus élastique car les coeffficients de relaxation diminuent significativement (P ~ 0,05) avec l'augmentation de la dosed'irradiation. Les valeurs de coefficients varient de 0,66 à 0,61 et de 0,63 à 0,57 pour des concentrations de 2,5% et 5,0% de glycérol respectivement. Un coeffficient de relaxation minimal est obtenu entre 30 et 40kGy pour ces deux concentrations de glycérol (voir table 16 et figure 10). La différence entre les deux concentrations de glycérol est significative (P ~ 0,05) à toutes les doses d'irradiation à l'exception des doses de 15 et 20kGy. Ainsi, I'addition de 5,0 % de glycérol produit un film plus 10 élastique avec un coeffficient de relaxation plus faible.
Avec une concentration de 7,5 % de protéines et 5,0% de glycérol, l'irradiation tend à abaisser significativement (P < 0,05) le coeffficient de relaxation sauf lorsqu'on irradie à 8kGy où une valeur maximale est atteinte. Les valeurs de coeffficients varient de 0.67 à 0.63 en fonction des doses d'irradiation. Alors, I'irradiation contribue à
produire un film plus élastique avec une valeur minimale suite à un traitement se situant entre 20 et 40kGy (voir table 16 et figure 10).
A 5,0 % de glycérol, les coeffficients de relaxation à 5,0% de protéines sont significativement inférieurs (P ~ 0,05) à ceux obtenus à 7,5 % de protéines et ce, pour toutes les doses d'irradiation.

TABLE 16: Coeffficients de relaxation en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à des concentrations en protéines de 5,0% P/P
et 7,5% P/P
DOSE (kGy) 5,0%/2,5% 5,0%/5,0% 7,5%/5,0%
0 0.66 i 0.01~2 - 0.67 i 0.01 '~
4 0.67 i 0.00' a 0.63 i o.oO7b 0.66 i 0.01 11,12,c 8 0.66iO.0123d 0.61 io.o17.8.e 0.69iO.01'3f 12 0.65 i 0.01349 0.62 i 0.0178h 0.66 i 0.01 '~ " i 0.64 i 0.0045J 0.63 i 0.017J 0.65 i 0.01 '2 '4 k 0.63 i 0.015 l 0.60 i 0.023 l 0.64 i 0.0115 m 0.61 i 0.016 n 0.57 i 0.019 ~ 0.64 i 0.01 '4 '5 P
0.61 i 0.016q 0.57 i 0.029r 0.63 i 0.00-55 L'expression 5,0%/2,5% signifie 5,0% de protéines avec 2,5% de glycérol.
Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). L'évaluation slalislique à 5,0% de glycérol est faite seulement pour une concentration de 5,0% et 7,5% de protéines.

d) Taux de formation de bityrosine La valeur moyenne obtenue à 0 kGy a été soustraite de celles obtenues aux différentes doses d'irradiation dans le but d'obtenir le taux réel de formation de o bityrosine.
Le taux de formation de bityrosine croit proportionnellement avec l'augmentation de la dose d' irradiation pour les deux concentrations de protéines (voir tables 17 et 18 et figure 11). Le taux de formation de bityrosine augmente de 23 000 à 350000 (en unité de surface arbitraire) pour des doses variant de 4 à 40 kGy et ce, pour les deux concentrations de protéines.
Pour une concentration de 5,0% de protéines, le taux de formation de bityrosine est significativement supérieur (P ~ 0,05) en présence de glycérol (1,0%, 2,5% et 5,0%) comparativement à son absence (0%) pour les doses de 15 et 20kGy (voir table 17). A 7,5% de protéines, la présence de glycérol (2,5% et 5,0%) augmente significativement (P ~ 0,05) le taux de formation de bityrosine pour les doses de 4 à
20kGy (voir table 17 et figure 11). On note de plus, qu'en présence de 2,5% de glycérol, le taux de formation de bityrosine dans l'échantillon de 7,5% de protéines a doublé par rapport à l'échantillon contenant 5,0% de protéines (43513vs20503) etlorsque celui-ci est irradié à 4 kGy (voir tables 17 et 18). On note une augmentation d'environ 10% du contenu en bityrosine lorsque les échantillons protéiques (5,0% et 7,5%) sont irradiés à 20kGy en absence et en présence de 2,5% de glycérol. Par contre, il n'y a pas de relation entre le taux de formation de bityrosine et la concentration en protéines en présence de 5,0% de glycérol.
Comme le glycérol seul dans le tampon n'absorbe pas et n'émet pas aux 3 o longueurs d'ondes d'excitation et d'émission utilisées, il semble favoriser la formation de bityrosine. Il existe une relation linéaire entre le taux de formation de bityrosine et les doses d'irradiation pour les différents mélanges protéine-glycérol expérimentés.

- 45 ~

TABLE 17: Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéine de 5,0% P/P.
DOSE 5,0%/0% 5,0%/1,0% 5,0%/2,5% 5,0%/5,0%
5(kGy) 428552 i 1621~a 21836 i 14845bC 20503 i941~b 23126 i 1482~3C
866803 i 23912d 76436 i 10067e 66439 i 1805~2d 81304 i 2395~9f 1282504 i 165039 79531 i 19643h 75782 i 1206~3i 85465 i 13922~i 1589584 i 18174 k113309 i 22499 l 134112 i 1328~4 m 125394 i 15512~ n 129044 i 9315~ 146654 i 1511~~P 163519 i 1126~5q 158853 i 128922r - - 254378 i1440~55 256610 i 239823S
~ - 348299 i 402217 t 336676 i 225424 U

Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. L'expression 5,0%/2,5% signifie 5,0% de protéines avec 2,5% de glycérol. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

TABLE 18: Taux de formation de bityrosine en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéine de 7,5% P/P.
DOSE 7,5%/0% 7,5%12,5% 7,5%/5,0%
(kGy) 4 17192 i 16211 a 43513 i13285 b 20803 i 92811 C
8 39344 i 6872d 97240 i 43887e 57961 i 897'2f 12 61076 i 60739 103811 i 16535 h 92734 i 190113 95587 i 12524.i 128415 i12329 k 1 17110 i 1398~4 l 20 139249 i 16975 m 184986 i 158110 n 151133 i 1653~5 ~
- - 290277 i 184815 - - 362756 i 1564'7 ll n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. L'expression 7,5%/2,5% signifie 7,5% de protéines avec 2,5% de glycérol. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

e) Dosage de tryptophane En présence de glycérol, le taux de perte de tryptophane due au traitement à
l'irradiation est significatif (p < 0,05), c'est-à-dire qu'une baisse du signal de fluorescence est perçue avec l'augmentation de la dose d'irradiation (voir tables 19 et 20 et figure 12).

A 5,0% de concentration de protéines, la baisse du signal est significative (P
~0,05) en présence de glycérol (1,0%, 2,5% et 5,0%) comparativement à son absence pour les doses variant de 4 à 20kGy. Le signal varie d'environ 760 000 à 560 000entre 0 et 20kGy et diminue jusqu'à environ 470 000 pour la dose de 40kGy lorsque les dosages se font sur des milieux en présence de glycérol (1,0%, 2,5% et 5,0%).
Toutefois, il n'y a pas de perte régulière et continue du signal en fonction de la dose d'irradiation à 0% de glycérol. Le signal moyen obtenu entre 0 et 20kGy est de 778000 pour une concentration en protéines de 5,0%. Même si parfois une différence significative (p ~ 0,05) est perçue entre les doses d'irradiation à 0% de glycérol, il n'y a pas de baisse constante du signal. Ainsi, le signal perçu à 0% de glycérol estsignificativement supérieur (p ~ 0,05) à celui perçu en présence de glycérol pour des doses d'irradiation supérieures ou équivalentes à 4kGy (voir table 19 et figure 12) A des doses supérieures ou équivalentes à 15kGy, la présence de glycérol 2 5 favorise une diminution du signal obtenu dans les solutions 5,0% de protéines. Cette baisse de signal semble être plus importante avec l'augmentation du contenu en glycérol. Elle devient cependant significative (P < 0,05) entre 5,0% et 2,5 % de glycérol pour les doses de 30 et 40kGy (voir table 19 et figure 12).
A 7,5 % de protéines, la perte du signal en présence de glycérol est significative (P ~ 0,05) à 12, 15 et 20 kGy en présence de 2,5 % et 5,0 % de glycérol comparativement à son absence. En présence de glycérol (2,5 % ou5,0 %), le signal varie d'environ 1 115 000 à 900 000 entre 0 et 20 kGy et diminue jusqu'à 814 000 pour la dose de 40kGy à 5,0 % de glycérol. Par contre, en absence de glycérol, il n'y a pas de perte régulière et continue du signal lors de l'irradiation. Un signal moyen de 1 122 000 est obtenu pour les doses d'irradiation de 0 à 20kGy. Ainsi, le signal obtenu 5 en absence de glycérol est significativement supérieur (P ~ 0,05) à celui obtenu en sa présence pour les doses d'irradiation supérieures à 8kGy (voir table 20 et figure 12).
Pour une dose d'irradiation équivalente ou supérieure à 12kGy, le signal perçu à 7,5 % de protéines est significativement inférieur (P ~ 0,05) en présence 5,0 % de glycérol que 2,5 % de glycérol (voir table 20 et figure 12).

10 TABLE 19: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue et du contenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéines de 5,0% P/P.

DOSE 5,0%/0% 5,0%/1,0% 5,0%/2,5% 5,0%/5,0%
(kGy) 0 764770 i 2693 796315 i 3894 ~b 782666 i 23326 700887 i 4245'8 4 793769i16772d 710132i23617e 714711 i6221"e 739892i10315'9f 8 749959 i 8149 9 677805 i 7018 686849 i 374312h 684373 i 75212~
12 778002 i 100644i 669722 i 101825i 623320 i 465313k 623178 i 21642' k814920 i 244751 585219 i 28669m 585219 i 2866'4m 583052 i 155922m 765954 i 9612' n 579666 i 74509 ~ 561248 i 11830' 5 P 546316 i332023 P
- - 531297 i 5928'5 q 494688 i 213624 r 471847 i 4943'75 466259 i 320825' Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. L'expression 5,0%/2,5% signifie 5,0% de protéines avec 2,5% de glycérol. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont 2 5 pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

- 48 ~

TABLE 20: Dosage de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation reçue et ducontenu en glycérol pour l'alanate 380 à une concentration en protéines de 7,5% P/P.

DOSE 7,5%/0% 7,5%12,5% 7,5%/5,0%
(kGy) 0 1 128405 i 220511 ~a1 140330 i 125214~ab 1 179255 i 313389 b 4 1101364 i 33652C1146510 i 204644d 1131341 i 86991~d 8 1100961 i47132~e1081601 i 164865ef 1070098 i 14308"f 12 1108578 i 14058~ 291006871 i 71536~h 980093 i 10770 1158964 i 53723i972919 i 53387.k 935709 i 8417131 1133910 i 21926~ 3m934142 i 75915n 876339 i 955714~
- - 847660 i 346915 - - 814091 i 11282'5 Il n'y a pas d'unité car ces taux sont mesurés par l'aire sous les courbes obtenues. L'expression 7.5%/2,5% signifie 7,5% de protéines avec 2,5% de glycérol. Pour chaque ligne, deux moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05). Pour chaque colonne, deux moyennes suivies d'un même chiffre ne sont pas significativement différentes entre elles (P > 0.05).

LA BIODÉGRADABILITÉ
Dans cette section, les résultats de la biodégradabilité d'un type de film seront présentés. Les essais ont été répétés en triplicata et ce, à trois reprises.
Les résultats du premier essai montrent que lorsque P. fragi est en contact avec le film, la croissance bactérienne est rapide et un maximum de population (environ 107 UFC/ml de milieu) est atteint après environ 80 heures d'agitation (voir table 21 et figure 13). La population tend à diminuer très lentement en fonction du temps et celle-ci est restée supérieure à 106 UFC/ml après 1127 heures d'expérimentation. Par contre, en absence de film, la population est demeurée sensiblement la même à 20 UFC/ml pour les 100 premières heures. Par la suite, elle décroît et demeure < 5 UFC/ml jusqu'à la fin. En présence unique de film, la population 3 o bactérienne est < 5 UFC/ml du début à la fin de l'expérimentation.

CA 022l7437 l997-09-30 TABLE 21: Résultats des dénombrements de l'essai # 1 de Pseudomonas fragi en présence eVou en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié à 20 kGy.

TEMPSP. fragiAVEC FILM P. fragiSEUL FILM SEUL
(h) (UFC/ml) (UFC/ml) (UFC/ml) 0 23i12 15i12 '5 4 20i17 8 18i12 9 < 5 o 10 53 i 45 21 100 i 18 27 370 i 120 27i20 ' 5 53 - - ' 5 54 12x104 i 61x103 76 89x105 i 18x105 102 12X106 i 24x105 13 i13 < 5 125 12X106 i 23x105 14610.4x105 i 16x105 148 - <5 <5 2 o 267 92x105 i 27x105 287 - <5 <5 293 93x105 i 22x105 413 77x105 x 24x105 414 - '5 '5 624 46x105 i 26x105 646 - '5 '5 1 12736x105 i 87x104 ' 5 < 5 Dans le deuxième essai, la croissance bactérienne est rapide en présence du film et un maximum (environ 107 UFC/ml) est atteint après environ 60 heures d'agitation (voir table 22 et figure 14), la population maximale a été atteinte plus rapidement mais la population initiale était de 70 UFC/ml comparativement à
20 UFC/ml pour le premier essai. La population ne diminue que très faiblement enfonction du temps et demeure à 106 FC/ml après une centaine d'heures d'agitation.
5 Par la suite, la population diminue régulièrement en fonction du temps pour atteindre environ de 103 UFC/ml après 1102 heures (voir table 22 et figure 14). En présence seul de film, le décompte bactérien est < 5 UFC/ml sur toute la durée de l'expérimentation .

TABLE 22: Résultats des dénombrements de l'essai # 2 de Pseudomonas fragi en 10 présence eVou en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié à 20 kGy.

TEMPSP. fragiAVEC FILM P. fragiSEULFILM SEUL
(h) (UFC/ml) (UFC/ml) (UFC/ml) 0 67i45 87i27 '5 4 83 i 22 21 7400 i5300 24 - 180i44 '5 34 81x104 i 62x104 47 48x105 i 12x105 2 o 53 66x105 i 67x104 - - ' 5 71 62x105 i 1 4x105 93 64x105 i 64x104 96 83x104 i 14x104 120 - 91x104 i 13x104 189 47x105 i 10x105 190 - - <5 192 - 80x104 i 69x103 720 31x105 i 21x105 - < 5 3 0 746 43x103 i 30x103 CA 022l7437 l997-09-30 1102 ¦ 99x104 i 26x104 ¦ 800 i 730 ¦ < 5 Pour le troisième essai, la croissance bactérienne est très rapide en présence de film et est maximale (environ 107 UFC/ml) après une soixantaine d'heures d'agitation. La population initiale était d'environ 130 UFC/ml et le maximum a été
atteint dans un délai similaire au deuxième essai. Dans cet essai, la population tend également à diminuer en fonction du temps mais après 1200 heures d'agitation, cette population tend à augmenter légèrement par la suite (voir table 23 et figure 15). En absence de film, la population demeure stable (environ 110 UFC/ml) pour la première période de 24 heures et augmente rapidement à 106 UFC/ml après une centaine 10 d'heures d'agitation. Ensuite, la population diminue d'une unité logarithmique et demeure stable pour l'intervalle de 500 à 1500 heures. Par la suite, la population chute rapidement à 2800 UFC/ml après 1779 heures d'agitation (voir figure 15). En présence seul de film, la population est < 5 UFC/ml pendant toute la durée de l'expérience.
Les expériences de biodégradabilité ont été arrêtées après l'obtention d'une stabilité de la population de P. fragidans les milieux en présence de film et lorsque la population, dans les milieux en absence de film (essais 2 et 3), avait diminué
distinctement. Pour les trois essais, le film n'était pas entièrement biodégradé au moment de l'arrêt de l'expérimentation.
Différentes tentatives ont été faites afin de suivre le taux de biodégradation du film par P.fragi en fonction du temps par dosage de l'azote soluble. Dans aucun cas nous avons pu récupérer le film après immersion complète dans les milieux sans en perdre une quantité non-négligeable. En effet, le film tant à se désorganiser une fois immergé dans l'eau, de telle sorte qu'il perd sa structure initiale. Alors, une récupération par filtration eVou évaporation n'a pas été efficace pour isoler le film des milieux lors des essais de biodégradabilité.

TABLE 23: Résultats des dénombrements de l'essai # 3 de Pseudomonas fragi en présence eVou en absence d'un échantillon de film d'alanate 380 composé de 5,0% P/P de protéines et 2,5% P/P de glycérol, irradié à 20 kGy.

TEMPS P. fragiAVEC FILM P. fragiSEUL FILM SEUL
3 o (h) (UFC/ml) (UFC/ml) (UFC/ml) CA 022l7437 l997-09-30 0 130i56 130i39 <5 4 170 i 47 103 i 29 2421x103 i 2700 88 i 22 < 5 3085x103 i 31x103 160 i 18 5047x105 i 14x105 30x103 i 20x103 < 5 7387x105 i 98x104 75x104 i 57x104 9878x105 i 1 Ox10598x104 i 59x104 17356x105 i 85x1041 Ox105 i 45x104 < 5 29161x105 i 25x105 83x104 i 55x104 50338x105 i 11 x10582x103 i 23x103 < 5 63429x105 i 33x104 - < 5 108326x105 i49x104 - < 5 1152 - 10x104 i 16x103 146533x105 i 1 1 x10582x103 i 1 9x103 < 5 177974x105 i 21x105 2800 i 480 < 5 ANALYSE DES RÉSULTATS POUR LES TROIS ALANATES
Des trois caséinates utilisés, le caséinate de calcium (alanate 380) a un comportement qui diffère de celui des deux caséinates de sodium (alanates 110 et180) à l'irradiation. Les différentes mesures des propriétés rhéologiques et physico-chimiques ont démontré que:
La force de rupture (rapport F/E) du caséinate de calcium (alanate 380) est supérieure comparativement aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180).
A 5,0% P/P et 7,5% P/P, le caséinate de calcium (alanate 380) a un rapport F/E
supérieur aux deux caséinates de sodium (alanates 1 10 et 180) pour les doses de 4, 8 et 12 kGy. Toutefois, il n'y a pas de relation directe entre la concentration en protéines et la résistance du film. En effet, pour une concentration de 5,0% P/P, le rapport F/E est supérieur à celui à 7,5% P/P pour les trois caséinates. Seules exceptions pour les deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180) irradiées à 4kGy ou le rapport est très légèrement inférieur (voir tables 4 et 5). Donc, toutes proportions 3 o gardées, un film produit avec une plus grande quantité de protéines ne forme pas obligatoirement un film plus résistant après irradiation.

A 5,0% de protéines, I'irradiation jusqu'à 1 2kGy du second caséinate de sodium (alanate 180) engendre un diminution significative (P ~ 0,05) du rapport F/E. Cephénomène est observé pour le premier caséinate de sodium (alanate 110) seulement à une dose de 4 kGy. L'irradiation jusqu'à 12kGy du caséinate de calcium (alanate 380) n'a pas d'effet significatif (P > 0,05) sur le rapport F/E (voir table 4).
En absence de glycérol, I'irradiation engendre une diminution significative (P
~ 0,05) du rapport F/E pour les caséinates de sodium (alanate 110) et de calcium(alanate 380) à une concentration de 7,5%. L'irradiation jusqu'à 12kGy n'a pas d'effet significatif (P > 0,05) sur le rapport F/E pour le second caséinate de sodium (alanate 0 180) à 7,5% (voirtable 5).
Donc, le fait d'irradier jusqu'à 12kGy ne génère pas de film plus résistant pources trois caséinates et ce, en absence d'agents plastifiants.
A une concentration de 5,0%, le caséinate de calcium (alanate 380) a produit un taux de formation de bityrosine significativement supérieur (P ~ 0,05) aux deux caséinates de sodium (alanates 1 10 et 180) lorsque ce caséinate est traité aux doses de 4, 8 et 12kGy. Par contre, à 7,5% de protéines, le caséinate de sodium (alanate 110) a formé significativement plus (P ~ 0,05) de bityrosine que les caséinates de sodium (alanates 180) et de calcium (alanate 380) et ce, pour les doses de 4 et 1 2kGy.
A 8kGy, les trois caséinates ont formé une proportion similaire de bityrosine (voir tables 8 et 9).
Toutefois, les caséinates de sodium (alanate 180) et de calcium (alanate 380) ont produit significativement plus (P < 0,05) de bityrosine à une concentration en protéines de 5,0% qu'à 7,5% pour les doses de 4, 8 et 12kGy. Le caséinate de sodium (alanate 110) a produit plus de bityrosine à 5,0% de protéines qu'à 7,5% pour la dose de 8kGy seulement (voir tables 8 et 9). Alors, serait-il possible que laconcentration de 5,0% représenterait une zone ou le taux de formation de bityrosine serait maximale et que la concentration de 7,5% représenterait un point de saturation?
Une étude beaucoup plus approfondie devrait être faite pour valider cette hypothèse.
La force de cohésion d'un film est, entre autres, reliée à sa structure polymérique et chimique (Kester et Fennema, 1986). Le taux de formation de bityrosine représente un facteur important dans le processus de polymérisation induit par les radicaux hydroxyls (Davies, 1987 et Davies ef al., 1987a). Ainsi, à une concentration de 5,0% de protéines, le caséinate de calcium (alanate 380) démontre, à la fois, un rapport F/E et un taux de formation de bityrosine supérieur aux deux caséinates de sodium (alanates 110 et 180). Par contre, une telle relation n'est pas observée à une concentration de 7,5% de protéines pour les trois caséinates.
Par contre, I'irradiation jusqu'à 12kGy a peu ou pas d'effet significatifs (P >
0,05) sur la déformation à la rupture des trois caséinates utilisées et ce, pour les deux concentrations expérimentées (voir tables 6 et 7).
De même, il n'a pas eu de perte régulière et continue de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation lors des dosages par fluorescence. Cette situation est perçue pour les trois caséinates et aux deux concentrations utilisées (voir tables 10 et 11). En absence de glycérol, il est possible que l'irradiation gamma engendre une dénaturation protéique exposant ainsi les poches hydrophobes en surface de la protéine. Alors, la stabilité relative du signal de fluorescence qui est perçue lors du dosage de tryptophane, se justifierait davantage par une plus grande quantité detryptophane ayant migré en surface plutôt que la formation de nouveaux résidus par l'irradiation .

INFLUENCE DU GLYCÉROL
a) Analyse des résultats avec 5,0% de protéines Comparativement aux résultats obtenus en absence de glycérol, pour un traitement de 0 à 12 kGy, à une concentration de 5,0% de protéines, la présence de 1,0% de glycérol abaisse significativement (P ~ 0,05) la force de rupture, accroît la déformation (environ 0,4mm) et n'affecte pas le taux de formation de bityrosine (voir tables 12, 14 et 17). Par contre, pour les doses de 15 et 20 kGy, la force de rupture démontre des rapports F/E comparables à ceux obtenus en absence de glycérol pourun traitement de 0 à 12kGy. La déformation est augmentée (environ 0,6mm) par rapport aux résultats obtenus en absence de glycérol pour les doses variant entre 0 et 12kGy (voir tables 12 et 14). Le taux de formation de bityrosine est significativement supérieur (P ~ 0,05) comparativement en absence de glycérol pour les doses de 15et 20 kGy (voir table 17).
A 2,5% et 5,0% de glycérol avec 5,0% de protéines, le rapport F/E, la déformation, la viscoélasticité et le taux de formation de bityrosine augmentent3 o significativement (P ~ 0,05) avec l'augmentation de la dose d'irradiation (voir tables 12, 14, 16et17).
En présence de 2,5% de glycérol, I'irradiation a permis d'accroître le rapport F/E d'un facteur de 2.2 et d'augmenter la déformation d'un facteur 1.3. Alors qu'à 5,0%

CA 022l7437 l997-09-30 de glycérol, I'irradiation a permis d'augmenter le rapport F/E d'un facteur 1.6 et la déformation d'un facteur 1.4 (voir tables 12 et 14). La viscoélasticité des films avec 5,0% de glycérol est supérieure à celle avec 2,5%. Toutefois, la manipulation des films avec 5,0% de glycérol demeure beaucoup plus difficile (voir table 16).
Le fait d'ajouter une plus grande quantité de glycérol (2,5 et 5,0%) dans le milieu, réduit considérablement la résistance du film mais améliore de beaucoup sa capacité déformante.
Le glycérol ne semble pas agir comme inhibiteur radicalaire. De par sa présence, il semble même favoriser la formation de bityrosine selon la dose d'irradiation. En effet, la présence de glycérol (1,0%, 2,5% ou 5,0%) améliore significativement (P < 0,05) le taux de formation de bityrosine pour des doses d'irradiation équivalentes ou supérieures à 15kGy pour une concentration de 5,0% de protéines (voir table 17). Par contre, les raisons justifiant l'effet bénéfique que produit la présence de glycérol sur le taux de formation de bityrosine ne sont pas démontrées.

b) Analyse des résultats avec 7,5% de protéines En présence de 2,5% de glycérol et de 7,5% de protéines, I'irradiation (0-12kGy) engendre une diminution significative (P ~ 0,05) du rapport F/E, une augmentation significative (P < 0,05) du pouvoir déformant et du taux de formation de bityrosine comparativement aux résultats obtenus en absence de glycérol (voir tables 13,15 et 18). Toutefois, un traitement radiatif jusqu'à 20kGy n'a pas de conséquences significatives (P > 0,05) sur le rapport F/E et la déformation pour les films formés avec 7,5% de protéines et 2,5% de glycérol (voir tables 13 et 14).
Avec 5,0% de glycérol et 7,5% de protéines, le rapport F/E, la déformation, la viscoélasticité et le taux de formation de bityrosine augmentent significativement (P ~
0,05) avec l'augmentation de la dose d'irradiation (voir tables 13, 15 et 18). En présence de 5,0% de glycérol, l'irradiation a permis d'accroître le rapport F/E et la déformation d'un facteur 1.5 (voir tables 13 et 15).
La présence de glycérol contribue également à réduire largement la résistance du film mais améliore de beaucoup sa déformation.
3 o En présence de 5,0% de protéines, l'ajout de glycérol n'inhibe pas la formation de bityrosine. Bien au contraire, la formation de bityrosine, en fonction des doses d'irradiation (4 à 20 kGy), est significativement supérieure (P ~ 0.05) (voir table 18).

CA 022l7437 l997-09-30 c) Comparaison entre les deux concentrations de protéines En présence de 2,5% de glycérol, les rapports F/E à 5,0% de protéines sont inférieurs à ceux à 7,5 % pour les doses d'irradiation de 0 à 20 kGy. Par contre, les déformations à 5,0 % de protéines sont significativement supérieures (P ~ 0,05) à
celles à 7,5 % et ce, pour les même traitements (voir tables 12 à 15). A 5.0% deglycérol, les rapports F/E à 5,0% de protéines sont significativement inférieurs (p ~
0,05) à ceux à 7,5 % pour des doses variant de 0 à 40kGy. Alors que les défor",dlions à 7,5 % de protéines sont supérieures à celles à 5,0 % pour les doses de 4, 8, 15, 20 et 40kGy. A 12 et 30kGy, les déformations à 7,5% de protéines sont inférieures àcelles à 5,0% (voirtables 12 à 15). La viscoélasticité des films avec 5,0% de glycérol est significativement supérieure (P ~ 0,05) avec 5,0% de protéines qu'à 7,5% (voir table 16).
L'ajout de 2,5% de glycérol à 7,5% de protéines augmente significativement (P
~ 0,05) le taux de formation de bityrosine entre les deux concentrations de protéines à l'exception de la dose de 15kGy. Toutefois, il n'y a pas de relation directe entre la concentration de protéines et la formation de bityrosine. Ainsi, le taux de formation de bityrosine n'est pas proportionnel à la quantité de protéines présentes dans le milieu pour une même dose d'irradiation donnée (voir tables 17 et 18).
Un rapport F/E maximal est obtenu à 30 kGy pour les deux concentrations de protéines avec 2,5% eVou 5,0% de glycérol. La déformation est maximale entre 20 et 30 kGy en présence de 5,0% de protéines et 2,5% ou 5,0% de glycérol. A 7,5% de protéines avec 5,0% de glycérol, la déformation est maximale entre 15 et 20 kGy.Finalement, la viscoélasticité est maximale entre 30 et 40 kGy pour les deux concentrations de protéines avec 2,5% eVou 5,0% de glycérol (voir tables 12 à 16).
Ainsi, une dose d'irradiation entre 20 et 30 kGy semble être une région ou les propriétés mécaniques expérimentées sont maximales pour ces deux concentrations de protéines et de glycérol.
Le ratio glycérol/protéine semble être un facteur important sur l'influence de l'irradiation sur les propriétés mécaniques et physico-chimique pour les deux 3 o concentrations de protéines avec 2,5% ou 5,0% de glycérol. Ainsi, un ratio de 0,5 (2,5% de glycérol/5,0% de protéines) démontre la plus forte augmentation du rapport F/E en fonction des doses d'irradiation alors que la plus faible est perçue pour un ratio de 0,33 (2,5% de glycérol/7,5% de protéines). Le plus fort pouvoir de déformation au cours de l'irradiation est perçue pour un ratio de 0,67 (5,0% de glycérol/7,5% de protéines) et le plus faible est obtenu pour un ratio de 0,33. Finalement, la progression obtenue pour la viscoélasticité est sensiblement la même pour les ratios de 0,5; 0,67 et 1,0. Alors, les ratios glycérol/protéine situés entre 0,5 et 0,67 semblent démontrer les plus fortes variations des propriétés rhéologiques à l'irradiation.
Donc, un traitement radiatif est bénéfique pour la résistance du film, son pouvoir déformant et la formation de bityrosine pour les deux concentrations de protéines avec 2,5% ou 5,0% de glycérol. Lors du processus de polymérisation, toutes les chaînes polymériques sont interconnectées et regroupées en un gigantesque réseau. Si le nombre de points de contact n'est pas trop élevé, le réseau démontre alors un pouvoir 1 o élastique appréciable. Cette déformation réversible serait due à la présenced'embranchements flexibles (Wunderlich, 1 981). Ainsi, une période d'irradiation ou une quantité inadéquate de glycérol affecterait concrètement la structure du réseau protéique qui, inévitablement, altérerait les propriétés rhéologiques du film.

d) Dosage de tryptophane en présence de glycérol L'oxydation d'une solution de tryptophane par les radicaux hydroxyls est directement relié à la perte d'intensité du signal de fluorescence (Davies et al., 1 987a et voir figure 6).
En absence de glycérol, il n'y a pas de perte de tryptophane lors des dosages des solutions de caséinates irradiées. A l'opposé, une perte du signal est perçue 2 o lorsque le glycérol est présent dans les milieux traités. A 5,0% de protéines, la perte du signal, en présence de glycérol, est significative (P ~ 0,05) pour les doses de 4 à
20 kGy alors qu'à 7,5% de protéines, elle est significative (P ~ 0,05) pour les doses de 1 2, 1 5 et 20 kGy (voir tables 1 9 et 20).
La présence de glycérol tend à privilégier l'état natif ou replié d'une protéineglobulaire plutôt qu'un état dénaturé (Gekko et Timasheff, 1981). Ainsi, seul letryptophane situé en surface de la protéine sera affecté lors de l'irradiation.
Globalement, la perte d'intensité du signal à 40 kGy comparativement à 0 kGy varie de 30 à 40% pour les deux concentrations de protéines.
En présence de 5,0% de protéines et de 5,0% de glycérol, une meilleure 3 o protection contre la perte de tryptophane est observée comparativement à 2,5% ou 1,0% de glycérol. Alors qu'entre 2,5% et 1,0% de glycérol, la proportion de perte du signal en fonction de la dose d'irradiation est approximativement la même.

CA 022l7437 l997-09-30 Par contre, à 7,5% de protéines, la perte d'intensité du signal en fonction de la dose d'irradiation est proportionnellement plus élevée en présence de 5,0% de glycérol que lorsque seulement 2,5% de glycérol est présent (voir tables 19 et 20). L'ajout d'une concentration de 2,5% de glycérol démontre une plus grande résistance à la5 perte de tryptophane comparativement à une solution contenant 5,0% de protéines pour des doses d'irradiation variant de 0 à 20 kGy. A 5,0% de glycérol, la situation inverse se présente; toutefois, pour les doses de 30 et 40kGy, la perte devient légèrement plus élevée avec 5,0% de protéines que 7,5% (voir tables 19 et 20).
Essentiellement, il n'y pas de relation directe entre la perte du signal et le 10 contenu en glycérol en fonction de la dose d'irradiation et ce, pour les deuxconcentrations de protéines étudiées. Il est difficile d'établir un ratio glycérol/protéine pour lequel la protection contre la perte de tryptophane en fonction de la dose d'irradiation serait maximale. Pour une concentration de 5,0% de protéines, un ratio de 1,0 est le plus adéquat alors que pour une concentration de 7,5% de protéines, un ratio de 0,33 est plus adéquat.
La présence de glycérol modifie fortement les propriétés physico-chimiques des films de caséinate de calcium (alanate 380). Il tend à diminuer la force à la rupture, il augmente la déformation à la rupture, il améliore la viscoélasticité, il n'inhibe pas la formation de bityrosine et il protège la protéine de la dénaturation radiative.

LA BIODÉGRADABILITÉ
Globalement, une croissance bactérienne maximale est rapidement atteinte lorsque P. fragi est en présence du film. Pour les trois essais, un maximum d'environ 107 UFC/ml est atteint dans un délai de 60 à 80 heures après le départ des milieux.
Une tendance à la baisse de la population est remarquée après que le maximum soit 2 5 atteint à l'exception du troisième essai, où la population tend à augmenter après 1200 heures d'agitation.
Pour les deux derniers essais en absence de film, la population bactérienne exige un temps de latence d'environ 24 heures avant de commencer à croître. Un maximum de 106 UFC/ml est atteint après une centaine d'heures d'agitation et dans 3 o les deux cas, la population décroît de façon évidente par la suite.
En présence unique de film, la population est demeurée < 5 UFC/ml sur toutes la durée de l'expérimentation et ce, sur les trois essais.

EXEMPLE 8: AUTRES FORMULATIONS
D'autres films à base de caséinate ont été fabriqués en reprenant les mêmes protocoles que dans les Exemples précédents avec les modifications qui suivent.
L'alanate 380 a été solubilisé à raison de 5% P/P dans un tampon Tris-HCI 1 mM à pH
5 8Ø Les agents plastifiants ajoutés ont été le propylène glycol (PG) et le triéthylène glycol (TEG) aux concentrations 0, 2.5 % et 5 % P/P. Le débit moyen de dose d'irradiation a été de 1.5 KGy/h pour des doses de 8, 16, 32, 64, 96 et 128 KGy. Du chlorure de calcium a été ajouté après l'irradiation aux concentrations 0, 0.125 et 0.25 % P/P. Les meilleurs films obtenus ont été formés de 5 % caséinate/2.5 % PGet de 5 % caséinate/2.5 % TEG (doses inférieures à 32 KGy), le premier ayant uneforce de rupture plus élevée et le second étant plus viscoélastique. Le calcium semble augmenter la force de cohésion du film sans toutefois affecter la déformation à la rupture.

EXEMPLE 9: AJOUTS D'AUTRES COMPOSANTES
On peut ajouter des polysaccharides à des films de caséinate de calcium/
agents plastifiants. Par exemple, l'addition de carboxyméthylcellulose (CMC) donne un film rigide (composition totale 5 % alanate 380/2.5 % glycérol/0.25 % CMC). Ce film est rendu plus viscoélastique si on lui ajoute un supplément d'agent plastifiant comme 2.5% sorbitol. Le CMC est ajouté après irradiation pour éviter une précipitation. Les propriétés de résistance et de viscoélasticité d'un film de caséinate peuvent donc être modifiées à volonté par l'ajout d'autres composantes (calcium, polysaccharides et agents plastifiants (polyéthylène, propylène et triéthylène glycols, glycérol et sorbitol).
Les propriétés mécaniques les meilleures sont obtenues avec des ratios de 0.5 à .67 d'agent plastifianVprotéine à une dose d'environ 30 KGy.
2 5 Lorsqu'on ajoute le PEG comme agent plastifiant, des concentrations inférieures à 1 % sont préférées pour éviter de former des films hétérogènes.
L'ajout de CaCI2 (environ 0.125% w/w) à la solution à trois composantes (ci-dessus) augmente la formation de bityrosine et la force de rupture. Les films decaséinate se forment à des doses d'irradiation égales ou plus clcvccs que 16 KGy. La force maximale des films est obtenue à 64 KGy. A des doses plus clcvccs, la dégradation protéique semble surmonter la formation de bityrosine. A la dose de 64 KGy, la présence de CaCI2 influence peu la force de rupture en présence ou enabsence de mannitol ou de sorbitol.

Le PEG diminue la force de rupture en présence de CaCI2. Le PEG semble inhiber la formation de liens électrostatiques et entre les sels. Le sorbitol est l'agent plastifiant préféré puisqu'il augmente le plus la viscoélasticité.

EXEMPLE 10: FORMULATION SPÉCIFIQUE
Une des formulations préférées est le 5% alanate 380/2.5% sorbitol/0,25%
CMC/0.125% CaCI2, alliant force de cohésion et viscoélasticité. La dose d'irradiation optimale est située entre 32 et 64 KGy.

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Claims (9)

1. Une composition comprenant de la caséine ou un sel de caséine et un agent plastifiant dans une proportion agent plastifiant/caséine d'environ 0.5 à 0.67 (poids/poids), ladite composition étant capable de former un film lorsque soumise à
une dose polymérisante d'irradiations gamma.

2. La composition définie à la revendication 1 dans laquelle le sel de caséine est un caséinate de calcium.

3. La composition définie à la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'agent plastifiant est le glycérol, le propylène glycol, le triéthylène glycol ou le sorbitol.

4. La composition définie selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, comprenant 5 % de caséine ou de sel de caséine et 2.5 % d'agent plastifiant.

5. La composition définie à la revendication 3 comprenant 5 % de caséinate de calcium et 2.5 % d'agent plastifiant.

6. Le composition définie à la revendication 5 comprenant également 0.25% carboxymethylcellulose.

7. La composition définie à la revendication 6 dans laquelle l'agent plastifiant est le sorbitol.

8. La composition définie à la revendication 7 comprenant aussi 0.125 %
CaCl2.

9. La composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans laquelle la dose polymérisante d'irradiations gamma est d'environ 32 KGy.