KR100911949B1

KR100911949B1 - 지방 분해 및 생성 억제 해양성 미네랄 조성물

Info

Publication number: KR100911949B1
Application number: KR1020070077846A
Authority: KR
Inventors: 추용식; 유영근; 김선화; 김남철; 장해진
Original assignee: 주식회사 워터비스
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2009-08-13
Also published as: KR20090013594A; WO2009017379A2; WO2009017379A4; WO2009017379A3

Abstract

본 발명은 특정 미네랄 성분을 함유하는 미네랄 워터, 바람직하게는 해양 심층수로부터 분리한 미네랄 워터 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미네랄 워터는 해양심층수에 존재하는 풍부한 미네랄 성분들로 인하여 지방 세포의 분화를 억제하여 지방 생성을 저해하며, 생성된 지방의 분해를 촉진하여 체지방을 감소시키는 작용을 하기 때문에, 우수한 체지방 감소, 체중 감량 및/또는 항비만 효과를 갖는다.

미네랄 워터, 해양 심층수, 지방 세포 분화 억제, 지방 생성 저해, 체지방 감소

Description

지방 분해 및 생성 억제 해양성 미네랄 조성물{Brine mineral composition for inhibiting differentiation and growth of fat cells}

본 발명은 특정 미네랄 성분을 함유하는 미네랄 워터, 바람직하게는 해양 심층수로부터 분리한 미네랄 워터 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근, 총 섭취 칼로리의 증가, 특히 지방 섭취량의 증가에 따라서, 비만의 비율이 해마다 증가하고 있다. 비만은 과영양에 기초하는 체지방의 과잉축적상태로, 소비 에너지에 대해서 섭취 에너지가 과잉이 되면, 그 과잉분을 백색 지방세포의 중성지방(체지방)으로서 축적하여 발생한다. 체지방으로서의 축적이 큰 비만은 미용상 바람직하지 않을 뿐만 아니라, 고지혈증 등의 여러 가지 질병을 일으키는 원인이 된다.

이러한 질병을 예방하고 체중을 감소시키기 위해 식이섬유, 천궁의 열수 추출액, 누에고치, 구기자와 같은 다양한 식품을 이용하여 비만 치료 효과를 달성하려는 연구가 계속되어 왔다.

그러나, 지금까지 연구되어온 다양한 체감량 및 항비만 제제는 대부분 특유의 향미를 갖지 때문에, 이용자의 기호에 따라서 거부감을 일으키는 경우가 발생하여, 범용적으로 이용되기에 적합하지 않은 경우가 많이 발생하였다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 특이한 방향이나 맛을 갖지 않고 범용특성이 뛰어난 체지방 감소, 체중감량, 및/또는 항비만 효과를 갖는 제제를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 미네랄 워터 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 지방 생성 억제 및 지방 분해 효과를 갖는 미네랄 워터, 바람직하게는 해양심층수에서 분리한 미네랄 워터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미네랄 워터를 포함하는 체지방 감소, 체중 감량 및/또는 항비만 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미네랄 워터를 포함하는 지방 생성 억제 및 지방 분해 효과를 갖는 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미네랄 워터를 포함하는 체중 감량용 피부외용제를 제공하는 것이다.

우선, 본 발명은 지방 생성 억제 및 지방 분해 효과를 갖는 미네랄 워터에 관한 것이다. 본 발명의 미네랄 워터는 물과, 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 포함하며, 생체, 바람직하게는 인체 내의 미네랄 조성과 유사하게, 마그네슘:칼슘:칼륨:나트륨염의 함량비가 중량 기준으로 3:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5, 바람직하게는 3:0.75～ 1.25:0.75 ～ 1.25:0.75 ～ 1.25, 가장 바람직하게는 약 3:1:1:1 가 되도록 상기 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 함유하는 것이 좋다. 상기 마그네슘염은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 황산마그네슘, 염화마그네슘 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 칼슘염은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 황산칼슘, 염화칼슘 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 칼륨염은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 황산칼륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 나트륨염은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 황산나트륨, 염화나트륨 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 미네랄 워터의 경도는 아래의 식 1에 의하여 계산할 수 있다.

경도 = (마그네슘(mg/L)x4) + (칼슘(mg/L)x2.5)

경도가 너무 낮으면 지방 분해 촉진 및 지방 생성 억제 효과가 미미하게 되므로, 충분한 지방 분해 촉진 및 지방 생성 억제 효과를 얻기 위하여, 경도는 적어도 100 이상, 바람직하게는 300 이상, 더욱 바람직하게는 500 이상이 되는 것이 좋다. 그러나, 경도가 너무 높으면 세포 독성 등의 부작용이 발생하므로, 세포 독성을 최소화하기 위하여, 경도는 4000 이하, 바람직하게는 3000 이하, 더욱 바람직하게는 2000 이하인 것이 좋다. 따라서, 본 발명의 미네랄 워터는 경도가 100 내지 4000, 바람직하게는 300 내지 2000, 더욱 바람직하게는 500 내지 2000인 것이 좋다.

본 발명의 미네랄 워터 내의 미네랄 농도는 상기 경도 범위를 유지할 수 있는 정도로 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 상기 경도 범위를 맞추고 체내 미네랄 환경과 유사하도록 하기 위하여, 본 발명의 미네랄 워터 내 총 미네랄 농도는 0.001 내지 1 %(w/v), 바람직하게는 0.01 내지 0.5 %(w/v)인 것이 좋다.

본 발명의 미네랄 워터는 특히 해양심층수로부터 얻어진 것이 좋다. 해양심층수는 겨울철 해수 수직 혼합 작용이 도달하는 심도 이하인 해저 약 1000m 이하의 깊이에서 채취되는 해수를 의미하는 것으로, 광합성에 의한 유기물 생성이 일어나지 않고, 분해능이 탁월하며, 화학적 및 생물학적 위험 요소 및 환경 오염의 영향을 거의 받지 않아서 이화학적 안정성이 매우 높은 대단위 물분자들이 각종 미네랄 을 함유하는 것이다. 근래들어, 해양심층수의 다양한 효능이 밝혀지면서 그 효용성이 증대되고 있다.

본 발명자들은 이러한 해양심층수에 함유된 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염 등의 미네랄 성분의 함량비가 상기한 바와 같은 본 발명의 미네랄 워터 내의 함량비와 유사함을 밝혔다. 따라서, 해양심층수 또는 해양심층수를 0.1 내지 1μm, 바람직하게는 0.3 내지 0.7μm 기공크기의 필터에 여과시킨 여과액에서 얻어진 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 정제수에 용해시키고, 상기한 바와 같은 적절한 경도 범위를 맞추기 위하여 정제수의 양을 조절하면, 별도의 미네랄 성분 함량 조절 없이 용이하게 본 발명의 미네랄 워터가 얻어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 미네랄 워터는 해양심층수로부터 분리된 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 정제수에 용해시킨 것이거나, 해양심층수 자체일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 미네랄 워터로서 해양심층수를 이용하는 경우, 상기한 바와 같은 해양심층수의 유리한 효과를 함께 얻을 수 있기 때문에 매우 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 지방 생성 억제 및 지방 분해 촉진 효과를 갖는 미네랄 워터를 포함하는 체지방 감소, 체중 감량 및/또는 항비만 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 미네랄 워터를 포함하는 지방 생성 억제 및/또는 지방 분해 촉진 효과를 갖는 기능성 식품을 제공하는 것이다. 상기 조성물과 기능성 식품 내의 상기 미네랄 워터 함량은 목적하는 조성물 및 기능성 식품의 효과와 형태에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 예컨대, 0.01중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량%일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 미네랄 워터를 포함하는 체중 감량및/또는 지방 조직 제거용 피부외용제 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피부 외용제는 원액 그대로 쓰이거나, 분산액, 에멀젼, 젤, 연고, 패치, 등의 다양한 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 피부 외용제 내의 상기 미네랄 워터 함량은 목적하는 효과와 제형 등에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 예컨대, 0.01중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량%일 수 있다. 본 발명에 따른 피부 외용제는 함유된 미네랄 워터의 지방 분해 효과에 의하여, 피부에 적용시 지방이 뭉쳐있는 조직, 예컨대 셀룰라이트를 제거하거나, 체중을 감량시키는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 미네랄 워터는 해양심층수에 존재하는 풍부한 미네랄 성분들로 인하여 지방 세포의 분화를 억제하여 지방 생성을 저해하며, 생성된 지방의 분해를 촉진하여 체지방을 감소시키는 작용을 하기 때문에, 우수한 체지방 감소, 체중 감량 및/또는 항비만 효과를 갖는다.

이하, 본 발명을 아래의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

[실시예]

[ 제조예 1] 해양심층수 채취 및 정제

해양심층수(동해 양양)를 마이크로 필터(재질: 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 기공크기: 약 0.5μm, 주식회사 새한 제품)로 정밀 여과하여 불순물을 제거한 후(전처리수), 역삼투 시스템(Dow Chemical Company 제품, FILMTEC, SW30-4021, 수율: 0.5)을 이용하여 농축한 농축수 및 담수로 분리하였다. 상기 해양심층수, 전처리수 및 농축수의 유량 (단위: GPD, gallon per day) 및 미네랄의 농도(단위: mg/l)을 하기 표 1에 나타내었으며, 얻어진 농축수의 보메도 비중은 4.5 °Be였다.

	해양심층수	전처리수	농축수
유량(GPD)	1722.4	1722.4	932.26
Na (mg/l)	14000	14000	26831
Ca (mg/l)	410	410	785.8
Mg (mg/l)	1300	1255	2491
K (mg/l)	430	430	824.1
B (mg/l)	4.2	4.2	8.05
S (mg/l)	820	820	1571

상기 농축수를 3개의 다중 효용증발장치에 순차적으로 통과시키면서, 농축수의 보메도 비중이 23 °Be, 30 °Be 및 36°Be가 되도록 함으로서, 칼슘염, 나트륨염 및 황산염을 순차적으로 분리하여 제거하였다. 다음으로, 상기 칼슘염, 나트륨염 및 황산염이 제거된 농축수를 증발 결정장치에 투입하고, 15mmHg의 압력 및 50℃의 온도에서 농축하여, 칼륨염 및 마그네슘염의 혼합염 슬러리를 얻고, 상기 슬러리를 워싱 컬럼에 투입한 다음, 물로 세척하여, 마그네슘염이 용해된 용액과 염화칼륨(KCl) 결정을 포함하는 슬러리를 얻었다. 상기 염화칼륨(KCl) 슬러리를 원심분리 및 건조하여 고체 상태의 염화칼륨 결정을 얻었다. 또한, 농축 장치를 이용하여, 상기 마그네슘염이 용해된 용액을 탈수, 농축함으로서, 칼륨염 및 마그네슘염이 혼합된 결정 및 염화나트륨(NaCl) 결정을 석출시켰고, 마그네슘 순도가 향상된 염화마그네슘·6수화물(MgCl₂ _·6H₂O) 및 황산마그네슘·7수화물(MgSO₄ _·7H₂O)의 혼합 용액을 얻었다. 최종 생성된 마그네슘염 용액에 있어서, 마그네슘염의 농도는 35.2 중량% 였다. 참고로, 최종 생성된 마그네슘염이 용해된 용액에 있어서, 염화마그네슘과 황산마그네슘은 4~7:1의 비율로 함유되어 있다. 다른 무기염류의 농도는 약 3.2 중량%로서, 순도가 향상된 마그네슘염 용액이 얻어짐을 알 수 있었다.

[ 제조예 2] 미네랄 워터의 제조

상기 제조예1에서 분리한 황산칼슘(CaSO₄) 267.88 mg, 염화마그네슘(MgCl₂)과 황산마그네슘(MgSO₄) 1172 mg(MgCl₂:MgSO₄=5:1의 비율에 근거하여 계산하면, MgCl₂ 976.7mg, MgSO₄ 195.3mg을 포함함), 염화칼륨(KCl) 150.43 mg, 염화나트륨(NaCl) 200.43mg을 투과수 0.522L에 용해시키고 교반하여, 인체에 존재하는 미네랄 조성비와 유사하게 마그네슘(Mg)/칼슘(Ca)/칼륨(K)/나트륨(Na)의 중량비가 3/1/1/1이 되도록 미네랄 워터를 제조하였다.

미네랄 워터의 경도는 아래의 식 1에 의하여 결정하였다.

[수학식 1]

경도 = (마그네슘(mg/L)x4) + (칼슘(mg/L)x2.5)

식 1에 의하여 계산된 상기에 제조된 미네랄 워터의 경도는 4000이었다. 이하의 실험예에서 사용된 미네랄 워터는 본 제조예에서 제조된 미네랄 워터를 원하는 경도에 맞게 희석한 것이다.

[ 실험예 1] 경도에 따른 세포 독성 측정

지방전구세포인 3T3-L1 세포(ATCC: CL-173, 2x10⁵cell/6well)를 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린 (100 IU/㎖) 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지 또는 동등 이상의 성장력을 갖는 배지를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 48시간동안 배양하였다. 본 시험의 시료 농도는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석을 이용한 실험을 통하여 세포 독성을 측정하였다.

세포 독성 측정 (MTT 분석) 방법은 다음과 같다.

상기 제조예 2에서 얻어진 경도 4000의 미네랄 워터를 그대로 혹은 물로 희석하여 경도가 각각 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000인 미네랄 워터를 제조하고, 상기 미네랄 워터 0.05ml 씩과 세포 배양액을 0.05ml을 넣고 48시간동안 세포를 배양한 다음, 각각의 웰에 0.5 % MTT 용액을 넣고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide) 용액 100 ㎕씩을 첨가하고 10분간 흔들어 준 다음 ELISA 판독기 (ELISA reader)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 측정하였다. 이와 같이 얻어진 세포 생존률 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 미네랄 워터를 25% (경도: 1000)까지 처리했을 때 미네랄 워터를 처리하지 않은 군 (경도: 0)에 버금가는 비독성을 나타내었다.

[ 실험예 2] 3 T3 - L1 지방 세포 ( adipocyte ) 내의 지방생성 억제효과

3T3-L1 세포 2x10⁵cell/well를 10% FBS (fetal bovine serum), 4.5 g/ℓ 글루코오스, 2 mM 글루타민, 항생제 페니실린-스트렙토마이신(penicilin-streptomycin, Gibco)이 함유된 DMEM 배지에서 37℃ 조건으로 세포가 완전히 자랄 때까지 배양을 하였다. 세포가 다 자란 다음, 인슐린 (10 μg/㎖, Sigma), 0.25 μM 덱사메타손 (dexamethasone, Sigma), 0.5mM 이소부틸메틸크산틴 (isobutylmethylxanthine, Sigma)이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 조건으로 2일간 배양한 후, 인슐린 (10 μg/㎖)만이 첨가된 배지에서 37℃ 조건으로 3일간 더 배양을 하였다. 이후 실험에 이용될 때까지 2일 간격으로 인슐린, 덱사메타손, 이소부틸메틸크산틴이 첨가된 DMEM/FBS 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 로 교환하였다.

분화된 세포들은 지방 방울 (lipid droplet)이 꽉 채워진 상태로 전체 세포 중 90% 이상의 지방 세포의 형태가 되었을 때 사용하였다. 구체적으로, 경도 4000인 미네랄워터에 DMEM 파우더를 용해시켜 경도 4000을 가지는 DMEM 배지를 제조한 후, 경도 0의 DMEM 배지로 희석하여 각각 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000의 경도를 나타내도록 하였다. 즉, 경도 4000인 군은 경도 4000을 가지는 DMEM 배지를 사용한 것이다. 이처럼 각 6-웰에서 배양한 세포에 경도 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000이 되도록 DMEM으로 희석된 미네랄 워터를 각각 1ml 처리하고 48시간 경과 후 세포내 지방 방울을 10% 오일 레드 O (Oil red O)로 염색한 후 에탄올로 추출하여 515 nm에서 정량화하였다. 상기 실험 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 경도 100 정도에서도 약 10%의 지방 생성 억제 효과가 나타났으며, 경도 300 이상에서는 20% 이상, 약 25 내지 45% 정도의 지방 생성 억제 효과를 보였다.

[ 실험예 3] 지방전구세포인 3 T3 - L1 의 지방세포( adipocyte )로의 분화 억제효과

3T3-L1 세포 2x10⁵ cell/well를 10% FBS (fetal bovine serum), 4.5 g/ℓ 글루코오스, 2 mM 글루타민, 항생제가 들어간 DMEM 배지에서 37℃ 조건으로 세포가 완전히 자랄 때까지 배양을 하였다. 세포가 다 자란 다음에는 인슐린 (10 μg/㎖), 0.25 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴 (isobutylmethylxanthine)와 경도 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000이 되도록 DMEM으로 희석된 미네랄 워터가 첨가된 DMEM/FBS 배지(배지 제조는 위와 동일함)에서 37℃ 조건으로 2일간 배양한 후 인슐린 (10 μg/㎖)과 시료만이 첨가된 배지에서 37℃ 조건으로 3일간 더 배양을 하였다. 이후 실험에 이용될 때까지 2일 간격으로 인슐린, 덱사메타손, 이소부틸메틸크산틴과 시료가 첨가된 DMEM/FBS 배지로 교환하였다. 상기 미네랄 워터를 첨가하지 않은 대조군에서 분화된 세포들이 지방 방울 (lipid droplet)을 꽉 채워진 상태로 전체 세포 중 90% 이상의 지방 세포의 형태가 되었을 때 분석하였다. 세포내 지방 방울을 10% 오일 레드 O (Oil red O)로 염색한 후 에탄올로 추출하여 515 nm에서 정량화하였다. 상기 실험 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 경도 100~300 실험군에서는 대조군과 비교하여 유의성이 없으나, 경도 1000 실험군에서는 약 35%, 경도 2000 실험군에서는 약 40%의 지방세포 분화 억제도를 보여주었다.

[ 실험예 4] 지방전구세포인 3 T3 - L1 에 분화 촉진물질 처리 후 미네랄 워터의 지방세포( adipocyte )로의 분화 억제효과

3T3-L1 세포 2x10⁵ cell/well를 10% FBS (fetal bovine serum), 4.5 g/ℓ 글루코오스, 2 mM 글루타민, 항생제가 들어간 DMEM 배지에서 배양을 하였다. 세포가 다 자란 다음에는 인슐린 (10 μg/㎖), 0.25 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴 (isobutylmethylxanthine)와 지방세포 분화 촉진물질인 10μM 트로글리타존 (Troglitazone, Sigma), 그리고 경도 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000이 되도록 DMEM으로 희석된 미네랄 워터가 첨가된 DMEM/FBS 배지(배지 제조는 위와 동일함)에서 37℃ 조건으로 2일간 배양한 후 인슐린 (10 μg/㎖)만이 첨가된 배지에서 37℃ 조건으로 3일간 더 배양을 하였다. 이후 실험에 이용될 때까지 2일 간격으로 인슐린, 덱사메타손, 이소부틸메틸크산틴과 트로글리타존이 첨가된 DMEM/FBS 배지로 교환하였다. 분화된 세포들이 지방 방울 (lipid droplet)을 꽉 채워진 상태로 전체 세포 중 90% 이상의 지방 세포의 형태가 되었을 때 미네랄 워터를 경도 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000이 되도록 DMEM에 희석하여 처리하고 37℃ 조건으로 48시간 경과 후 세포내 지방 방울을 10% 오일 레드 O (Oil red O)로 염색한 후 에탄올로 추출하여 515 nm에서 정량화하였다.

도 4에 본 발명에 따른 미네랄 워터의 분화촉진 물질 처리된 지방 세포의 분화 억제 효과를 경도별로 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 5일 경과 후 경도 500 이상에서 10% 이상, 약 10 내지 40% 정도의 지방 생성 억제 효과를 보였다.

[ 실험예 5] 미네랄 워터의 지방세포( adipocyte ) 유도 발현 유전자 억제 효과

지방전구세포가 인슐린에 의해 지방세포로 분화유도 되는 동안 PPARγ, C/EBP famil, ADD1/SREBP1 등의 전사인자들의 전사 발현이 증가하게 된다. 본 실험예에서는 이들 유전자 중 미네랄 워터의 지방세포 유도 관련 유전자에 대한 발현 억제 효과를 알아보기 위하여 임의로 PPARγ를 선택하여 세포내 유전자 발현을 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)으로 해석하였다.

1. 실험 재료 준비

3T3-L1 세포 6x10⁵ cell/25cm² T-플라스크(flask)를 10% FBS, 4.5 g/ℓ 글루코오스, 2 mM 글루타민, 항생제가 들어간 DMEM 배지에서 배양을 하였다. 세포가 다 자란 다음에는 인슐린 (10 μg/㎖), 0.25 μM 덱사메타손, 0.5 mM 이소부틸메틸크산틴과 지방세포 분화 촉진물질인 10μM 트로글리타존(Troglitazone, Sigma), 그리고 경도 1000, 2000, 4000이 되도록 DMEM으로 희석된 미네랄 워터가 첨가된 DMEM/FBS 배지에서 37℃ 조건으로 2일간 배양한 후 미네랄 워터와 인슐린 (10 μg/㎖)만이 첨가된 배지에서 37℃ 조건으로 3일간 더 배양을 하였다. 이 후 실험에 이용될 때까지 2일 간격으로 인슐린, 덱사메타손, 이소부틸메틸크산틴, 트로글리타존과 미네랄 워터가 첨가된 DMEM/FBS 배지로 교환하였다. 대조군에서 분화된 세포들이 지방 방울(lipid droplet)을 꽉 채워진 상태로 전체 세포 중 90% 이상의 지방 세포의 형태가 되었을 때 총(total) RNA를 추출하였다.

총 RNA는“Invisorb Spin Cell RNA Mini Kit”(Invitek GmbH, Germany)를 이용하여 추출하였다. RNA는“Genensis 10 spectrophotometer”(Thermo scientific, USA)를 사용하여 정량하였다.

2. 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)에 의한 유전자 발현 해석

타겟 유전자(Target gene)인 PPARγ와 하우스키핑(Housekeeping) 유전자인 GAPDH의 프라이머(primer)는“SG Quantitect primer assay”(Qiagen Inc, USA)를 사용하고, 각 세포에서 추출한 총 RNA 1pg ~ 100ng을 주형으로 하여“Sensimix onestep kit”(Quantace, UK)를 이용하여 실시간(real time) PCR을 수행하여 각 유전자에 대한 증폭곡선과 융해곡선을 분석하여 목적서열의 특이적인 증폭을 확인하였다. 각 유전자의 mRNA 발현수준은 CT(threshold cycle) 값으로 정량화되고 GAPDH의 CT 값으로 표준화되었다.

도 5에 본 발명에 따른 미네랄 워터의 분화촉진 물질 처리된 지방 세포의 유도 발현 유전자 억제 효과를 경도별로 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 경도가 증가할수록 PPARγ의 발현이 억제되었으며, 경도 1000은 50%, 경도 2000은 67%, 경도 4000은 95%의 유전자 발현 억제 효과를 나타냄으로써 유의성 있는 결과를 보였다.

[ 실험예 6] 미네랄 워터의 비만생쥐 모델에서의 체중 감소 및 지질 조절 효과

비만생쥐 모델(db/db)에서 미네랄 워터의 체중 감소 및 지질 조절 효과를 관찰하기 위하여, 흰쥐를 이용하여 다음과 같은 동물실험을 수행하였다.

1. 실험동물의 구입과 사육

본 실험에 사용한 흰쥐는 스프라그-돌리계로 생후 3주령(체중 80±10g)의 수컷(샘타코, 한국)을 구입하여 동물실험실 내 고형사료(삼양사료, 한국)를 제공하고 물은 무제한 공급하면서 사육실에서 7일간의 적응기간을 갖도록 하였다. 적응기간 후 증류수와 경도 100, 500, 1000, 2000, 4000의 미네랄 워터 투여군의 총 6군으로 나누어 각각 준비된 사료 및 물을 자유로이 섭취하도록 하여 5주간 사육하면서 체중변화 및 물 섭취량을 측정한 후 3주 동안 비만 억제효과 실험에 사용하였다. 동물사육실의 조건은 항온항습(23± 3℃, 50± 10% RH)환경에서 08：00부터 20：00까지 12시간 간격으로 명암이 자동 조절되도록 하였다.

2. 실험재료

본 실험에 사용된 미네랄 워터는 제조예 2에서 제조된 경도 4000의 미네랄 워터를 희석없이 사용하거나 증류수로 경도 100, 500, 1000, 2000이 되도록 희석하여 사용하였다.

3. 체중, 부위별 체지방 무게의 측정

이틀마다 오후 2시경에 체중을 측정하였으며 평량된 식이를 주고, 다음날 물의 잔량을 평량하여 매일의 물 섭취량을 계산하였다. 모든 실험이 끝난 후 부위별 체지방 무게를 비교하기 위하여 마취 후 관류하기 전 갈색지방조직(brown adipose fat;BAT), 부고환 지방(epididymal fat)의 무게를 재고, 관류 후에 복막 지방(peritoneal fat)과 내장 지방(visceral fat)의 무게를 측정하였다.

상기의 실험과정에 의한 실험결과는 다음과 같다.

가. 체중의 변화

상기 증류수군과 미네랄 워터 군 (경도 100, 500, 1000, 2000 및 4000)의 3주동안 물 섭취에 따른 체중 변화를 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 미네랄 워터군에서 유의적인 체중 증가의 억제 효과가 관찰되었다. 도 6 중의 시간“0”은 미네랄 워터를 처치한 시기를 나타낸 것이다. 처치가 끝난 후 최종 몸무게를 비교하여 보았을 때 미네랄 워터 섭취군에서 체중 증가의 억제효과가 현저하게 나타났음을 확인하였으며, 3주까지 5 내지 25%의 체중이 감소하는 것을 확인하였다.

나. 부위별 체지방 무게의 비교

미네랄 워터 섭취에 의한 부위별 체지방 무게의 변화를 비교하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 부고환 지방(epididymal fat)은 대조군과 차이가 크게 나지 않았으며, 경도 1000인 미네랄 워터군은 증류수군 대비 내장 지방(visceral fat)은 20.2% 감소되었으며, 복막 지방(peritoneal fat)은 19.4% 감소되었다.

[ 실험예 7] 미네랄 워터의 슬리밍 효능 효과

본 발명에 따른 미네랄 워터를 이용하여 미네랄 워터 스킨을 제조하였으며, 그 조성비율은 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표에서 미네랄 워터는 각각 그 경도가 100, 1000, 2000, 4000이 되도록 4군으로 준비하였다. 본 실험에 사용된 미네랄 워터는 제조예 2에서 제조된 경도 4000의 미네랄 워터를 희석없이 사용하거나 증류수로 경도 100, 1000, 2000이 되도록 희석하여 사용하였다. 참고로 화장품 원료 명칭 중에서 해양심층수 미네랄 워터는 스펙에 상관없이‘해수’라는 명칭으로 지칭하기도 한다.

성분	함량 (%)
증류수 및 미네랄 워터(해수)	86.17
글리세린/글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드코폴리머/프로필렌글라이콜	5.00
카보머	0.10
디소듐이디티에이	0.05
벤조페논-5	0.05
알란토인	0.30
파라옥시안식향산에스텔	0.20
부틸렌글라이콜	2.00
에탄올	1.00
피이지-60하이드로제네이티드 케스터 오일	0.30
향료	0.03
페녹시에탄올	0.20
포타슘하이드록사이드	0.10
쇠비름추출물	1.00
하마멜리스껍질/잎/잔가지추출물	0.50
소듐히알루로네이트	2.00
장미수	1.00

국소 비만이나 셀룰라이트가 있는 여성 중 BMI(Body Mass Index, 체중(kg)/신장(m²))가 21∼30인 25∼46세의 성인 여성 20명을 대상으로 하여 집에서 6주 동안 아침과 저녁 하루 2회 한쪽 허벅지에 사용자의 마사지와 함께 경도별로 제조된 미네랄 워터 함유 스킨을 사용하고, 8주 동안 사용전, 사용후를 기기평가, 연구자에 의한 평가에 의해 효과여부를 판단하였다.

허벅지 둘레는 줄자(단위:cm)를 이용하여 양쪽 허벅지 중 일정한 부위에 표지를 한 후 측정을 하였으며 허벅지의 측정 부위는 두 부위, 즉 허벅지 상단부와 가운데 부분에서 측정하였다. 얻어진 수치는 양측검정으로 스튜던트 티 테스트(Student t test) 또는 윌콕슨 테스트(Wilcoxon test)를 이용하여 적용전과 적용후를 비교하여 통계적인 유의성을 분석하였다(유의수준 α= 0.05). 분산과 분포의 균질성을 확인하기 위해 각각 레빈 테스트(Levene test)와 콜모고로프-스미르노프 테트스(Kolmogorov-Smirnov test)를 수행하여 균일한 경우 스튜던트 티 테스트를 사용하였다.

초음파를 이용한 피하 지방층과 침윤된 셀룰라이트의 두께(단위:mm) 측정은 Ultrasound-EuB 415 US 스캐너를 이용하였으며 얻어진 수치는 양측검정으로 스튜던트 티 테스트 또는 윌콕슨 테스트를 이용하여 사용전과 사용후를 비교하여 통계적인 유의성을 분석하였다(유의수준 α=0.05). 분산과 분포의 균질성을 확인하기 위해 각각 레빈 테스트와 콜모고로프-스미르노프 테트스를 수행하여 균일한 경우 스튜던트 티 테스트를 사용하였다.

미네랄 워터 함유된 스킨을 사용한 지 6주 후 허벅지 둘레를 측정 및 비교한 결과, 비교예(증류수 함유 스킨)에 비해 미네랄 워터 함유 스킨을 적용한 경우 허벅지 둘레가 0.3cm~0.6cm 감소한 것으로 나타나 통계적으로 유의한 결과를 보였다. 이때, 시험기간 동안 피검자의 몸무게는 변화가 없었다.

도 8에 본 발명에 따른 미네랄 워터 함유 스킨의 적용후 피하 지방 및 셀룰라이트의 감소율을 도시하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 미네랄 워터 함유 스킨을 사용한 허벅지에서 사용전과 비교하여 피하 지방이 2.7%(경도 100의 경우) 감소하여 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다. 반면에 비교예를 사용한 허벅지에서는 유의한 변화가 없었다.

또한, 비교예와 대비하였을 때, 미네랄 워터 함유 스킨을 적용한 경우, 예컨대 경도 1000의 경우 셀룰라이트 감소율이 약 15%로 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.

이상의 결과로부터, 해양심층수로부터 분리한 미네랄 워터가 피하 지방 감소, 및 셀룰라이트 감소에 효과적이라는 사실을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 지방 생성 억제 효과를 나타내는 해양 심층수 조성물은 풍부한 미네랄 성분으로 인하여 항비만 효과를 가지는 해양 심층수를 함유한 음료 및 식품 조성물, 피부 화장품료로서 체중감량의 효과를 보일 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 미네랄 워터의 독성을 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 미네랄 워터의 지방 세포 생성률 측정한 결과를 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 미네랄 워터의 지방 세포의 분화 억제 효과를 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 미네랄 워터의 분화촉진 물질 처리된 지방 세포의 분화 억제 효과를 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 미네랄 워터의 분화촉진 물질 처리된 지방 세포의 유도 발현 유전자 억제 효과를 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명에 따른 미네랄 워터의 시간에 따라 체중에 미치는 영향을 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 미네랄 워터의 체지방 무게에 대한 영향을 경도별로 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명에 따른 미네랄 워터 함유 스킨의 피하 지방 및 셀룰라이트 감소에 대한 영향을 경도별로 나타낸 그래프이다.

Claims

마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 마그네슘:칼슘:칼륨:나트륨의 중량을 기준으로 3:0.5 내지 1.5:0.5 내지 1.5:0.5 내지 1.5의 함량비로 함유하는 지방 분해 촉진 또는 지방 생성 억제용 미네랄 워터.
제1항에 있어서, 아래의 수학식 1에 의하여 계산된 경도값이 100 내지 4000인 미네랄 워터:

[수학식 1]

경도 = (마그네슘(mg/L)x4) + (칼슘(mg/L)x2.5)
해양심층수로부터 분리된 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염 및 나트륨염을 마그네슘:칼슘:칼륨:나트륨의 중량을 기준으로 3 : 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5 의 함량비로 정제수에 용해시킨 것을 함유하는 지방 분해 촉진 또는 지방 생성 억제용 미네랄 워터.
제3항에 있어서, 아래의 식 1에 의하여 계산된 경도값이 100 내지 4000이 되도록 물이 첨가된 미네랄 워터:

[수학식 1]

경도 = (마그네슘(mg/L)x4) + (칼슘(mg/L)x2.5)
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미네랄 워터를 함유하는 체지방 감소, 체중 감량 또는 항비만용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미네랄 워터를 함유하는 지방 생성 억제 또는 지방 분해 촉진 효과를 갖는 기능성 식품.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미네랄 워터를 함유하는 체중 감량또는 지방 조직 제거용 피부 외용제.