KR100882780B1

KR100882780B1 - 솔잎 추출물을 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소저해제

Info

Publication number: KR100882780B1
Application number: KR1020040105854A
Authority: KR
Inventors: 고지훈; 황의일; 이기원; 최금희
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2009-02-09
Also published as: KR20060067255A

Abstract

본 발명은 솔잎 추출물 또는 이로부터 분리된 디터펜(diterpene) 성분인 코무닉산(trans-communic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제에 관한 것이다. 그러므로 본 발명의 약학적 조성물은 테스토스테론 5-알파 환원효소 활성을 억제함으로서 탈모, 여드름, 전립선 비대증 등의 증상을 예방 및 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

솔잎 추출물을 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제{INHIBITORS COMPRISING EXTRACTS OF PINE NEEDLE FOR 5-α REDUCTASE}

본 발명은 솔잎 추출물 또는 이로부터 분리된 디터펜(diterpen) 성분인 코무닉산(trans-communic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제에 관한 것이다.

솔잎(Pine needle)은 소나무의 잎으로 그 주요성분은 터펜틴 오일(Terpentine oil), 시네올(cineole), 살리니그린(Salinigrin), 코니페린(Coniferin), 피-사이멘(P-Cymen), 덴시피마릭산(Densipimaric acid), 레텐(Retene) 등과 엽록소, 단백질, 인, 철분, 효소, 미네랄, 지용성 비타민 A 및 비타민 C 등이 함유되어 있다. 솔잎은 민간요법 등에서 피부손상 회복과 관련된 효능이 전해오고 있으며, 한방의학서인 명의별록에는 솔잎을 사용하면 모발이 희어지는 것을 방지한다고 기재되어 있으며, 목초강목에는 모발이 잘 부스러지는 것을 방지 하며, 머리를 맑게 해주어 건망증에 효과가 있으며, 오장을 편하게 해주고, 고혈압, 여성의 미용, 불면증, 냉 대하증 등 부인병 예방에도 효능이 있다고 개시하고 있다.

대한민국 특허공보 제1995-7720호에는 삼림욕 효과를 나타내는 솔잎성분이 함유된 화장비누 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제150577호에는 솔잎 추출물과 은행잎 추출물을 함유하는 모발용 조성물이 비듬 및 두피의 가려움증을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 개시하고 있다. 그러나 솔잎 추출물이 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해활성을 가짐에 대해서는 알려진 바가 없으며, 종래 코무닉산 및 디하이드로바이어틱산은 디터펜 성분으로 항암효과가 있음이 알려져 있으나(Toshifumi Minami et al., J. Nat. Prod. 2002, 65, 1921-1923; Peiko Tanaka et al., Cancer Letters, 2000, 161, 165-170), 솔잎 추출물 성분들 중에 코무닉산 또는 디하이드로아비어틱산을 포함하고 있음에 대해서는 알려진 바가 없다.

한편. 테스토스테론 5-알파 환원효소는 피지선, 모낭, 전립선 등 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하며 정소에서 생합성 되는 남성 호르몬인 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시키는 데 관여하는 생체 촉매이다. 테스토스테론은 남성의 형질발현에 있어서, 골격근 증가, 정자 형성 등에 관여하고 디하이드로테스토스테론은 여드름, 피지증가, 탈모 및 전립선비대증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다(J. Invest. Dermatol. 1995; 105(2): 209-14).

따라서 본 발명자들은 탈모, 여드름, 전립선 비대증 등과 관련된 호르몬인 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하고자 테스토스테론 5-알파 환원효소의 저해활성을 갖는 천연물을 찾던 중 솔잎에서 이와 같은 효능을 발명하고 나아가 생리활성물질까지 단리하였다.

본 발명은 솔잎 추출물 또는 이로부터 단리된 생리활성물질의 신규한 용도를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 본 발명은 솔잎 추출물로부터 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산을 단리하는 것에 의한 상기 물질들의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 솔잎 추출물 또는 이로부터 단리된 생리활성물질인 코무닉산(trans-coomunic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)의 신규한 용도인 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 솔잎으로부터 상기 생리활성물질인 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산을 단리하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 솔잎 추출물, 또는 이로부터 단리된 생리활성물질인 코무닉산(trans-coomunic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 유효성분으로 함유하며, 테스토스테론 5-알파 환원효소에 대하여 우수한 저해 활성을 갖는 신규한 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 솔잎추출물은 적송(赤松), 유송(油松), 마미송(馬尾松), 해송(海松) 등의 소나무과에 속하는 솔잎에서 추출된 것이며, 기타 소나무과에 속하는 솔잎에서 추출된 추출물도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 솔잎 추출물은 상기 솔잎을 건조한 후 물 또는 저급 알콜을 첨가하여 추출한 솔잎의 조추출물을 포함한다. 또한, 솔잎의 알콜 추출물에 헥산, 클로로포름, 등의 유기용매와 물을 사용하여 순차적으로 분획 추출한 분획물도 포함한다.

디터펜 성분인 상기 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산은 Thuja standishii (Iwamoto et al., 2001), Calocedrus formosana (Fang et al., 1989) 및 Larix kaempferi (Ohtsu et al., 1998; Tanaka et al., 1997)로부터 단리 될 수 도 있고, 공지의 합성법에 의해 제조될 수도 있다. 바람직하게는 솔잎으로부터 단리함으로서 상기 물질들을 얻을 수 있다.

테스토스테론 5-알파 환원효소는 피지선, 모낭, 전립선 등 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하며 정소에서 생합성 되는 남성 호르몬인 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시키는 데 관여하는 생체 촉매이다. 사춘기 이후 과량 분비된 디하이드로테스토스테론은 피지세포(sebocyte)에서 피지를 과잉 생성하는 주원인 물질로 작용하여 여드름 및 남성형 탈모를 유발한다(Metcalf BW et al., Trends Pharmacol Sci. 1989 Dec;10(12):491-5. Review). 더욱 상세하게는 여러 모낭 세포에서 테스토스테론에 비하여 디하이드로테스토스테론이 호르몬 수용체에 더욱 잘 결합하기 때문에 탈모를 일으키는 원인을 제공한다. 그러므로 테스토스테론 5-알파 환원효소의 작용을 저해함으로서 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하여 탈모를 방지할 수 있다(Winson JD., J Biol Chem., 1975 May 10;250(9):3498-504).

본 발명에서는 솔잎 추출물 또는 이로부터 단리된 코무닉산(trans-communic acid), 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)의 테스토스테론 5-알파 환원효소 작용의 저해 효과 실험을 한 결과 우수한 효소 활성 저해 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 솔잎 추출물, 코무닉산(trans-communic acid) 또는 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 탈모 방지를 위한 의약품으로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 전립선비대증, 여드름 등 테스토스테론 5-알파 환원효소 활성과 관련된 증상을 예방 및 치료하는 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등과 혼합하여 솔잎 추출물 또는 솔잎으로부터 분리된 코무닉산(trans-communic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 유효성분으로 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제를 제조할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 등의 경구투여용 제제나 통상의 방법으로 주사용 증류수에 용해하여 주사제로 또는 에어로졸, 로션, 크림 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 생리 활성 물질인 코무닉산(trans-communic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)는 광범위한 투여 범위에 대해 유효하다. 예를 들어, 코무닉산(trans-communic acid) 및 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)의 1일 투여량은 통상적으로 약 1mg/kg 내지 2000㎎/kg, 바람직하게는 약 10mg/kg 내지 500mg/kg 범위이다. 그러나 실제적으로 투여되는 생리 활성 물질의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

또한 본 발명은 종래 솔잎의 성분으로 알려져 있지 않은 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산을 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산은 하기 기재된 방법에 의해 단리될 수 있다.

솔잎을 물 또는 저급 알콜로 추출하여 솔잎의 조추출물을 제조하는 단계;

상기 솔잎 조추출물을 헥산으로 추출하여 헥산 가용 분획물을 제조하는 단계; 및

상기 헥산 가용 분획물을 통상의 정제방법(역상 크로마토그라피, 실리카겔 크로마토그라피, 액체 크로마토그라피 등)을 이용하여 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산을 분리하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 솔잎 조추출물의 제조

솔잎은 충남 서천군 종천면에 소재하는 희리산 해송 자연휴양림에 있는 해송으로부터 채취한 것을 사용하였다. 완전히 건조된 솔잎 0.5kg을 건조 분쇄한 후 20L의 메탄올로 7일간 냉침하여 추출하고, 상기 추출원액을 여과 한 후 농축하여 솔잎 조추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 솔잎 헥산 가용 분획물의 제조

상기 실시예 1의 솔잎 조추출물을 80% 메탄올 100ml에 녹인 후 헥산 100ml로 3회 추출하고 그 상층액을 여과 증류하여 솔잎 헥산 가용 분획물을 수득하였다.

<실시예 3> 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산의 분리 및 정제

상기 헥산 가용 분획물을 실리카겔 컬럼크로마토그라피에 흡착시킨 후, 클로로포름(95%)과 메탄올(5%) 혼합액으로 용출시켜서 활성분획을 얻고, 이 활성분획을 농축한 후 다시 실리카겔 컬럼크로마토그라피에 흡착시켰다. 실리카겔에 흡착된 활성 성분을 클로로포름(100%) 및 클로로포름(70%)/에틸아세테이트(30%) 혼합액으로 용출시켜서 부분 정제된 활성물질을 얻었다. 부분 정제된 활성분획을 최종적으로 고성능 액체크로마토그라피를 이용하여 순수한 효소 저해제들을 분리하였다. 이때 고성능 액체크로마토그라피는 uBondapak C18 ODS(7.7×300mm, waters 사)를 사용하였다. 상기 클로로포름(100%) 활성분획을 메탄올(90%)/물(10%)부터 메탄올(100%)까지 순차적으로 용출하였다. 또한, 상기 클로로포름(70%)/에틸아세테이트(30%) 활성분획을 메탄올(90%)과 물(10%)의 혼합용액으로 용출시켰다. 최종적으로 클로로포름(100%)과 클로로포름(70%)/에틸아세테이트(30%) 활성분획으로부터 각각 단일물질들을 21mg, 38mg 얻었다. 클로로포름(100%) 활성분획으로부터 단리된 물질을 UV 흡광도(Shimadzu UV-265 spectrophotometer) 및 고성능 질량분석(Mariner mass spectrometry, Perseptive Biosystem)을 통하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기 공명(Varian 400MHz, Brucker 400MHz NMR)을 이용하여 ¹H, ¹³C, Cosy, HMQC, HMBC 스펙트럼을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석한 결과 상기 단일물질은 코무닉산(trans-communic acid)으로 확인되었다. 또한, 클로로포름(70%)/에틸아세테이트(30%) 활성분획으로부터 단리된 물질을 상기와 같은 방법으로 분석한 결과 디하이드로아비어틱산(dehydroabiatic acid)으로 확인되었다. 이들의 분석치들은 하기에 나타내었고, 스펙트럼 데이터 등으로부터 얻어진 이화학학 성질은 하기 표 1에 화학 구조식은 코무닉산은 화학식 1, 디하이드로아비어틱산은 화학식 2와 같이 나타났다.

코무닉산:

UV(MeOH) λmax 232 nm;

ESI-MS m/z 301.2 [M-H]+;

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 1.09, 1.86 (each 1H, m, H-1), 1.54, 1.89 (each 1H, m, H-2), 1.06, 2.14, (each 1H, m, H-3), 1.34 (1H, m, H-5), 1.96, 1.89 (each 1H, m, H-6), 2.39, 1.94 (each 1H, m, H-7), 2.40 (1H, m, H-9), 1.36, 1.89 (each 1H, m, H-11), 5.40 (1H, br s, H-12), 6.33 (1H, dd, H-14), 4.89 (1H, d, H-15), 5.05 (1H, d, H-15), 4.46 (1H, s, H-17), 4.86 (1H, d, H-17), 1.74 (3H, s, 16-CH ₃), 1.24 (3H, s, 18- CH ₃), 0.64 (3H, s, 20- CH ₃);

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃): δ 39.23 (C-1), 19.90 (C-2), 38.47 (C-3), 44.19 (C-4), 56.38 (C-5), 25.81 (C-6), 37.91 (C-7), 147.92 (C-8), 56.25 (C-9), 40.34 (C-10), 23.28 (C-11), 141.57 (C-12), 133.42 (C-13), 133.90 (C-14), 109.90 (C-15), 11.82 (16- CH₃), 107.63 (C-17), 29.03 (18- CH₃), 184.05 (19-COOH), 12.81 (20- CH₃).

디하이드로아비어틱산:

UV(MeOH) λmax 268, 276 nm;

ESI-MS m/z 299.5 [M-H]+;

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 1.49, 2.30 (each 1H, m, H-1), 1.70, 1.77 (each 1H, m, H-2), 1.80, 1.67 (each 1H, m, H-3), 2.24 (1H, d, H-5), 1.84, 1.52 (each 1H, m, H-6), 2.88 (2H, m, H-7), 7.17 (1H, d, H-11), 7.70 (1H, d, H-12), 6.88 (1H, brs d, H-14), 2.82 (1H, m, H-15), 1.23 (3H, s, 16-CH ₃), 1.21 (3H, s, 17-CH ₃), 1.25 (3H, s, 19-CH ₃), 1.21 (3H, s, 20-CH ₃);

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃): δ 37.97 (C-1), 18.65 (C-2), 36.77 (C-3), 44.48 (C-4), 44.65 (C-5), 21.81 (C-6), 30.93 (C-7), 134.61 (C-8), 146.71 (C-9), 36.90 (C-10), 124.03 (C-11), 123.77 (C-12), 145.54 (C-13), 126.80 (C-14), 33.51 (C-15), 24.05 (16,17-2CH₃), 184.75 (18-COOH), 16.37 (19- CH ₃), 25.20 (20- CH₃).

구 분	코무닉산	디하이드로아비어틱산
외형(appearance)	연한 노란색 oil	연한 노란색 oil
분자식	C₂₀H₃₀O₂	C₂₀H₂₈O₂
분자량	302	300
가용용매	메탄올, 헥산, 클로로포름
붕용용매	물

<실험예 1> 테스토스테론 5-알파 환원효소에 대한 저해 활성 실험

1. 실험재료 및 방법

테스토스테론 5-알파 환원효소는 수컷 스프라그-도울리(Sprague-Dawley) 쥐의 전립선으로부터 분리한 마이크로좀(microsome)을, 기질은 0.3 uM, 0.1 uCi의 [¹⁴C]-테스토스테론을 사용하였고, 시료물질은 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 솔잎 조추출물, 헥산 가용분획물, 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산을 사용하였다.

상기 기질에 2 uM NADPH가 포함된 125 mM Potasium phosphate buffer (pH 6.5) 및 시료 물질을 DMSO에 녹인 것 2.5 ul를 첨가하여 반응액을 제조하였다. 상기 반응액을 상기 테스토스테론 5-알파 환원효소원 하에서 37℃의 온도를 유지하며 1시간동안 반응시킨 후 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였다. 이후 원심 분리기를 통하여 수층과 에틸아세테이트층으로 분리하고, 이 중 생성물이 포함된 상층에서 용매를 증발시키고 다시 소량의 에틸아세테이트를 첨가하여 녹인 후 TLC를 실시하였다. 이 때 TLC 조건은 클로로포름: 디에틸에테르를 80:20로 하였다. TLC상에 나타나는 생성물인 디하이드로테스토스테론(Dehydrotestosterone) 및 반응물인 테스토스테론은 각각 iodine vapor와 UV를 통하여 확인한 후 정량적 분석을 위하여 Instaimager를 사용하여 autoradiogram을 실시하였고, 생성물과 반응물의 방사능량을 정량하여 하기식에 따라 테스토스테론 5-알파 환원효소의 활성 저해도를 추정하였다. 비교군(Control)은 반응액에 시료를 첨가하지 않았으며, 대조군(Blank)에는 시료와 NADPH를 첨가하지 않고 반응시켜 방사능을 측정하였다.

2. 실험 결과

테스토스테론 5-알파 환원효소 저해활성은 하기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 저해활성도(%)가 높을수록 그 효과가 우수한 것으로 솔잎 추출물 및 솔잎 추출물에서 단리된 생리활성물질들은 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해활성도(%)가 현저히 높은 것으로 확인되었다. 특히, 솔잎 조추출물 및 헥산 가용 분획물은 300μg/ml 농도에서 각각 50.5%, 84.5%로 저해활성을 나타냈으며, 단일물질인 코무닉산은 150 μg/ml 농도에서 86.3%, 디하이드로아비어틱산 또한 150 μg/ml 농도에서 85.4%로 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해활성도를 나타내었다. 상기 물질들은 테스토스테론 5-알파 환원효소를 현저히 억제하므로 이 효소가 활성화됨으로서 나타나는 남성형 탈모 또는 전립선 비대증 등의 증상을 예방 및 치료하기 위하여 유용하게 이용될 수 있다.

5-알파 환원효소 저해활성도(%)
농도( μg/ml)	솔잎 조추출물	솔잎 헥산 가용분획물
300	50.5	84.5

5-알파 환원효소 저해활성도(%)
농도( μg/ml)	코무닉산	디하이드로아비어틱산
150	86.3	85.4
75	63.6	68.3
37.5	20.5	12.4
18.75	6.8	2.4

또한 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해물질로 분리한 코무닉산 과 디하이드로아비어틱산의 효소 저해 활성을 측정한 결과 IC₅₀ 값은 각각 63.4 μg/ml, 63.0 μg/ml 로 아주 적은 농도로도 상기 효소의 활성을 억제함을 확인하였으며, 상기 생리활성물질들은 우수한 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해 활성을 가짐을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 솔잎 추출물 또는 이로부터 단리되는 코무닉산 및 디하이드로아비어틱산의 신규한 용도인 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해제에 관한 것으로서, 본 발명은 상기 생리활성물질을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 테스토스테론 5-알파 환원효소의 저해 활성에 의한 탈모, 여드름, 전립선비대증 등의 증상을 예방 및 치료하기 위해 유용하게 이용될 수 있다.

도 1 은 코무닉산의 MASS Spectroscopy를 나타낸 그래프이다.

도 2 는 코무닉산의 ¹H-NMR Spectroscopy를 나타낸 그래프이다.

도 3 은 디하이드로아비어틱산의 MASS Spectroscopy를 나타낸 그래프이다.

도 4 는 디하이드로아비어틱산의 ¹H-NMR Spectroscopy를 나타낸 그래프이다.

Claims

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다음의 단계를 거쳐 수득하는 분획물을 유효성분으로 함유하는 테스토스테론 5-알파 환원효소 저해 활성을 갖는 탈모 방지, 여드름 또는 전립선 비대증 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 솔잎에 메탄올을 첨가하여 추출물을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 수득한 추출물에 헥산을 첨가하여 헥산 가용 분획물을 수득하는 단계.
제 3 항에 있어서, 상기 솔잎은 해송(Pinus thunbergii)으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 탈모 방지, 여드름 또는 전립선 비대증 예방 또는 치료용 조성물.
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테스토스테론 5-알파 환원효소 저해 활성을 갖는 트랜스-코무닉산(trans-communic acid) 또는 디하이드로아비어틱산(dehydroabietic acid)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지, 여드름 또는 전립선 비대증 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제 6 항에 있어서, 상기 유효성분은 해송(Pinus thunbergii)으로부터 유래하는 솔잎으로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 탈모 방지, 여드름 또는 전립선 비대증 예방 또는 치료용 조성물.
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