상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 붓꽃추출물 및 붓꽃으로부터 단리된 신규 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 5-알파 환원효소 저해제 및 탈모증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 붓꽃추출물 및 붓꽃으로부터 단리된 신규 생리활성 물질은 5-알파 환원효소 저해작용을 갖는다.
또한, 본 발명은 붓꽃으로부터 단리된 신규 생리활성 물질 및 이의 제조방법을 제공한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 붓꽃추출물은 붓꽃에 물 또는 저급 알코올을 첨가하여 추출된 붓꽃 조추출물, 상기 붓꽃 조추출물에 핵산, 클로로포름, 부탄올 등의 유기용매와 물을 사용하여 순차적으로 분획 추출한 분획추출물들 및 실리카겔 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 등으로 정제한 추출물도 포함한다.
본 발명의 신규 생리활성 물질은 붓꽃을 저급 알코올로 추출하여 얻어진 붓꽃 조추출물을 헥산을 이용하여 수가용성 분획추출물을 제조하고, 이를 다시 클로로포름으로 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 제조하며, 상기 클로로포름 가용 분획추출물을 ODS flash 컬럼에서 100% 수용성 메탄올로 용출하여 분획추출물을 제조하고, 이 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 분획추출물을 제 조하며, 이 분획추출물을 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 단리함으로서 제조된다.
상기 단리된 물질은 하기 <화학식>의 화학구조를 갖는, 3-((Z)-헵타덱-9-에닐)-2-하이드록시-5-메톡시싸이클로헥사-2.5-디엔-1.4-디온 화합물[분자량 : 390, 3-((Z)-heptadec-9-enyl)-2-hydroxy-5-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione]임을 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 확인하였다. 이하 본 발명에 따른 신규 생리활성물질을 '이소팔라손 C(isopallason C)'라고 명명한다.
<화학식>
5-알파 환원효소는 피지선, 모낭, 전립선 등 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하며 정소에서 생합성 되는 남성 호르몬인 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron; DHT)으로 전환시키는 데 관여하는 생체 촉매이다. 사춘기 이후 과량 분비된 디하이드로테스토스테론은 피지세포(sebocyte)에서 피지를 과잉 생성하는 주원인 물질로 작용하여 여드름 및 남성형 탈모를 유발한다(Metcalf BW et al., Trends Pharmacol Sci. 1989 Dec;10(12):491-5. Review). 더욱 상세하게는 여러 모낭 세포에서 테스토스테론에 비하여 디하이드로테스토스테론이 호르몬 수용체에 더욱 잘 결합하기 때문에 탈모를 일으키는 원인을 제공한다. 그러므로 5-알파 환원효소의 활성을 저해함으로서 디하이드로테스토스테론의 생성을 저해하여 탈모를 방지할 수 있다(Winson JD., J Biol Chem., 1975 May 10;250(9):3498-504). 또한, 5-알파 환원효소의 활성 저해효과를 이용하여 남성형 탈모 방지 이외에도 전림선 암, 전립선 비대증 등 디하이드로테스토스테론의 생성을 저해함으로서 관여되는 각종 질환의 치료에도 이용할 수 있다.
본 발명은 붓꽃의 각 추출물 및 이소팔라손 C의 5-알파 환원효소 작용의 저해 효과 실험을 한 결과 효소의 활성 저해 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 붓꽃추출물 및 이로부터 단리된 신규생리활성물질인 이소팔라손 C는 5-알파 환원효소의 활성을 저해함으로서 관련되는 증상, 탈모증, 전림선 암, 전립선 비대증 등을 예방 또는 치료하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
특히 상기 디하이드로테스토스테론의 생성을 저해함으로서 관여되는 증상 중 탈모증에 본 발명의 붓꽃추출물 및 이소팔라손 C의 효과를 검증하기 위해, 실험을 통해 탈모 모델을 제작하고 이를 이용한 동물 실험 및 시험관내 시험을 행하였다. 탈모 모델은 디하이드로테스토스테론의 농도를 달리하여 탈모를 유발하고 육안으로 관찰하였을 뿐 아니라 모발 성장 관련 사이토카인 IGF-1 (Insunlin-like Growth Factor-1) 및 모발 탈락 관련 사이토카인 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 유전자의 발현 정도를 확인함으로서 디하이드로테스토스테론의 적정농도를 대략 20mg/kg b.w. 설정하여 제작되었다.
IGF-1은 피부의 중간엽 세포에서 많이 발현하는 세포의 증식과 분화의 조절인자로써 모발 성장의 주요역할을 하며, TGF-β는 생체에서 세포자멸을 유발함으로써 모낭의 퇴행기를 유도한다. 예로써 TGF-β가 과잉 발현되는 마우스 모델을 모발의 휴지기에서 성장기로의 재 진입이 되지 않아서 결국 탈모가 일어나게 된다(Controls of Hair Follicle Cycling. Physological reviews 81: 449-494. 2001)
본 발명은 상기에서 제작된 탈모 모델을 이용하여 이소팔라손 C의 탈모증 효과에 관한 동물실험 및 시험관내 시험을 하였으며, 그 결과 시험관내 시험에서 상기 이소팔라손 C에 의해 IGF-1이 TGF-β에 비하여 2배 이상 발현되어 모발 탈락 보다 모발 성장에 더 영향을 미칠 것으로 판단되며, 실제 육안관찰에서도 동일한 결론을 도출함으로서 이소팔라손 C 및 이를 포함하는 붓꽃추출물이 탈모증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등과 혼합하여 붓꽃추출물 또는 이소팔라손 C를 함유하는 탈모방지용 약학적 조성물 및 5-알파 환원효소 활성 저해제를 제조할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 등의 경구투여용 제제나 통상의 방법으로 주사용 증류수에 용해하여 주사제로 또는 에어로졸, 로션, 크림 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 탈모방지용 약학적 조성물 및 5-알파 환원효소 활성 저해제는 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 생리활성물질인 이소팔라손 C는 성인 기준으로 약 0.001mg 내지 10㎎/kg, 바람직하게는 약 0.8mg/kg 내지 1.2mg/kg 범위내에서 투여될 수 있다. 그러나 실제적으로 투여되는 생리활성물질의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 붓꽃 조추출물의 제조
붓꽃 종자를 건조 후 분쇄하여 분말화 한 후 메탄올로 7일간 냉침하여 추출하였다. 상기 추출원액을 여과 한 후 농축하여 붓꽃 조추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 붓꽃 핵산 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 1의 붓꽃 조추출물을 80% 메탄올 100ml에 녹인 후 핵산 100ml로 3회 추출하고 그 상층액을 여과 증류하여 붓꽃 핵산 가용 분획추출물을 수득하였다.
<실시예 3> 붓꽃 클로로포름 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물을 80% 메탄올에 녹여서 감압 농축한 후 수층을 100ml 클로로포름에 3회 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 얻었다.
<실시예 4> 붓꽃 부탄올 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물을 100ml 부탄올로 3회 추출하고 그것의 상층에서 부탄올 가용 분획추출물을 얻었다.
<실시예 5> 이소팔라손 C의 제조
상기 실시예 3에서 얻은 클로로포름 분획추출물을 ODS flash 컬럼에서 80% 수용성 메탄올을 첨가하여 분획추출물을 얻었다. 상기 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 3개의 분획추출물로 나누고 2번째 분획추출물을 다시 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 신규 활성성분물질을 단리하였다. 상기 신규한 활성물질에 대한 구조를 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 3-((Z)-heptadec-9-enyl)-2-hydroxy-5-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(분자량 : MW 390)인 화합물임을 확인하였으며, 이하 상기 생리활성물질을 '이소팔라손 C' 라 하였다.
1H-NMR 및 13C-NMR 값은 하기와 같고, 1H-NMR, IR, 13C-NMR, UV spectroscopy를 나타낸 그래프는 각각 도 1 내지 도 4에 도시되어 있는 것과 같다.
1H-NMR (600 MHz, CDCl3, δ=ppm): 5.83 (H, s, H-6), 3.85 (3H, s, -OCH3), 2.43 (2H, t, 7.8 Hz, H-1'), 1.44 (2H, m, 2'), 1.21-1.35 (20H, m, H-3', 4', 5', 6' 7', 12', 13', 14', 15', 16'), 2.00 (2H, brs, H-8'), 5.33 (2H, m, H-9', 10'), 2.00 (2H, brs, H-11'), 0.86 (3H, t, 6.6 Hz, H-17').
13C-NMR (150 MHz, CDCl3, δ=ppm): 182.8 (C-1), 151.5 (C-2), 119.3 (C-3), 181.6 (C-4), 161.1 (C-5), 102.1 (C-6), 56.7 (2-OCH3), 22.6 (C-1'), 27.9 (C-2'), 28.9-31.7 (C-3', 4', 5', 6', 7'), 27.2 (C-8'), 129.8 (C-9', 10'), 27.2 (C-11'), 28.9-31.7 (C-12', 13', 14', 15'), 31.8 (C-16'), 14.0 (C-17').
상기 결과에 따라 이소팔라손 C의 화학구조는 아래와 같다.
<실험예 1> 5-알파 환원효소에 대한 저해 활성 실험
가. 붓꽃의 용매 분획추출물에 따른 저해 활성 실험
(1) 실험방법
기질은 방사능이 표지된 0.3 uM, 0.1 uCi의 [14C]-테스토스테론(testosterone)을 사용하였고, 반응액은 상기 기질에 2 uM NADPH가 포함된 125 mM Potasium phosphate buffer (pH 6.5)와, 시료 물질로 상기 실시예 2, 3, 4에서 얻은 핵산 가용 분획추출물, 클로로포름 가용 분획추출물, 부탄올 가용 분획추출물을 DMSO에 녹인 것 2.5 ul를 첨가하였다. 상기 반응액을 수컷 스프라그-도울리(Sprague-Dawley) 쥐의 전립선에서 분리한 마이크로좀(microsome)을 효소원으로 하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하였다. 이후 원심 분리기를 통하여 수층과 에틸아세테이트층으로 분리하고, 이 중 반응 생성물이 포함된 상층에서 용매를 증발시키고 다시 소량의 에틸아세테이트를 첨가하여 녹인 후 TLC를 실시하였다. 이 때 TLC 조건은 클로로포름: 디에틸에트르를 80:20로 하였다. TLC상에 나타나는 생성물인 디하이드로테스토스테론(Dehydrotestosterone) 및 반응물인 테스토스테론은 각각 iodine vapor와 UV를 통하여 확인한 후 정량적 분석을 위하여 Instaimager를 사용하여 autoradiogram을 실시하였고, 생성물과 반응물의 방사능량을 정량하여 5-알파 환원효소의 활성 저해도를 추정하였다.
실험결과는 대조군으로서 5-알파 환원효소 저해제를 첨가하지 않고 반응시켰을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 100%로 하고, 대조군에 비해 5-알파 환원효소 저해제로서 실시예 2, 3, 4를 첨가하였을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 퍼센트로 나타내었다. 그러므로 대조군에 비해 퍼센트 값이 낮을수록 각 용매에 따른 붓꽃추출물이 테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론으로 반응의 생체 촉매로 작용하는 5-알파 환원효소의 활성 저해작용이 우수함을 알 수 있다.
(2) 실험결과
각 용매에 따른 분획추출물의 5-알파 환원효소의 활성 저해 효과는 하기의 표와 같다. 표 1에 따르면 실시예 2에서 제조된 핵산 가용 분획추출물, 실시예 4에서 제조된 부탄올 가용 분획추출물에서 5-알파 환원효소의 활성 저해효과를 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 3에서 제조된 클로로포름 가용 분획추출물이 5-알파 환원효소의 활성 저해 효과가 가장 뛰어남을 확인 할 수 있었다.
|
% of control |
대조군 |
100 |
실시예 2 |
16.2 |
실시예 3 |
15.0 |
실시예 4 |
16.5 |
나. 클로로포름층 분획물에 따른 저해 활성 실험
(1) 실험방법
상기 가.의 실험 방법과 같으나, 시료 물질은 상기 실시예 3에서 제조된 클로로포름 가용 분획추출물을 ODS flash 컬럼에서 60%, 80%, 90%, 100% 수용성 메탄올을 첨가하여 분획추출물들(각각 제조예 1, 2, 3, 4라 한다)을 얻었다. 상기 분획추출물들의 5-알파 환원효소 활성 저해 효과를 확인하였다. 양성 대조군으로는 현재 탈모 방지제 및 전립선 비대증 치료제로 시판되고 있는 물질인 피나스테라이드를 사용하였다.
실험결과는 대조군으로서 5-알파 환원효소 저해제를 첨가하지 않고 반응시켰을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 100%로 하고, 대조군에 비해 5-알파 환원효소 저해제로서 제조예 1, 2, 3, 4,를 첨가하였을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 퍼센트로 나타내었다. 그러므로 대조군에 비해 퍼센트 값이 낮을수록 각 붓꽃 분획추출물들이 테스토스테론(testosterone)에서 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron)으로 반응의 생체 촉매로 작용하는 5-알파 환원효소의 활성 저해작용이 우수함을 알 수 있다.
(2) 실험결과
표 2 에 따르면 각각 제조예 2, ,3, 4인 80%, 90%, 100% 수용성 메탄올로 용출한 분획추출물에서 5-알파 환원효소의 활성 저해효과를 확인 할 수 있었으며, 특히 제조예 2 및 4인 80%, 100% 수용성 메탄올로 용출한 분획추출물이 5-알파 환원효소의 활성 저해 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
시료명 |
% of control |
대조군 |
100 |
양성대조군 |
10 |
제조예 1 |
78 |
제조예 2 |
14 |
제조예 3 |
17 |
제조예 4 |
14 |
다. 이소팔라손 C의 저해 활성 실험
(1) 실험방법
상기 가. 의 실험 방법과 같으나, 실험결과는 대조군으로서 5-알파 환원효소 저해제를 첨가하지 않고 반응시켰을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 100%로 하고, 대조군에 비해 5-알파 환원효소 저해제로서 상기 실시예 5에서 제조된 신규 생리활성물질인 이소팔라손 C를 농도를 달리하여 첨가하였을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 퍼센트로 나타내었다. 양성 대조군으로는 현재 탈모 방지제 및 전립선 비대증 치료제로 시판되고 있는 물질인 피나스테라이드를 사용하였고, 양성 대조군 또한 대조군의 5-알파 환원효소 저해작용을 100%로 하여 피나스테라이드 농도를 달리하여 첨가하였을 때 반응물과 생성물의 정량비율을 퍼센트로 나타내었다. 그러므로 대조군에 비해 퍼센트 값이 낮을수록 이소팔라손 C의 테스토스테론(testosterone)에서 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron)으로 반응의 생체 촉매로 작용하는 5-알파 환원효소의 활성 저해작용이 우수함을 알 수 있다.
(2) 실험결과
표 3에 따르면 이소팔라손 C는 5-알파 환원효소의 활성 저해 효과가 있었으며, 특히 645uM의 농도에서는 양성 대조군인 피나스테라이드를 13.4nM 투여한 군과 유사한 효과가 나타남을 알 수 있었다. 그러므로 이소팔라손 C는 천연물인 붓꽃으로부터 추출한 생리활성물질로서 양성대조군인 피나스테라이드 보다 부작용이 적고 경제적인 생리활성물질로서 우수한 5-알파 환원효소 저해 효과를 나타내었다.
양성대조군 |
이소팔라손 C |
농도(nM) |
저해 활성 |
농도 (uM) |
저해 활성 |
대조군 |
100.0% |
대조군 |
100.0% |
0.0134 |
83.0% |
0.645 |
103.8% |
0.134 |
30.4% |
6.45 |
59.7% |
1.34 |
12.8% |
64.5 |
24.4% |
13.4 |
10.3% |
645 |
10.2% |
<실험예 2> 탈모증 효과 실험
가. 실험모델 제작
(1) 실험방법
탈모유발 실험동물을 제작하기 위하여 시약은 폴리에틸렌글리콜3350 15g 및 폴리에틸렌글리콜400 85g을 수조상에서 65℃로 가온하여 녹인 후 탈모유발 물질인 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron; DHT) 1.25mg/kg b.w. 20mg/kg b.w. 125mg/kg b.w.를 넣어 잘 섞어 15% 폴리에틸렌글리콜(poly ethylen glycol: PEG) 연고제제를 제조하였다. 실험동물은 C57BL/6 마우스(25±5g, female, n=6)를 사용하였으며 등 부위를 미리 제모하고 상기 연고제제를 15일간 도포하였다. 도포 후 육안으로 관찰하여 모발의 성장을 확인함으로서 디하이드로테스토스테론의 탈모 유발 정도를 알아보았다. 또한, 마지막으로 도포 한 날로부터 2주 및 3주 후 피부를 절취하여 cDNA로 제작하고 Real time PCR을 실시하여 모발 성장기 관련 사이토카인 IGF-1 및 모발 탈락기 관련 사이토카인 TGF-β에 대한 유전자 발현 양상을 확인하였다. 대조군으로는 디하이드테스토스테론은 함유하지 않고 10% 폴리에틸렌글리콜을 함유하는 연고제제를 도포한 실험동물을 사용하였다. 대조군과 시험군에서의 유전자 발현차이를 확인하기 위하여 mouse 8.0K cDNA chip을 이용하였다.
(2) 실험결과
연고제제를 도포하고 15일 후 대조군과 시험군을 육안으로 관찰한 결과 제모를 하고 폴리에틸렌글리콜이 함유된 연고제제만을 도포한 대조군(도 5A)에 대해 디하이드로테스토스테론 1.25mg/kg b.w. 처리군(도 5B), 20mg/kg b.w. 처리군(도 5C), 125mg/kg b.w. 처리군(도 5D)에서 농도가 증가할수록 탈모 증상이 심화됨을 확인할 수 있었다.
또한, 모발 성장기 관련 사이토카인 IGF-1 및 모발 탈락기 관련 사이토카인 TGF-β에 대한 유전자 양상은, 연고제제를 도포한 대조군의 발현율을 기준으로 하여 IGF-1의 발현이 점차 저하되어 디하이드로테스토스테론 20mg/kg b.w. 처리군 에서는 대조군의 50% 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, TGF-β의 발현량은 IGF-1과 비교하면 DHT 1.25 mg/kg b.w. 처리군은 약 1.5배 적게 발현되었으나, 20 mg/kg b.w. 처리군은 약 1.1배, 125mg/kg b.w. 처리군은 약 5배 이상 많이 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
따라서 디하이드로테스토스테론 대략 20mg/kg b.w. 이상에서 모발 성장기 관련 사이토카인 IGF-1 보다 모발 탈락기 관련 사이토카인 TGF-β가 더 많이 발현함으로서 탈모를 유발할 수 있다. 그러나 그 농도가 125mg/kg b.w.에서는 도 5D 에 나타난 바와 같이 처음 제모한 상태 그대로 존재하여 이는 디하이드로테스토스테론의 농도 과다로 인해 기초 대사에 이상이 발생한 것으로 판단되므로, 탈모를 유발하기 위해서는 디하이드로테스토스테론의 농도를 20mg/kg b.w.로 처리할 수 있다.
나. 이소팔라손 C의 탈모증 효과 시험
(1) 실험방법
탈모 유발은 상기 가. 항목에서 제작된 탈모 모델을 이용하였다. 따라서 미리 제모된 실험동물에 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron; DHT) 20mg/kg b.w. 및 이소팔라손 C 20mg/kg b.w.를 에탄올 80% 및 글리콜 20% 혼합된 용매에 녹여 제조된 스프레이 제제를 21일 동안 도포하여 모발의 성장 정도를 관찰하였다. 모발 성장기 관련 사이토카인 IGF-1 및 모발 탈락기 관련 사이토카인 TGF-β에 대한 유전자 발현 양상은 상기 가. 탈모 모델의 제작에서 실시한 방법과 동일하게 하였다. 대조군으로는 이소팔라손 C를 처리하지 않은 실험동물을 이용하였다.
(2) 실험결과
대조군에서는 모발이 거의 성장하지 않았으나 이소팔라손 C가 같이 포함되어 있는 스프레이 제제를 도포한 시험군에서는 정상적으로 모발이 성장하였다(도 7) 유전자 발현을 비교해보면, 대조군은 TGF-β가 IGF-1에 비하여 2.5배 많이 발현 되었으며, 시험군은 반대로 IGF-1이 TGF-β에 비하여 2배 많이 발현되어 디하이드로테스토스테론에 의해 탈모를 유발함에도 이소팔라손 C가 탈모를 방지함을 알 수 있다(도 8).
다. 이소팔라손 C의 농도에 따른 탈모증 효과 시험
(1) 실험방법
이소팔라손 C의 농도에 따른 탈모 효과를 알아보기 위해 이소팔라손 C의 농도를 20mg/kg b.w. 10mg/kg b.w. 1mg/kg b.w. 으로 달리하여 상기 나. 이소팔라손 C의 탈모증에 관한 효과시험과 동일한 방법으로 실험을 행하여 육안으로 실험동물의 모발 성장 정도를 관찰하였다. 정상군으로는 제모 후 어떤 처리도 하지 않은 실험동물을 사용하였고, 대조군으로는 제모 후 디하이드로테스토스테론 20mg/kg b.w.을 처리한 실험동물을 사용하였다.
(2) 실험결과
이소팔라손 C 1mg/kg b.w.을 처리한 시험군은 모발이 거의 성장하지 않아 탈모 방지 효과가 미약하였다(도 9C). 그러나 이소팔라손 C 10 mg/kg b.w.을 처리한 시험군에서는 대조군(도 9D)보다도 모발 성장 정도가 우수하여 탈모 방지효과가 나타나기 시작함을 알 수 있다(도 9B). 이소팔라손 C의 농도를 증가시켜 20mg/kg b.w. 일 때는 정상군(도 9E)과 유사하게 모발이 성장하여 탈모 방지 효과가 현저함을 확인하였다(도 9A).