상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 긴잎모시풀추출물 및 긴잎모시풀로부터 단리된 신규 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 TGF beta생합성 저해제 및 탈모증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 긴잎모시풀추출물 및 긴잎모시풀추출물로부터 단리된 신규 생리활성 물질은 TGF beta생합성 저해작용을 갖는다.
또한, 본 발명은 긴잎모시풀로부터 단리된 신규 생리활성 물질 및 이의 제조방법을 제공한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 긴잎모시풀추출물은 긴잎모시풀(전초)에 물 또는 저급 알코올을 첨가하여 추출된 긴잎모시풀추출물, 상기 긴잎모시풀추출물에 핵산, 클로로포름, 부탄올 등의 유기용매와 물을 사용하여 순차적으로 분획 추출한 분획추출물들 및 실리카겔 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 등으로 정제한 추출물도 포함한다.
본 발명의 신규 생리활성 물질은 긴잎모시풀을 저급 알코올로 추출하여 얻어진 긴잎모시풀추출물을 헥산을 이용하여 수가용성 분획추출물을 제조하고, 이를 다시 클로로포름으로 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 제조하며, 상기 클로로포름 가용분획추출물을 ODS flash 컬럼에서 100% 수용성 메탄올로 용출하여 분획추출물을 제조하고, 이 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 분획추출물을 제조하며, 이 분획추출물을 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 단리함으로서 제조된다.
상기 단리된 물질은 하기 <화학식>의 화학구조를 갖는, 5,7-디하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-4-벤조피론 화합물[분자량:270.24, 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-benzopyrone]임을 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 확인하였다. 이하 본 발명에 따른 신규 생리활성물질을 '아피제닌(Apigenin)'이라고 명명한다.
TGF-β는 생체에서 세포자멸(apoptosis)을 유발함으로써 모낭의 퇴행기를 유도한다. 예로써 TGF-β가 과잉 발현되는 마우스 모델을 모발의 휴지기에서 성장기로의 재 진입이 되지 않아서 결국 탈모가 일어나게 된다(Controls of Hair Follicle Cycling. Physological reviews 8:449-494. 2001). 5-알파 환원효소가 활성화될 경우, 디하이드로테스토스테론의 합성이 증가된다. 이로인해 하위 신호전달물질인 TGF beta생합성이 촉진되어 탈모현상을 촉진시킨다고 알려져 있다.
본 발명은 긴잎모시풀의 각 추출물 및 아피게닌의 TGF beta생합성의 저해 효과 실험을 한 결과, 저해 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 긴잎모시풀 및 이로부터 단리된 신규생리활성물질인 아피게닌은 TGF beta생합성을 저해함으로서 탈모증 예방 또는 치료하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
탈모증에 본 발명의 긴잎모시풀추출물 및 아피게닌의 효과를 검증하기 위해, 탈모 모델을 이용한 동물 실험 및 시험관내 시험을 행하였다. 탈모 모델은 디하이드로테스토스테론를 처리하여 TGF beta생합성을 촉진하고, 이로 인해 발생하는 탈모현상을 육안으로 관찰하였다.
본 발명은 긴잎모시풀추출물과 아피게닌의 탈모증 효과에 관한 동물실험 및 시험관내 시험을 하였으며, 그 결과 시험관내 시험에서 상기 긴잎모시풀추출물과 아피게닌에 의해 TGF-β의 발현이 현저히 감소되어 모발 탈락 보다 모발 성장에 더 영향을 미칠 것으로 판단되며, 실제 육안관찰에서도 동일한 결론을 도출함으로서 아피게닌 및 이를 포함하는 긴잎모시풀추출물이 탈모증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등과 혼합하여 긴잎모시풀추출물 또는 아피게닌을 함유하는 탈모방지용 약학적 조성물 및 5-알파 환원효소 활성 저해제를 제조할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 등의 경구투여용 제제나 통상의 방법으로 주사용 증류수에 용해하여 주사제로 또는 에어로졸, 로션, 크림 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 탈모방지용 약학적 조성물 및 5-알파 환원효소 활성 저해제는 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 생리활성물질인 아피게닌는 성인 기준으로 약 0.001mg 내지 10㎎/kg, 바람직하게는 약 0.8mg/kg 내지 1.2mg/kg 범위내에서 투여될 수 있다. 그러나 실제적으로 투여되는 생리활성물질의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 긴잎모시풀추출물의 제조
긴잎모시풀 전초를 건조 후 분쇄하여 분말화 한 후 에탄올로 7일간 냉침하여 추출하였다. 상기 추출원액을 여과 한 후 농축하여 긴잎모시풀추출물을 제조하였다.
[실시예 2] 긴잎모시풀 핵산 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 1의 긴잎모시풀추출물을 80% 메탄올 100ml에 녹인 후 핵산 100ml로 5회 추출하고 그 상층액을 여과 증류하여 긴잎모시풀 핵산 가용 분획추출물을 수득하였다.
[실시예 3] 긴잎모시풀 클로로포름 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물을 80% 에탄올에 녹여서 감압 농축한 후 수층을 100ml 클로로포름에 5회 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 얻었다.
[실시예 4] 아피게닌의 분리
상기 실시예 3에서 얻은 클로로포름 분획추출물을 ODS flash 컬럼에서 80% 수용성 에탄올을 첨가하여 분획추출물을 얻었다. 상기 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 4개의 분획추출물로 나누고 2번째 분획추출물을 다시 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 신규 활성성분물질을 단리하였다. 상기 신규한 활성물질에 대한 구조를 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-benzopyrone(분자량 : MW 270.24)인 화합물임을 확인하였으며, 이하 상기 생리활성물질을 '아피게닌'이라 하였다.
상기 결과에 따라 아피게닌의 화학구조는 아래와 같다.
[실시예 5] 용매분획추출물 및 아피게닌의 TGF beta 프로모터에 대한 활성 저해 실험
Human hair follicle cell(인간 모발세포)의 적당 수를 24 well plate에 각각 분주하여 16시간 배양하였다. 분주한 Human hair follicle cell에 TGF-β1 promoter plasmid를 transient transfection(형질전환)한 후, 24시간 배양하였다. 형질전환 된 Human hair follicle 세포에 시험물질을 각 농도별로 처리한 후 24시간 incubation한 후, 시료를 처리한 배양액 50ul씩을 96well plate에 분주하였다. 1X Substrate(기질)/Reaction buffer(반응액) 5ul를 각 샘플에 첨가한 뒤 루미노미터 Luminometer(Berthold, Germany)를 이용하여 assay를 수행하였다 (참고: Planta medica 2005; 71:338-343). 각 시료의 처리 농도는 10 ug/ml이었다. 표 1에 제시된 것과 같이, 긴잎모시풀의 용매추출물(에탄올, 핵산, 클로로포름)과 아피게닌 모두 TGF beta 1의 프로모터 활성을 억제하였고 아피게닌의 효능이 가장 우수함을 알 수 있었다. 억제효능 순서는 하기와 같았다.
[에탄올추출물<핵산추출물<클로로포름추출물<
아피게닌
]
TGF beta 1프로모터에 대한 저해효과
종류 |
TGF beta1 프로모터 활성정도(%) |
무처리군(음성대조군) |
100 |
실시예1 (에탄올추출물)(10ug/ml) |
75.4 |
실시예2 (핵산추출물)(10ug/ml) |
64.6 |
실시예3 (클로로포름추출물)(10ug/ml) |
52.3 |
실시예4(아피게닌) (10ug/ml) |
32.7 |
[실시예 6] 용매분획추출물 및 아피게닌의 TGF beta 생산에 대한 저해 실험
Human hair follicle cell(인간모발세포)를 24 well plate에 일정한 수로 분주한 후 24시간 배양한 후, 배양액을 serum-free 배양액으로 교체한 뒤 16시간 배양하였다. 각각의 well에 시험물질을 농도별로 처리한 후 48시간동안 다시 배양하고, 48시간 후 세포배지를 수집하였다. 수집한 sample을 1:10의 비율로 assay buffer를 이용해 희석한 후, 희석한 sample 200ul에 1N HCl 20ul를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 1N NaOH 20ul로 중화시켰다. 준비해 놓은 sample 100ul를 TGF-beta1 항체로 코팅된 microplate의 각 well에 넣고 각 well에 assay buffer를 이용해 1:100의 비율로 희석한 HRP-conjugate 50ul를 첨가한 뒤 실온에서 4시간 동안 incubation하였다. 4시간 후, wash buffer 300ul로 3회 세척한 후, 기질용액(TMB) 100ul를 각 well에 첨가한 후, 실온에서 10분간 incubation하였다. Stop solution 100ul를 각 well에 첨가하여 잘 섞은 후, 450nm에서 ELISA reader로 detection하였다. 시료의 처리농도는 10ug/ml이었다. 표 2의 결과를 보듯이 TGF beta 1 프로모터 활성실험과 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 긴잎모시풀의 용매분획추출물보다 아피게닌이 가장 우수한 TGF beta1 생산 억제효과를 나타내었고, 용매분획추출물중에서는 클로로포름추출물, 핵산추출물, 에탄올추출물의 순서로 효능이 좋았다. 이러한 결과는 통해서 긴잎모시풀추출물과 아피게닌이 TGF beta 1 발현을 억제함으로써 육모효능을 나타낼 수 있음을 제시하고 있다.
TGF beta 1 생산에 대한 억제효과
종류 |
TGF beta1 함량(%) |
무처리군(음성대조군) |
100 |
실시예1 (에탄올추출물)(10ug/ml) |
85.2 |
실시예2 (핵산추출물)(10ug/ml) |
77.4 |
실시예3 (클로로포름추출물)(10ug/ml) |
61.1 |
실시예4(아피게닌) (10ug/ml) |
44.2 |
[실시예 7] 용매분획추출물 및 아피게닌의 육모효과
실험동물에서의 탈모를 유발하기위해, 유발물질로 dihydrotestosteron(DHT, 20mg/kg b.w.)을 사용하였다. 실험동물은 C57BL/6 마우스(25±5g, female, n=6)를 사용하였으며 등 부위를 미리 제모하고, 제모된 실험동물에 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron; DHT;20mg/kg b.w.), 긴잎모시풀 에탄올분획추출물(20mg/kg b.w.), 긴잎모시풀 핵산추출물(20mg/kg b.w.), 긴잎모시풀 클로로포름추출물(20mg/kg b.w.) 및 아피게닌(20mg/kg b.w.)를 에탄올 80% 및 글리콜 20% 혼합된 용매에 녹여 제조된 스프레이 제제를 18일 동안 도포하여 모발의 성장 정도를 관찰하였다. 대조군으로는 아피게닌을 처리하지 않은 실험동물을 이용하였다.
도 1에서 보듯이, 대조군에서는 모발이 거의 성장하지 않았으나 아피게닌 및 긴잎모시풀추출물을 함유한 스프레이 제제를 도포한 시험군 모두에서 모발이 성장하였다. 또한 긴잎모시풀의 분획추출물(에탄올, 핵산, 클로로포름)에서보다 아피게닌을 처리한 시험군에서 모발성장속도가 가장 높음을 알 수 있었다. 상기의 결과를 통해 긴잎모시풀 및 이의 유효성분인 아피게닌을 TGF beta1 발현을 억제함으로써 탈모을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 8] 긴잎모시풀의 용매분획추출물과 아피게닌의 사람 피부에 대한 안전성 확인 실험
긴잎모시풀의 용매분획추출물 (에탄올, 핵산, 클로로포름)과 아피게닌이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 시험방법으로는 피부누적자극시험을 실시하였다.
스쿠알렌을 베이스로 긴잎모시풀의 에탄올추출물, 핵산추출물, 클로로포름추출물, 아피게닌 을 첨가한 제형을 제조하고, 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하는 것에 의하여 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.
첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15ul씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 공식을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
평균반응도=[[반응지수x 반응도/ 총피검자수 x 최고점수 (4점)] x 100 ] ÷ 검사회수 (9회)
이 때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.
시험물질 |
반응이 나타난 피검자 수 |
평균반응도 |
1주 |
2주 |
3주 |
1차 |
2차 |
3차 |
4차 |
5차 |
6차 |
7차 |
8차 |
9차 |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
± + ++ |
대조군(스쿠알렌) |
2 - - |
0 - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
0.18 |
긴잎모시풀 에탄올(1.0%) |
0 - - |
0 - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
0.00 |
긴잎모시풀 핵산추출물(1.0%) |
0 - - |
0 - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
0.00 |
긴잎모시풀 클로로포름추출물(1.0%) |
2 - - |
0 - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
0.18 |
아피게닌(1.0%) |
2 - - |
0 - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
- - - |
0.18 |
피검인원 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
|
상기 표 3에서 시험군 모두 ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명, 2명, 2명이고, 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.18, 0.18이었다. 그러므로 평균반응도가 3이하의 반응도를 나타내므로, 긴잎모시풀의 분획추출물 및 아피게닌은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.