KR100849232B1

KR100849232B1 - 혈전용해 증강 기능성 발효물 및 그 발효방법

Info

Publication number: KR100849232B1
Application number: KR1020070003124A
Authority: KR
Inventors: 김종부; 이은주; 정현진; 이경자
Original assignee: 주식회사 엔유씨전자
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2008-07-31
Also published as: KR20080066115A

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스 NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 이용하여 전통장류에 속하는 청국장 등의 혈전용해 증강 기능성 발효물의 취미를 개선하고 청국장에서 기대되는 혈전용해능력을 증가시키므로써 동맥경화, 심장마비 및 뇌졸중 등과 같은 인체 내의 혈전형성에 따른 질병에 대한 예방적 기능성 식품의 개발을 위한 것으로 청국장 발효 시에 당귀, 쑥, 솔잎, 홍삼, 영지, 녹차 등 혈전용해능력이 인정되는 약용식물의 추출물을 가미함으로써 혈전용해능력을 향상시킨 혈전용해 증강 기능성 발효물의 발효방법에 관한 것이다.

바실러스 서브틸리스, 청국장, 홍삼, 당귀, 영지, 쑥, 솔잎, 녹차, 약용식물, 혈전용해능, 기능성식품

Description

혈전용해 증강 기능성 발효물 및 그 발효방법{The functional fermented products increased fibrinolytic activity and fermentation method thereof}

도 1은 바실러스 서브틸리스 NNT-0701(KCCM 10674)로 제조한 청국장의 인공혈전분해 사진을 나타낸다.(B:삶은대두, C:약용식물추출물무첨가 청국장, S:약용식물추출물첨가 청국장)

도 2는 바실러스 서브틸리스 NNT-0701(KCCM 10674)로 제조한 대두약용식물발효액의 인공혈전분해 사진을 나타낸다.(C:무첨가, H:홍삼추출물첨가, SS:쑥추출물첨가, S:솔잎추출물첨가, D:당귀추출물첨가, Y:영지추출물첨가, N:녹차추출물첨가, T:6종 약용식물 추출물혼합)

도 3은 20%대두배지에 홍삼엑기스를 첨가하고 발효하지 않은 경우와 발효한 경우의 인공혈전분해 사진을 나타낸다.(B:blank(미첨가 대두액), H-1:홍삼 0.5%첨가, H: 홍삼 0.5%첨가 후 NNT-0701균 접종)

도 4는 대두에 약용식물추출액을 첨가하고 발효균주로서 BN-NUC1균주를 사용한 경우의 인공혈전분해 사진을 나타낸다.

도 5는 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 16S rDNA 부분 서열을 나타낸다.

본 발명은 대두의 발효시에 발효균주로서 바실러스 서브틸리스 NNT-0701(KCCM 10674)을 사용하고, 약용식물 중 홍삼, 바람직하게는 홍삼, 당귀, 쑥, 상황, 솔잎, 영지, 녹차 등의 추출물을 첨가함으로써 혈전용해 기능성을 높여 혈전의 축적으로 인한 동맥경화, 고혈압, 뇌졸중 등과 같은 성인병을 예방할 수 있는 혈전용해 증강 기능성 발효물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

현대화되는 식생활에 따라 심장 및 혈관계 질환이 증가하고 있으며, 전세계 사망율 1위를 차지하고 있는 심혈관계질환의 치료 의약품들이 다양하게 개발되어 있으나, 부작용 등의 이유로 마땅한 치료제가 없고 예방이 최선의 치료라고 강조를 하고 있다. 따라서 기능성 식품의 섭취로 뇌졸증, 심근경색, 혈전증 등을 평상시에 예방하거나 개선을 시킬 수 있는 소재에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 전통발효식품도 그 중의 하나로서 연구가 활발히 이루어지고 있는데, 요즘에는 전통장류에 대한 선호도가 낮아져 최근 된장, 간장, 청국장, 고추장 등의 섭취가 거의 이루어지지 않고 있다. 최근 공교롭게도 우리 식탁에서 점차 전통식품들이 사라지고 식생활이 서구화되는 경향과 성인병과 암발생률의 증가 추세가 비례하고 있다고 지적되고 있다. 이러한 경향에서 식품 영양학자들은 현대인들의 성인병이나 기타 질병에 대한 예방과 치료를 위해서는 어떤 방법으로든 전통 장류를 먹을 수 있도록 해야 한다고 조언하고 있으며, 이는 전통장류가 가지는 갖가지 질병의 예방과 치료 효과에 대한 연구 결과물에 기인한 것이다.

청국장은 콩을 원료로 한 우리나라의 대표적인 발효식품으로 간장, 된장, 고 추장 등과 함께 오늘날까지 상용되어 온 전통 장류인데 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 많고 소화 흡수율이 높다. 또한 발효과정에서 강력한 소화효소인 아밀라제, 프로테아제 등이 생성되어 삶은 콩의 소화율이 50～70% 정도인데 반하여 청국장은 90～92%나 되어 소화 및 흡수가 잘 돼 소화제 역할도 한다. 청국장은 삶은 콩을 적정 온도에서 발효시켜 콩 단백질을 분해시킨 전통식품으로서 주로 가을에서 초봄까지 만들어 먹는 장류에 속한다. 청국장을 발효시키는 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 등이 있으며, 특히 청국장은 발효 식품 중 발효기간(2~3일)이 가장 짧은 전통 장류식품이다. 따라서 그 풍미의 독특성을 제외하고 발효식품 중에서 가장 쉽고, 간편한 가공뿐만 아니라 영양적, 경제적으로도 가장 효과적인 콩의 섭취방법으로 인정된다. 특히 청국장은 대두가 갖는 영양기능 이외에도 여러 가지 생체조절기능이 있어 최근 많은 관심이 집중되고 있다. 또한 전통 장류는 [동의보감]에도 쓰여 있듯이 '체내의 독을 말끔히 없애주는' 작용 외에, 고혈압 등의 심, 혈관계질환의 예방과 치료에 효과가 뛰어난 것으로 알려지고 있다.

청국장에 들어 있는 레시틴과 단백질 분해효소는 혈관을 막고 있는 혈전이나 콜레스테롤을 녹여내는 효과가 탁월하므로 뇌졸중의 치료와 예방에 최선책이 될 수 있다. 우리나라 청국장과 유사한 일본의 낫또(Natto)는 증자대두에 바실러스 낫또(Bacillus subtilis natto)를 접종시켜 만드는 일본의 전통 발효식품인데, 소화, 정장작용이 우수할 뿐만 아니라 발효 과정 중 분비되는 낫또키나제(nattokinase)가 섬유소를 강력하게 분해하는 효소로 밝혀지면서 혈전 용해제로서의 이용도 기대되 고 있다. 현재 낫또(natto)가 건강식품으로서 판매량이 급증하고 있다 (미국특허 제5,750,650호 참조).

그리고 혈전용해능과 혈액순환 개선의 기능이 있는 생약성분들로, 영지버섯은 건강장수를 상징하는 십장생도(十長生圖)에 보이는 불로초(不老草)가 바로 그것이다. 한방에서 상약으로 치고 있으며 현대의학에서 예방, 치유, 개선작용이 있는 고분자 단백 다당체 성분이 다량 함유되어 있음이 밝혀졌고, 그 효과가 실험을 통하여 속속 밝혀지고 있다. 혈관 안쪽에 생기는 혈전(血栓)을 없애 주며, 과산화지질의 형성을 억제해준다. 과산화지질이 생체내에 축적되면 간장애, 동맥경화증 및 각종 혈전증을 일으킨다. 성분은 혈액순환을 좋게 하고 혈액내의 해로운 물질을 제거해 주는 작용을 하여 성인병의 치료효과를 경험하거나 체질개선의 효과를 보기도 한다. 영지버섯에 다량 함유되어 있는 게르마늄은 체내에 신선한 산소를 보내고 세포를 더욱 활성화시켜 항상 건강을 유지해주며, 인간이 갖고 태어난 자연치유력을 강화시켜 준다. 고혈압, 당뇨, 뇌졸중, 암, 동맥경화, 간장병, 위궤양, 십이지장궤양에 좋은 식품이다.

당귀의 물 추출액은 실험동물의 혈압강하작용이 있고, 이뇨작용, 대뇌의 진정작용, 연수의 흥분과 마비작용이 있으며 단백질 합성과 자궁조직의 신생을 돕는 작용을 한다. 또한 포도당의 흡수를 늘리는 등 물질대사를 활성화하고 골수를 재생시켜서 에탄올 추출액은 자궁의 운동을 활발하게 한다고 합니다. 그리고 당귀물추출액은 안압 및 혈압을 낮추는 기능도 가진다고 한다.

홍삼은 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 있으며, 순환계에 작용하 여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있다. 그러면서도 조혈작용(造血作用)과 혈당치(血糖値)를 저하시켜 주고, 간을 보호하며, 내분비계에 작용하여 성행동(性行動)이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하며, 항염(抗炎) 및 항종양작용(抗腫瘍作用)이 있고, 방사선에 대한 방어효과, 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용도 있다. 홍삼의 효과 중 중요한 것은 어댑토겐(adaptogen: 適應素) 효과로서 주위 환경으로부터 오는 각종 유해작용인 누병(淚病), 각종 스트레스 등에 대해 방어능력을 증가시켜 생체가 보다 쉽게 적응하도록 하는 능력이 있음이 과학적으로 입증되고 있다. 심신의 기운을 돋워 허약한 체질을 개선시키며 피로회복에 좋다. 몸 안에서의 혈액생성을 왕성하게 하여 혈액순환을 고르게 하며 신체의 기능이나 발육을 개선시키는 거의 만병에 적용되는 약초에 속한다. 일본 에히메대 의학부 생화학교수인 오쿠다 박사는 당뇨에 효능이 인정될 뿐만 아니라 또 고려홍삼이 모세혈관의 혈액순환을 촉진시켜 당뇨병 환자가 흔히 걸리기 쉬운 동맥경화' 등의 증상을 예방시켜 줌으로써, 당료병 치료에는 천혜의 약이라고 밝혔다.

한편, 홍삼을 청국장 발효에 사용한 특허로서는 특허출원 2004-0010316(청국장을 이용한 다이어트 식품 조성물), 특허출원 2003-0046438(등록 10-0519484, 인삼을 첨가하여 불쾌취와 갈변현상을 감소시킨 기능성 청국장 및 그의 제조방법), 특허출원 2004-0115400(등록 10-0597853, 홍삼 추출액을 이용한 청국장의 제조방법), 특허출원 2003-0001238(기능성 청국장), 특허출원 2004-0110028(등록 10-0606241, 항당뇨의 효과가 증강된 홍삼청국장 제조방법), 특허출원 2006-0052823(등록 10-0659015, 기능성 건강식품 및 그 제조방법) 등이 알려져 있다. 또한, 홈삼의 항혈전 기능과 관련해서는 특허공개 2004-0060032(항혈전 조성물), 특허공개 2001-0059137(홍삼 복합물을 이용한 혈액순환 개선제 및 그 제조 방법) 등이 알려져 있다.

그러나, 홍삼을 청국장 발효에 이용하여 혈전용해능이 크게 증진된 사례는 아직 없는 실정이다.

또 쑥에는 무기질과 비타민의 함량이 많은 것이 특색이다. 특히 비타민 A가 많아 약 80g만 먹어도 하루에 필요한 양을 공급할 수 있는 셈이다. 비타민 A가 부족하면 우리 몸에 여러 세균이 침입했을 경우 저항력이 약해진다. 또한 쑥은 몸을 따뜻하게 해주는데 효과적이어서 특히 부인병에 좋은 것으로 알려져 있으며 추위를 잘 타는 사람에게 좋고 몸이 차서 일어나는 복통과 설사에 효과적이다. 기혈과 경맥을 따뜻하게 해주기 때문에 자궁과 하복부가 차서 일어나는 자궁출혈 및 임신중 출혈, 토혈, 코피, 각혈 등에 사용하면 지혈작용을 한다. 하초가 허약하고 차며, 복부에 냉감과 동통이 있는 증상 및 생리불순, 생리통, 대하에 효과가 있으며, 기관지 평활근 이온효과가 있어 만성기관지염과 만성간염, 간경변에도 효과가 있다. 그 외 각종 세균의 번식을 억제하는 효과도 있어 세균성 이질과 습진, 피부가려움증 등에도 달인 물을 사용하면 도움이 된다.

솔잎은 솔잎 특유의 향을 내는 휘발 성분인 테레빈과 떫은맛을 내는 탄닌이 주요 구성 성분인데, 테레빈은 콜레스테롤 수치를 낮추고 말초 신경을 확장시켜 호르몬 분비를 높이는 등 몸의 조직을 일깨워 고혈압이나 심근경색 등 성인에게 주로 나타나는 증상에 효과가 있다. 또한 신경을 안정시키고 감기 예방과 치료에도 도움 을 준다. 탄닌은 활발한 위 운동을 도와 식욕을 촉진시키고 위 점막을 보호하며 장의 긴장을 풀어 신경성 변비가 있는 사람에게 좋은 성분이고, 이밖에 혈당 수치를 낮춰 당뇨병에 도움을 주는 글리코키닌, 빈혈에 좋은 철분, 모세혈관을 튼튼하게 해 주는 루틴, 담배의 유해 물질을 없애 주는 아피에긴산, 비타민 C 등 몸에 이로운 성분들로 구성되어 있다.

녹차는 중국의 예방의학과학원의 연구 결과에 따르면 녹차, 홍차, 우롱차 등 모든 찻잎에 N-니트로소화합물의 합성을 억제하는 항암 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. 차의 성분 중에는 항산화 작용을 하는 성분이 많이 함유되어 있어 노화를 억제시키고, 고혈압과 같은 성인병 예방하고, 열량이 거의 없는 저칼로리 음료로, 중금속을 해독하는 효능이 있다. 또한 녹차는 숙취제거, 충치예방, 항염증기능을 하는 대표적인 알카리성 음료이다.

상기와 같이 청국장은 혈전용해능이 있는 것으로 알려져 있으나 그 효과가 아직 기대에 미치지 못하고 있다. 청국장의 발효에서 혈전용해능에 영향을 크게 미치는 요소는 발효에 사용되는 균주이다. 종래에 혈전용해능이 있는 청국장 발효균주와 관련된 특허로서는 특허출원 2003-0053090(신규한 바실러스 속 균주 및 이로부터 생산되는 항혈전성 물질), 특허출원 2004-0031505(등록 10-0588521, 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ＣＨＫＪ1339균주), 특허출원 2002-0061116(신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42와 이로부터 생산되는 신규 혈전 분해효소), 특허출원 2002-0022551(등록 10-0511637, 바실러스 속 ＢＲＤ-54 균주 (ＫＣＴＣ 10183ＢＰ) 및 이 균주로부터 생산된 혈전용해능을 갖는 효소단백 질), 특허출원 2004-0019198(청국장으로부터 분리한 청국장 점질물 추출물을 함유하는 혈전용해용 약학 조성물), 특허출원 2005-0028064(등록 10-0630272, 혈전용해능이 우수한 납두균과 삶은 콩을 발효시켜 제조된 즉석 생청국장) 등이 알려져 있다.

그러나, 이들 특허출원에 의한 청국장은 혈전용해능이 아직 기대에 미치지 못하고 있는 실정이다. 이에 본 출원인은 혈전용해능이 우수한 균주와 이에 의해 제조된 청국장에 대하여 특허출원 2006-86676(바실러스 서브틸리스 ＮＮＴ-0701 균주 및 이에 의해 제조된 청국장)으로 출원한 바 있다.

본 발명자들은 현재까지 알려진 청국장보다 혈전용해능이 더 월등한 청국장을 제공하기 위하여 연구한 결과, 상기의 효능들을 가진 약용식물 추출물을 청국장 발효에 적절하게 첨가한 결과 혈전용해 기능성이 크게 증강된 청국장이 제조됨을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

특히, 본 출원인에 의하여 선출원된 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 이용하여 청국장 발효나 대두약용식물발효액을 제조할 때, 타 균주와는 달리 홍삼, 바람직하게는 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차를 첨가하여 발효할 경우, 대두발효물의 혈전용해 기능이 크게 증강되는 것을 발견 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 실시예에 따르면, 대두를 발효하여 제조되는 발효물에 있어서, 상기 대두에 홍삼을 첨가하고 발효균주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 이용한 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물이 제공된다. 상기 발효물은 대두를 고상발효한 청국장, 대두유를 발효(액상발효)하여 수득한 대두약용식물발효액(즉, 홍삼, 또는 홍삼과 쑥, 솔잎, 영지, 당귀, 및 녹차를 함유하여 발효된 발효액)을 동결건조하여 제조된 대두약용식물발효물 등, 다양한 형태가 가능하다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면 고상발효, 액상발효에 의하여 수득하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법이 제공된다. 고상발효의 경우 일반적으로 청국장의 발효방법을 사용하는데 종래에 공지된 방법과 큰 차이는 없고, 단지 홍삼 등의 약용식물이 발효시에 첨가된다. 예를들면, 본 발명에 따른 고상발효의 한 예로서 대두에 홍삼이 혼합된 물을 첨가하여 수침하는 단계; 불린 대두를 가열하여 삶는 단계; 삶은 대두를 증자하고 여기에 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)을 접종하는 단계; 접종된 대두를 발효시켜 청국장을 획득하는 단계로 이루어진다. 구체적으로는 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀, 및 녹차가 혼합된 물을 대두 무게의 2~3배 중량% 첨가하여 3~5시간 수침하는 단계; 불린 대두를 약 2~4시간 동안 중불에서 가열하여 수분이 거의 없을 때까지 졸여서 삶는 단계(약용식물의 대두 침투를 용이하게 함); 삶은 대두를 100℃~130℃에서 30~50분간 증자하고 청국장균 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 배양액(대략 10⁸cell/ml 내외)을 삶은 대두 무게의 0.5~1.0 중량% 접종하는 단계; 접종된 대두를 36℃~45℃에서 24~72시간 발효시켜 청국장을 획득하는 단계로 이루어진다.

액상발효의 경우는 고형의 대두가 아닌 대두액을 사용한다는 점에서 고상발효와 차이가 있다. 예를들면, 홍삼이 첨가된 증자대두의 대두액을 준비하는 단계; 상기 대두액에 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)을 접종하는 단계; 상기 접종된 대두액을 진탕발효시키는 단계; 상기 발효된 대두약용식물 발효액을 동결건조하여 대두약용식물발효물로 획득하는 단계로 이루어진다. 구체적으로는, 증자대두 또는 대두와 물을 혼합하여 분쇄한 대두액에 홍삼 또는 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차엑기스를 각각 0.3~9.0 중량%(대두액에 대하여)가 되게 첨가하여 110℃~130℃에서 10~30분간 살균하는 단계; 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 배양액(대략 10⁸cell/ml 내외)을 약용식물이 첨가된 대두액의 0.5~1.0 중량% 접종하는 단계; 36℃~45℃에서 24~72시간 진탕발효시켜 혈전용해능이 있는 대두약용식물발효액을 얻는 단계; 상기 대두약용식물 발효액을 동결건조하여 대두약용식물발효물로서 획득하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서 사용하는 약용식물은 홍삼만 사용하여도 가능하지만 추가로 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차를 첨가하여 발효하는 것이 더 바람직하다. 이들 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료로부터 추출한 엑기스상이거나 원재료를 파쇄한 분말상인 둘다 가능한데, 엑기스상이 더 바람직하다. 엑기스상은 일반적으로 공지된 수단에 의하여 직접제조도 가능하지만 현재 시중에서 시판도 되고 있다. 분말상은 목적으로 하는 혈전용해능을 위하여 첨가량을 많이 할 필요가 있는데 이럴 경우 청국장 등의 본래 기능이 떨어지는 단점이 있다.

엑기스상일 경우에는 그 첨가량은 대두에 대하여 0.1~3.0 중량%인 것이 바람직하고, 분말상일 경우 첨가량은 대두에 대하여 1.0~10.0 중량%인 것이 바람직하다. 엑기스의 양이 너무 적으면 혈전용해능 떨어지고 너무 많으면 발효균주의 생육을 저해할 우려가 있다.

이하 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않는다.

본 발명에 사용된 바실러스 서브틸리스 NNT-0701은 일반적인 청국장 제조균의 형태학적 특성 및 생화학적 특성이 유사하나 혈전용해능력이 우수하고 대두 단백질을 분해하는 프로테아제 활성이 우수한 것이 특징이다. 또한 점질물의 생성능이 우수한 청국장을 제조할 수 있으며 혈전용해능도 우수한 균주이다.

< 실시예 1> 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus sutilis ) NNT -0701( KCCM 10674) 균주를 이용한 청국장 발효

세척한 대두에 3배 중량의 물을 가하여 18~20시간 침지한 후 115℃에서 40분간 증자한 다음 상기의 청국장 발효균 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701 (KCCM 10674) 균주(10⁸cell/ml)를 증자 대두의 0.5 중량%되게 접종하여 40℃에서 48시간 발효하여 청국장을 제조하였다.

< 실시예 2> 천연약용식물 추출물이 첨가된 청국장 발효

상기의 청국장 발효균 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 사용하여 다음의 도식에 따라 혈전용해능이 증강된 청국장을 제조할 수 있다. 홍삼, 쑥, 솔잎, 당귀, 영지, 녹차엑기스(각각 (주)바산 시판의 엑기스제품)를 정제수에 각 0.5 중량% 첨가한 액을, 세척한 대두 무게의 3배 중량부 첨가하여 1~3시간 침지 후 가열하여 중불에서 약 3~5시간 수분이 없어질 때까지 가열한 후 115℃에서 40분간 증자한다. 증자하여 식힌 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)균주 배양액(10⁸/ml)을 대두분량의 0.5 중량%가 되게 접종하여 40℃에서 48시간 발효시켜 혈전용해능이 증강된 청국장을 제조하였다.

도식 1. 혈전용해능이 증강된 약용식물 추출물 첨가 청국장의 제조방법

대두:홍삼, 쑥, 솔잎, 당귀, 영지, 녹차엑기스 각 0.5중량% 수액 = 1:3

↓

침 지: 1~3시간

↓

가 열: 3~5시간. 수분이 없을 때까지

↓

증 자: 115℃,40분간

↓

종균 접종: 대두분량의 0.5%

↓

발 효: 40℃, 48시간

↓

혈전용해능이 증강된 청국장 획득

( 실험예 1) 청국장 발효 추출물의 조제 및 혈전용해능 비교측정

혈전용해능 테스트는 Fibrin Plate법을 이용하여 Thrombin, fibrinogen 처리에 의해 형성된 gel상 fibrin plate에서의 Fibrin 용해정도를 지표로 혈전용해능을 확인하였다[식품의약품 안전청 독성연구소 혈전용해제의 효능검색 프로토콜(1)]. Fibrin plate는 0.5% fibrinogen을 0.067M sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시켜서 직경 9cm인 petri dish에 10ml을 가하였다. 여기에 0.067M sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 용해된 thrombin(100NIH/mL) 0.1mL을 가하여 신속하게 혼합하고 균일한 평판을 제조한 후 실온에서 30분 방치하여 fibrin plate를 완전히 응고시켜 사용하였다. 실시예 1과 실시예 2의 방법으로 발효된 청국장에 0.1M sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 2배 중량부 첨가하여 1시간 정도 진탕하여 추 출된 액을 0.45um filter로 여과한 여액을 fibrin plate 에 20uL 점적하여 37℃에서 방치 후(10시간 인큐베이션) 혈전용해환의 면적을 측정하여 혈전용해 활성을 비교하였다. 결과는 표 1 및 도 1과 같다. 약용식물추출물을 첨가하지 않은 청국장보다 약용식물추출물을 첨가하여 발효시킨 청국장에서 인공혈전의 분해능이 거의 2배가 증가하였다.

바실러스 서브틸리스 NNT -0701( KCCM 10674)로 제조한 청국장 혈전용해능 결과

시 료 명	용해환의 직경(mm)	용해환의 면적 (r²×π)	비 율
증자 대두(B)	0	0	0
약용식물추출물 무첨가 청국장(C)	25.0	490.6	100
약용식물추출물 첨가 청국장(S)	34.5	934.4	190

< 실시예 3> 천연약용식물 엑기스 첨가 액상 대두발효액의 제조

혈전용해능이 증강된 대두발효물을 획득하는 방법으로 불린 대두와 물을 25:75의 비율로 혼합하여 분쇄한 대두액에 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀, 녹차엑기스(각각 (주)바산 시판의 엑기스제품)를 각각 0.5 중량%가 되게, 각각 또는 모두를 첨가하여 121℃, 20분간 살균한 후 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)의 배양액(10⁸cell/ml) 0.5 중량%를 접종하였다. 그런 다음 40℃에서 48시간 진탕발효시켜 혈전용해능이 증강된 대두약용식 물발효액을 얻었다.

( 실험예 2) 대두약용식 물발효액의 조제 및 혈전용해능 비교측정

위 실시예 3에서 제조된 대두약용식물 발효액의 혈전용해능을 실험예 1과 동일한 방식으로 측정하여 약용식물추출물을 첨가하지 않은 대두발효액과 비교하였다. 결과는 표 2 및 도 2와 같다.

약용식물추출물 무첨가 대두발효액의 혈전용해능을 100으로 하였을 때, 약용식물을 각각 단일로 첨가시 홍삼추출물 첨가 대두발효액의 혈전용해능이 166%로 가장 우수하였고, 6종의 추출물이 혼합 첨가된 대두발효액은 183%로 위 실험예 1의 약용식물 첨가 청국장의 결과와 비슷하였다. 약용식물 추출물을 단일로 첨가하였을 때보다 혼합첨가 시 혈전용해능 증강이 우수하였다.

바실러스 서브틸리스 NNT -0701( KCCM 10674)로 제조한 대두약용식물발효액의 혈전용해능 결과

시료명	직경( mm )	면적( r ² ×π)	비율
C (무첨가)	11.25	99.35	100
H (홍삼추출물)	14.50	165.05	166.13
SS ( 쑥추출물 )	9.75	74.62	75.11
S (솔잎추출물)	9.75	74.62	75.11
D (당귀추출물)	12.15	115.88	116.64
Y (영지추출물)	10.50	86.55	87.12
N (녹차추출물)	7.5	44.16	44.45
T (6종 추출물혼합)	15.25	182.56	183.75

( 비교예 1) 홍삼 자체의 혈전용해능 측정

대두액체 배지에 홍삼추출엑기스만을 넣고 배양균으로 발효시키지 않고 혈전용해능(18시간 인큐베이션)을 실험예 1과 동일한 방식으로 측정하여 홍삼추출엑기스를 첨가한 대두발효액과 비교하였다. 결과는 표 3 및 도 3과 같다. 대두액체배지에 홍삼추출엑기스를 넣고 균으로 발효시킨 경우(대두 20%에 홍삼엑기스 0.5% 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방식으로 제조)에는 혈전용해가 일어남에 반해, 발효하지 않은 것은 혈전용해가 일어나지 않음을 알 수 있다.

대두20 %에서 홍삼엑기스 첨가(0.5%)에 따른 혈전용해능

시료명	직경1(mm)	직경2(mm)	반지름(r)	면적(mm²)
B	0	0	0	0
H-1	0	0	0	0
H	13.0	13.0	6.5	132.7

( 비교예 2) 타균주를 이용한 혈전용해능의 측정

발효균주로서 BN-NUC1균주(바실러스 서브틸리스로서 낫또에서 분리한 균주)를 사용하여 접종, 68hr 배양하여 천연약용식물 엑기스 첨가 액상 대두발효액의 제조하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방식으로 액상 대두발효액을 제조하고, 혈전용해능을 실험예 1과 동일한 방식으로 측정하였다. 결과는 표 4 및 도 4와 같다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 사용한 경우와 달리 BN-NUC1균주의 경우에는 솔잎, 당귀의 경우 혈전 용해능이 증가함을 알 수 있고, 홍삼을 사용한 경우 혈전용해능이 별로 높지 않음을 알 수 있다.

타균주를 이용한 혈전용해능의 측정

시료명	직경1( mm )	직경2( mm )	mean (r)	면적( r ² ×π)	control 비%
C ( control )	14.8	14	7.20	162.78	-
H (홍삼)	16.2	16	8.05	203.48	125.00
SS (쑥)	14	13.2	6.80	145.19	89.20
S (솔잎)	16	15.5	7.88	194.73	119.63
D (당귀)	17	16.2	8.30	216.31	132.89
Y (영지)	14	15	7.25	165.05	101.39
N (녹차)	15	15.2	7.55	178.99	109.96
T (혼합)	16	15.0	7.75	188.60	115.86

한편, 발효균주로서 Bacillus licheniformis BNT11 균주를 사용하고, 대두 20% 액체배지에서 혈전용해능을 시험한 경우에도, 쑥, 당귀, 영지, 상황버섯, 솔잎에서 혈전분해능이 다소 상승하였으나, 홍삼이나 혼합 사용의 경우에는 혈전분해능이 높지 않았다.

참고예 1 : 균주의 탐색 및 균주의 동정

혈전 용해능, 점액질 성분 형성능, 프로테아제 활성이 우수하고, 청국장 고유의 악취가 적은 신규 균주인 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 탐색 및 동정은 다음과 같다.

대한민국 내에서 무농약 및 유기농 형태로 재배된 볏짚을 경주, 포항, 영덕, 울진, 양산, 상주, 여주, 수원, 남원, 원주 등지에서 입수하여 15시간 동안 침지하여 121℃에서 30분 동안 멸균된 콩을 이용하여 청국장을 생산하여 피브리노겐이 트롬빈의 반응으로 형성된 인공혈전에 반응시켜 형성된 용해영역의 직경이 큰 용해 활성이 높은 균주를 분리하였다.

본 발명에 사용된 바실러스 서브틸리스 NNT-0701은 일반적인 청국장 제조균의 형태학적 특성 및 생화학적 특성이 유사하나 혈전용해능력이 우수하고 대두 단백질을 분해하는 프로테아제 활성이 우수한 것이 특징이다.

표 5는 본 발명에서 사용되는 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 인공혈전에 대한 높은 활성도를 나타내는 도표이다.

혈전 용해능(Fibrinolytic activity)의 측정은 일반적인 방법을 사용한다. 예를 들면, 0.15%(w/v) 피브리노겐 용액 6 ㎖에 0.2 ㎖ 트롬빈(20 NIH/㎖) 용액을 잘 혼합하여 페트리접시에 깔고, 30분간 방치하여 피브린 플레이트를 만든다. 플레이트에 2 ㎎/㎖ 농도의 점질물 용액을 각각 10 ㎕씩 적가하여, 37℃에서 5시간 방치시킨 후 형성된 용해된 피브린 영역의 직경을 비교하여 점질물의 혈전 용해능을 측정하였다. 한편, 표준 플라스민(plasmin) 용액을 0.075, 0.15, 0.30, 0.45, 0.1 unit/㎖로 조제한 후, 피브린 플레이트에 10 ㎕씩 적가하여 형성된 용해 영역의 직경을 측정한 후 점질물의 활성과 비교하였다.

분리균주 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 피브린 용해 활성(fibrin lyzed activity)

실험 목록	피브린 용해 활성 ( unit )
실험구 (분리균주 B. subtilis NNT-0701 배양액)	0.541
실험구 (분리균주 B. subtilis NNT-0701을 이용한 청국장)	0.537
수입 낫도 A	0.438
수입 낫도 B	0.356
시판 청국장 A	0.163
시판 청국장 B	0.149
B. subtilis KCTC 배양액	0.412
B. subtilis KCTC 배양액	0.394

수입 낫도 A(미또낫도^™, 수입처 모노마트, 판매처 E-마트)

수입 낫도 B(유기농낫도^™, 수입처 모노마트, 판매처 E-마트)

시판 청국장 A(토박이 청국장^™, 제조원 토박이 식품)

시판 청국장 B(오월의 장맛^™, 제조원 풀무원)

표 6은 본 발명에서 사용되는 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 높은 세포외 프로테아제 활성(extra protease activity)을 나타낸 표이다. 세포외 프로테아제 활성을 측정하기 위한 방법은 브라운과 쉬미츠(Braun, V. and G. Schmitz)가 제시한 아조카제인(azocasein) 방법을 사용하였다.

분리균주 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 프로테아제 활성

실험 목록	세포외 프로테아제 활성
실험구 (분리균주 B. subtilis NNT-0701)	0.114 unit/㎎?protein
B. subtilis KCTC	0.071 unit/㎎?protein
B. subtilis KCTC	0.067 unit/㎎?protein

참고예 2 : 균주의 동정

상기 분리 균주의 생리학적, 배양학적 특성은 YMG 배지를 기본배지로 하여 버기스 매뉴얼(Bergey's manual of systematic bacteriology, Palleroni, 1984)에 준하여 조사하였다. 상기 분리 균주의 동정은 연세대학교 생명공학연구원 KCCM에 의뢰하여 rDNA 서열을 사용하여 동정하였다.

상기의 방법에 의해 분리된 본 발명 균주의 생리학적 및 형태학적 특성은 표 7과 같다.

분리균주 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 생리학적, 형태학적 특성

목록	*Bacillus* *subtilis*	*Bacillus* *subtilis* NNT -0701
모양	포자를 형성하는 막대기형	포자를 형성하는 막대기형
그램염색	양성	양성
혐기성 생장	+ or -	-
카탈라아제	+	+
옥시다아제	+	+

포도당 이용성	+	+
아라비노스	+	+
자일로스	+	+
만니톨	+	+

2% NaCl에서의 생장	+	+
5%	+	+
7%	+	+
10%	+	+

5-10℃ 에서의 생장	-	-
30-55℃	+	+
65℃	-	-

본 발명 균주는 YMG 한천 평판배지에서 배양하였을 때, 유백색의 균집락을 형성하며, 20~55℃의 넓은 온도 범위에서 생육이 가능하며, pH 4~11까지 넓은 pH범위에서의 생육이 가능하다. 최적 배양조건은 온도의 경우 37~43℃이며, pH의 경우 5.5~6 사이에서 가장 우수한 생육을 나타내며, 16s rDNA 염기서열을 분석결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 16S rDNA 염기서열의 상동성은 99.0%(600 bp 중 595 bp가 동일함)로 나타났다. 바실러스 서브틸리스 NNT-0701의 16S rDNA 부분 서열은 도 5에 도시되어 있다.

상기 균주의 생리학적 및 배양학적 특성을 통해 통상의 바실러스 서브틸리스의 신규한 스트레인으로 동정되어 본 발명의 균주 바실러스 서브틸리스 NNT-0701을 한국 미생물보존센터에 2005년 8월 10일자로 기탁번호 KCCM 10674P로 기탁하였다.

본 발명의 효과는 상기 실시예에서 본 바와 같이 홍삼 특히, 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차추출물을 첨가한 대두 또는 대두액을 청국장균으로 발효시킬 경우, 바실러스 서브틸리스 NNT-0701(KCCM 10674P)의 배양액을 접종하여 발효시키면 타 균주에 비하여 혈전용해능이 크게 증강된 기능성 발효물이 제조됨을 알 수 있다.

Claims

대두를 발효하여 제조되는 발효물에 있어서, 상기 대두에 홍삼을 첨가하고 발효균주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674) 균주를 이용한 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 1에 있어서, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차를 추가로 첨가하여 발효된 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 2에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료로부터 추출한 엑기스상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 3에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 엑기스의 첨가량은 대두에 대하여 0.1~3.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 2에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료를 파쇄한 분말상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 5에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 분말의 첨가 량은 대두에 대하여 1.0~10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효물은 청국장인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효물은 상기 발효균주의 접종에 의해 발효된 발효액을 동결건조하여 제조된 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물.
대두에 홍삼이 혼합된 물을 첨가하여 수침하는 단계;

불린 대두를 가열하여 졸이는 단계;

졸인 대두를 증자하고 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)을 접종하는 단계;

접종된 대두를 발효시켜 청국장을 획득하는 단계로 이루어진 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 9에 있어서, 상기 수침하는 단계에서 상기 홍삼에 추가하여 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 10에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료로부터 추출한 엑기스상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 11에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 엑기스의 첨가량은 대두에 대하여 0.1~3.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 10에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료를 파쇄한 분말상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 13에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 분말의 첨가량은 대두에 대하여 1.0~10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 9 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀, 및 녹차가 혼합된 물을 대두 무게의 2~3배 중량% 첨가하여 3~5시간 수침하는 단계;

불린 대두를 약 2~4시간 동안 중불에서 가열하여 수분이 거의 없을 때까지 졸여서 삶는 단계;

삶은 대두를 100℃~130℃에서 30~50분간 증자하고 청국장균 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)의 배양액 0.5~1.0 중량%를 접종하는 단계;

접종된 대두를 36℃~45℃에서 24~72시간 발효시켜 청국장을 획득하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
홍삼이 첨가된 증자대두의 대두액을 준비하는 단계;

상기 대두액에 바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)을 접종하는 단계;

상기 접종된 대두액을 진탕발효시키는 단계;

상기 진탕발효된 발효액을 동결건조하여 동결건조발효물로 획득하는 단계로 이루어진 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 16에 있어서, 상기 대두액을 준비하는 단계에서 상기 홍삼에 추가하여 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 17에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료로부터 추출한 엑기스상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 18에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 엑기스의 첨가량은 대두에 대하여 0.1~3.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 17에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차는 원재료를 파쇄한 분말상인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 20에 있어서, 상기 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차 분말의 첨가량은 대두에 대하여 1.0~10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.
청구항 16 내지 21 중 어느 한 항에 있어서,

증자대두 또는 대두와 물을 혼합하여 분쇄한 대두액에 홍삼 또는 홍삼, 쑥, 솔잎, 영지, 당귀 및 녹차엑기스를 첨가하고 110℃~130℃에서 10~30분간 살균하는 단계;

바실러스 서브틸리스(Bacillus sutilis) NNT-0701(KCCM 10674)의 배양액 0.5~1.0 중량%를 접종하는 단계;

36℃~45℃에서 24~72시간 진탕발효시켜 혈전용해능이 있는 발효액을 얻는 단계;

상기 발효액을 동결건조하여 동결건조발효물로서 획득하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈전용해 증강 기능성 발효물의 제조방법.