KR101156767B1 - 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종하여 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 산야초 발효액은 장류 및 절임류 소재로 적용하여 기능성과 기호성이 향상된 고부가 가치의 제품 생산에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

혈전용해, 산야초 착즙액, 분말 희석액, 바실러스 서브틸리스, 산야초 발효액

Description

혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액 및 이의 제조 방법{Fermented wild vegetable juice having fibrinolytic activity and preparation method thereof}

본 발명은 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종하여 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

식품업계는 기존 시장의 한계성을 인식하여 기능성 식품 쪽으로 제품개발을 강화하고 있는 추세이며 소비자들도 소득증대와 건강에 대한 관심증가로 기능성 식품에 대한 소비가 계속 증대되고 있어 식품업체와 소비자들의 요구가 부합되어 기능성 식품 시장은 계속해서 성장하고 있다. 그러나 관심증가와 함께 많은 문제점들도 나타나고 있는데 가장 큰 문제점은 효능검증이나 구체적인 과학적인 규명 없이 기능성 식품이 생산된다는 점이다.

또한 경제성장과 식생활의 서구화로 인한 식생활 환경의 변화는 관상동맥 질환, 퇴행성 뇌질환, 고혈압, 당뇨, 암 등을 일으키는 주원인으로 알려져 있으며 이 를 예방하기 위한 여러 가지 식이요법들이 권장되고 있으므로 이런 측면에서 국내 전통식품을 활용한 기능성 소재에 의한 건강 기능 항진 효능 연구에 많은 관심이 요구된다. 그러나 우리나라의 경우 전통식품을 활용한 기능성 식품 소재들에 대한 과학적 기전 연구는 아직 미비한 상태이다.

우리나라는 세계적인 기능성 식품시장에 내세울 만한 김치, 된장, 고추장, 전통차, 인삼, 마늘제품 등 전통식품이 있으며 최근에는 전통식품의 함유성분인 켑사이신(고추성분), 펩타이드(고추장, 된장), 플라보노이드(콩 등), 폴리페놀(차 성분), 사포닌(인삼), 알리신(마늘) 등 전통식품을 포함한 여러 가지 식품에서도 여러 가지 기능성이 있다는 결과가 많이 발표되고 있다.

이처럼 전통 발효식품은 식품 저장성이 우수하여 보존성과 위생상 안정성이 확보되는 경제적인 식품으로 식량자원으로 효율적으로 이용 가능성이 있으며 최근에는 발효식품에서 3차 기능 식품효과가 있는 유용한 물질 탐색 및 발효대사의 연구가 활발하게 진행되고 있어 새로운 건강 및 생리 작용에 긍정적인 효과를 보이고 있다.

국내 식용식물자원에 대한 관심이 높아지면서 생리활성물질에 대한 많은 연구결과들이 보고되고 있으나 아직 그 자체가 식품화되어 개발되는 일은 미비한 실정이다.

우리나라 산야에 야생적으로 자라고 있으며 그 가치에 따라 재배가 가능한 식용식물 자원의 기능성 성분을 활용한 식품개발은 식량자원의 확대, 고부가가치를 창출하는 농촌 경제적인 면과 인류의 건강증진을 위해 매우 필요한 일이라 사료된 다.

그러나 식용식물자원은 그 특성상 저장성이 좋지 않기 때문에 쉽게 색의 변화 및 비타민류의 파괴 등 품질변화가 빨리 일어나므로 이를 개선해야 하며 또한 식품개발의 종류도 현대인의 취향에 맞게 다양하게 이루어져야 할 것으로 보인다.

천연물은 생체에 투여했을 때 부작용이 거의 없을 뿐 아니라 생리활성물질로서 큰 효과를 나타내는 새로운 기능성 물질원이 된다는 점에서 높이 평가되고 있다. 이러한 생리활성물질은 그 화학적 구조의 특이성과 식품 내에 같이 존재하는 물질에 의해 많은 영향을 받게 되므로 개개 식품과 화합물에 대한 정확한 분리, 정량법이 확립되어야 할 것으로 보이며 아울러 완전한 식품으로서의 효과에 대한 연구가 체계적으로 진행되어야 할 것으로 보인다.

국내에서 자생하고 있는 식물자원 중에서 식, 약용식물은 약 120과 350속으로 이 중에서 산채류는 320 여종으로 지역적으로도 전국에 걸쳐 고루 분포하고 있다. 녹황색 채소류를 비롯한 각종 산야초류들은 각종 비타민류, 무기물류, 색소류 그리고 각종 특수성분 등 중요한 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 건강의 유지, 개선 및 질병예방에 크게 기여하고 있다.

한국특허등록 제0844185호에는 유산균을 이용한 발효 쑥차 제조 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0849232호에는 프로테아제 증강 기능성 발효물 및 그 발효방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2004-0084522호에는 항산화효과가 증강된 발효식품 및 체내 항산화활성 검정방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 생체기능 조절 및 향상이 기대되는 식용식물을 대상으로 그 효능을 검증하고 새로운 기능성 생물소재를 개발하여 이를 관련 식품산업에 활용하기 위해, 산야초를 활용한 기능성 식품소재 개발을 목표로 연구를 수행하던 중, 산야초 발효액이 혈전용해 활성을 가짐을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종하여 발효시켜 제조된 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 산야초 발효액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 산야초 발효액의 혈전용해 활성 및 고유한 풍미는 전통장류(된장, 간장) 원료 소재로서 활용하여 풍미와 기능이 우수한 고부가 가치 제품 개발에 활용이 가능하며, 또한, 절임류의 원료로서 풍미와 기능성이 우수한 고부가 가치 절임류 제품 개발에 활용이 가능하다. 그리고, 산야초의 기능성을 활용한 풍미와 기능이 우수한 고부가 가치 발효 음료 개발에도 활용이 가능할 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산야초 착즙액 또는 분말 희 석액에 질소원을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 접종하여 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액을 제공한다.

본 발명의 산야초 발효액은 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원으로 대두 유래의 분리 대두 단백질, 분리 대두 농축물, 탈지 대두 분말, 전지 대두 분말, 청국장 분말 등을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.1~10% 접종하여 25~60℃에서 1~10일 동안 발효시켜 제조될 수 있으며, 바람직하게는, 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원으로 대두 분말 또는 청국장 분말을 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5% 접종하여 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시켜 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원으로 대두 분말 0.1~5%를 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5% 접종하여 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시켜 제조될 수 있으며, 가장 바람직하게는 산야초 착즙액 또는 분말 희석액에 질소원으로 대두 분말 0.5%를 첨가하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 2% 접종하여 40℃에서 84시간 동안 발효시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 산야초 발효액에 있어서, 상기 산야초는 신선초, 미나리, 쑥, 취나물, 머위, 참나물, 케일, 더덕, 도라지, 고사리, 달래, 두릅, 고들빼기, 씀바귀, 질경이, 돌나물, 민들레, 둥글레, 참비름, 고비, 물냉이, 원추리, 곰취, 단재, 참취, 구기자나물, 고추나무, 산달래, 미역취, 싸리, 산마늘, 다래나물, 참죽나무, 으름, 모시대, 오갈피나무, 청나래고사리, 수리취, 쇠뜨기, 삽주, 쇠무릎, 참나리, 멧미나리, 음나무, 갯비름나물, 우산나물, 비비주 등일 수 있으며, 바람직하게는 신선초, 미나리, 쑥, 취나물, 머위, 참나물 또는 케일 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 이용된 산야초에 간단히 살펴보면 하기와 같다.

신선초(Angelica keiskei Koize)는 아열대지방에서 자생하는 미나리과에 속하는 다년생 초본으로 명일엽, 선삼초, 신립초 등으로 알려져 있으며, 생리활성을 나타내는 각종 유기산, 플라보노이드, 쿠마린, 사포닌 등과 각종 무기질 특히, 게르마늄이 함유되어 있다.

미나리(Oenanthe javanica)는 다습한 땅이나 물이 흐르는 곳에서 자생하는 산형과의 다년생 초본으로 물기가 있는 곳이나 냇가에서 자라는 호습성으로 한방에서는 수영, 수근이라고도 한다. 미나리는 신선한 빛깔과 특유의 방향을 지니고 있으므로 미각을 돋구는 채소로 이용되어 왔으며 식용뿐만 아니라 오래전부터 민간요법이나 한방에서 숙취제거, 이뇨작용, 간경변 억제작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 해독작용, 지혈작용 등의 여러 약리작용을 지니고 있어, 물고기 중독, 혈뇨, 자궁출혈, 고혈압, 불면증 등 여러 질병의 치료에 다양하게 응용되어 왔다. 특히 급만성 간염의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. 최근에는 미나리 추출물의 간기능 회복, 항산화, 항돌연변이 작용과 함께 위암세포의 성장억제 효과 등이 보고된 바 있다.

쑥(Artemisia princeps var. orientalis)은 번식력이 강한 다년생 식물로서 약 2,000 여종이 있으며 우리나라 자생종만도 300 여종이나 알려져 있다. 쑥은 독특한 맛과 향으로 인하여 여러 가지 형태의 식품 재료로 이용되어 오고 있다. 쑥잎의 독특한 향기는 치네올이라는 정유 성분으로 쑥떡이나 쑥버무리는 떡의 산성을 중화하고 영양적인 보완을 하여 고른 영양 섭취를 가능케 해준다.

취나물(참취 : Aster scabar Thunb)은 산채류를 대표하는 식물로서 우리나라 자생종은 60 여종이고 식용이 가능한 것은 24종이 있다. 우리나라에서 재배되고 있는 취나물은 참취, 개미취, 각시취, 곰취, 미역취, 청옥취, 수리취 등이 있는데 그 중에서 참취가 향기가 독특하고 수확량이 많기 때문에 농가에서 많이 재배하고 있다.

취나물은 맛과 향기가 뛰어나고 탄수화물, 비타민 A 등 다양한 영양분이 함유되어 있어 묵나물, 튀김, 부침용으로 이용되며 감기, 두통, 진통, 해독, 항암 등에 효과가 있어 한약재로도 이용된다. 취나물에는 비타민 A의 모체가 되는 카로틴과 비타민 B 복합체가 있고, 칼슘과 철분 등을 비교적 골고루 가지고 있는 알칼리성 식품이다. 취나물 중의 비타민 C가 알코올 분해에 도움을 주며, 비타민 B₂는 간의 해독작용을 도와주기도 한다.

머위는 중국, 일본, 우리나라의 제주도, 울릉도, 남부지방과 중부지방의 산야지 특히 햇볕이 잘 드는 산비탈의 숲이나 계곡 주변의 습지에서 자생하는 국화과에 속하는 다년생 초본식물이다. 머위는 30cm의 높이로 자라고 꽃은 5, 6월에 피며 암수의 구별이 있어 암그루는 꽃이 희고 숫그루는 황백색으로 구별이 가능하다.

머위는 머우, 머구 등 지방에 따라 달리 불리우는데, 특유의 향기와 쓴맛이 있으며 주로 데치거나 삶아 먹는다. 머위 잎은 비타민 A를 비롯한 각종 비타민이 골고루 들어 있으며, 칼슘이 풍부한 알칼리성 식품이다. 이른 봄에 뜯는 새순일수록 무기질과 비타민이 풍부하며, 예로부터 잎을 달인 물은 천식치료에 사용해 왔으며, 말린 것은 간장이 나빠지는 것 같을 때, 달여 마시면 좋다. 털머위라 하여 해변 근처의 산에서 나는 머위의 잎에는 강한 항균작용이 있는 것으로 알려져 있다.

참나물(pimpinella brachycarpa Nakai)은 우리나라, 일본, 중국, 유럽 등에 분포하며, 수풀 밑 음지의 비옥한 땅에 자생하며 미나리과에 속하는 다년초로서 높이 50~80cm로 자라며 전체에 털이 없다.

참나물은 산형과에 속하며 체내 신진대사와 생리활성을 증진시킬 수 있는 유리당, 필수아미노산, 필수지방산을 비롯한 비타민과 무기질을 다량 함유하고 있다. 특히 비타민 C가 풍부하며 β-carotene, 플라보노이드, 폴리페놀 등과 같은 다양한 항산화 생리활성 물질을 함유하고 있다.

케일(Brassica oleracea var . acephala)은 십자화과 채소 중 하나로 지중해로부터 유래되었고, 케일 잎의 일반성분은 수분 90.1%, 조단백 4.1%, 조지방 0.6%, 조회분 1.0%, 조섬유 1.5%로 양질의 단백질과 함께 비타민 C(146mg%), 비타민 U(54mg%), β-carotene(7.0mg%), 칼슘 (181mg%) 등이 많이 함유되어 있다. 한편, 클로로필 (187mg%), 플라보노이드인 quercetin (11mg%), kaempferol (21.1mg%) 등 항콜레스테롤, 항돌연변이, 항산화, 항암 활성을 갖는 성분이 많이 함유되어 있어 영양뿐만 아니라 기능성 측면에서도 매우 가치가 있는 식품소재로 알려져 있다.

본 발명은 또한,

산야초를 착즙하여 착즙액을 얻는 단계;

상기 착즙액에 질소원으로 대두 분말 또는 청국장 분말을 첨가하고 가열 살균하는 단계;

상기 질소원이 첨가된 착즙액에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5% 접종하고 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액의 제조 방법은 먼저 산야초를 착즙하여 착즙액을 얻는 단계를 포함한다. 이 단계는 산야초를 수돗물로 세척하고, 플라스틱 트레이에서 물을 뺀 다음, 착즙기를 이용하여 산야초를 착즙하고, 5℃로 냉각시키는 단계이다. 상기 착즙액은 건조하여 분말로 제조된 후 희석하여 이용할 수도 있다.

본 발명의 산야초 발효액의 제조 방법은 상기 착즙액에 질소원으로 대두 분말 또는 청국장 분말을 첨가하고 가열 살균하는 단계를 포함한다. 질소원은 대두 유래의 분리 대두 단백질, 분리 대두 농축물, 탈지 대두 분말, 전지 대두 분말, 청국장 분말 등일 수 있으며, 바람직하게는 대두 분말 또는 청국장 분말이며, 더욱 바람직하게는 경제성을 고려할 때 대두 분말이다. 상기 대두 분말의 함량은 바람직하게는 0.1~5%이며, 더욱 바람직하게는 0.5%이다.

탄소원은 특별히 제한되지 않지만, 덱스트로스, 수크로스, 가용성 전분(soluble starch) 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 덱스트로스이며, 덱스트 로스의 함량은 3%가 바람직하다. 또한, 탄소원을 첨가하지 않고 질소원만 첨가하여 발효를 진행할 수도 있다. 질소원을 첨가하고 혼합한 후, 예를 들면, 121℃에서 15분간 가열 살균할 수 있다.

본 발명의 산야초 발효액의 제조 방법은 상기 질소원이 첨가된 착즙액에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5% 접종하고 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시키는 단계를 포함한다.

발효 단계는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.1~10% 접종하여 25~60℃에서 1~10일 동안 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5% 접종하여 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 2% 접종하여 40℃에서 84시간 동안 발효시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 2% 접종하여 40℃에서 84시간 동안, 200rpm으로 발효시킬 수 있다.

본 발명의 산야초 발효액의 제조 방법에 있어서, 상기 산야초는 전술한 바와 같으며, 바람직하게는 신선초, 미나리, 쑥, 취나물, 머위, 참나물 또는 케일 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 재료 및 시료 조제

농협하나로 마트에서 구입한 머위, 곰취, 참나물, 취나물, 미나리, 케일, 신선초와 철원군 명성산에서 채취한 쑥을 수돗물로 세척 후 물기를 제거한 후 녹즙기(Dong Ah Inc, Korea)를 이용하여 착즙액을 조제하여 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다.

쑥 분말 용액은 함양농협의 쑥가루를 농협하나로 마트에서 구입하여 증류수로 희석하여 시료로 사용하였다. 청국장 분말은 순창 전통고추장 민속마을에서 입수하였고, 전지대두분말(Full fat soy flour)은 기린농협의 콩가루를 구입하여 사용하였다. Nutrition broth(NB)는 Difco사 제품을, 이 외 시약은 시판용 특급 및 1급 시약을 구입하여 사용하였다.

산야초 착즙액 제조

야채를 수돗물로 세척하고, 플라스틱 트레이에서 물기를 제거한 후 녹즙기(Dong Ah Inc, Korea)를 이용하여 착즙액을 조제하여 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다.

산야초 발효액 제조

산야초 착즙액에 대두 분말 0.5%(w/v)를 첨가하고, 균일하게 혼합하였다. 121℃에서 15분간 가열하고, 실온으로 냉각하였다. 바실러스 서브틸리스 균주 배양액을 2% 접종하고, 40℃, 200rpm으로 84시간 발효하여 산야초 발효액을 얻었다.

Bacillus subtilis sp . starter 제조

300ml 삼각플라스크에 Nutrition broth(NB) 100ml을 취하여 면전하고 121℃ 에서 15분간 가압 멸균한 후에 Bacillus subtilis sp. 1백금이를 접종하고 37℃에서 24시간 200rpm으로 진탕 배양하여 starter를 제조하였다.

프로테아제 생산을 위한 배양조건 검토

항산화 활성이 비교적 우수한 쑥분말 10% 환원액을 기본 배지로 하여 Bacillus subtilis sp. starter 2%(v/v)를 접종하고 37℃에서 60시간, 200rpm으로 진탕 배양하면서 프로테아제 생산에 미치는 탄소원과 질소원의 영향을 검토한 후, 초기 배양 pH, 배양온도 및 배양시간 등 배양조건이 프로테아제 생산에 미치는 영향을 검토하였다.

발효액 종류에 따른 프로테아제 생산성 비교

산야초 발효액 종류에 따른 프로테아제 생산성을 검토하기 위하여 산야초 착즙액 종류별로 전지 대두분 0.5%를 첨가하고 균일하게 혼합, 면전, 멸균 (121℃/15분) 후, B. subtilis sp. starter 2%를 무균 접종하였다.

B. subtilis sp. starter를 무균 접종한 착즙액을 40℃ shaking incubator (LSI-2005 RL, DAIHAN LABTECH. Co., Ltd)에서 200rpm으로 84시간 진탕 배양하여 발효액을 만들고 이들의 프로테아제 생산성을 비교하였다.

2. 실험 방법

가. 착즙액 수율

착즙 전 재료의 중량과 착즙 후 착즙액 중량으로부터 착즙액 수율을 산출하였다.

나. pH , 적정 산도, 당도

pH는 pH meter(Mettler Toledo, USA)로 측정하였으며, 적정 산도는 시료 10 ml에 1% 페놀프탈레인 용액을 지시약으로 하여 0.1 N NaOH 용액으로 적정하고 NaOH 소비량을 유산함량으로 환산하여 산도(%, w/v)로 표시하였다. 당도는 굴절당도계(Atago DR-A1, Atago Co., Ltd., Japan)를 이용하여 측정하였다.

다. 세포독성

96 웰 플레이트에 마우스 흑색종 세포주인 B16 F10 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 웰당 5x10³ 씩 분주한 후 밤새 배양한 다음, FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지로 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 산야초 시료를 농도별 (1/1000, 1/10000, 1/100000)로 처리하고 다시 24시간 배양 후, MTS 방법을 이용하여 세포 독성 정도를 확인하였다.

라. 항혈전 활성

항혈전 활성은 피브린 플레이트법(Astrup and Mullertz. 1991. Archives of biochemistry and biophysics. 40: 346-351)을 사용하였다.

0.01 M phosphate buffered salin(pH 7.25)에 피브리노겐을 0.6%가 되도록 용해시킨 후 페트리 디쉬에 10 ml을 분주하고 트롬빈 10 유닛을 가하여 균일한 두께의 피브린 clot을 형성시킨 후 실온에 30분 방치하여 혈전용해효소 활성 측정에 사용하였다.

활성 측정은 제조한 피브린 플레이트 표면에 페이퍼 디스크(7 mm, Whatman, USA)를 놓고 발효액을 10ul를 점적하여 37℃에서 20시간 동안 반응 후 생성된 투명환 부위의 직경을 측정하였다. 대조구로서는 플라스민(Roche, USA) 1 유닛을 사용하였다.

마. 항균 활성

산야초 착즙액 및 발효액의 항균력을 E. coli , S. aureus 및 B. subtilis에 대해 확인하였다. 즉, E. coli , S. aureus 및 B. subtilis O.D₅₉₅ =0.3 에서 산야초 착즙액 100 ug/ml을 처리한 후 24시간 배양하여 마이크로플레이트 리더기를 사용, 490 nm에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.

바. 세균수

식품공전의 미생물시험법에 준하여 각 발효액 10진 희석 시료 1ml씩을 멸균 페트리 접시에 무균적으로 취하고 45℃로 유지한 표준한천배지 약 15ml을 무균적으로 분주하여 고르게 혼합, 고화시킨 후 37℃에서 48시간 배양한 후 생성된 집락수로부터 산출하였다.

사. 효소활성도 측정

1) 조효소액 조제

프로테아제 생산을 위한 쑥 발효 배양액에 종균 배양액을 2%(v/v) 양으로 접종하여 37℃에서 60시간 진탕 배양한 후에 배양액을 원심분리(4,000x g, 10 min)하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.

2) 프로테아제 활성

단백질 분해 효소의 활성은 1/15 M 인산염 완충용액(pH 7.0)에 녹인 0.6% 카제인 기질 용액 5 mL에 조효소액 1 mL를 첨가한 후 30℃에서 10분간 반응시키고 0.44 M 트리클로로아세트산(TCA) 용액 5 mL을 가하여 반응을 정지시킨 다음 30분간 정치하였다. 이 반응액을 No. 2(Toyo, Japan) 여과지로 여과시키고 여액 2 mL에 0.55 M Na₂CO₃ 용액 5 mL과 1N Folin reagent 1 ml을 신속히 가하여 30℃, 30분 발색시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에 의한 타이로신 양으로 환산하여 표시하였다. 즉, 시료 1ml이 1분 동안 생성한 타이로신 1㎍을 1단위로 하였다.

3) Amylase 활성

전분 분해효소 활성은 Lin 등(2009, Food chemistry 117, 94-98)의 방법으로 측정하였다. 2% 가용성 전분(pH 6.0) 용액 0.5 ml에 조효소액 50 ul를 첨가하여 37℃, 10분 동안 반응을 시켰다. 반응이 완료되면 DNS 용액 0.5 ml를 첨가하여 100℃, 10분 동안 끓여 식힌 후, 반응액을 50배 희석하여 540 nm에서 측정하였다. 글루코스 표준곡선에 의하여 정량하였고, 37℃에서 1분간 생성한 글루코스 1 mg을 생성할 수 있는 효소의 양을 1 유닛으로 하였다.

아. 관능특성

산야초 발효액의 색, 냄새, 맛, 전체 기호도 등의 관능적 특성은 발효액에 친숙한 12명의 관능검사 패널에 의한 difference test를 적용하여 7점 채점법(7 아주 좋음, 4 보통, 1 아주 나쁨)으로 평가하였다.

자. 통계처리

SAS-PC 프로그램에 의한 분산분석 및 Duncan's 다중검정에 의해 p<0.05 수준에서 유의적 차이를 검증하였다.

실시예 1: 산야초 착즙액의 이화학적 특성

산야초 착즙액의 이화학적 특성은 하기와 같다. 착즙액 수율은 미나리 착즙액 81%로 최대치, 쑥 착즙액 63%로 최저치를 나타내었다. 나머지 머위, 참나물, 취나물, 신선초, 케일 착즙액 등은 70~80%를 나타내 비교적 경제성이 있다고 판단된다.

pH는 대부분 산야초 착즙액이 중성 pH를 나타낸 반면, 미나리 착즙액은 pH 4.9로 약산성을 나타내었다. 산도는 쑥 착즙액이 0.57%로 최대치를, 참나물 착즙액이 0.25%로 최소치를 나타내었다.

당도는 쑥 착즙액이 7.9brix로 가장 높았고, 신선초, 케일, 취나물 착즙액 등이 5~6 brix로 두 번째로 높았다. 머위, 미나리, 참나물 착즙액 등이 2~3 brix로 가장 낮았다.

실시예 2: 산야초 착즙액의 세포독성

기능성 발효 식품 소재 개발을 위한 후보 식물자원 선발을 위해 산야초 시료의 세포 독성 여부를 알아본 결과, 모든 시료에서 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

실시예 3: 항혈전 활성

산야초 착즙액과 이들을 B. subtilis sp.로 발효한 산야초 발효액의 항혈전 활성은 도 1, 도 2, 표 1, 그리고 표 2에 나타낸 바와 같이, 산야초 착즙액은 항혈전 활성을 나타내지 않았으나, 산야초 발효액은 항혈전 활성을 나타내었다.

즉, 산야초 착즙액 시료는 도 1과 표 1에 나타난 바와 같이 반응시간이 경과해도 피브리노겐 플레이트 상의 투명환이 형성되지 않았으며, 반응 20 시간 이후에도 투명환이 나타나지 않았다. 반면에, B. subtilis sp.를 접종하여 발효시킨 산야초 발효액은 도 2와 표 2에 나타난 바와 같이 반응시간이 경과함에 따라 피브리노겐 플레이트 상에서 투명환의 크기가 확대되었다.

표 1. 산야초 착즙액에 따른 투명환의 크기

산야초 발효액에 따른 투명환 지름의 크기(mm)는 표 2에 나타낸 바와 같다. 반응 20 시간에 B. subtilis sp. 배지와 쑥분말 5%를 함유하는 발효액에서는 투명환이 나타나지 않았으나, 반응 30시간부터 투명환이 나타나기 시작했다. 미나리 발 효액과 신선초 발효액은 플라스민에 비하여 높은 항혈전 활성을 나타냈으며, 쑥(10%) 발효액과 취나물 발효액은 플라스민과 비슷한 활성을 보였다.

표 2. 산야초 발효액에 따른 투명환의 크기

실시예 4: 항균 활성

표 3에 나타낸 바와 같이, 산야초 착즙액의 항균활성은 없는 것으로 나타났다. 즉, 참나물, 취나물, 미나리, 곰취 착즙액에 대해 E. coli는 85~109%, 황색 포도상 구균인 S. aucreus는 97~104%를, B. subtilis는 95~106%의 생존율을 나타내어 이들 균에 대한 항균효과가 없는 것으로 판단된다. 한편으론, 장류의 주요 발효균 가운데 하나인 B. subtilis에 대해 항균활성을 나타내지 않아 장류 소재 개발에 산야초 착즙액을 이용할 수 있을 것으로 판단된다.

표 3. 산야초 착즙액의 항균 활성

실시예 5: 산야초 발효액의 발효조건 최적화

가. 탄소원의 영향

쑥분말 10% 환원액을 기본 배지로 하여 탄소원 종류별로 1%를 첨가하여 Bacillus subtilis sp. starter 2%(v/v)를 접종하고 37℃에서 60시간, 200rpm으로 진탕 배양하면서 프로테아제 활성에 미치는 탄소원의 영향을 검토한 결과는 도 3에 나타난 바와 같다. 프로테아제 활성이 전반적으로 낮은 상태로 비교적 높은 효과를 나타내는 탄소원은 덱스트로스이었다.

덱스트로스를 0~5%로 농도를 조정하여 효소활성을 측정한 결과는 도 4에 나타낸 바와 같다. 즉, 프로테아제 활성이 전반적으로 낮은 상태로 비교적 높은 활성을 나타내는 시료는 덱스트로스 3% 첨가구이었다.

나. 질소원의 영향

쑥분말 10% 환원액을 기본 배지로 하여 질소원 종류별로 1%를 첨가하여 Bacillus subtilis sp. starter 2%(v/v)를 접종하고 37℃에서 60시간, 200rpm으로 진탕 배양하면서 프로테아제 활성에 미치는 질소원의 영향을 검토한 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다.

프로테아제 활성에 우수한 효과를 보인 질소원은 전지대두분과 청국장 분말로 프로테아제 활성이 약 30 유닛을 나타내 비교적 높은 것으로 판단된다. 경제성을 고려할 때, 청국장 분말보다 전지 대두분을 첨가하는 것이 유리할 것으로 판단된다.

한편, 덱스트로스와 전지 대두분 병용시 덱스트로스 첨가 유무가 프로테아제 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 덱스트로스 농도를 0%와 3%로 대별하고 여기에 전지 대두분을 0~5%로 조정하여 프로테아제 활성에 미치는 영향을 검토한 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이 덱스트로스를 첨가하지 않고, 전지대두분 0.5%를 첨가한 시료에서 프로테아제 활성이 높게 나타났다.

다. 배양온도가 프로테아제의 생산에 미치는 영향

프로테아제 생산에 미치는 배양온도의 영향을 조사하기 위해 전지 대두분 0.5%를 첨가한 쑥 분말 10% 환원액을 실온(RT, 25±2℃), 40±2℃, 50±2℃에서 200rpm으로 60시간 발효한 발효액의 프로테아제 활성도를 측정한 결과는 도 7에 나타낸 바와 같다.

배양온도에 따른 프로테아제 활성도는 비교적 낮은 편으로 배양온도 40℃에서 프로테아제 활성도가 높게 나타났다. 즉, 실온 배양액에서는 프로테아제 활성도가 거의 나타나지 않았고, 50℃ 배양액에서는 40℃ 배양액에 비하여 낮게 측정되었 다. 이를 통해 프로테아제 생산을 위한 B. subtilis 발효는 40℃ 전후에서 하는 것이 바람직하다고 판단된다.

B. subtilis로 효소생산을 위한 발효를 함에 있어서, 일반적으로 40~50℃에서 효소활성도가 높은 것으로 보고된 바 본 실험 결과도 이와 유사한 경향을 나타내었다.

라. 발효시간이 프로테아제의 생산에 미치는 영향

프로테아제 생산에 미치는 발효시간의 영향을 조사하기 위해 전지 대두분 0.5%를 첨가한 쑥 분말 10% 환원액을 40±2℃에서 200rpm으로 발효할 때, 발효시간 별로 프로테아제 활성을 측정한 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다.

발효 48시간까지는 프로테아제 활성이 증가하나, 발효 60시간에서 그 활성이 대폭 감소하다가 발효 72시간에 다시 증가하였다. 발효 84시간에 프로테아제 활성은 약 15 유닛으로서 최대치를 나타내었다. 이상에서 쑥분말 10% 환원액에 전지 대두분 0.5%를 첨가하고 B. subtilis로 발효시킬 때 프로테아제활성이 높게 나타나는 발효시간은 72시간 이상임을 확인하였다.

마. 산야초 착즙액이 프로테아제의 생산에 미치는 영향

프로테아제 생산에 미치는 종류별 산야초 착즙액의 영향을 조사하기 위하여, 최대 효소 생산을 나타내는 전지 대두분 0.5%로 첨가한 종류별 산야초 착즙액을 가압 멸균 후 B. subtilis를 무균적으로 접종하고 40℃에서 5일간 200rpm으로 진탕 배양했을 때, 종류별 산야초 발효의 프로테아제 활성도는 도 9에 나타낸 바와 같다.

미나리발효액과 신선초발효액의 프로테아제 활성이 30 유닛 내외로 가장 높았고, 다음으로 쑥분말 10% 환원 발효액이 약 25 유닛을 나타내 기능성 식품소재로서 이용할 수 있는 가능성이 있는 것으로 판단되며, 취나물발효액, 머위발효액, 케일발효액의 프로테아제 활성도는 약 5 유닛 내외를 나타내었다. 한편, 참나물발효액에서는 활성이 나타나지 않았다.

이와 같이 산야초 착즙액 종류별로 동일한 조건에서 발효시킨 발효액에서 활성도 차이는 착즙액 중에 B. subtilis sp.의 생육에 영향을 주는 bacteriostatic effect와 관련이 있을 것으로 추정된다.

실시예 6: 산야초 발효액의 관능특성

산야초 발효액의 색, 향, 맛, 전체적인 기호도를 7점 채점법 (7점 아주좋다, 4점 보통이다, 1점 아주 나쁘다)으로 검사한 결과는 하기와 같다.

산야초 발효액의 색상의 선호도는 미나리발효액 4.4±1.7, 신선초발효액 4.0±1.2, 취나물 발효액 4.0±1.4, 머위발효액 3.8±1.7, 쑥발효액 3.7±1.4, 참나물발효액 3.5±1.4, 케일발효액 3.0±1.7 순으로 산야초 발효액간의 유의차는 없는 것으로 나타났다. 그러나, 미나리발효액, 신선초발효액, 취나물발효액 색상이 선호되는 경향이 있고, 케일발효액의 색상은 선호되지 않는 경향이 있는 것으로 나타났다.

산야초 발효액의 향의 선호도는 미나리발효액 5.0±1.0, 쑥발효액 3.8±1.2, 취나물 발효액 3.8±0.8, 신선초발효액 3.6±1.5, 머위발효액 3.2±0.7, 참나물발효액 2.8±1.0, 케일발효액 1.8±0.8 순으로 미나리발효액, 쑥발효액, 취나물 발효액 향이 유의적으로 선호되었다.

산야초 발효액의 맛의 선호도는 쑥 발효액 4.4±1.1, 미나리 발효액 4.3±0.5, 머위 발효액 4.0±1.3, 참나물발효액 3.0±1.3, 취나물 발효액 3.0±1.4, 신선초발효액 2.7±1.2, 케일발효액 2.3±0.8 순으로 쑥발효액과 미나리발효액의 맛이 유의적으로 선호되었다.

산야초 발효액의 전체적인 기호도는 쑥 발효액 4.4±0.5, 미나리 발효액 4.2±1.5, 머위 발효액 3.7±1.2, 신선초발효액 3.2±1.0, 참나물발효액 3.0±0.9, 취나물 발효액 2.4±0.9, 케일발효액 2.4±0.9 순으로 쑥발효액과 미나리발효액이 나머지 발효액에 비해 전체적인 기호도가 유의적으로 높았다.

도 1은 산야초 착즙액의 항혈전 활성을 보여준다. 각 시료에 대한 설명은 표 1을 참고한다. P는 양성대조군으로서 플라스민을 나타내며, 1은 증류수이며, 2~9는 산야초 착즙액을 나타낸다.

도 2는 산야초 발효액의 항혈전 활성을 보여준다. 각 시료에 대한 설명은 표 2를 참고한다. P는 양성대조군으로서 플라스민을 나타내며, 2는 B. subtilis sp. 배지이며, 2~9는 산야초 착즙액을 나타낸다.

도 3은 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 탄소원의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말을 포함하는 착즙액에 37℃, 200rpm으로 60시간 키웠다. NC, none carbon ; D, 덱스트로스; S, 수크로스; SS, 가용성 전분(soluble starch).

도 4는 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 덱스트로스 농도의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말을 포함하는 착즙액에 37℃, 200rpm으로 60시간 키웠다. D, 덱스트로스

도 5는 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 질소의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말 및 상이한 질소원을 포함하는 착즙액에 37℃, 200rpm으로 60시간 키웠다. NN, none nitrogen; YE, 효모 추출액; PT, 펩톤; SF, 대두 분말(soy flour); CKJ, 청국장 분말; NaN, NaNO₃

도 6은 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 대두 분말의 영향 을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말 및 상이한 농도의 질소원을 포함하는 착즙액에 37℃, 200rpm으로 60시간 키웠다. SF, 대두 분말; D, 덱스트로스; D3 덱스트로스 3%; D0 덱스트로스 0%; SF0 대두 분말 0%; SF0.5 대두 분말 0.5%; SF1 대두 분말 1%; SF2 대두 분말 2%; SF3 대두 분말 3%; SF5 대두 분말 5%

도 7은 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 온도의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말을 포함하는 착즙액에 200rpm으로 60시간 동안 상이한 온도에서 키웠다. RT, 실온

도 8은 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 발효시간의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 10% 쑥분말을 포함하는 착즙액에 37℃, 200rpm으로 다양한 시간 동안 키웠다.

도 9는 바실러스 서브틸리스 종의 프로테아제 생산에 대한 다양한 산야초 착즙액의 영향을 보여준다. 바실러스 서브틸리스 종을 상이한 착즙액에 40℃, 200rpm으로 5일 동안 키웠다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 산야초를 착즙하여 착즙액을 얻는 단계;

   상기 착즙액에 질소원으로 대두 분말 또는 청국장 분말을 첨가하고 가열 살균하는 단계;

   상기 질소원이 첨가된 착즙액에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주의 배양액을 0.5~5%(v/v) 접종하고 35~55℃에서 60~100시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는 혈전용해 활성을 갖는 산야초 발효액의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 질소원은 대두 분말 0.1~5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 산야초는 신선초, 미나리, 쑥, 취나물, 머위, 참나물 또는 케일인 것을 특징으로 하는 방법.

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