KR100842052B1 - 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서 구체적으로, 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 택사, 및 계지를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 뇌 신경세포의 허혈성 및 산화적 손상에 대한 보호 효과가 탁월하여 뇌졸중 등 뇌혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Cerebrovascular Diseases}

도 1은 본 발명의 조성물의 화학적 특성을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.

도 2는 본 발명의 조성물이 허혈/재관류 시 쥐의 뇌 조직 손상에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. 대조군 및 실험군(A)의 허혈로 인한 손상 조직의 부피(%)를 보여준다.

도 3은 본 발명의 조성물을 투여한 실험군(도 3a)과 대조군(도 3b)의 뇌 절편 사진이다.

본 발명은 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 택사 및 계지를 유효 성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

뇌혈관 질환(cerebrovascular disease)은 뇌의 정상적인 혈액공급 장애에 의한 신경 질환(neurologic deficit)을 말하는 것으로, 뇌혈관 사고(cerebrovascular accident, CVA) 또는 뇌졸중(stroke)이라고도 하며, 우리나라에서는 옛날부터 중풍이라고 불렀다. 뇌졸중(중풍)은, 뇌 조직에 산소와 포도당 같은 영양분을 공급하는 뇌혈관이 정맥염, 정맥류(aneurysm), 고혈압, 동맥경화 및 혈전색전증 등 여러 가지 원인으로 좁아지거나 파열되어 혈액을 충분히 공급하지 못하게 됨에 따라, 혈류량 감소, 허혈 또는 출혈 등을 나타냄으로서 발생한다. 발생빈도(incidence), 유병률(prevalence rate), 사망률이 높은 중요한 질환이며, 손상 받은 부위와 허혈, 경색이나 출혈의 정도에 따라 의식장애나 마비 등 증상은 다양하다.

뇌졸중은 국내를 포함한 전 세계적으로 중요한 사망 원인 중 하나이며, 평균수명의 연장에 의한 고령층의 인구증가에 따라서 심장 질환 및 악성 종양과 함께 성인의 3대 사인을 이루고 있다.

뇌졸중에 대해서는 동, 서양에서 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히 미국에서는 1958년에 최초로 이를 NINDB-I (National Institute of Neurological Diseases and Blindness) 기준으로 분류 하였고, 그 후 1975년에 이를 수정 보완하여 NINCD-II (National Institute of Neurological Diseases and Communicative Disorders) 기준으로 분류 하였으며, 또한 1981년에는 NINCDS (National Institute of Neurological Diseases and Communicative Disorders and Stroke)에서 역학조사 를 통하여 이를 진단기준에 첨가하여 분류하였고, 1990년에는 NINDS-III(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) 기준의 분류를 통하여 더욱 체계적이고 세분화하여 정교하게 수정 보완한 후 현재까지 사용하고 있다.

90년대에는 뇌졸중 치료에 대한 많은 발전이 있었으나 아직도 매우 미진한 상태이다. 뇌졸중의 치료에서 뇌 조직은 한번 손상되면 재생되지 않기 때문에 뇌졸중 치료에 있어서 제일 중요한 것은 예방이다. 뇌졸중의 치료의 목적은 1) 위험인자를 감소시키는 것과 2) 이미 있는 병변을 미리 치료하여 재발을 막고 3) 뇌경색이 왔을 때 뇌부종을 감소시키고, 허혈 상태인 곳은 적절하게 순환되게 하여 이차적인 뇌 손상을 줄이는 것이다.

따라서, 뇌졸중 발생 시에 일어나는 뇌신경 세포의 손상 기전을 이해하고 더 나아가 이러한 뇌 신경세포의 손상을 지연 혹은 예방할 수 있는 뇌 신경세포 보호 약물 개발하려는 연구가 활발하다.

한의학에서는 뇌졸중의 상용 처방으로, 안궁우황환(安宮牛黃丸), 황련해독탕(黃連解毒湯) (Xu J et al. J Ethnopharmacol 2000;73(3):405-13.), 조등산(釣藤散), 대승기탕(大承氣湯), 곽향정기산(藿香正氣散), 성향정기산(星香正氣散), 우황청심원(牛黃淸心元) (문상관. 서울: 경희대학교 박사학위논문; 2000.7)등이 임상에서 주로 활용되고 있다.

특히 우황청심원(牛黃淸心元)은 태평혜민화제국방(太平惠民和劑局方)에 최초로 기록되었으며, 국내에서 중풍구급약 또는 치료제로 가장 널리 사용되고 있다. 그러나, 우황청심환은 그 구성약물이 28종으로 약효의 실험적 근거를 밝히기 어렵고, 웅황(雄黃), 주사(朱砂) 등 중금속 약물은 만성 독성이 우려되므로 주의가 필요하며, CITES (the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) 협약 (환경부 국제협력관실. 행정간행물등록번호 38000-67042-97-200005. 서울: 환경부; 2000.)으로 인해 사향(麝香), 서각(犀角)등 동물 신체의 일부로 구성된 약은 사용할 수 없는 문제점을 가지고 있다.

따라서, 유효 성분이 표준화되고 효능 안전성이 확보된 생약을 이용함과 동시에 그 구성이 간단한 뇌혈관 질환 예방 및 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 육미지황원은 자음작용(滋陰作用)의 삼보(三補)(숙지황, 산수유, 산약)와 청열이수작용(淸熱利水作用)을 가지는 삼사(三瀉)(목단피, 택사, 복령)로 구성되는 처방으로 자보간신(滋補肝腎), 청허열(淸虛熱), 이습(利濕)등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 그 적응증으로는 신질환, 방광질환, 구루병, 바세도우씨병, 백내장, 변비, 사지 번열, 폐결핵이 있다.

한편, 계지는 그 추출물이 항혈전작용, 항염증작용, 충치억제작용(발열, 진정작용)이 있음이 보고되어 있고, 이는 계지의 시남알데히드 및 정유 성분에 기인한 것으로 알려져 있다(일본약학회지 103: 313 1983). 계지의 주요성분인 시남알 데히드는 혈압강하, 혈류량 증가 작용이 있는 것으로 알려져 있으며(Chem. Pharm. Bull 23: 941, 1975), 그 작용은 주로 내인성 카테콜아민 유리작용과 관계가 있는 것으로 생각되고 있다(J. Pharmacobiodyn 1: 89, 1978). 이외에도 시남알데히드는 혈소판응집인자인 트롬복산 A2의 생산을 억제하여 항혈소판응집작용을 하는 것이 보고된 바 있다(일본화한의약학회지 29: 228, 1992).

이에 본 발명자들은 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용 생약 조성물 개발에 노력하던 중, 육미지황원에 관한 연구를 시작하게 되었고, 종래 한방에서 신장질환 치료제로 사용되던 육미지황원의 주 재료 및 이와 구별되는 약리학적 특성을 가진 계지를 추가적으로 함유하는 생약 조성물이 뛰어난 뇌 신경세포 보호 활성을 나타냄을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 뇌 신경세포 보호 활성이 뛰어난 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 택사 및 계지를 유효 성분으로 함유하는 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물의 각 성분 약재별 약리학적 특성은 다음과 같다.

숙지황(熟地黃: Rehmanniae Radix Preparata)은 생진(生津)작용에 상응하는 혈당강하작용이 실험적으로 확인되었고; 산약(山藥 : Dioscoreae Rhizoma)의 보신삽정(補腎澁精)효능은 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone) 수용체수 증가작용이 실험적으로 밝혀져 있어 그 근거가 되고 있으며; 산수유(山茱萸 : Corni Fructus)는 자양, 강장, 수렴작용을 가진 약물로 전탕액이 이뇨작용, 혈압을 일시적으로 떨어뜨리는 작용이 실험적으로 밝혀져 있으며, 그 외에도 항당뇨작용, 지방분해억제작용 등이 알려져 있다.

복령(茯笭 : Hoelen)의 이수삼습(利水渗濕)효과는 이뇨 작용으로 그 의미를 파악할 수 있으며; 목단피(牧丹皮 : Moutan Cortex Radicis)의 청열양혈(淸熱凉血)작용은 현대의학의 항염증작용과 상관성이 있을 것으로 추정되고, 그 활혈산어(活血散瘀)작용으로 혈소판응집억제작용과 혈관수축억제작용, 실험적 DIC 경감 작용이 보고되고 있으며; 택사(澤瀉 : Alismatis Rhizoma)의 이뇨작용은 활성성분인 알리솔(alisol) A와 B의 요량 개선 작용(일본생약학회지 36: 150, 1982)과 생쥐의 요독증 개선이 보고된 바 있다.

계지의 발한해표(發汗解表), 활혈통경(活血通經) 작용은 계지(桂枝 : Cinnamomi Cortex)의 시남알데하이드(cinnamaldehyde)와 정유성분의 혈관확장작용으로 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 생약의 건조 중량을 기준으로 숙지황 7-22 중량부, 산약 5-12 중량부, 산수유 5-12 중량부, 복령 3-9 중량부, 목단피 3-9 중량부, 택사 3-9 중량부, 계지 3-9 중량부를 함유하는 것이 바람직하며, 숙지황 15 중량부, 산약 7.5 중량부, 산수유 7.5 중량부, 복령 5.6 중량부, 목단피 5.6 중량부, 택사 5.6 중량부, 계지 5.6 중량부를 함유하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물은 상기 생약의 혼합 추출물을 포함할 수 있다. 상기 생약의 혼합 추출물은 각 성분 약재를 물에 씻어 건조시킨 후 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매에 침적, 가열 환류하고, 이를 여과, 농축 및 동결 건조하는 과정을 거쳐 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 뇌졸중의 실험 연구 모델로서 사용이 증가하고 있는 중대뇌동맥폐쇄(MCA occlusion, MCAo)이용한 국소 뇌허혈 흰쥐 모델에서, 23.8%(300 mg/kg) 및 43.1%(1,000 mg/kg)의 우수한 뇌 신경세포 보호 효과를 나타내며, MCAo 흰쥐 모델의 허혈 유발 뇌조직에서 신경세포 손상을 억제하는 것으로 알려진 GST((glutathione S-transferase)의 발현을 증가시키고, 허혈 후 염증 억제작용을 방해하는 IRF-1(interferon regulatory factor-1) 및 뇌졸중 예측 인자인 IL-6(interleukin-6)의 발현을 억제함으로써 뇌혈관 질환의 예방 및 치료에 유용하게 쓰일 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 투여 및 정맥, 근육, 경피 투여 등 비경구 투여의 방법으로 투여될 수 있다.

실제 임상에서 사용될 수 있는 경구 및 비경구 투여를 위한 제제로 제형화 하는 경우에, 통상적인 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제가 포함될 수 있다. 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제제는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제형화한다.

또한, 본 발명의 조성물은 한방에서 사용되는 통상적인 방법으로 탕제, 환제 및 기타 형태로 제형화 되어 경구 투여 될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율, 배 설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일에 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그 유효용량은 상기 생약의 혼합 추출물의 건조 중량을 기준으로 10 ~ 5,000 ㎎/㎏/일 이고, 바람직하기로는 100 ~ 3,000 ㎎/㎏/일 이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 혼합 추출물의 제조

1) 숙지황 15 중량부, 산약 7.5 중량부, 산수유 7.5 중량부, 택사 5.6 중량부, 복령 5.6 중량부, 목단피 5.6 중량부, 계지 5.6 중량부의 비율로 혼합하여(총중량: 262.5 g) 1.5 ℓ 3차 증류수에 넣어 90℃에서 3 시간 환류 추출한 것을 실온에 방치하여 침전시킨 후 상등액을 3 MM 여과지로 여과하여 동결 건조기를 이용하여 분말화 시켜, 114.4 g(43.6 %)의 추출물을 얻었다. 본 추출물은 -20℃에서 보관하였으며 하기 실험예에서 사용하였다.

<실험예 1> HPLC 분석

본 발명의 조성물의 표준화와 약효의 안정성을 확보하기 위하여 HPLC를 이용하여 대한약전 등에 제시되어있는 지표성분으로 상기 실시예 1의 추출물에 대한 정 성·정량분석을 실시하였다. HPLC 분석조건은 표 1과 같다.

펌프	Shimadzu LC-10AD vp
검지기	Shimadzu SPD-10A vp UV-VIS detector
컬럼	Aquasil C18 (4.6 X 250 mm)
파장	5-HMF : 283 nm loganin : 237 nm paeonol : 274 nm cinnamaldehyde: 288 nm
컬럼온도	Room temperature
용매계	(A= 0.05% TFA in H2O : B=0.05 % TFA in acetonitrile 0 min) (0 min 100:0, 20 min, 90:10, 40 min 70:30, 60 min 50:50, 80 min 0:100, 90 min 100:0)
용출속도	1 ㎖/min

표 2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 추출물에는 숙지황의 5-HMF가 0.17 %, 산수유의 로가닌(loganin)이 0.25 %, 목단피의 파에오놀(paeonol)이 0.036 %, 계지의 시남알데하이드(cinnamaldehyde)가 0.0025 % 각각 함유되어 있었다.

분석물질	머무름시간 (min)	함량(%) 실시예1
5-HMF	19.08	0.17
Loganin	34.51	0.25
Cinnamaldehyde	56.97	0.0025
Paeonol	56.27	0.036

<실험예 2> MCAo 모델을 이용한 뇌 신경세포의 허혈성 손상에 대한 치료 효능 실험

1) 실험동물

체중 240~260 g의 웅성 흰쥐(Sprague-Dawley Rat)를 사용하였다. 실험실 조건에 적응시키면서 물과 사료를 충분히 공급하면서 사육하여, 280~320 g이 되었을 때 선별하여 수술 전날 물만 공급하여 실험에 사용하였다.

2) 중대뇌동맥폐쇄를 이용한 일시적 국소뇌허혈 유발

Zea-Longa의 방법을 응용한 관내봉합법(Intraluminal suture method)을 사용하였다. 25 ㎜의 4-0 나일론 봉합사의 끝 부분에서 약 5 ㎜길이를 실리콘으로 코팅하되 지름이 0.28~0.30 ㎜가 되게 제작하여 실험에 사용하였다. 흰쥐를 70 % N₂O와 30 % O₂가 섞인 혼합가스에 5 %의 이소플루란(isoflurane)으로 전마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙을 피부절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인 익돌근구개동맥을 전기소작하고 외경동맥을 자르고 프로우브(probe)를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 18∼20 ㎜정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연 회복시켰다. 수술 120분 후 같은 방법으로 재마취하여 프로우브(probe)를 후퇴시켜 재관류시켰다. 모든 수술과정은 이소플루란을 2 %로 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였으며, 체온이 37 ± 0.5℃이하로 떨어지지 않도록 체온유지장치 (Harvard apparatus, Holliston, MA)를 이용하였다.

3) 본 발명의 조성물의 투여와 실험군의 설정

실시예 1에서 제조된 추출물(300 mg/kg, 1,000 mg/kg)을 중대뇌동맥 폐쇄와 동시에 1회, 120 분 후 1회 경구투여 하였다.

4) 트리페닐테트라졸륨 클로라이드를 이용한 뇌 조직 염색

재관류 후 24 시간 뒤에 경추 탈골시켜 2 분 이내에 뇌를 적출 하여 뇌 해부 지침(brain dissection guide, Harvard Instruments Large Rat Brain Matrix, Coronal, #52-4512c)를 이용하여 정수리점(bregma)으로부터 +3 ㎜의 부위로부터 2mm의 두께로 잘라서 6 개의 절편으로 나누었다. 이 절편들을 2 % 트리페닐테트라졸륨 클로라이드가 들어 있는 16 웰 플레이트(well plate)에 조직을 충분히 담그고 37℃에서 30분동안 방치한 후 4 % 파라포름알데히드로 고정시켜 조직을 관찰하였다.

5) 뇌 손상 부위 측정

고정된 6 개의 조직을 디지털 카메라로 하나씩 촬영한 후 컴퓨터에서 옮겼고, 이미지 분석프로그램 (Optimas 6.5 Media cybernetics, U.S.A.)을 이용하여 허혈 부위의 부피를 계산하였다(수학식 1 참조). 뇌 허혈의 부피는 아래의 수학식 2와 같이 허혈이 유발되지 않은 좌반구의 전체부피에서 우반구의 손상되지 않은 부위를 뺀 실제 조직 손상 부위를 좌반구 전체에서 퍼센트로 계산하였다.

뇌허혈 유발로 인한 손상 조직의 부피 =

(비손상 좌반구의 전체 부피) - (손상 우반구의 정상 부위의 부피)

전체 반구에서의 허혈로 인한 손상 조직의 부피 (%) =

[(뇌허혈 유발로 인한 손상 조직의 부피)/(비손상 좌반구의 전체 부피)] x 100

그 결과를 도 2에 도시하였다.

또, TTC 염색 이후 절개된 쥐의 뇌 사진을 도 3에 도시하였다. 각 슬라이스의 두께는 2 mm 였다.

5) 결과

상기와 같이 허혈로 인한 손상 조직의 부피를 계산한 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 허혈로 인한 손상 조직의 부피는 32.87 ± 2.69% 인 반면, 본 발명의 조성물을 각각 300 ㎎/㎏ 및 1,000 ㎎/㎏ 투여한 실험군의 경우는 약 22.75 ± 6.64 % 및 17.62 ± 3.73 % 로서 대조군과 비교하였을 때 각각 23.8% 와 43.1%(상대오차(S.E.)의 중앙값을 더하여 비례식으로 계산하였음)의 뇌 신경세포 보호 효과를 나타내었다.

또한, TTC 염색 이후에 각각의 조직 샘플을 살펴보면 대조군(도 3b)에 비해 본 발명의 조성물을 투여한 실험군(도 3a)의 피질의 경색 부위가 줄어든 것을 볼 수 있었다.

이와 같은 결과는 기존의 뇌 신경세포 보호약물인 LY231617이 25~30%, L- NAME가 23%, 3-브로모-7-니트로인다졸이 20% 등의 보호 효과(O'Neill MJ 등, Eur J Pharmacol 1996; 310)를 보인 것과 비교하여 본 발명의 조성물의 뇌 신경세포 보호 효과가 매우 우수함을 보여준다.

<실험예 3> 유전자칩(Genechip)을 이용한 유전자 발현 조사

MCAo 흰쥐 모델의 허혈 유발 뇌조직에서 본 발명의 조성물이 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

1) 총 RNA(Total RNA)의 추출

MCAo 동물 모델의 뇌 허혈된 뇌 조직 100 mg당 1 ml의 트리 리에이전트(Tri Reagent, Molecular research center)을 넣고 균질화시켜 시료를 준비하였다. 여기에다 0.2 vol의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 흔든 다음 얼음에 5분간 방치한 후 4℃, 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 상징액을 다른 튜브로 옮겨 동일 부피의 이소프로판올을 첨가 후 4℃에서 15분간 방치 후 4℃, 12,000g에서 15분간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 침전물에 약 1 ml의 75 % 에탄올을 첨가하고 4℃, 7,500g에서 8분간 원심 분리하여 침전물을 건조시켜 20 ㎕의 DEPC-워터에 녹여 RNA농도를 측정하였다.

2) 유전자칩 처리(Genechip processing)

Affymetrix사의 유전자칩(RG-U34A)을 사용하였다.

총 RNA는 A260/A280 비(ratio)가 1.8이상이고 5.0-20.0 ㎍이 소요되었다.

제 1가닥(First-strand) cDNA 합성은 50 μM T7-올리고(dt) 프라이머(T7- oligo(dt) primer) 2 ㎕, 총 RNA 10 ㎍을 70℃에서 10분간 반응시키고 얼음에 정치하였다. 첫가닥(First-strand) cDNA 버퍼 4㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, 10mM dNTP 1 ㎕를 상기 튜브와 섞은 후 42℃에서 2분간 반응시켰다. 역전사효소(SuperScript II RT)를 500 U이 되도록 튜브에 넣어 잘 섞은 후 42℃에서 1시간 반응시켰다.

제 2가닥(Second-strand) 반응을 위해 DEPC 워터 91 ㎕, 제 2가닥 반응 버퍼(Second-strand reaction buffer) 30 ㎕, 10 mM 혼합 dNTP 3 ㎕, 10 U/㎕ E. coli DNA 리가제 1 ㎕, 10 U/㎕ E. coli DNA 폴리머라제 I 4 ㎕, 2 U/㎕ E. coli RNase H 1 ㎕를 상기 튜브에 넣어 잘 섞은 후 16℃에서 2시간 반응시켰다. 여기에 10 U의 T4 DNA 폴리머라제를 넣어주고 16℃ 에서 5분간 정치하였다. 0.5 M EDTA를 10 ㎕ 넣어주고 정제과정을 거쳐서 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

바이오틴 표지(Biotin-labeled) cRNA의 제조에는 증폭 안티센스 RNA 기술(Enzo BioArray HightYield RNA Transcript labeling Kit, Affymetrix, USA)을 사용하였다. cRNA의 바이오틴 표지를 위해 상기 제조된 주형(template) cDNA 8 ㎕, 이온제거수(deionized water) 14 ㎕와 키트 내에 들어있는 10× HY 반응 완충액(HY reaction buffer) 4 ㎕, 10× 바이오틴 표지 리보뉴클레오티드 4 ㎕, 10× DTT 4 ㎕, 10× RNase 억제 혼합물(RNase inhibitor mix) 4 ㎕, 20× T7 RNA 폴리머라제 2 ㎕를 합해 총 부피가 40 ㎕이 되게 맞춘 후, 조심스럽게 섞고, 원심분리기로 5초간 스핀다운(spindown)하고, 즉시 37℃ 에서 4~5 시간동안 반응시켰다. 이때 30~45 분에 한번씩 조심스럽게 섞어주었다. 분광기(Spectrophotometer)로 A260에서 정량하였다. 그리고 사용할 때까지 -20℃ 또는 -70℃에 보관하였다.

혼성화(Hybridization)를 위해서, 먼저 혼성화 칵테일(Hybridization cocktail)을 99℃에서 5분간 두고, 45℃에서 5 분간 정치하였다. 프로우브 어레이(probe array)는 1 배의 혼성화 버퍼(hybridization buffer)를 45℃에서 10 분간 정치하고 여기에 혼성화 칵테일(hybridization cocktail)를 넣어 45℃의 혼성화 오븐(Hybridization Oven)에서 16 시간 동안 혼성화를 수행하였다..

세척(Washing)과 염색(staining)은 Affymetrix사의 플루이딕 스테이션(Fluidics Station)에서 기기 프로토콜대로 실행하였다. 프로우브 어레이(probe array)의 스캐닝은 Affymetrix의 마이크로어레이 스위트(Microarray Suite) 프로그램으로 유전자칩 스캐너(GeneChip Scanner)를 조절하여 스캔하였다.

3) 결과

본 발명의 조성물에 의한 유전자 발현의 변화를 살펴본 결과, 본 발명의 조성물 투여군의 경우 IRF-1(interferon regulatory factor-1) 및 IL-6(interleukin-6)의 발현이 대조군에 비해 억제 되었고, GST (glutathione S-transferase)의 발현은 대조군에 비해 증가되었다 (표 3).

IRF-1는 전염증(pro-inflammatory) 유전자 발현을 촉진하여 허혈 후 염증을 줄이는 작용을 억제하는 것으로 알려져 있으며(Cytokine Growth Factor Rev. 8, 2934, 1997), IL-6는 염증 관련 인자로서 뇌졸중 예측인자로 CRP (C-reactive protein)보다 유용하다고 알려져 있다 (Circulation, 108:2317, 2003). GST는 허혈 후 생성되는 ROS (reactive oxygen species)를 없애서 산화적 손상으로 인한 신 경세포 손상을 억제한다 (Neurochem. Int. 29,565,1996).

따라서, 본 발명의 조성물은 뇌 신경세포의 산화적 손상을 억제하는 유전자의 발현을 증가시키고 염증 관련 유전자의 발현을 억제함으로서 뇌 신경세포를 보호함을 알 수 있다.

유전자명칭	기능	Fold change
IRF-1	염증	0.2
IL-6	염증	0.1
GST	산화적 손상 억제	2.0

본 발명의 조성물은 뇌 허혈이 유발된 손상 조직 부위를 회복시키고, 피질의 경색 부위를 감소시켜 뇌 신경세포의 허혈성 손상에 대한 보호 효과가 기존의 약물들에 비하여 뛰어날 뿐 아니라, 뇌 신경세포의 산화적 손상을 억제하는 유전자 발현을 증가시키고 염증 관련 유전자 발현을 억제하는 효과가 있어 뇌혈관 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

Claims (3)

1. 생약 건조 중량을 기준으로 숙지황 7-22 중량부, 산약 5-12 중량부, 산수유 5-12 중량부, 복령 3-9 중량부, 목단피 3-9 중량부, 택사 3-9 중량부 및 계지 3-9 중량부를 함유하는 조성물을 물에 씻어 건조시킨 후 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매에 침적, 가열 환류하고, 이를 여과, 농축 및 동결 건조하는 과정을 거쳐 제조되는 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 생약 건조 중량을 기준으로 숙지황 15 중량부, 산약 7.5 중량부, 산수유 7.5 중량부, 복령 5.6 중량부, 목단피 5.6 중량부, 택사 5.6 중량부 및 계지 5.6 중량부를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환이 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 약학조성물.

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