KR101118371B1

KR101118371B1 - 로가닌 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101118371B1
Application number: KR1020100041088A
Authority: KR
Inventors: 장춘곤
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-03-09
Also published as: KR20110121483A

Abstract

본 발명은 로가닌(loganin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

로가닌 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of Parkinson's disease, stress, aging, stroke or Huntington's disease comprising loganin and pharmaceutically acceptable salts thereof}

본 발명은 로가닌(loganin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환에 활성을 가지는 로가닌 및 약학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 로가닌 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 다양한 뇌신경계 이상으로 인한 현대인들의 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 예방 및 치료하는 약학조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며(Markesbery, Oxidative Stress Hypothesis in Alzheimer's Disease, Free radical biology & medicine, 1997, v.23, pp. 134-147), 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계(hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis), 해마(hippocampus), 선조체(striatum), 흑질(subtantia nigra) 그리고 전뇌피질(frontal cortex) 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Yu et al., Alzheimer's Disease and Oxidative Stress, 2006, v.23, pp.1142-1148; Mirescu et al., Stress and adult neurogenesis, Hippocampus, 2006, v.16, pp.233-238; Lotharius and Brundin, Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein, Neuroscience, 2002, v.3, pp.932-942; Lee et al., Repression of phospho-JNK and infarct volume in ischemic brain of JIP1-deficient mice, Journal of neuroscience research, 2001, v.74, pp.326-332; Graham, Hostility and pain are related to inflammation in older adults, Brain, behavior, and immunity, 2006 v.20, pp 389-400). 특히 산소에서 유리되는 자유라디칼(Free radical)은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼(oxygen radical)의 종류에는 과산화수소(H₂O₂), 과산화수소 음이온(O₂ ^-), 수산화기(OH) 등이 있고, 이중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다(McCord, 1985, Free radicals and myocardial ischemia: Overview and outlook, 1988, Free radical biology & medicine, v.4, pp.9-14; Rantan et al., Ascorbic acid and focal cerebral ischaemia in a primate model, 1994, Acta neurochirurgica, v.123, pp.87-91).

뇌신경세포에 산화적 스트레스(oxidative stress)를 주게 되면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트(glutamate), 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca² ⁺ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca² ⁺의 증가는 또한 카스파제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다(Annunziato et al., Apoptosis induced in neuronal cells by oxidative stress: role played by caspases and intracellular calcium ions, 2003, Toxicology letter, v.139, pp.125-133). 뇌 허혈 손상에 의한 세포사멸은 Ca² ⁺이온 항상성의 파괴로 인한 흥분성 신경독성, 내형질 세망과 미토콘드리아의 기능불능, 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 등으로 인해 일어나게 된다고 알려져 있다(Wei et al., The antioxidant EPC-K1 attenuates NO-induced mitochondrial dysfunction, lipid peroxidation and apoptosis in cerebellar granule cells, 1999, Toxicology, v.134, pp.117-126).

이러한 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 인한 사망률은 국내뿐만 아니라 세계적으로 매년 증가하고 있는 추세이며, 오늘날 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환 치료 약물 개발에 많은 관심이 모이고 있다. 그러나 임상적으로 유효한 상기 질환들의 약물들은 다양한 부작용들 때문에 사용에 신중을 기해야 하는 단점이 있으며, 다양한 질환을 복합적으로 치료 및 예방할 수 있는 약물은 현재까지 전무한 실정이다.

한편, 인체 유해 물질을 소거하는 항산화제는 합성물질이나 식품 등을 산화작용으로부터 보호하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 최근에는 산화적 스트레스로 인한 퇴행성 뇌질환에 대한 신경 보호성 약물로 연구, 개발이 되고 있는 상황이다.

본 발명에 사용한 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 금은화, 산수유 및 호미카의 주요성분 물질로서 면역기능 조절, 항염증 및 항쇼크에 대한 효과는 보고가 되어있으나(Frederich et al., 2004; Li et al., 2003; Li et al., 2006, Kwon et al., 2009), 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환에 효과가 있다는 문헌은 현재까지 보고된 바 없다.

이러한 배경하에서 본 발명자들은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 이용하여 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환 등과 같은 퇴행성 뇌질환에 대한 신경세포 보호효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서 본 발명은 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 로가닌은 금은화, 산수유 및 호미카 등의 식물로부터 천연적으로 얻거나 또는 당업계에 알려진 방법에 의해 인공적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염"은 통상적인 방법으로 제조한 염을 의미하며, 당업자에게 공지되어 있다. "약학적으로 허용되는 염"은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 다음 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 알칼리코금속, 예를 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

본원에서의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본원에서의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 로가닌이 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로, SH-SY5Y 세포들에 대한 MTT 실험(세포생존효과)을 통해 과산화수소, 6-하이드록시도파민 유도를 통한 세포사멸에서 로가닌이 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었고(도 2), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 LDH 분비 측정 실험에서 로가닌이 LDH 분비를 억제하므로 세포독성이 없음을 알 수 있었으며(도 3), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 ROS 생성 억제 효과 실험에서 로가닌이 ROS 생성을 억제함을 알 수 있었고(도 4), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 미토콘드리아 막 전위 손상 억제 효과 실험에서 로가닌이 미토콘드리아 막 전위에 복구 효과가 있음을 알 수 있었다(도 5). 따라서 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 항산화 및 신경세포 보호작용을 통해 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 유용함을 알 수 있다.

본 발명의 로가닌 또는 그의 염은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제, 또는 희석제를 말한다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 로가닌 또는 그의 염을 포함한 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 로가닌 또는 그의 염은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 로가닌 또는 그의 염을 포함한 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 뇌신경계 관련 정신질환 예방을 위한 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한 조성물은 뇌신경계 관련 정신질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카 라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용 할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환에 효과를 갖는 조성물 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 기능성 식품 조성물은 매실, 천마, 오미자, 감초, 결명자, 석창포, 오적골, 원지, 황기, 산조인, 시호, 창출, 당귀, 지자, 안육, 복령 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 생약 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 언급한 바와 같이 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 다양한 뇌신경계 이상으로 인한 현대인들의 퇴행성 뇌질환, 우울증 및 불안증을 예방 및 치료하는 효과를 갖는 의약품 및 기능성 식품으로서 이용될 수 있다.

도 1은 로가닌의 화학구조식을 나타낸 도이다.
도 2는 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소, 6-하이드록시도파민 유도를 통한 세포사멸에서 로가닌의 신경세포 보호 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 LDH 분비에서 로가닌의 LDH 분비 억제효과를 나타낸 도이다.
도 4는 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 ROS 생성에서 로가닌의 ROS 생성 억제효과를 나타낸 도이다.
도 5는 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 미토콘드리아 막 전위(mitocondria membrane potential) 손상에 있어서 로가닌의 미토콘드리아 막 전위 복구 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 세포사멸에 있어서 로가닌의 세포사멸 관련 단백질들의 발현 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 약물 및 시약

로가닌은 엑스트라신테이즈사(Extrasynthese, France)로부터 구매하여 사용하였고, DCFH-DA(2',7'-dichlorofluoroscein diacetate), DMSO(dimethyl sulfoxide), 6-하이드록시도파민(6-hydroxydopamine), 30% 과산화수소(H₂O₂), 로다민-123(Rhodamine-123), MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], 항-β-액틴은 시그마사(Sigma-Aldrich Chemistry Co.)에서 구입하여 사용하였으며, 항- PARP (poly ADP ribosepolymerase), 항-카스파제-3, 항-백스(Bax), 항-포스포-JNK, 항-포스포-ERK1/2 항체들은 셀시그널링사(Cellsignaling, USA)로부터 구매하여 사용하였고, 항-Bcl-2, 항-포스포-p38, 항-p53 항체들은 에피토믹스사(Epictomics, USA)로부터 구매하여 사용하였으며, 세포독성 어세이 키트(LDH cytotoxicity assay kit)는 타카라사(Takara, Japan)로부터 구매하여 사용하였다. 그 밖에 실험에 사용된 시약들은 최상의 제품의 것을 구매하여 사용하였다.

실시예 2. SH - SY5Y 신경세포주의 준비

인간신경아세포종 SH-SY5Y 세포는 10％ FBS(fetal bovine serum) 및 항생물질(Gibco-BRL, USA)이 함유된 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)(Hyclone, Thermo, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기를 37℃ 온도로 유지했고, 95％ 공기와 5％ CO₂가 혼합된 기체를 계속 공급하여 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포는 6-웰 플레이트 혹은 96-웰 플레이트에 각각 1x10⁶및 2x10⁴세포/웰로 실험 24시간 전에 배양하였다. 과산화수소, 6-하이드록시도파민의 농도는 세포 생존율을 평가한 후 각각 400μM, 200μM로 결정하였다. 로가닌은 PBS에 녹여서 사용하였다.

실시예 3. 로가닌의 MTT (세포생존효과) 실험

세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 환원 어세이를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트에 MTT 용액을 최종농도 0.5㎎/㎖가 되도록 각 웰에 넣었다. 배양기에서 2시간 동안 반응시키고 배지와 MTT 용액을 제거한 후 DMSO를 넣어 교반하였다. 완전히 용해되었을 때 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 540㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다.

측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 세포 생존율을 계산하였다.

세포 생존율(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100

실험 결과는 도 2와 같다.

과산화수소 처리에 의한 세포생존율은 63% 이상의 생존율을 나타냈으며, 로가닌 각각 0.1, 0.5, 1, 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 70%, 73%, 76%, 및 77% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.

6-하이드록시도파민 처리에 의한 세포생존율은 72% 이상의 생존율을 나타냈으며, 로가닌 각각 0.1, 0.5, 1, 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 78%, 85%, 90%, 및 76% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.

실시예 4. 로가닌의 LDH 분비 측정(세포독성) 실험

LDH 분비 측정(세포독성) 실험을 수행하기 위해 LDH 세포독성 어세이 키트를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트의 배지를 50㎕씩 취하여 새로운 96-웰 플레이트에 분주하고, 반응시약을 50㎕ 넣은 뒤, 빛에 노출되지 않게 하였다. 배양기에서 30분 동안 반응시키고 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 490㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다.

측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 LDH 분비량를 계산하였다.

LDH분비(％) = (배지 내 LDH 분비 O.D. / 배지 내 총 LDH 분비 O.D.)×100

실험 결과는 도 3과 같다.

정상대조군은 5% 이하의 LDH 분비를 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 LDH 분비는 61% 이상의 LDH 분비를 나타냈고, 로가닌 각각의 0.1, 0.5, 1, 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 58%, 55%, 48%, 및 44% 이하의 LDH 분비를 나타냈다.

실시예 5. 로가닌의 ROS 생성 억제 효과 실험

ROS 소거 활성 측정하기 위해 DCFH-DA 형광을 표지시켜 형광량계(fluorescence meter)를 이용하여 정량 실험을 실시하였다.

실험을 수행한 6-웰 플레이트에 로가닌을 2시간 동안 전처치를 한 뒤, 과산화수소를 30분간 반응시켜 ROS를 유도시킨 후 DCFH-DA 10mM의 용량을 10㎕ 넣어 30분간 반응시켰다. 이때 DCFH-DA는 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. DCFH-DA 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 이를 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 1ml의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 취한 후, 새로운 96-웰 플레이트에 분주한 뒤, 여기파장 488nm 그리고 방출파장 515nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다.

측정된 값을 다음 수학식에 대입하여 ROS 생성을 계산하였다.

ROS 생성(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100

실험 결과는 도 4와 같다.

정상 대조군은 100% 이하의 ROS 생성을 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 ROS 생성은 176% 이상의 ROS 생성을 나타냈고, 로가닌 각각의 0.1, 0.5, 1, 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 176%, 146%, 123%, 및 113% 이하의 ROS 생성을 나타냈다.

실시예 6. 로가닌의 미토콘드리아 막 전위 손상 억제 효과 실험

미토콘드리아 막 전위 손상 억제 효과를 측정하기 위해 로다민-123 형광을 표지시켜 형광량계를 이용하여 정량실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 로가닌을 2시간 전처치를 한 뒤, 과산화수소를 30분간 반응시켜 미토콘드리아 막 전위 손상을 유도시킨 후 로다민-123이 최종농도 10μM를 10㎕ 넣어준 뒤, 30분간 반응시켰다. 이때 로다민-123은 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. 로다민-123 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 0.5ml의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100㎕씩 취한 뒤 새로운 96-웰 플레이트에 분주하였으며, 여기파장 480nm 및 방출파장 530nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다.

측정된 흡광도 값을 다음 식에 대입하여 △미토콘드리아 막 전위 감소값을 산출하였다.

△미토콘드리아 막 전위 감소(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100

실험 결과는 도 5와 같다.

정상대조군은 98% 이하의 미토콘드리아 막 전위 감소를 나타냈으며, 과산화수소 처리한 군은 169% 이상의 미토콘드리아 막 전위 감소를 나타냈고, 로가닌 각각 0.1, 0.5, 1, 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 167%, 153%, 153%, 및 135% 이하의 미토콘드리아 막 전위 감소를 나타냈다.

실시예 7. 로가닌 의 뇌질환과 관련된 단백질 발현 실험

로가닌의 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 관련된 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다.

실험을 수행한 6-웰 플레이트에 로가닌을 2시간 동안 전처리를 한 뒤, 과산화 수소로 처리한 뒤, 24시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 24시간 뒤, 각각의 농도로 처리된 웰의 상층액을 수집하여 원심분리기를 이용하여 400g, 3분간 침전시키고, 세포는 차가운 PBS로 세척한 뒤, Tper 용해 버퍼(Thermo, USA) 100㎕를 첨가하여 30분간 용해시켰다. 용해물들은 원심분리기를 이용하여, 10000g, 4℃로 15분간 원심분리시켰으며, 원심분리 후 상층액은 실험을 위한 샘플로서 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질은 BCA 정량분석 키트(Thermo, USA)를 이용하여 정량분석하였으며, 8.5% - 12%의 SDS 겔로 용출한 후 PVDF 막에 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하기 위해, ECL(enhanced chmilumenescence)로 형광발색시켜 확인하는데, 먼저 5% 무지방분유로 막을 1시간 동안 반응시키며, 일차항체인 Bcl-2, Bax, 카스파제-3, PARP, p-53, 포스포-p38, 포스포-JNK, 포스포-ERK1/2 및 β-액틴으로 밤새 4℃에서 표지시켰으며, TTBS로 3회 세척한 다음 이차항체인 HRP(horseradish peroxidase)-접합된 항-래빗 그리고 항-마우스 항체를 상온에서 1시간 동안 표지시켰다. 표지 후 10분간 TTBS를 이용하여 5회 세척하였고, 세척된 막은 ECL를 이용하여, x-ray 필름을 이용하여 발색시켰으며, 농도는 정량분석법에 따라 정량분석프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석하였다.

실험결과는 도 6과 같다.

PARP 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 PARP의 발현은 48% 이하의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 63%, 83% 이상의 PARP 발현을 나타냈다.

카스파제-3 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 카스파제-3의 발현은 33% 이하의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 47%, 81% 이상의 카스파제-3 발현을 나타냈다.

Bcl-2/Bax 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 Bcl-2/Bax의 발현은 64% 이상의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 61%, 78% 이상의 Bcl-2/Bax 발현을 나타냈다.

P-53단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 p-53의 발현은 132% 이상의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 83% , 25% 이하 p-53 발현을 나타냈다.

포스포-JNK 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 포스포-JNK의 발현은 542% 이상의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 417%, 384% 이하의 포스포-JNK 발현을 나타냈다.

포스포-p38 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 포스포-p38의 발현은 151% 이상의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 146%, 119% 이하의 포스포-p38 발현을 나타냈다.

포스포-ERK1/2 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 포스포-ERK1/2의 발현은 1458% 이상의 발현을 나타냈으며, 로가닌 각각의 1, 5㎍/㎖의 용량에서 각각 1069%, 287% 이하의 포스포-ERK1/2 발현을 나타냈다.

실시예 11. 통계처리

모든 실험 결과는 ANOVA(one way analysis of variance)를 이용하여 통계처리하였고, 유의성이 검증될 경우 뉴만 쿨스 검증(Newman-Keuls test)을 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

Claims

로가닌(loganin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
로가닌 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 개선용 기능성 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 좌제 또는 멸균 주사용액으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.