KR100662700B1 - 모나콜린 케이 생합성 유전자 - Google Patents

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Abstract

모나스커스에 의해 생산되는 콜레스테롤 저해제, 모나콜린 케이는 폴리케타이드의 2차 대사산물이다. 본 발명은 모나콜린 케이 생합성 유전자 클러스터에 특이적인 프로브를 제공한다. 가능한 모나콜린 케이 유전자 클러스터를 가지는 BAC 클론이 BAC (세균성 인공 염색체) 라이브러리로부터 스크린되어졌고, 서열분석과 주석달기가 이들 클론에 수행되어졌다. 결과에 의하면 2개의 폴리케타이드 합성효소 (PKS) 유전자와 모나콜린 케이 합성과 관련된 7개의 조절유전자가 얻어졌다. 이들 유전자의 전장 cDNA가 RT-PCR에 의해 얻어졌고, 이들 유전자의 발현용 발현벡터에 클론되어졌다.

Description

모나콜린 케이 생합성 유전자{Monacolin K Biosynthesis Genes}
도 1A∼1G는 모나스커스와 다른 곰팡이, 및 래트(rat)로부터 유래된 지방산 합성효소의 모티프(motif)로부터 유래된 폴리케타이드 합성효소의 서열비교이다. 도 1A는 케토아실 합성효소의 비교, 도 1B는 아실 트랜스퍼라제의 비교, 도 1C는 디하이드라타제의 비교, 도 1D는 메틸트랜스퍼라제의 비교, 도 1E는 에노일 환원효소의 비교, 도 1F는 케토아실 환원효소의 비교, 및 도 1G는 아실 운반 단백질의 비교결과를 보여준다.
도 2는 3∼14일에서의 모나스커스 mk 유전자 클러스터의 발현결과를 나타낸다.
도 3A 및 3B는 각각 pPICZamkA와 pPICZamkB의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 MKH의 아미노산 서열과 VectorNTI로 분석된 가능한 Zn(Ⅱ)Cys6 바이뉴클리어 모티프를 나타낸다. 박스내의 아미노산 서열은 Zn(Ⅱ)Cys6 이핵 모티프를 나타내며; 6 Cys는 회색 라벨로 표시되어 있다.
도 5는 폴리케타이드 합성효소 mkA 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터의 구조를 나타낸다. 1쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (p3과 p4)는 RT-PCR에 의해 mkA 유전자 (6.5kb)의 부분 cDNA를 증폭하도록 설계되었다. p1과 p2 프라이머는 RT-PCR에 의해 mkA 유전자 (3.0kb)의 부분 cDNA를 증폭하도록 설게되었다.
도 6은 바실러스 서브틸리스 유래의 4'-포스포판테테인 트랜스퍼라제 sfp 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 7은 대장균에서의 mkA와 sfp의 발현결과를 나타낸다. 대조 플라즈미드 pCDF-1b 및 pET30 (레인1)과, 발현 플라즈미드 pCDFsfp (sfp 유전자) 및 pETmkA (mkA 유전자) (레인 2)를 함유하는 대장균의 총 단백질은 로딩버퍼에서 끓인 후 SDS-PAGE에 넘겨졌다. 단백질들은 콜로이드 쿠마시 블루로 염색되어졌다. 화살표는 sfp와 MKA의 위치를 나타낸다. 용해질 단백질은 ProBondTM 정제시스템( Invitrogen)에 의해 정제되어졌다. 레인 3은 60분간 3000×g로 원심분리한 용해질이고, 레인4는 Ni-칼럼에 의해 정제된 단백질이다.
본 발명은 분자생물학 및 미생물 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 모나콜린 케이(K) 생합성 유전자에 관한 것이다.
모나스커스는 중국에서 수천년간 식품산업에 적용되어 왔다. 최근에 모나스커스는 다양한 생리활성물질을 생산한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 생리활성물질들은 주로 모나스커스의 2차 대사산물, 예를 들어 혈압강하물질, 모나스시딘(monascidin)과 같은 항부패성균제, 항암물질, 혈당강하물질, 에르고스 테랄, 항산화제, 및 모나콜린과 같은 콜레스테롤 합성 저해제를 포함한다. 이에 따라 모나스커스는 최근 들어 기능성 건강식품으로서 평가되고 있다.
모나스커스에 의해 생산되는 콜레스테롤 합성 저해제인 모나콜린 케이는 SANKYO, Merk 사에 의해 모나스커스 루버(M. ruber)의 배지로부터 처음으로 분리되어졌으며, 로바스타틴(lovastatin)으로 명명된 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)의 배지로부터 얻어진 물질과 동일하며, HMG-CoA 환원효소 저해제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다.
모나콜린 케이는 폴리케타이드(polyketides)에 속하며, 그 구조는 HMG-CoA와 상동성이 있다. 따라서, 모나콜린 케이는 HMG-CoA와 함께 경쟁적으로 콜레스테롤 합성을 저해하고, HMG-CoA 환원효소는 HMG-CoA가 메볼로네이트(mevolonate)를 형성하도록 촉매하지 않아 결국 콜레스테롤의 합성을 감소시킨다.
곰팡이로부터 생산되는 폴리케타이드의 2차 대사산물은 구조적 다양성과 다른 세균에서는 존재하지 않는 고유한 특성을 나타낸다 (O'Hagan, 1995). 이들 특성은 또한 폴리케타이드 합성의 효소 다양성으로 표현되어진다. 모나스커스에 의해 생산된 모나콜린 케이는 폴리케타이드 그룹에 속하며, 다양한 폴리케타이드들이 폴리케타이드 합성효소 (PKS)에 의해 촉매되는 아세틸 CoA의 응축과정에 의해 생산되어지는 것이 밝혀졌다 (Kennedy et al., 1999; and Abe et al., 202). 조합 생합성과 결합한 폴리케타이드 합성효소의 연구로부터 신규한 폴리케타이드의 개발은 큰 가능성을 가지며 (Mc Daniel et al., 1999), 새로운 폴리케타이드는 유효 약물의 스크리닝을 위한 또 다른 새로운 초석이 될 것이다.
이에 따라 본 발명은 모나콜린 케이 생합성 유전자를 제공함에 목적이 있다.
이를 위해 본 발명의 실시예는 서열번호1의 뉴클레오티드 서열 또는 엄격조건(stringent conditions)하에서 상기 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자를 제공하다.
본 발명의 다른 실시예는 a) mkA이고, 서열번호2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, b) mkB 이고, 서열번호3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, c) mkC 이고, 서열번호4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, d) mkD 이고, 서열번호5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, e) mkE 이고, 서열번호6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, f) mkF 이고, 서열번호7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, g) mkG 이고, 서열번호8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, h) mkH 이고, 서열번호9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, i) mkI 이고, 서열번호10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 j) 엄격조건에서 a), b), c), d), e), f), g), h), 또는 i)로부터의 폴리뉴클레오티드와 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 DNA 분자를 제공한다.
또 다른 본 발명의 실시예는 상기 정의된 바와 같은 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 실시예는 a) mkA이고, 서열번호2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, b) mkB 이고, 서열번호3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, c) mkC 이고, 서열번호4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, d) mkD 이고, 서열번호5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, e) mkE 이고, 서열번호6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, f) mkF 이고, 서열번호7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, g) mkG 이고, 서열번호8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, h) mkH 이고, 서열번호9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, i) mkI 이고, 서열번호10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 j) 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또, 본 발명의 실시예는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 세포로부터 모나콜린 케이를 수거하는 과정을 포함하는 모나콜린 케이의 생산 증대방법을 제공한다. 상기 벡터는 a) mkA이고, 서열번호2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, b) mkB 이고, 서열번호3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, c) mkC 이고, 서열번호4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, d) mkD 이고, 서열번호5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, e) mkE 이고, 서열번호6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, f) mkF 이고, 서열번호7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, g) mkH 이고, 서열번호9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 h) 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또, 본 발명의 실시예는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 세포로부터 HMG-CoA 환원효소 저해제를 수거하는 과정을 포함하는 HMG-CoA 환원효소 저해제의 증가된 생산방법을 제공한다. 상기 벡터는 위에서 정의된 바와 같다.
또한, 본 발명은 HMG-CoA 환원효소 저해제의 생산방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 서열번호2 (mkA 게놈 DNA), 서열번호3 (mkB 게놈 DNA), 서열번호6 (mkE 게놈 DNA), 및 서열번호7 (mkF 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열들과 95％ 상동성을 공유하는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 형질전환하는 단계, 상기 서열들은 각각 노나케타이드 합성효소(nonaketide synthase), 디케타이드 합성효소(diketide synthase), 디하이드로게나제(dehydrogenase), 및 트랜스에스터라제(transesterase) 활성을 가지는 단백질을 암호화한다.; (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 환경하에 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (c) HMG-CoA 환원효소 저해제를 수거하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 세포로부터 모나콜린 케이를 수거하는 과정을 포함하는 모나콜린 케이의 생산방법을 제공한다. 상기 벡터는 위에서 정의된 바와 같다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
모나스커스에 특이적인 프로브가 니콜슨(2001)에 의해 공개된 아스퍼질러스 테레우스의 로바스타틴에서의 축퇴성(degenerate) 프라이머에 따라 제작되었다. 모나콜린 케이 합성과 관련된 상기 유전자들은 콜로니 혼성화를 이용하여 모나스커스 BAC 라이브러리로부터 클론되어졌고, 서열분석되었으며, 주석이 달려졌다. 두 개의 PKS 전장 cDNA들은 RT-PCR로 증폭되어졌으며, 각각 발현벡터로 클론되어졌으며, 이에 따라 본 발명이 얻어졌다.
1980년대 모나스커스에 의해 생산된 콜레스테롤 저해제의 발견 이래, 모나스커스의 혈압, 혈당 및 콜레스테롤 강하효과에 대한 많은 관심이 집중되어졌다. 모나콜린 케이 이외에도 콜레스테롤의 함량을 낮추는 다른 물질들, 예를 들면 모나콜린 제이(J), 엘(L), 엠(M) 및 엑스(X) (Endo et al., 1979, 1985, 1986 및 Komagata et al., 1989) 들이 모나스커스로부터 분리되어졌다. 모나콜린 제이와 엘은 모나콜린 케이의 전구체이다. 모나콜린 케이에 의한 콜레스테롤 합성 저해기작은 모나콜린 케이와 HMG-CoA 사이의 구조적 유사성으로부터 기인된다. 모나콜린 케이는 HMG-CoA 환원효소에 결합하여 HMG-CoA로부터 메볼로네이트의 형성에 관여하는 촉매활성을 방해하여, 콜레스테롤의 합성을 크게 감소시킨다. 모나콜린 케이 이외에도 콜레스테롤 저해를 위한 생물학적 변환 또는 화학적 변환과정을 적용한 다른 방법들이 또한 상용화되어 있다. 예를 들어, HMG-CoA와 구조적 유사성을 공유하는 프라바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 또는 아토르바스타틴을 들 수 있다.
이에 따라 본 발명의 제1 목적은 모나스커스로부터 모나콜린 케이 생산에 관련된 유전자를 제공하는 것에 있다.
본 발명에서 분석된 주제는 하기와 같은 특성을 가지는 모나스커스 에스피(sp). BCRC 38072이다.
거시적 특징:
CYA, 25℃, 7일. 콜로니 25-26mm 직경, 균사 초기 흰색, 붉은 기미의 연한 주황으로 되고, 뒤는 붉은 기미의 짙은 주황
MEA, 25℃, 7일. 콜로니 48mm 직경, 붉은 기미의 밝은 주황, 뒤는 붉은 기미의 새뜻한 주황
G25N, 25℃, 7일. 콜로니 28-29mm 직경, 붉은 기미의 짙은 주황, 중앙은 노란기미의 짙은 주황
미시적 특징:
단생 또는 종종 짧은 연쇄상의 알류디오분생자(aleurioconidia), 도서양배형에서 둥근형, 10-13×8-10㎛. 폐쇄자낭구 원형(cleistothecia globose), 37-72㎛ 직경, 자낭포자 투명, 타원형, 4.6-6.3 (-6.6)×3.3-4.2㎛.
Hawksworth 와 Pitt의 분류시스템(1983)에 따르면, BCRC 38072는 다음과 같이 분류된다.
형태적 특성:
BCRC 38072는 M.필로서스(pilosus)와 M.루버(ruber)의 사이에 있다.
(1) BCRC 38072는 콜로니 색과 성장속도에서 M.필로서스와 유사하다.
(2) BCRC 38072는 자낭포자의 형태에서 M.루버와 유사하다.
서열분석:
BCRC 38072, M.루버, 및 M.필로서스는 rDNA ITS 절편과 베타 튜블린 유전자에 있어서 100％ 상동성을 가진다.
종의 동정:
BCRC 38072는 임시적으로 Monascus pilosus K. Sato ex D. Hawksw. & Pitt로 부르기로 한다.
모나스커스 필로서스 BCRC 38072의 분석으로부터 226bp(서열번호1)의 길이를 가지는 케토 합성효소의 보존 부위에 특이적인 프로브가 콜로니 혼성화, 서던블로팅, 및 PCR용으로 제작되었다. 또한, 상기 프로브는 모나스커스 스크리닝 용도로도 사용되어질 수 있다. 전장 BAC DNA 서열의 주석 및 예상은 BLAST와 VectorNTI에 의해 수행되어졌다. 아스퍼질러스 테레우스에 의해 생산된 로바스타틴 유전자 클러스터와 54％ 이상의 높은 상동성을 공유하는 9개의 유전자들이 표 1에서와 같이 BAC 라이브러리에 의해 얻어졌다.
<표1> 모나스커스의 mk 유전자, 아스퍼질러스 테레우스의 lov 유전자 클러스터 및 페니실리움 시트리넘의 mlc 유전자 클러스터의 상동성 비교
mk유전자 아미노산 분자량 (kDa) 제시된 기능 상동 lov 유전자 단백질 상동성(％) 상동 mlc 유전자 단백질 상동성(％)
mkA 3075 338 폴리케타이드합성효소 lovB 76 mlcA 66
mkB 2547 276 폴리케타이드합성효소 lovF 73 mlcB 61
mkC 524 60.6 P450모노옥시게나제 lovA 85 mlcC 67
mkD 263 28.9 옥시도리덕타제 lovG 67 mlcF 53
mkE 360 38.9 디하이드로게나제 lovC 81 mlcG 70
mkF 413 46.8 트랜스에스터라제 lovD 74 mlcH 63
mkG 1052 113 HMG-CoA 환원효소 lvrA 69 mlcD 39
mkH 455 49.4 전사인자 lovE 54 mlcR 49
mkI 543 57.5 유출펌프 lovI 81 mlcE 68
모나콜린 케이 유전자 클러스터와 페니실린 시트리넘(Penicillin citrinum)으로부터 합성된 콤팩틴(compactin) 유전자 클러스터는 49％ 이상의 높은 상동성을 공유한다. 상기 9개의 유전자들은 2개의 폴리케타이드 합성효소 유전자, 그 중 하나는 노나케타이드 합성에 관여하고, 다른 하나는 디케타이드 합성효소에 관여하는 유전자를 포함하고, 1개의 모노옥시게나제(monooxygenase) 유전자, 1개의 옥시도리덕타제(oxidoreductase) 유전자, 1개의 디하이드로게나제 유전자, 1개의 트랜스에스터라제 유전자, 1개의 HMG-CoA 환원효소 유전자, 1개의 전사인자(transcription factor) 유전자, 1개의 유출펌프(efflux pump) 유전자를 포함한다. 모나스커스의 포스미드(fosmid) 라이브러리가 구축되었으며, 포스미드 말단 서열비교에 의해 스크린된 2개의 클론이 mkB, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH을 포함하는 pMPF001 및 mkA, mkC, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH 및 mkI를 포함하는 pMPF002로서 특허 기탁용으로 기탁되어졌다. pMPF001은 PTA-5685로서 미국미생물 보존센터(ATCC)에 기탁되어졌고, pMPF002는 PTA-5686으로서 기탁되어졌다. 노나케타이드 합성효소 유전자와 디케타이드 합성효소 유전자의 기능 부위는 아스퍼질러스, 페니실리움, 코크리오볼러스(Cochliobolus) 및 지베렐라의 알려진 폴리케타이드 합성 유전자, 및 래트(rat)의 지방산 합성(FAS) 유전자와 비교하여 더욱 분석되어졌다. 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이 이들 2 유전자들의 기능부위는 아스퍼질러스 테레우스에 의해 생산되는 로바스타틴과 페니실리움 시트리넘에 의해 생산되는 콤팩틴의 그것과 유사하다는 것을 알려준다. 모나스커스로부터 추출된 총 RNA의 노던블롯 분석에 의하면 전사단계에서의 이들 유전자의 발현은 도 2에 나타낸 바와 같다.
상기 본 발명의 두 폴리케타이드 합성효소 유전자는 다기능 효소이다: 도 1에 나타낸 바와 같이 mkA 유전자는 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제(dehydratase), 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 및 아실 운반 단백질의 기능을 가지며, mkB 유전자는 상기 언급된 6개의 기능과 추가적으로 에노일(enoyl) 리덕타제 기능을 가진다. 상기 두 유전자들의 전장 cDNA는 RT-PCR에 의해 얻어졌으며, 그런 다음 폴리케타이드 산물의 발현을 위해 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템에 콜론되어졌다. 폴리케타이드 합성효소 유전자가 다기능 효소를 발현하므로 다양한 폴리케타이드 산물들이 본 발명의 전장 cDNA로부터 셔플링과 같은 DNA 재조합에 의해 생산되어질 수 있다. 이 방법은 신종 약물을 스크리닝함에 있어 새로운 초석이 된다. US 6,221,641과 6,391,594과 같은 많은 특허는 세균에서 발현하는 유사한 방법들을 개시하고 있다. 하지만, 곰팡이로부터 생산되는 폴리케타이드의 2차 대사산물은 구조적 다양성과 복잡성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 얻어진 pPICZamkA (도 3A)와 pPICZamkB (도 3B) 는 셔플링에 의해 다양한 폴리케타이드 산물을 발현하기 위한 용도의 발현 플라즈미드로서 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 하기의 DNA 분자, 벡터, 및 방법을 제공한다.
(Ⅰ) 모나콜린 케이 합성과 관련된 유전자 스크리닝을 위한 프로브
본 발명은 모나콜린 케이 합성과 관련된 유전자의 스크리닝을 위한 프로브에 있어서, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 특징으로 한다. 상기 프로브는 모나스커스 BCRC 38072에 특이적이며, 니콜슨(2001)에 의해 제작된 아스 퍼질러스 테레우스의 로바스타틴 합성 유전자용 축퇴성 프라이머로부터 제작되어졌다. 본 발명의 상기 프로브를 이용하여 혼성화와 같은 알려진 방법에 따라 모나콜린 케이와 유사한 유전자를 분리하거나 정제하는 것은 당업자에게 용이한 일이다.
(Ⅱ) 노나케타이드 합성효소 (mkA 게놈 DNA)
본 발명의 1측면은 서열번호2 (mkA 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호2와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다. 상기 엄격조건에 대한 참조는 EP 1,325,959A1 P7 [0036]에서 찾을 수 있다. 노나케타이드 합성효소는 1개의 아세테이트와 8개의 말로네이트를 촉매하여 노나케이드를 형성한다. 이 유전자는 베타-케토아실 합성효소, 아세틸트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 및 아실 운반 단백질을 포함하는 다기능 부위를 가진다. 다른 종에서 유래된 기능 부위와 상기 유전자를 비교한 결과, 모나스커스 BCRC 38072의 mkA 기능 부위는 아스퍼질러스 테레우스의 lovB 유전자와 페니실리움 시트리넘의 mlcA 유전자와 높은 상동성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호2 (mkA 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호2와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 특징으로 한다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스이며, 바람직하게는 상기 벡터는 셔틀벡터이다. 본 발명의 벡터는 셔플링에 의해 다양한 폴리케타이드 산물을 더 생산한다. 셔플링의 참조는 US 특허 6,221,641과 US 특허 6,391,594에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호2의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호2와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환체를 특징으로 한다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종(Monascus sp.)으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스(M. pilosus), 모나스커스 루버(M. ruber), 또는 모나스커스 퍼퓨레우스(M. purpureus), 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호2 (mkA 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호2와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 수율을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호2의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호2와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
(Ⅲ) 디케타이드 합성효소 (mkB 게놈 DNA)
본 발명은 서열번호3 (mkB 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호3와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다. 상기 엄격조 건에 대한 참조는 EP 1,325,959A1 P7 [0036]에서 찾을 수 있다. 디케타이드 합성효소는 모나콜린 케이의 일종, 즉 디케타이드 또는 2-메틸부틸레이트로 명명된 물질을 생합성한다. 이 유전자는 베타-케토아실 합성효소, 아세틸트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 및 아실 운반 단백질 및 에노일 리덕타제를 포함하는 다기능 부위를 가진다. 다른 종에서 유래된 기능 부위와 상기 유전자를 비교한 결과, 모나스커스 필로서스 BCRC 38072의 mkB 기능 부위는 아스퍼질러스 테레우스의 lovF 유전자와 페니실리움 시트리넘의 mlcB 유전자와 높은 상동성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호3의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호3과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 특징으로 한다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스를 들 수 있다. 본 발명의 벡터는 셔플링에 의해 다양한 폴리케타이드 산물을 더 생산한다. 셔플링의 참조는 US 특허 6,221,641과 US 특허 6,391,594에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호3의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호3과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환 체에 관련된다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호3의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호3과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 생산성을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호3의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호3과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴 클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
(Ⅳ) 전사인자 (mkH 게놈 DNA)
본 발명은 서열번호9 (mkH 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다. 상기 엄격조건에 대한 참조는 EP 1,325,959A1 P7 [0036]에서 찾을 수 있다. mkH 유전자는 벡터 NTI 비교결과 Zn(Ⅱ)Cys6 이핵 모티프로서 확인되었다. 이 유전자의 보존 서열은 도 4에 나타낸 바와 같이 Cys-X2-Cys-X6-Cys-X11-Cys-X2-Cys-X6-Cys이다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호9의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관련된다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스를 들 수 있다. 바람직하게는 상기 본 발명의 벡터는 발현벡터이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호9의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환체에 관련된다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 발현시스템에 관련된다. 상기 발현시스템은 서열번호9의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 상기 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 숙주세포를 포함한다. 상기 서열은 형질전환과정에 의해 숙주세포로 전달된다. 적합한 숙주세포는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균을 포함한다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다 음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호9의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 생산을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호9의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호9와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다.
(Ⅴ) HMG-CoA 리덕타제 저해제 및 모나콜린 케이 생산
본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 저해제, 바람직하게는 모나콜린 케이의 생산방 법에 관련된다. 상기 방법은 (a) 서열번호2 (mkA 게놈 DNA), 서열번호3 (mkB 게놈 DNA), 서열번호6 (mkE 게놈 DNA), 및 서열번호7 (mkF 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열들과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 형질전환하는 단계, 상기 서열들은 각각 노나케타이드 합성효소, 디케타이드 합성효소, 디하이드로게나제, 및 트랜스에스터라제 활성을 가지는 단백질을 암호화한다.; (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 환경하에 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (c) 모나콜린 케이를 수거하는 단계를 포함한다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. Hutchinson 등(2000)은 로바스타틴의 합성을 위해서는 4개의 유전자가 요구된다고 주장하였다. 이 4개의 유전자는 이종발현되는 경우 노나케타이드 합성효소, 디케타이드 합성효소, 디하이드로게나제, 및 트랜스에스터라제이다. 이들 중에서, 노나케타이드 합성효소 및 디하이드로게나제가 로바스타틴 전구체의 생산에 기여하며, 디케타이드 합성효소는 2-메틸부티레이트의 생산을 지원한다. 생산된 2-메틸부티레이트는 트랜스에스터라제에 의해 노나케타이드에 결합되고, 완전한 로바스타틴을 형성한다.
상기 언급된 방법은 서열번호4 (mkC 게놈 DNA), 서열번호5 (mkD 게놈 DNA), 서열번호8 (mkG 게놈 DNA), 서열번호9 (mkH 게놈 DNA), 및 서열번호10 (mkI 게놈 DNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열들과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 더 포함하며, 상기 서열들은 P450 모노옥시게나제, 옥시도리덕타제, HMG-CoA 리덕타제, 전사인자, 및 유출펌프 활성을 각각 암호화한다.
(Ⅵ) 노나케타이드 합성효소 (mkA cDNA)
본 발명은 서열번호19 (mkA cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호19와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호19 (mkA cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호19와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관련된다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스이며, 바람직하게는 상기 벡터는 발현벡터이고, 보다 바람직하게는 상기 벡터는 pPICZαA (Invitrogen)다. 본 발명의 구조물은 서열번호19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pPICZamkA이다. 구조물 pPICZamkA는 mkA 유전자의 전장 cDNA를 분자 클로닝(Molecular Cloning)에 언급된 방법에 따라 pPICZαA로 클로닝함으로써 얻을 수 있다. 셔플링에 의해 본 발명의 벡터를 이용하여 다양한 폴리케타이드 산물을 생산할 수 있다. 셔플링의 참조는 US 특허 6,221,641과 US 특허 6,391,594에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호19의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호19와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호19의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호19와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하 에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 수율을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호19의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호19와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
(Ⅶ) 디케타이드 합성효소 (mkB cDNA)
본 발명은 서열번호20 (mkB cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호20과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호20 (mkB cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호20과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관련된다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스이며, 바람직하게는 상기 벡터는 발현벡터이고, 보다 바람직하게는 상기 벡터는 pPICZαC (Invitrogen)이다. 본 발명의 구조물은 서열번호20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pPICZamkB이다. 구조물 pPICZamkB는 mkB 유전자의 전장 cDNA를 분자클로닝에 언급된 방법에 따라 pPICZαC로 클로닝함으로써 얻을 수 있다. 셔플링에 의해 본 발명의 벡터를 이용하여 다양한 폴리케타이드 산물을 생산할 수 있다. 셔플링의 참조는 US 특허 6,221,641과 US 특허 6,391,594에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호20의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호20과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호20의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호20과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 생산을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호20의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호20과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
(Ⅷ) 전사인자 (mkH cDNA)
본 발명은 서열번호25 (mkH cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 을 포함하는 DNA 서열에 관련된다. 상기 DNA 서열은 BCRC 38072로부터 분리되어졌다. 또한, 본 발명의 DNA 서열은 본 발명의 기재에 의하면 PCR 또는 혼성화와 같은 알려진 방법에 의해 당업자가 용이하게 얻을 수 있다. 상기 엄격조건에 대한 참조는 EP 1,325,959A1 P7 [0036]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호25의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관련된다. 본 발명의 벡터를 구축하기 위한 도구에는 숙주세포에서 자가복제가 가능하고, 염색체에 통합가능한 분자 서열을 포함한다. 예를 들어, 플라즈미드, 파아지, 바이러스이며, 바람직하게는 상기 벡터는 발현벡터이고, 보다 바람직하게는 상기 벡터는 pMS이다. 본 발명의 구조물은 서열번호25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pMSmkH이다. 구조물 pMSmkH는 mkH 유전자의 전장 cDNA를 분자 클로닝에 언급된 방법에 따라 pMS로 클로닝함으로써 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호25의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 형질전환체를 구축하기 위한 숙주세포를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루 버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. 형질전환은 주지된 숙주-벡터 시스템을 이용하는 아스퍼질러스 속에 속하는 사상균에 대한 형질전환 방법을 적용하는 것에 의해 완성되어질 수 있다. EP 1,325,959 A1 P5 [0022] 참조.
본 발명의 다른 측면은 발현시스템에 관련된다. 상기 발현시스템은 서열번호25의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 상기 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 숙주세포를 포함한다. 상기 서열은 형질전환과정에 의해 숙주세포로 전달된다. 적합한 숙주세포는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균을 포함한다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다.
본 발명의 다른 측면은 모나콜린 케이 생산을 증가하는 방법에 관련되고, 다음 단계를 포함한다.
(a) 서열번호25의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케 이를 생산하는 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 HMG-CoA 리덕타제 저해제 생산을 증가시키는 방법에 관련된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다. (a) 서열번호25의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호25와 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능하고, 전사인자 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주세포로 형질전환하는 단계; 및 (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계. 바람직하게는 상기 숙주세포는 근원적으로 모나콜린 케이를 생산하는 세포이다.
본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 저해제, 바람직하게는 모나콜린 케이의 생산방법에 관련된다. 상기 방법은 (a) 서열번호19 (mkA cDNA), 서열번호20 (mkB cDNA), 서열번호23 (mkE cDNA), 및 서열번호24 (mkF cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열들과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 형질전환하는 단계, 상기 서열들은 각각 노나케타이드 합성효소, 디케타이드 합성효소, 디하이드로게나제, 및 트랜스에스터라제 활성을 가지는 단백질을 암호화한다.; (b) 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 환경하에 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (c) 모나콜린 케이를 수거하는 단계를 포함한다. 상기 숙주세포는 원핵세포, 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 비한정적인 의미에서 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 또는 사상균이다. 사상균은 모나스커스 종으로서, 바람직하게는 모나스커스 필 로서스, 모나스커스 루버, 또는 모나스커스 퍼퓨레우스, 보다 바람직하게는 BCRC 38072이다. Hutchinson 등(2000)은 로바스타틴의 합성을 위해서는 4개의 유전자가 요구된다고 주장하였다. 이 4개의 유전자는 이종발현되는 경우 노나케타이드 합성효소, 디케타이드 합성효소, 디하이드로게나제, 및 트랜스에스터라제이다. 이들 중에서, 노나케타이드 합성효소 및 디하이드로게나제가 로바스타틴 전구체의 생산에 기여하며, 디케타이드 합성효소는 2-메틸부티레이트의 생산을 지원한다. 생산된 2-메틸부티레이트는 트랜스에스터라제에 의해 노나케타이드에 결합되고, 완전한 로바스타틴을 형성한다.
상기 언급된 방법은 서열번호21 (mkC cDNA), 서열번호22 (mkD cDNA), 서열번호25 (mkH cDNA), 및 서열번호26 (mkI cDNA)의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열들과 95％ 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격조건하에서 상기 서열들과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 더 포함하며, 상기 서열들은 P450 모노옥시게나제, 옥시도리덕타제, 전사인자, 및 유출펌프 활성을 각각 암호화한다.
<실시예>
실시예 1: 모나스커스의 배양
모나스커스는 사면 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 균사와 포자를 떼어내어, 50㎖ 배지(7％ 글리세롤, 3％ 글루코스, 3％ MSG, 1.2％ 폴리펩톤, 0.2％ NaNO3, 0.1％ MgSO4ㆍ7H2O)에 접종하고 25℃에서 진동 시켜 배양하였다.
실시예2: 모나스커스 BAC 라이브러리의 구축
A. 모나스커스 세포핵의 준비
모나스커스 세포를 수거하여, ddH2O로 수세한 후 공기추출 방법을 이용하여 건조하였다. 건조된 세포에 10×부피의 프리콜드(pre-cold) 와쉬 버퍼(HB 버퍼 + 1.5％베타-메르캅토에탄올)를 가하고, 상기 세포들을 블렌더로 균질화하였다. 모나스커스 핵은 미라클로스(Miracloth) 여과방법에 의해 얻어졌다.
B. 플러그(pludgs)와 염색제 DNA의 준비
1.8％의 저융점 아가로즈를 HB 버퍼에 준비하여, 50℃ 수조에 넣었다. 동일 부피의 아가로즈와 핵용액은 충분히 교반시켰고, 플러그 몰드 (Bio-Rad)에 가하였다. 불순물은 프로티나제 케이 (1mg/mL)로 처리되어졌다. 플러그는 작은 조각으로 쪼개지고 HindⅢ로 부분 소화시켰다. 제한반응을 수행한 후에 플러그는 펄스 전기영동을 위해 1％ 아가오즈 겔하에 분석하였다. 200kb의 DNA 절편이 전기용출에 의해 회수되어졌다.
C. 모나스커스 라이브러리의 구축
pIndigoBAC-5 HindⅢ ready (Epicentre)가 회수된 DNA와의 연결을 위한 벡터로서 사용되어졌다. 연결반응물은 수용세포 (Epicentre, TransforMaxTMEC 100TM electro competent E.Coli)에 전기천공되어졌다. 콜로니는 384 마이크로플레이트에 저장되었다.
실시예3: 모나스커스 BAC 라이브러리의 구축
축퇴성 프라이머를 이용하여 PCR과 서열분석을 수행하였고, 얻어진 DNA 서열은 첨부1에 나타낸 바와 같이 226bp 프로브의 프라이머를 제작하는 자료로서 사용되었다. 프라이머 제작을 위해 소프트웨어 VectorNTI가 이용되었고, 제작된 프라이머는 하기와 같다.
Mplov1 5' TCCACTGCCGTTTATGTTG 3' (서열번호: 29)
Mplov2 5' TCGTCATCTTCACCCCATC 3' (서열번호: 30)
DIG-11-dUTP (Roche, PCR DIG 프로브 합성키트)를 포함하는 DNA 서열은 PCR에 의해 증폭되어졌고, 프로브로서 사용되었다.
실시예4: 콜로니 혼성화의 분석 및 BAC DNA의 추출
나일론 막 (Roche)의 귀퉁이를 잘라 위치를 표지하였다. 그리고 나일론 막을 콜로니를 함유하는 플레이트 위에 놓았다. 콜로니 측면을 위로 하여 나일론막을 5분 용해액 (2N NaOH, 0.1％ SDS), 5분 0.5M NaOH/1.5M NaCl 용액, 5분 1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl (pH 7.4), 및 5분 2X SSC에 연이어 접촉시켰다. UV 빛을 이용하여 DNA를 나일론 막에 고정하였다. 얻어진 나일론 막은 혼성화 및 면역검출 (Roche)에 이용되었다. 그 후, 반응으로부터 얻은 콜로니를 배양하여, Large-construct 키트 (Qiagen)을 이용하여 BAC DNA를 추출하였다.
실시예5: 콜로니 혼성화의 분석 및 BAC DNA의 추출
A. 샷건 라이브러리의 준비
3∼5㎍의 BAC DNA를 적당한 초음파 조건하에 초음파 처리하여 1∼2kb로 만들었으며, 결과는 전기영동을 통해 확인하였다. Bal31 뉴클레아제와 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 DNA를 수리하여 블런티드 엔드로 만들었다. 1∼2kb의 DNA 절편은 전기영동을 통해 회수하였다. 벡터로 pUC18/SmaⅠ/CIAP (50ng/㎕) (Pharmacia)을 이용하여 연결반응을 수행하였고, 연결반응물은 대장균 DH5α에 전기청공되어졌다.
B. DNA 시퀀싱 및 분석
96마이크로플레이트를 이용하여 고속으로 플라즈미드 DNA를 추출하였다. 얻어진 플라즈미드 DNA는 ABI Bigdye v3.0 키트를 이용하여 서열화하였다. 서열분석은 10×커버리지로 ABI3700 서열분석기를 이용하여 수행하였다.
실시예6: DNA 서열 어셈블리 및 주석달기
DNA 서열 어셈블리는 필그린 연구소에서 개발한 Phred-phrap-Consed를 이용하여 수행하였다. 전장 BAC는 VectorNTI와 BLAST를 이용하여 추가적으로 주석을 달았다.
실시예7: 모나스커스 총 RNA의 추출과 RT-PCR 반응
0.2g의 모나스커스 균사를 모르타르에 넣고 액체질소로 냉동시킨 다음 분말 화하였다. 트리졸 시약 (Invitrogen)과 클로로포름을 이용하여 총 RNA를 추출하였고, DEPC-H2O에 녹였다. RNA는 전장 cDNA를 얻기 위해 역전사반응 (Promega, ImProm-IITM 역전사 시스템)을 위한 주형으로 사용하였다. 전장 cDNA는 TA 벡터 (Promega, pGEM-T 벡터 시스템)에 연결시켰다.
실시예8: RNA 전기영동 및 노던 블롯
A. RNA 전기영동
포름알데히드 겔 러닝 버퍼와 포름알데히드를 함유하는 1.2％ 아가로즈 겔을준비하였다. RNA는 포름알데히드 겔 러닝 버퍼, 포름알데히드 (37％)와 포름아마이드와 완전하게 혼합하였다. RNA 전기영동을 수행하고, 겔은 ETBr로 염색하였다.
B. RNA 전달
나일론 막은 겔과 동일한 크기로 잘랐다. 나일론 막의 귀퉁이를 잘라 위치를 표지하였다. 겔로부터 나일론 막으로 RNA를 옮겼으며, RNA는 UV를 이용하여 나일론막에 고정하였다. 얻어진 나일론 막은 혼성화 및 면역검출 (Roche) 용으로 사용하였다.
실시예9: RNA 전기영동 및 노던 블롯
노던 블롯에 사용할 프로브의 준비를 위해 BAC DNA 서열에 따라 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머는 하기와 같다.
mkA 유전자
전방 5' ATA GCT CCG AGA ATG GTC CC 3' (서열번호: 31)
후방 5' CCA TCA AGG ATG CTC TGT CG 3' (서열번호: 32)
프로브 길이: 229bp
mkB 유전자
전방 5' CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3' (서열번호: 33)
후방 5' CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3' (서열번호: 34)
프로브 길이: 167bp
mkC 유전자
전방 5' GGC CTG AGC CGA AGA AGT AC 3' (서열번호: 35)
후방 5' TCA GAG ATC TTC GTC CCG AC 3' (서열번호: 36)
프로브 길이: 304bp
mkD 유전자
전방 5' TGA TGA CTT TGC CCT GGC GG 3' (서열번호: 37)
후방 5' TCA CCC AAT GAC TCT AGC CC 3' (서열번호: 38)
프로브 길이: 175bp
mkE 유전자
전방 5' TTC TCT CCC GAC AAC TGC CC 3' (서열번호: 39)
후방 5' AAT GGT CAC CGC CGA CTG GA 3' (서열번호: 40)
프로브 길이: 246bp
mkF 유전자
전방 5' GCC CCG AAT CCT ACA TGA AG 3' (서열번호: 41)
후방 5' GGC CCA CCG TAG TTG ATG TG 3' (서열번호: 42)
프로브 길이: 166bp
mkG 유전자
전방 5' CCT CGC TCT GAA TAT GAC CC 3' (서열번호: 43)
후방 5' TCG GAT CGG CTT CTC AAA CC 3' (서열번호: 44)
프로브 길이: 217bp
mkH 유전자
전방 5' ACC TCA TCG CTC CAG ACC AT 3' (서열번호: 45)
후방 5' CTG CGA GAG AAT GAG AGT GC 3' (서열번호: 46)
프로브 길이: 179bp
mkI 유전자
전방 5' CTA GAC TCG TTC ATC GCG GC 3' (서열번호: 47)
후방 5' CCA TAC ATT CTA CCT TGC GG 3' (서열번호: 48)
프로브 길이: 127bp
실시예10: 피키아 패스토리스( Pichia pastoris )의 형질전환
PKS (mkA와 mkB)의 전장 cDNA를 pPICZαA와 C (Invitrogen)에 각각 연결하였다. 형질전환은 피키아 EasyComp. 키트 (Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.
실시예11: 서던 블롯
평판 쉐이커에 흔들면서 10분간 겔을 0.25M HCl에 담가 산 탈퓨린화를 수행하였다. 겔은 ddH2O로 씻어주었다. 변성은 겔을 NaCl/NaOH 용액(1.5M NaCl,0.5N NaOH)에 넣어 15분간 2회 흔들면서 수행되었고, 겔은 ddH2O로 수세하였다. 마지막으로 중화반응은 겔을 NaCl/Tris-HCl 용액 (1.5M NaCl,1M Tris-HCl, pH 7.4)에 넣어 15분간 2회 흔들면서 수행되었다. 겔과 동일 크기의 나일론 막을 준비하고, 나일론 막의 귀퉁이를 잘라 위치를 표지하였다. 겔로부터 나일론 막으로의 DNA를 옮겼으며, DNA는 UV 빛을 이용하여 나일론 막에 고정하였다. 얻어진 나일론 막은 혼성화 및 면역검출 (Roche) 용으로 사용하였다. 하기에 열거된 프라이머들은 서던 블롯에 사용되는 프로브의 준비를 위해 제작되었다.
mkA 유전자
전방2 5' TGA ACA GCA CAG CAT AGG GG 3' (서열번호: 49)
후방2 5' GCA GCC ATT GAA GAC GGC AT 3' (서열번호: 50)
프로브의 길이: 293bp
mkB 유전자
전방 5' CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3' (서열번호: 51)
후방 5' CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3' (서열번호: 52)
프로브의 길이: 167bp
실시예12: 폴리케타이드의 생산
이종 폴리케타이드 합성효소 발현의 숙주로서 대장균과 스트렙토마이세스의 유용성은 Bedford (1995), Gokhale (1999), 및 Pfeifer (2001)에 의해 연구되어 왔다. 더욱이, 세균성 폴리케타이드 합성효소는 대장균과 스트렙토마이세스에서 성공적으로 발현되어졌으며, 보다 낮은 수준의 폴리케타이드의 수율이 관찰되어졌다. 일반적으로 대장균에서 번역후 수정(posttranslational modification)과정의 결핍은 기능성 폴리케타이드 합성효소의 이종 발현을 방해한다. 따라서, 폴리케타이드 생산을 위해서는 4'-포스포판테테인 트랜스퍼라제 (PPTase)와 함께 PKS를 공발현하여 PKS의 holo-ACP (아실 운반 단백질) 도메인을 생산하는 것이 합리적이다 (Mootz 등, 2001). 본 발명의 발현벡터의 발현효율을 더욱 조사하기 위하여, 바실러스 서 브틸리스의 sfp 유전자 (PPTase)가 성공적으로 클론되어졌고, 발현벡터, pCDF-1b (도 6)에 도입되었으며, 대장균에서 PKS, mkA 유전자 (도 5)와 함께 공발현되었다. SDS-PAGE의 결과에서 낮은 수준의 수율로 PKS 가용성 단백질 (342kDa)이 확인되었다 (도 7). 하지만, 대부분의 Sfp 단백질은 가용성이며, 29kDa 단백질로 발현되었다.
1. 발현 플라즈미드의 구축
mkA 유전자의 부분 cDNA 절편 (전방 프라이머 p3: 5'-CCATCAAGGATGCTCTGTCG-3' (서열번호: 49)와 후방 프라이머 p4: 5'-TCAAGCCAACTTCAACGCGG-3' (서열번호: 50)을 가지는 6.5kb cDNA)이 RT-PCR을 이용하여 모나스커스의 첫 가닥 cDNA로부터 증폭되어졌다. 6.5kb의 cDNA 절편은 pGEM-T 벡터에 도입되어 제한반응을 통해 EcoRⅠ-NotⅠ 절편을 얻었다. 그런 다음, 상기 절편은 pET30과 연결하여 pETmkA1으로 되었다. 5' mkA 유전자에 상보적인 23염기가 포함되고, EcoR1 제한부위가 도입된 전방 프라이머 p1: 5'-GGAATTCATGTACGTAGGACGCATTGGTGC-3' (서열번호: 51)과, 후방 프라이머 p2: 5'-TCGCGAGGACGGACAAAGTT-3'를 가지는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 이용하여 부분 3.0 kb cDNA를 증폭하였다. 3.0kb EcoRⅠ-EcoRⅠ cDNA 절편을 pETmkA1에 연결하여 pETmkA로 만들었다 (도 6).
5' sfp 유전자에 상보적인 20 염기가 포함되고, BamH1 제한부위가 도입된 전방 프라이머 5'-CGGGATCCCATGAAGATTTACGGAATTTA-3' (서열번호: 53)과, 5' sfp 유전자에 상보적인 20 염기가 포함되고, NotⅠ 제한부위가 도입된 후방 프라이머 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTTATAAAAGCTCTTCGTACG-3' (서열번호: 54)를 가지는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하여 바실러스 서브틸리스 168의 게놈 DNA로부터 sfp 유전자를 증폭하였다. BamH1-NotⅠ sfp 유전자를 pCDF-1b와 연결시켜 pCDFsfp를 만들었다 (도 7).
2. 대장균에서 mkA와 sfp의 공발현(coexpression)
pETmkA와 pCDFsfp 양자를 대장균 BL21 (DE3)에 공형질전환시켰고, 밤샘배양을 위해 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하였다. 그런 다음, LB 배지를 10％ 글리세롤이 보충된 ATCC 배지 765로 옮겼으며, OD600이 0.6∼0.8에 이를 때 까지 배양하였다. 유전자 발현은 이소프로필 베타-디-티오갈락토사이드 (IPTG) 1.0mM (최종 농도)의 첨가로 유도되어졌으며, 배양은 20℃에서 48시간 동안 이루어졌다. 세포 펠렛을 수거하여 액체질소에 냉동하고, 42℃에서 해동하여 세포를 용해하였다. 용해를 쉽게하기 위해서 세포 펠렛에 라이소자임을 첨가하였다. 단백질의 발현은 총 세포성 단백질과 가용성 단백질에 대하여 SDS PAGE (7.5％ 겔)로 모니터링하였으며, 콜로이드 쿠마시 블루 염색을 수행하였다.
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본 발명에 의하면 모나콜린 케이 생합성 유전자를 제공할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (67)

  1. 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된 DNA 분자
  2. a) mkA이고, 서열번호2의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    b) mkB 이고, 서열번호3의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    c) mkC 이고, 서열번호4의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    d) mkD 이고, 서열번호5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    e) mkE 이고, 서열번호6의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    f) mkF 이고, 서열번호7의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    g) mkG 이고, 서열번호8의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    h) mkH 이고, 서열번호9의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및
    i) mkI 이고, 서열번호10의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된 DNA 분자
  3. 제 2항에 있어서, (a)인 분리된 DNA 분자
  4. 제 2항에 있어서, (b)인 분리된 DNA 분자
  5. 제 2항에 있어서, (c)인 분리된 DNA 분자
  6. 제 2항에 있어서, (d)인 분리된 DNA 분자
  7. 제 2항에 있어서, (e)인 분리된 DNA 분자
  8. 제 2항에 있어서, (f)인 분리된 DNA 분자
  9. 제 2항에 있어서, (g)인 분리된 DNA 분자
  10. 제 2항에 있어서, (h)인 분리된 DNA 분자
  11. 제 2항에 있어서, (i)인 분리된 DNA 분자
  12. 제 3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 및 아실 운반 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  13. 제 12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  14. 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 아실 운반 단백질, 및 에노일 리덕타제로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  15. 제 14항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  16. 제 5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 P450 모노옥시게나제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  17. 제 6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 옥시도 리덕타제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  18. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 디하이드로게나제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  19. 제 8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 트랜스에스터라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  20. 제 9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 HMG-CoA 리덕타제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  21. 제 10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전사인자 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  22. 제 11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 유출펌프 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  23. 제 2항의 분리된 DNA 분자를 포함하는 셔틀벡터
  24. a) mkA이고, 서열번호19의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    b) mkB이고, 서열번호20의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    c) mkC이고, 서열번호21의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    d) mkD이고, 서열번호22의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    e) mkE이고, 서열번호23의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    f) mkF이고, 서열번호24의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    g) mkG이고, 서열번호27의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    h) mkH이고, 서열번호25의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및
    i) mkI이고, 서열번호26의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된 DNA 분자
  25. 제 24항에 있어서, a)이면서, 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제 및 아실 운반 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  26. 제 25항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  27. 제 24항에 있어서, b)이면서, 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 아실 운반 단백 질, 및 에노일 리덕타제로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  28. 제 27항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  29. 제 24항에 있어서, c)이면서, P450 모노옥시게나제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  30. 제 24항에 있어서, d)이면서, 옥시도 리덕타제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  31. 제 24항에 있어서, e)이면서, 디하이드로게나제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  32. 제 24항에 있어서, f)이면서, 트랜스에스터라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  33. 제 24항에 있어서, g)이면서, HMG-CoA 리덕타제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  34. 제 24항에 있어서, h)이면서, 전사인자 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  35. 제 24항에 있어서, i)이면서, 유출펌프 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA 분자
  36. 제 24항의 분리된 DNA 분자를 포함하는 발현벡터
  37. a) mkA이고, 서열번호2 또는 19의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    b) mkB 이고, 서열번호3 또는 20의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    c) mkC 이고, 서열번호4 또는 21의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    d) mkD 이고, 서열번호5 또는 22의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    e) mkE 이고, 서열번호6 또는 23의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    f) mkF 이고, 서열번호7 또는 24의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    g) mkG 이고, 서열번호8 또는 27의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    h) mkH 이고, 서열번호9 또는 25의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    i) mkI 이고, 서열번호10 또는 26의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및
    j) 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포
  38. 제 37항에 있어서, 상기 세포는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포, 또는 사상균인 세포
  39. 제 37항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 에스피(sp)인 세포
  40. 제 37항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 및 모나스커스 퍼퓨레우스로 구성되는 군에서 선택되는 세포
  41. 제 37항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 BCRC 38072인 세포
  42. Ⅰ) a) mkA이고, 서열번호2 또는 19의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    b) mkB 이고, 서열번호3 또는 20의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    c) mkC 이고, 서열번호4 또는 21의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    d) mkD 이고, 서열번호5 또는 22의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    e) mkE 이고, 서열번호6 또는 23의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    f) mkF 이고, 서열번호7 또는 24의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    g) mkH 이고, 서열번호9 또는 25의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및
    h) 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시킨 모나콜린 케이 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    Ⅱ) 상기 세포로부터 모나콜린 케이를 수거하는 단계를 포함하는 모나콜린 케이 생산 증대방법
  43. 제 42항에 있어서, 상기 세포는 곰팡이인 방법
  44. 제 42항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 에스피(sp)인 방법
  45. 제 42항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 및 모나스커스 퍼퓨레우스로 구성되는 군에서 선택되는 방법
  46. 제 42항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 BCRC 38072인 방법
  47. 제 42항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 g)인 방법
  48. Ⅰ) a) mkA이고, 서열번호2 또는 19의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    b) mkB 이고, 서열번호3 또는 20의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    c) mkE 이고, 서열번호6 또는 23의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    d) mkF 이고, 서열번호7 또는 24의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 1종의 폴리뉴클레오티드로 형질전환시킨 HMG-CoA 리덕타제 저해제 생산 세포를 배양하는 단계; 및
    Ⅱ) 상기 세포로부터 HMG-CoA 리덕타제 저해제를 수거하는 단계를 포함하는 HMG-CoA 리덕타제 저해제의 생산방법
  49. 제 48항에 있어서, 상기 HMG-CoA 리덕타제 저해제는 모나콜린 케이인 방법
  50. 제 48항에 있어서, 상기 세포는 곰팡이인 방법
  51. 제 48항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 에스피(sp)인 방법
  52. 제 48항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 필로서스, 모나스커스 루버, 및 모나스커스 퍼퓨레우스로 구성되는 군에서 선택되는 방법
  53. 제 48항에 있어서, 상기 세포는 모나스커스 BCRC 38072인 방법
  54. 제 48항에 있어서, 상기 세포는
    ⅰ) mkC이고, 서열번호4 또는 21의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    ⅱ) mkD이고, 서열번호5 또는 22의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드,
    ⅲ) mkH이고, 서열번호9 또는 25의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및
    ⅳ) 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드가 더 형질전환되어지는 방법
  55. a) 서열번호11의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    b) 서열번호12의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    c) 서열번호13의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    d) 서열번호14의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    e) 서열번호15의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    f) 서열번호16의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    g) 서열번호28의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드,
    h) 서열번호17의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드, 및
    i) 서열번호18의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된 DNA 분자
  56. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 a)이면서, 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 및 아실 운반 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  57. 제 56항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 노나케타이드 합성효소 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  58. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 b)이면서, 베타-케토아실 합성효소, 아세틸 트랜스퍼라제, 디하이드라타제, 메틸트랜스퍼라제, 케토리덕타제, 아실 운반 단백질, 및 에노일 리덕타제로 구성되는 군에서 선택되는 1종의 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  59. 제 58항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 디케타이드 합성효소 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  60. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 c)이면서, P450 모노옥시게나제 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  61. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 d)이면서, 옥시도리덕타제 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  62. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 e)이면서, 디하이드로게나제 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  63. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 f)이면서, 트랜스에스터라제 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  64. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 g)이면서, HMG-CoA 리덕타제 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  65. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 h)이면서, 전사인자 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  66. 제 55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 i)이면서, 유출펌프 활성을 가지는 분리된 DNA 분자
  67. 제 55항의 분리된 DNA 분자를 포함하는 발현벡터
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