FR2883297A1 - Genes de la biosynthese de la monacoline k - Google Patents

Abstract

L'inhibiteur de cholestérol produit par Monascus, la lovastatine, est un métabolite secondaire de polykétides. L'invention propose des sondes spécifiques du groupe de gènes de biosynthèse de la lovastatine. Les clones BAC ayant un groupe de gènes supposé de la lovastatine ont été criblés à partir d'une bibliothèque de BAC (chromosome artificiel bactérien) et un séquençage et une annotation ont été réalisés sur ces clones. Les résultats montrent que 2 gènes de polykétide synthétase (PKS) et 7 gènes régulateurs liés à la synthèse de lovastatine ont été obtenus. Des ADN entiers de ces gènes ont ensuite été obtenus par RT-PCR et cloner dans des vecteurs d'expression pour l'expression de ces gènes.

Description

GENES DE LA BIOSYNTHESE DE LA MONACOLINE K

La présente invention concerne le domaine de la biologie 5 moléculaire et de la microbiologie. Plus particulièrement, l'invention concerne des gènes de la biosynthèse de la monacoline K. La levure Monascus est utilisée dans la production alimentaire depuis des milliers d'années en Chine. Récemment, on a découvert que Monascus produit plusieurs substances bioactives. Ces substances bioactives sont principalement des métabolites secondaires de Monascus, comprenant des substances permettant de réduire l'hypertension, des substances de bactéries anti-putréfaction telles que la monascidine, des substances anti-cancéreuses, des substances permettant de réduire le sucre sanguin, de l'ergostérol, des anti-oxydants, et des inhibiteurs de la synthèse du cholestérol tels que la monacoline. Par conséquent, Monascus est apparu ces dernières années comme un aliment naturel fonctionnel.

La monacoline K, l'inhibiteur de la synthèse du cholestérol produit par Monascus, a tout d'abord été isolée du milieu de Monascus rubber par SANKYO CO., LTD. Merck & Co., Inc., puis on a trouvé la même substance dans le milieu de Aspergillus terreus, nommée lovastatine et agissant comme inhibiteur de la HMG-CoA réductase. La monacoline K fait partie des polykétides et leur structure présente des similitudes avec celle de HMGCoA. Par conséquent, la monacoline K inhibe de manière compétitive la synthèse du cholestérol avec HMG-CoA, et la HMGCoA réductase ne peut pas catalyser HMG-CoA pour former le mévolonate, entraînant la réduction de la synthèse du cholestérol.

Les métabolites secondaires des polykétides produits par des champignons expriment une variété structurelle et des caractéristiques uniques qui n'existent pas dans d'autres bactéries (O'Hagan, 1995). Ces caractéristiques sont également exprimées dans une variété d'enzymes de la synthèse du polykétide. La monacoline K produite par Monascus est un élément du groupe des polykétides et on a observé que les divers polykétides sont produits par condensation de l'acétyle CoA catalysé par la polykétide synthase (PKS) (Kennedy et coll., 1999; et Abe et coll., 2002). A partir de l'étude de la polykétide synthase associée à la biosynthèse combinatoire, le développement de nouveaux polykétides représente un potentiel important (Mc Daniel et coll., 1999), et les nouveaux polykétides constitueront une nouvelle voie permettant de trouver des médicaments efficaces.

RE SUME

En conséquence, un mode de réalisation de la présente invention fournit une molécule d'ADN isolée, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle- ci dans des conditions stringentes.

Un autre mode de réalisation de la présente invention procure une molécule d'ADN isolée comprenant un polynucléotide choisi dans un groupe comprenant: a) un polynucléotide désigné mkA et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 , b) un polynucléotide désigné mkB et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , c) un polynucléotide désigné mkC 2883297 3 et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 4 , d) un polynucléotide désigné mkD et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 5 , e) un polynucléotide désigné mkE et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N 6 , f) un polynucléotide désigné mkF et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 7 , g) un polynucléotide désigné mkG et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N 8 , h) un polynucléotide désigné mkH et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , i) un polynucléotide désigné mkI et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 10 , et 7) un polynucléotide pouvant être hybridé aux polynucléotides a), b), c), d), e), f), g), h), ou i) dans des conditions stringentes.

Un autre mode de réalisation de la présente invention 15 fournit un vecteur comprenant la molécule d'ADN isolée telle que définie ci-dessus.

De plus, un mode de réalisation de la présente invention procure une cellule transformée par un vecteur comportant un polynucléotide choisi dans le groupe comprenant a) un polynucléotide désigné mkA et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 , b) un polynucléotide désigné mkB et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , c) un polynucléotide désigné mkC et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 4 , d) un polynucléotide désigné mkD et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 5 , e) un polynucléotide désigné mkE et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 6 , f) un polynucléotide désigné mkF et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 7 , g) un polynucléotide désigné mkG et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 8 , h) un polynucléotide désigné mkH et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , i) un polynucléotide désigné mkI et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 10 , et j) la combinaison de ceux- ci.

En outre, un mode de réalisation de la présente invention fournit un procédé d'augmentation de la production de monacoline K, comprenant la culture d'une cellule transformée par un vecteur, et le recueil de la monacoline K à partir de la cellule. Le vecteur comportant un polynucléotide est choisi dans un groupe comprenant a) un polynucléotide désigné mkA et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 , b) un polynucléotide désigné mkB et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , c) un polynucléotide désigné mkC et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 4 , d) un polynucléotide désigné mkD et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 5 , e) un polynucléotide désigné mkE et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 6 , f) un polynucléotide désigné mkF et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 7 , g) un polynucléotide désigné mkH et comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , et h) leur combinaisons.

De plus, un mode de réalisation de la présente invention procure un procédé d'augmentation de la production de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase, comprenant la culture d'une cellule transformée par un vecteur, et le recueil de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase à partir de la cellule. Le vecteur est tel que défini ci-dessus.

En outre, un mode de réalisation de la présente invention fournit un procédé de production de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. Le procédé comprend les étapes constituées de: (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 (ADN génomique de mkA), SEQ ID N : 3 (ADN génomique de mkB), SEQ ID N : 6 (ADN génomique mkE), et SEQ ID N : 7 (ADN génomique mkF), ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec ces séquences, ou d'une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à ces séquences dans des conditions stringentes dans une cellule hôte, ces séquences codant pour des protéines présentant respectivement l'activité de la nonakétide synthase, de la dikétide synthase, de la déshydrogénase, et de la transestérase; (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des séquences de nucléotides; et (c) le recueil de l'inhibiteur de la HMG-CoA.

En outre, un mode de réalisation de la présente invention fournit un procédé de production de la monacoline k, comprenant la culture d'une cellule transformée par un vecteur et le recueil de la monacoline k à partir de la cellule. Le vecteur est tel que défini ci-dessus.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

Les modes de réalisation de la présente invention pourront être compris plus complètement et d'autres avantages apparaîtront en référence à la description suivante et aux dessins l'accompagnant, sur lesquels: les FIG. 1A-1G illustrent la comparaison de séquences de la polykétide synthase de Monascus ou d'autres champignons, et du motif de la synthase d'acide gras de rat. La FIG. 1A présente la comparaison avec la kétoacyle synthase, la FIG. 1B montre la comparaison avec l'acyle transférase, la FIG. 1C montre la comparaison avec la déshydratase, la FIG. 1D présente la comparaison avec la méthyle transférase, la FIG. 1E montre la comparaison avec l'énoyle réductase, la FIG. 1F montre la comparaison avec la kétoacyle réductase et la FIG. 1G montre la comparaison avec la protéine porteuse d'acyle.

La FIG. 2 illustre l'expression de la batterie de gènes mk 10 de Monascus à 3-14 jours.

Les FIG. 3A et 3B illustrent des cartes de pPICZamkA et de pPICZamkB respectivement.

La FIG. 4 illustre la séquence d'acides aminés MKH et le motif binucléaire supposé Zn(II)Cys6 analysé par le vecteur NTI.

La séquence d'acides aminés dans l'encadré indique le motif binucléaire Zn(II)Cys6; 6 Cys est marqué en gris.

La FIG. 5 illustre des constructions du vecteur d'expression de E. coli contenant le gène mkA de la polykétide synthase. Un groupe d'amorces d'oligonucléotides (p3 et p4) a été conçu pour amplifier l'ADNc partiel du gène mkA (6,5kb) par RT-PCR. Les amorces de p1 et p2 ont été conçues pour amplifier l'ADNc partiel du gène mkA (3,Okb) par RT-PCR.

La FIG. 6 illustre la construction du vecteur d'expression de E. coli contenant le gène sfp de la 4'-phosphopantéthéine 25 transférase de B. subtilis.

La FIG. 7 illustre l'expression de mkA et sfp dans E coli. Les protéines totales de E. coli abritant les plasmides de contrôle pCDF-lb et pET30 (bande 1) et les plasmides d'expression pCDFsfp (gène sfp) et pETmkA (gène mkA) (bande 2) ont été portées à ébullition dans un tampon de chargement et soumises à une analyse SDS-PAGE. Les protéines ont été colorées avec du bleu de coomassie colloïdal. Les flèches indiquent les positions de Sfp et de MKA. Les protéines lysées ont été purifiées par le système de purification ProBondTM (Invitrogen).

La bande 3 montre la centrifugation du lysat à 3000xg pendant 60 min et la bande 4 correspond aux protéines purifiées par colonne Ni.

DESCRIPTION DETAILLEE

Des sondes spécifiques à Monascus ont été conçues selon les amorces dégénérées de la lovastatine d'Aspergillus terreus, selon la publication de Nicholson (2001). Les gènes apparentés à la synthèse de la monacoline K ont été clonés à partir de la banque BAC de Monascus par hybridation sur colonie, séquencés et annotés. Deux ADNc complets de PKS ont été amplifiés par RT-PCR et clonés dans des vecteurs d'expression, respectivement. L'invention était alors réalisée.

La découverte des inhibiteurs du cholestérol produits par Monascus dans les années 1980 a suscité un intérêt accru centré sur l'effet de Monascus sur la réduction de l'hypertension, de l'hyperglycémie et du cholestérol. Outre la monacoline K, d'autres substances destinées à réduire le taux de cholestérol ont été isolées à partir de Monascus, par exemple, la monacoline J, L, M, et X (Endo et coll., 1979, 1985, 1986, et Komagata et coll., 1989). Les monacolines J et L sont les précurseurs de la monacoline K. Le mécanisme de l'inhibition de la synthèse du cholestérol par la monacoline K est basé sur des similitudes structurelles existant entre la monacoline k et HMG-CoA. La monacoline k peut se lier à la HMG- CoA réductase et bloquer son activité de catalyse pour la formation de mévolonate à partir de HMG-CoA, ce qui réduira alors considérablement la synthèse du cholestérol. Excepté la monacoline K, d'autres procédés adoptant la biotransformation ou la modification chimique pour l'inhibition du cholestérol sont également disponibles dans le commerce, par exemple, la pravastatine, la simvastatine, la fluvastatine, ou l'atorvastatine, qui partagent toutes les similitudes structurelles avec HMG-CoA.

Par conséquent, l'objet principal de la présente invention est de fournir des gènes liés à la production de la monacoline K à partir de Monascus. L'objet analysé dans la présente invention 10 est Monascus sp. BCRC 38072 présentant les caractéristiques suivantes: Caractéristiques macroscopiques CYA, 25 C, 7 jours. Colonies de 25-26 mm diamètre, mycélium blanc initialement, devenant rouge - orange pâle puis rouge 15 orange foncé.

MEA, 25 C, 7 jours. Colonies de 48 mm de diamètre, rouge orange brillant, puis rouge orange vif.

G25N, 25 C, 7 jours. Colonies de 28-29 mm de diamètre, rouge orange foncé, jaune orange foncé aux centres.

Caractéristiques microscopiques Aleurioconidia se présentant sous forme individuelle ou occasionnellement en courtes chaînes, obpyriforme à globuleux, 10-13x8-10 m. Cleistothecia globuleux, 37-72 m de diamètre.

Ascospores hyalins, ellipsoïdes, 4,6-6,3 (-6,6)x 3,3-4,2 m.

Selon le système de classification de Hawksworth & Pitt (1983), BCRC 38072 a été identifié comme suit: Caractéristiques morphologiques BCRC 38072 est entre M. pilosus et M. ruber.

1. BCRC 38072 est similaire à M. pilosus dans la couleur des colonies et le taux de croissance.

2. BCRC 38072 est similaire à M. ruber en matière de morphologie de l'ascospore.

Analyse de séquence: BCRC 38072, M. ruber, et M pilosus partagent 100 % de similitude de séquence en matière d'ADNr, de ses fragments et du gène de -tubuline.

Identification de l'espèce: BCRC 38072 a été nommé provisoirement Monascus pilosus K. Sato selon D. Hawksw. & Pitt.

A partir de l'analyse de BCRC 38072 de Monascus pilosus, des sondes spécifiques à la région conservée de la kétosynthase, d'une longueur de 226 pb ( SEQ ID N : 1 ) ont été conçues pour servir à l'hybridation en colonies, l'analyse southern blot et la PCR. De plus, les sondes peuvent être utilisées pour le screening de Monascus. L'annotation et la prévision de la séquence d'ADN BAC complète ont été réalisées par BLAST et Vecteur NTI. Neuf gènes partageant des similitudes élevées sur plus de 54 % avec la batterie de gènes de la lovastatine produits par Aspergillus terreus ont été obtenus par la banque BAC, comme le montre le tableau 1.

Tableau 1 Comparaison des similitudes de la batterie de gènes mk de Monascus, la batterie de gènes lov de Aspergillus terreus, et la batterie de gènes m1c de Penicillium citrinum.

Gène mk Acides Poids moléculaire Fonction Gène lovSimilitude Gène mlcSimilitude aminés homologue protéique (%) (kDa) proposée homologue protéique (%) mkA 3075 338 polykétide lovB 76 micA 66 synthase mkB 2547 276 polykétide lovF 73 mlcB 61 synthase P450 lovA 85 mlcC 67 mkC 524 60.6 monooxygénase mkD 263 28.9 Oxydoréductase lovG 67 m1cF 53 mkE 360 38.9 Déshydrogénase lovC 81 micG 70 mkF 413 46.8 Transestérase lovD 74 mlcH 63 mkG 1052 113 HMG-CoA 1vrA 69 mlcD 39 réductase mkH 455 49.4 Facteur delovE 54 mlcR 49

transcription

raki 543 57.5 Pompe à efflux lovl 81 micE 68 La batterie de gènes de la monacoline K et la batterie de gènes de la compactine, synthétisés à partir de Penicillin citrinum, partagent des similitudes élevées de plus de 49 Les neufs gènes comprennent deux gènes de la polykétide synthase, l'un étant responsable de la synthèse des nonakétidse et l'autre, de la synthèse des dikétides. De plus, un gène de la monooxygénase, un gène de l'oxydoréductase, un gène de la déshydrogénase, un gène de la transestérase, un gène de la HMGCoA réductase, un gène du facteur de transcription et un gène de la pompe à efflux sont également compris. Une banque de fosmide de Monascus a été construite et deux clones qui ont été détectés par la comparaison des séquences terminales de fosmide ont fait l'objet d'une demande de brevet sous le n pMPF001, comprenant mkB, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH; et pMPF002 comprenant mkA, mkC, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH, et mkl. pMPF001 a été déposé auprès de la American Type Culture Collection (ATCC) sous la référence PTA-5685, et pMPF002, sous la référence PTA-5686. Les régions fonctionnelles du gène de la nonakétide synthase et du gène de la dikétide synthase ont en outre été analysées par comparaison avec des gènes de polykétide connus d'Aspergillus, Penicillium, Cochliobolus, et Gibberella, et des gènes de la synthèse d'acides gras (FAS) de rat. Les résultats indiquent que les régions fonctionnelles de ces deux gènes sont similaires à celles de la lovastatins produite par Aspergillus terreus et de la compactine produite par Penicillium citrinum, comme le montre la FIG. 1. L'analyse northern blot de l'ARN total extrait de Monascus met en évidence l'expression de ces gènes au niveau transcriptionnel, comme le montre la FIG. 2.

Les deux gènes de la polykétide synthase de la présente 30 invention sont des enzymes multifonctionnelles: le gène mkA a une fonctionnalité de kétoacyle synthase, d'acétyle transférase, de déshydratase, de méthyltransférase, de kétoréductase, et de protéine porteuse d'acyle; le gène mkB exerce les 6 fonctions mentionnées ci-dessus et en outre, la fonction de l'énoyle réductase, comme le montre la FIG. 1.

L'ADNc complet des deux gènes a été obtenu par RT-PCR, puis cloné dans le système d'expression de Pichia pastoris pour l'expression des produits des polykétides. Comme le gène de la polykétide synthase exprime des enzymes multifonctionnelles, divers produits de polykétides peuvent être produits par recombinaison de l'ADN comme le réarrangement à partir de l'ADNc complet de la présente invention. Ce procédé ouvre une nouvelle voie de recherche de nouveaux médicaments. Plusieurs brevets tels que les brevets US n 6 221 641 et 6 391 594 présentent des procédés similaires d'expression dans des bactéries. Toutefois, les métabolites secondaires des polykétides produits par des champignons présentent une variété et une complexité structurelles. Par conséquent, pPICZamkA (FIG. 3A) et pPICZamkB (FIG. 3B) obtenus dans la présente invention peuvent être utilisés comme plasmides d'expression pour exprimer divers produits de polykétides par réarrangement.

En conséquence, la présente invention propose les molécules d'ADN, vecteurs et procédés suivants.

(I) Sondes pour le screening de gènes liés à la synthèse de la monacoline K La présente invention présente une sonde pour le screening des gènes liés à la synthèse de la monacoline K, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 1 . La sonde est spécifique à Monascus BCRC38072 et a été conçue à partir des amorces dégénérées pour le gène de la synthèse de la lovastatine d'Aspergillus terreus conçu par Nicoholson (2001). Il est facile pour l'homme du métier d'isoler ou de purifier des gènes similaires à ceux de la monacoline K par des procédés connus tels que l'hybridation en utilisant la sonde de la présente invention.

(II) Nonakétide synthase (ADN génomqiue de mkA) Un aspect de la présente invention concerne une séquence ADN comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 (ADN génomique mkA), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de nonakétide synthase. La séquence d'ADN a été isolée à partir de BCRC38072. De plus, la séquence d'ADN de la présente invention peut être obtenue par l'homme du métier par des procédés connus tels que la PCR ou l'hybridation selon la description de la présente invention. Des références aux conditions stringentes peuvent être trouvées dans le document EP 1 325 959 Al P7 [0036]. La nonakétide synthase catalyse un acétate et huit malonates pour former un nonakétide. Ce gène présente des régions multifonctionnelles, comprenant la - kétoacyle synthase, l'acétyltransférase, la déshydratase, la méthyltransférase, la kétoréductase, et la protéine porteuse d'acyle. La comparaison de ce gène avec les régions fonctionnelles d'autres espèces montre que les régions fonctionnelles de mkA de Monascus BCRC38072 partagent une similitude élevée avec le gène IovB de Aspergillus terreus et le gène micA de Penicillium citrinum.

Un autre aspect de la présente invention propose un vecteur, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 (ADN génomique de mkA), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles- ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de nonakétide synthase. Les outils de construction du vecteur de la présente invention comprennent des séquences moléculaires auto-réplicables ou intégrables au chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus; de préférence, le vecteur est un vecteur navette. Le vecteur de la présente invention produit en outre divers produits de polykétide par réarrangement. Une référence au réarrangement peut être trouvée dans le brevet US n : 6 221 641 et le brevet US n : 6 391 594.

Un autre aspect de l'invention concerne un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec la SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de nonakétide synthase, et une cellule hôte pour construire le transformant. La cellule hôte comprend les cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules hôtes appropriées comprennent de manière non restrictive, les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insecte, les cellules végétales, ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement, BCRC38072.

La transformation peut être réalisée en utilisant un procédé de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en utilisant le système hôte - vecteur connu. Voir le document EP 1 325 959 Al P5 [0022].

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'augmentation de la production de manacoline K, comprenant les étapes constituées de: (a) la transformation d'une séquence de nucléotides de SEQ ID N : 2 (ADN génomique de mkA), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de nonakétide synthase dans une cellule hôte; et (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte est initialement une cellule produisant la monacoline K. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'augmentation de la production d'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. Le procédé comprend les étapes constituées de: (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 , ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 2 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider avec celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de nonakétide synthase dans une cellule hôte; (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides; et (c) le recueil de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. De préférence, la cellule hôte est initialement une cellule produisant la monacoline K. (III) Dikétide synthase (ADN génomique mkB) La présente invention concerne une sequence d'ADN comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 (ADN génomique mkB), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de dikétide synthase. La séquence d'ADN a été isolée à partir de BCRC38072. De plus, la séquence ADN de la présente invention peut être obtenue de l'homme du métier par des procédés connus tels que la PCR ou l'hybridation selon la description de l'invention. Des références aux conditions stringentes peuvent être trouvées dans le document EP 1 325 959 Al P7 [0036]. La dikétide synthase fait la biosynthèse d'une branche de la monacoline K, à savoir les dikétides ou désignés sous le terme 2-méthylbutyrate. Ce gène présente des régions multifonctionnelles comprenant la -kétoacyle synthase, l'acétyle transférase, la déshydratase, la méthyltransférase, la kétoréductase, la protéine porteuse d'acyle et l'énoyle réductase. La comparaison de ce gène avec les régions fonctionnelles d'autres espèces montre que les régions fonctionnelles de mkB de Monascus pilosus BCRC38072 partagent une similitude élevée avec le gène lovF de Aspergillus terreus et le gène mlcB de Penicillium citrinum.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de dikétide synthase.

Les outils de construction du vecteur de la présente invention comprennent les séquences moléculaires qui sont auto-réplicables ou intégrables à un chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus. Le vecteur de la présente invention produit en outre divers produits de polykétide par réarrangement. Des références au réarrangement peuvent être trouvées dans les brevets US N : 6 221 641 et US n : 6 391 594.

Un autre aspect de l'invention concerne également un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de dikétide synthase, et une cellule hôte pour construire le transformant. La cellule hôte comprend les cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules hôtes appropriées comprennent de manière non restrictive, les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insecte, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement, BCRC38072. La transformation peut être réalisée en utilisant un procédé de transformation des champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en utilisant le système hôte - vecteur connu. Voir le document EP 1 325 959 Al P5 [0022].

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'augmentation de la production de monacoline K, comprenant les étapes constituées de: (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de dikétide synthase dans une cellule hôte; et (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte estinitialement une cellule produisant la monacoline K. Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé d'augmentation de la production de la HMG-CoA réductase.

Le procédé comprend les étapes constituées de (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 3 , ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 3 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de dikétide synthase dans une cellule hôte; (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides; et (c) le recueil de l'inhibiteur de la HMG- CoA réductase. De préférence, la cellule hôte est initialement une cellule produisant la monacoline K.

(IV) Facteur de transcription (ADN génomique mkH)

La présente invention concerne une séquence d'ADN comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 (ADN génomique mkH DNA), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription. La séquence ADN a été isolée à partir de BCRC38072. De plus, la séquence ADN de la présente invention peut être obtenue de l'homme du métier par des procédés connus tels que la PCR ou l'hybridation selon la description de l'invention. Des références aux conditions stringentes peuvent être trouvées dans le document EP 1 325 959 Al P7 [0036]. Le gène mkH est identifié sous le motif binucléaire Zn(II)Cys6 à partir de la comparaison avec le vecteur NTI. La séquence conservée de ce gène est Cys-X2-Cys-X6-Cys-Xll-Cys-X2- Cys-X6-Cys, comme le montre la FIG. 4.

Un autre aspect de la présente invention concerne un vecteur comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription. Les outils de construction du vecteur de la présente invention comprennent des séquences moléculaires auto-réplicables ou intégrables au chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus. De préférence, le vecteur de la présente invention est un vecteur d'expression.

Un autre aspect de l'invention concerne également un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription, et une cellule hôte pour la construction du transformant. La cellule hôte comprend les cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules hôtes appropriées comprennent de manière non restrictive, des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insecte, des cellules végétales ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC38072. La transformation peut être réalisée en utilisant un procédé de transformation des champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en utilisant le système hôte - vecteur connu. Voir le document EP 1 325 959 Al P5 [0022].

Un autre aspect de l'invention concerne un système d'expression. Le système d'expression comprend une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription, et une cellule hôte pour l'expression de la séquence de nucléotides. La séquence est transformée dans la cellule hôte par transformation. Les cellules hôtes appropriées comprennent les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insecte, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC38072.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'augmentation de la production de monacoline K, comprenant les étapes constituées de: (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription dans une cellule hôte; et (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte est initialement une cellule produisant la monacoline K. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'augmentation de la production de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. Le procédé comprend les étapes constituées de. (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 9 , ou d'une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec SEQ ID N : 9 , ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celles-ci dans des conditions stringentes et codant pour une protéine présentant une activité de facteur de transcription dans une cellule hôte; (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides; et (c) le recueil de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. La cellule hôte comprend les cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules hôtes appropriées comprennent de manière non restrictive, les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insecte, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC38072.

(V) Inhibiteur de la HMG-CoA réductase et production de monacoline K La présente invention concerne un procédé de production de l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase, utilisé de préférence pour la production de monacoline K. Le procédé comprend les étapes constituées de (a) la transformation d'une séquence de nucléotides SEQ ID N : 2 (ADN génomique mkA), SEQ ID N : 3 (ADN génomqiue mkB), SEQ ID N : 6 (ADN génomique mkE), et SEQ ID N : 7 (ADN génomqiue mkF), ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à ces séquences dans des conditions stringentes dans une cellule hôte, ces séquences codant pour des protéines présentant respectivement l'activité de nonakétide synthase, de dikétide synthase, de déshydrogénase, et de transestérase; (b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des séquences de nucléotides; et (c) le recueil de la monacoline K. La cellule hôte comprend des cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules hôtes appropriées comprennent de manière non restrictive, les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insecte, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être Monascus sp., en particulier Monascus pilosus, Monascus ruber, ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC38072.

Hutchinson et coll. (2000) ont suggéré que quatre gènes étaient nécessaires pour la synthèse de la lovastatine lorsque celle-ci est exprimée de manière hétérologue, à savoir, ceux de la nonakétide synthase, la dikétide synthase, la déshydrogénase, et la transestérase. Parmi celles-ci, la nonakétide synthase et la déshydrogénase contribuent à la production du précurseur de la lovastatine, la dikétide synthase aide à la production de 2-méthylbutyrate, et le 2-méthylbutyrate produit se lie à la nonakétide par transestérase et forme la lovastatine complète.

Le procédé mentionné ci-dessus comprend en outre une séquence de nucléotides SEQ ID N : 4 (ADN génomique mkC), SEQ ID N : 5 (ADN génomique mkD), SEQ ID N : 8 (ADN génomqiue mkG), SEQ ID N : 9 (ADN génomique mkH) , et SEQ ID N : 10 (ADN génomique mkl), ou une séquence de nucléotides partageant une homologie de 95 % avec ces séquences, ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à ces séquences dans des conditions stringentes, ces séquences codant pour des protéines présentant respectivement les activités de P450 monooxygénase, d'oxydoréductase, de HMG-CoA réductase, du facteur de

transcription et l'activité de pompe à efflux.

(VI) Nonakétide synthase (ADNc de mkA) L'invention concerne une séquence d'ADN comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 (ADNc de mkA), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité nonakétide synthase. La séquence d'ADN a été isolée à partir de BCRC38072. En outre, la séquence d' ADN de l'invention peut être obtenue par l'homme du métier à partir de procédés connus tels qu'une amplification PCR ou une hybridation, conformément à la description de l'invention.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 (ADNc de mkA), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité nonakétide synthase. Les outils permettant de construire le vecteur de l'invention comprennent des séquences moléculaires auto-réplicables ou intégrables à un chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus. De préférence, le vecteur de l'invention est un vecteur d'expression. De manière davantage préférée, le vecteur de l'invention est le vecteur pPICZ A (Invitrogen). Le produit d'assemblage de l'invention est pPICZamkA comprenant la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 . Le produit d'assemblage pPICZamkA a été obtenu par clonage de l'ADNc pleine longueur du gène mkA dans pPICZ A conformément aux procédés décrits dans le document Molecular Cloning (Clonage moléculaire). L'utilisation du vecteur de l'invention permet d'obtenir, par recombinaison aléatoire (shuffling), différents produits polykétides. Il existe des références à la recombinaison aléatoire consultables dans le Brevet US N : 6 221 641 et dans le Brevet US N : 6 391 594.

Un autre aspect de l'invention concerne aussi un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité nonakétide synthase, et une cellule hôte pour construire le transformant. La cellule hôte est une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Les cellules hôtes appropriées comprennent, mais sans limitation aucune, des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être ceux de l'espèce Monascus, en particulier le Monascus pilosus, le Monascus rober ou le Monascus purpureus, et plus particulièrement le BCRC38072. La transformation peut être réalisée par l'application d'un procédé de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en faisant appel au système hôte-vecteur connu de longue date. Voir Document EP 1 325 959 Al P5 [0022] .

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production de monacoline K, comprenant les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité nonakétide synthase dans une cellule hôte; et (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production d'un inhibiteur de la HMGCoA réductase. Ce procédé comprend les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 19 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité nonakétide synthase dans une cellule hôte; (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides et (c) recueillir l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K. (VII) Dikétide synthase (ADNc de mkB) L'invention concerne une séquence d'ADN comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 20 (ADNc de mkB), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité dikétide synthase. La séquence d'ADN a été isolée à partir de BCRC38072. En outre, la séquence d' ADN de l'invention peut être obtenue par l'homme du métier à partir de procédés connus tels qu'une amplification PCR ou une hybridation conformément à la description de l'invention.

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 20 (ADNc de mkB), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité dikétide synthase. Les outils permettant de construire le vecteur de l'invention comprennent des séquences moléculaires auto-réplicables ou intégrables à un chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus. De préférence, le vecteur de l'invention est un vecteur d'expression. De manière davantage préférée, le vecteur de l'invention est le vecteur pPICZ C (Invitrogen). Le produit d'assemblage de l'invention est pPICZamkB comprenant la séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 20 . Le produit d'assemblage pPICZamkB a été obtenu par clonage de l'ADNc pleine longueur du gène mkB dans le vecteur pPICZ C conformément aux procédés décrits dans le document Molecular Cloning (Clonage moléculaire). L'utilisation du vecteur de l'invention permet d'obtenir par recombinaison aléatoire (shuffling), différents produits polykétides. Il existe des références à la recombinaison aléatoire consultables dans le Brevet US N : 6 221 641 et dans le Brevet US N : 6 391 594.

Un autre aspect de l'invention concerne aussi un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité dikétide synthase, et une cellule hôte pour construire le transformant. La cellule hôte est une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Les cellules hôtes appropriées comprennent, mais sans limitation aucune, des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être ceux de l'espèce Monascus, en particulier le Monascus pilosus, le Monascus rober ou le Monascus purpureus, et plus particulièrement le BCRC38072. La transformation peut être réalisée par l'application d'un procédé de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en faisant appel au système hôte-vecteur connu de longue date. Voir Document EP 1 325 959 Al P5 [0022] .

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production de monacoline K, comprenant les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité dikétide synthase dans une cellule hôte; et (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production d'un inhibiteur de la HMGCoA réductase. Ce procédé comprend les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 20 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celle-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité dikétide synthase dans une cellule hôte; (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides et (c) recueillir l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K.

(VIII) Facteur de transcription (ADNc de mkH)

L'invention concerne une séquence d'ADN comprenant une séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 25 (ADNc de mkH), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s'hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité de facteur de transcription. La séquence d'ADN a été isolée à partir de BCRC38072. En outre, la séquence d' ADN de l'invention peut être obtenue par l'homme du métier à partir de procédés connus tels qu'une amplification PCR ou une hybridation conformément à la description de l'invention. Il existe des références aux conditions stringentes consultables dans le document EP 1 325 959 Al P7 [0036].

Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité de facteur de transcription. Les outils permettant de construire le vecteur de l'invention comprennent des séquences moléculaires autoréplicables ou intégrables à un chromosome dans une cellule hôte, par exemple, un plasmide, un phage, ou un virus. De préférence, le vecteur de l'invention est un vecteur d'expression. De manière davantage préférée, le vecteur de l'invention est le vecteur pMS. Le produit d'assemblage de l'invention est pMSmkH comprenant la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 . Le produit d'assemblage pMSmkH a été obtenu par clonage de l'ADNc pleine longueur du gène mkH dans le vecteur pMS conformément aux procédés décrits dans le document Molecular Cloning (Clonage moléculaire).

Un autre aspect de l'invention concerne aussi un transformant, comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et le codage d'une protéine ayant une activité de facteur de transcription, et une cellule hôte pour construire le transformant. La cellule hôte est une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Les cellules hôtes appropriées comprennent, mais sans limitation aucune, des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être ceux de l'espèce Monascus, en particulier le Monascus pilosus, le Monascus ruber ou le Monascus purpureus, et plus particulièrement le BCRC38072. La transformation peut être réalisée par l'application d'un procédé de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en faisant appel au système hôte-vecteur connu de longue date. Voir Document EP 1 325 959 Al P5 [0022].

Un autre aspect de la présente invention concerne un système d'expression. Ce système d'expression comprend une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes, et une cellule hôte appropriée pour l'expression d'une séquence de nucléotides, où la séquence est transformée dans la cellule hôte par une transformation. Les cellules hôtes appropriées comprennent des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être ceux de l'espèce Monascus, en particulier le Monascus pilosus, le Monascus ruber ou le Monascus purpureus, et plus particulièrement le BCRC38072.

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production de monacoline K, comprenant les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité de facteur de transcription dans une cellule hôte; et (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé permettant d'augmenter la production d'un inhibiteur de la HMG- CoA réductase. Ce procédé comprend les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec la SEQ ID NO: 25 , ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à celles-ci dans des conditions stringentes et à coder une protéine ayant une activité de facteur de transcription dans une cellule hôte; (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides et (c) recueillir l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase. De préférence, la cellule hôte est, à l'origine, une cellule produisant de la monacoline K. (IX) Production d'un inhibiteur de la HMG-CoA réductase et de monacoline K La présente invention concerne un procédé pour la production d'un inhibiteur de la HMG-CoA réductase, de préférence la production de monacoline K. Ce procédé comprend les étapes consistant à : (a) transformer une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 19 (ADNc de mkA), SEQ ID NO: 20 (ADNc de mkB), SEQ ID NO: 23 (ADNc de mkE) et SEQ ID NO: 24 (ADNc de mkF), ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à ces séquences dans des conditions stringentes dans une cellule hôte, où ces séquences codent des protéines ayant respectivement une activité nonakétide synthase, dikétide synthase, déhydrogénase et transestérase; (b) cultiver la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence de nucléotides et (c) recueillir la monacoline K. La cellule hôte est une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Les cellules hôtes appropriées comprennent, mais sans limitation aucune, des bactéries, des levures, des cellules animales, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, ou des champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être ceux de l'espèce Monascus, en particulier le Monascus pilosus, le Monascus rober ou le Monascus purpureus, et plus particulièrement le BCRC38072. Selon Hutchinson et al. (2000), quatre gènes sont nécessaires pour la synthèse de la lovastatine en cas d'expression hétérologue, qui sont la nonakétide synthase, la dikétide synthase, la déhydrogénase et la transestérase. Parmi elles, la nonakétide synthase et la déhydrogénase contribuent à la production du précurseur de la lovastatine, la dikétide synthase participe à la production du 2-méthylbutyrate, et le 2-méthylbutyrate ainsi produit se lie à la nonakétide par la transestérase, et forment la lovastatine complète.

Le procédé ci-dessus mentionné comprend, en outre, une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 21 (ADNc de mkC), SEQ ID NO: 22 (ADNc de mkD), SEQ ID NO: 25 (ADNc de mkH) et SEQ ID NO: 26 (ADNc de mkl), ou une séquence de nucléotides présentant 95 % d'homologie avec ces séquences, ou une séquence de nucléotides pouvant s' hybrider à ces séquences dans des conditions stringentes, où ces séquences codent pour des protéines ayant respectivement une activité mono-oxygénase (cytochrome P450), oxydoréductase, une activité de facteur de transcription et de pompe à efflux.

EXEMPLES

EXEMPLE 1: Culture du Monascus Le Monascus a été inoculé dans de la gélose PDA (pomme de terre et dextrose) inclinée et cultivée à 30 C. Les hyphes et les spores ont été recueillis par grattage, inoculés dans 50 ml de milieu (7 % de glycérol, 3 % de glucose, 3 % de MSG, 1,2 % de polypeptone, 0,2 % de NaNO3, 0,1 % de MgSO4.7H2O), et cultivés sous vibration à 25 C.

EXEMPLE 2: Construction de la banque de Monascus A Préparation des noyaux de Monascus Les cellules de Monascus ont été recueillies, lavées avec du ddH2O et séchées par extraction d'air. On a ajouté 10x volumes de tampon de lavage pré-refroidi (tampon HB + 1,5 % de mercaptoéthanol) aux cellules séchées puis les cellules ont été homogénéisées dans un mélangeur. Les noyaux de Monascus ont été obtenus par filtration Miracloth.

B. Préparation des matrices semi-solides et d'ADN chromosomique On a préparé une solution d'agarose à 1,8 % à bas point de fusion avec un tampon HB et on l'a mise au bain-marie à 50 C. Des volumes égaux d'une solution d'agarose et de noyaux ont été mélangés complètement et ajoutés dans un moule à matrice (Bio-Rad). Les impuretés ont été traitées avec une protéinase K (1 mg/mL). Les matrices semi-solides ont été épissées à de petits morceaux et partiellement digérées par HindIII. A la fin de la réaction de restriction, les matrices semi-solides ont été analysées sous gel d'agarose à 1 % pour électrophorèse en champ pulsé. Les fragments d'ADN ayant une taille de 200 kb ont été récupérés par électro-élution.

C. Construction d'une banque de Monascus On a utilisé le vecteurpIndigoBAC-5 digéré par Hindlll prêt à l'emploi (Epicentre) comme vecteur pour la ligature avec l'ADN recueilli. Le réactif de ligature a ensuite été électroporé dans des cellules compétentes (E. coli électrocompétentent TransforMaxTM EC 100TM, de la Société Épicentre.).

Les colonies ont été stockées sur des microplaques à 384 puits.

EXEMPLE 3: Conception des amorces de sonde et préparation des sondes L'amplification PCR et le séquençage ont été réalisés par des amorces dégénérées et la séquence d'ADN obtenue a été utilisée comme base pour la conception des amorces d'une sonde de 226 paires de base, tel qu'illustré dans l'annexe 1. On a utilisé le logiciel VectorNTl pour concevoir les amorces et les amorces conçues sont présentées dans la liste ci-dessous.

Mplovl 5' TCCACTGCCGTTTATGTTG 3' (SEQ ID NO: 29) Mplov2 5' TCGTCATCTTCACCCCATC 3' (SEQ ID NO: 30) Une séquence d'ADN contenant la DIG-11-dUTP (Roche, PCR DIG Probe Synthesis Kit) a été amplifiée par PCR et utilisée comme sonde.

EXEMPLE 4: Analyse d'une hybridation des colonies et extraction de l'ADN des BAC Après avoir découpé un coin de la membrane de nylon (Roche) afin de repérer la direction, on a ensuite placé la membrane en nylon sur une plaque contenant les colonies. La membrane de nylon sur le dessus de laquelle la colonie a été déposée, a été mise en contact de manière séquentielle avec une solution de lyse (NaOH 2N, SDS 0,1 %) pendant 5 minutes, une solution de NaOH 0,5 M/ NaCl 1,5 M pendant 5 minutes, un tampon de NaCl 1,5 M/ Tris-HC1 0,5 M (pH 7,4) pendant 5 minutes, et un tampon 2X SSC pendant 5 minutes. L'ADN a ensuite été immobilisé sur la membrane de nylon par une exposition à la lumière UV. La membrane de nylon obtenue a été utilisée pour l'hybridation et l'immuno-détection (Roche). Après cela, les colonies obtenues à partir de la réaction ont été cultivées et l'ADN des BAC a été extrait en utilisant la trousse Large Construct Kit (Qiagen).

EXEMPLE 5: Analyse de la séquence obtenue par shotgun A. Préparation de la banque shotgun 3 à 5 g d'ADN de BAC ont fait l'objet d'un traitement aux ultra-sons pour avoir des tailles de 1 à 2 kb dans des conditions d'ultra-sonication appropriées et les résultats ont été confirmés par électrophorèse. L'ADN a ensuite été réparé par la nucléase Bal 31 et la T4 ADN polymérase de manière à être bouts francs puis les fragments d'ADN de 1 à 2 kb ont été recueillis par électrophorèse. La ligature a été réalisée en utilisant le vecteur pUC18/Sural/CIAP (50 pg/uL) (Pharmacia) comme vecteur et le réactif de ligature a été électroporé dans des souches de bactéries E. Coli DH5.

B. Séquençage de l'ADN et analyse de la séquence L'ADN plasmidique a été extrait avec rendement élevé en utilisant une microplaque à 96 puits et l'ADN plasmidique obtenu a été séquencé au moyen de la trousse BigDye v3. 0. L'analyse de la séquence a été exécutée par un séquenceur ABI3700 avec une couverture X10.

EXEMPLE 6: Assemblage des séquences d'ADN et annotation L'assemblage des séquences d'ADN a été réalisé au moyen des logiciels Phred, Phrap, Consed développés par le Phil Green lab.

Le BAC pleine longueur a ensuite été annoté au moyen des logiciels VectorNTl et BLAST.

EXEMPLE 7: Extraction de l'ARN total de Monascus et réaction RT-

PCR

0,2 g d'hyphes de Monascus ont été placés dans un mortier, congelés à l'azote liquide puis réduits en poudre. L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif Trizol (Invitrogen) et de chloroforme, puis dissous dans du DEPC-H20. On a utilisé un ARN en tant que modèle de transcription inverse (Système ImProm-IITM Reverse Transcription, Promega) afin d'obtenir un ADNc pleine longueur. L'ADNc pleine longueur a été ligaturé à un vecteur TA (Système pGEM-T vector, Promega).

EXEMPLE 8: Electrophorèse d'ARN et analyse Northern blot A. Electrophorèse d'ARN On a préparé un gel d'agarose à 1,2 % contenant un tampon de migration gel formaldéhyde et du formaldéhyde. L'ARN a été mélangé soigneusement avec le tampon de migration de gel formaldéhyde, le formaldéhyde (37 %) et le formamide. L' électrophorèse de l'ARN a été réalisée et le gel a été coloré avec ETBr.

B. Transfert de l'ARN La membrane de nylon a été découpée à la taille du gel et un coin de la membrane de nylon a été découpé afin de repérer la direction. L'ARN a été transféré à partir du gel sur la membrane de nylon puis l'ARN a été immobilisé sur la membrane de nylon par exposition à la lumière UV. La membrane de nylon obtenue a été utilisée pour l'hybridation et l'immuno-détection (Roche).

EXEMPLE 9: Conception des amorces de sondes et préparations des sondes Les sondes ont été conçues selon la séquence d'ADN des BAC pour la préparation des sondes utilisées pour l'analyse Northern blot. Les sondes conçues sont présentées dans la liste ci-dessous.

gène mkA Directe 5'ATA GCT CCG AGA ATG GTC CC 3' (SEQ ID NO: 31) Inverse 5'CCA TCA AGG ATG CTC TGT CG 3' (SEQ ID NO: 32) 10 Longueur de la sonde: 229 paires de base gène mkB Directe 5' CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3' (SEQ ID NO: 33) Inverse 5' CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3' (SEQ ID NO: 34) 15 Longueur de la sonde : 167 paires de base gène mkC Directe 5'GGC CTG AGC CGA AGA AGT AC 3' (SEQ ID NO: 35) Inverse 5'TCA GAG ATC TTC GTC CCG AC 3' (SEQ ID NO: 36) 20 Longueur de la sonde : 304 paires de base gène mkD Directe 5'TGA TGA CTT TGC CCT GGC GG 3' (SEQ ID NO: 37) Inverse 5'TCA CCC AAT GAC TCT AGC CC 3' (SEQ ID NO: 38) 25 Longueur de la sonde : 175 paires de base gène mkE Directe 5'TTC TCT CCC GAC AAC TGC CC 3' (SEQ ID NO: 39) Inverse 5'AAT GGT CAC CGC CGA CTG GA 3' (SEQ ID NO: 40) 30 Longueur de la sonde : 246 paires de base gène mkF Directe 5'GCC CCG AAT CCT ACA TGA AG 3' (SEQ ID NO: 41) Inverse 5'GGC CCA CCG TAG TTG ATG TG 3' (SEQ ID NO: 42) Longueur de la sonde : 166 paires de base gène mkG Directe 5'CCT CGC TCT GAA TAT GAC CC 3' (SEQ ID NO: 43) Inverse 5'TCG GAT CGG CTT CTC AAA CC 3' (SEQ ID NO: 44) Longueur de la sonde : 217 paires de base gène mkH Directe 5'ACC TCA TCG CTC CAG ACC AT 3' (SEQ ID NO: 45) Inverse 5'CTG CGA GAG AAT GAG AGT GC 3' (SEQ ID NO: 46) Longueur de la sonde : 179 paires de base gène mkI Directe 5'CTA GAC TCG TTC ATC GCG GC 3' (SEQ ID NO: 47) Inverse 5'CCA TAC ATT CTA CCT TGC GG 3' (SEQ ID NO: 48) Longueur de la sonde : 127 paires de base EXEMPLE 10: Transformation de pastoris Les ADNc pleine longueur de PKS (mkA et mkB) ont été ligaturés à pPICZA et C (Invitrogen), respectivement. La transformation a été réalisée en utilisant la trousse de transformation Pichia EasyComp. Kit (Invitrogen).

EXEMPLE 11: Southern blot La dépurination à l'acide a été réalisée en immergeant le gel dans du HC1 0,25 M, sous agitation pendant 10 min dans un agitateur plat puis le gel a été lavé avec du ddH2O. La dénaturation a ensuite été réalisée en immergeant le gel dans une solution de NaCl/NaOH (NaCl 1,5 M 'NaOH 0,5 N) pendant 15 minutes en agitant à deux reprises puis le gel a été lavé avec du ddH2O. La neutralisation a finalement été réalisée en immergeant le gel dans une solution de NaCl/Tris-HC1 (NaCl 1, 5 M Tris-HC1 1M'pH 7,4) pendant 15 minutes en agitant à deux reprises. Une membrane de nylon de même taille que le gel a été préparée et un coin de la membrane de nylon a été découpé pour repérer la direction. L'ADN a été transféré à partir du gel sur la membrane de nylon puis immobilisé sur la membrane de nylon par une exposition à la lumière UV. La membrane de nylon obtenue peut être utilisée pour l'hybridation et l'immuno- détection (Roche). Les amorces présentées dans la liste ci-dessous ont été conçues pour la préparation de sondes utilisées pour l'analyse Northern blot.

gène mkA Directe2 5'TGA ACA GCA CAG CAT AGG GG 3' (SEQ ID NO: 49) 15 Inverse2 5'GCA GCC ATT GAA GAC GGC AT 3' (SEQ ID NO: 50) Longueur de la sonde : 293 paires de base gène mkB Directe 5' CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3' (SEQ ID NO: 51) 20 Inverse 5' CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3' (SEQ ID NO: 52) Longueur de la sonde : 167 paires de base EXEMPLE 12: Production des polykétides En outre, les polykétides synthases bactériennes ont été exprimées avec succès dans E. coli et Streptomyces et un faible niveau de rendement de polykétides a été detécté. En règle générale, le manque de modifications post-translationnelles dans E. coli empêche l'expression hétérologue de la polykétide synthase fonctionnelle. C'est pourquoi il est raisonnable de coexprimer PKS avec une 4'- phosphopantéthéine transférase (PPTase) afin de produire un domaine holo- ACP (Protéine porteuse d'acyle) de PKS pour la production de polykétydes (Mootz et al., 2001). Pour approfondir la recherche sur l'effet de l'expression du vecteur d'expression de l'invention, le gène sfp (PPTase) de Bacillus subtilis a été cloné avec succès afin d'introduire dans le vecteur d'expression pCDF-lb (Fig. 6) et de co-exprimer avec PKS, le gène mkA (Fig. 5), dans E. coll. Le résultat de l'analyse SDS-PAGE a montré un faible niveau de rendement de la protéine soluble PKS (342 kDa) (Fig. 7). Toutefois, la majorité des protéines de Sfp étaient solubles avec pour résultat l'expression d'une protéine de 29 kDa.

1. Construction des plasmides d'expression Le fragment d'ADNc partiel (6, 5 kb d'ADNc) avec l'amorce directe p3 : 5'-CCATCAAGGATGCTCTGTCG-3' (SEQ ID NO : 49) et l'amorce inverse p4 : 5'-TCAAGCCAACTTCAACGCGG-3' (SEQ ID NO : 50) du gène mkA a été amplifié à partir du premier brin d'ADNc de Monascus par amplification RT-PCR. Le fragment d'ADNc de 6, 5 kb a été introduit dans le vecteur pGEM-T afin d'obtenir le fragment EcoRI NotI par une réaction de restriction. Puis le fragment a été ligaturé avec pET30 pour donner pETmkAl. Un jeu d'amorces d'oligonucléotidiques avec l'amorce directe pl : 5'-GGAATTCATGTACGTAGGACGCATTGGTGC -3' (SEQ ID NO: 51) contenait 23 bases complémentaires du gène mkA 5' et introduisait un site de restriction EcoRI et l'amorce inverse p2 : 5'- TCGCGAGGACGGACAAAGTT-3' (SEQ ID NO: 52) a été conçue afin d'amplifier l'ADNc partiel de 3,0 kb par amplification RT-PCR. Le fragment d'ADNc EcoRI EcoRI de 3,0 kb a été ligaturé avec pETmkAl pour donner pETmkA (Fig. 6).

Un jeu d'amorces oligonucléotidiques avec l'amorce directe 5'CGGGATCCCATGAAGATTTACGGAATTTA -3' (SEQ ID NO : 53) contenait 20 bases complémentaires du gène sfp 5' et introduisait un site de restriction BamHI et l'amorce inverse 5'- ATAGTTTAGCGGCCGCTTATAAAAGCTCTTCGTACG -3' (SEQ ID NO : 54) contenait 20 bases complémentaires du gène sfp 5' et introduisait un site de restriction NotI a été conçue afin d'amplifier le gène sfp à partir de l'ADN génomique du Bacillus subtilis 168. Le gène sfp BamHI NotI était ligaturé avec pCDF-lb pour donner pCDFsfp (Fig. 7).

2. Co-expression de mkA et de sfp dans E. coli Les pETmkA et pCDFsfp ont tous deux été co-transformés dans E. coli BL21 (DE3) et un milieu LB a été inoculé avec une seule colonie pour être cultivé jusqu'au lendemain matin. Ensuite le milieu LB a été transféré dans un milieu ATCC 765 enrichi avec 10 % de glycérol et la culture a été poursuivie jusqu'à obtention d'une densité optique à 600 nm (DO600) de 0,6 à 0,8. L'expression du gène a été induite par l'addition d'isopropyl- - D- thiogalactoside (IPTG) à 1,0 mM (concentration finale) et la culture a été mise à incuber pendant 48 h à 20 C. Le culot de cellules a été recueilli et congelé à l'azote liquide puis décongelé à 42 C pour lyser les cellules. Afin de faciliter la lyse, on a ajouté un lysozyme au culot de cellules. L'expression des protéines a été surveillée par une électrophorèse SDS-PAGE (gels 7,5 %) des protéines cellulaires totales et des protéines solubles, opération suivie par une coloration au bleu de Coomassie colloïdal.

RÉFÉRENCES 1. Abe Y., Suzuki T., Ono C., Iwamoto K, Hosobuchi M, Yoshikawa H. Molecular cloning and characterization of an ML-236B (compactin) biosynthetic gene cluster in Penicillium citrinum. 2002, Mol. Genet. Genomics. 267: 636-646.

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4. Endo A., Komagata D., Shimada H. : Monacolin M., a new 10 inhibitor of cholesterol biosynthesis. J Antibiot (Tokyo), Déc 1986; 39(12) : 1670-3.

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8. Hendrickson L, Davis CR, Roach C, Nguyen DK, Aldrich T, McAda PC & Reeves CD. : Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terreus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a multifunctional polyketide synthase gene. 1999, Chem. Biol. 6: 429-439.

9. Hutchinson C.R., Kennedy J., Park C., Kendrew S., Auclair K. and Vederas J. : Aspects of the biosynthesis of non-aromatic fungal by iterative polyketide synthases. Antonie van Leeuwenhoek 2000, 78: 287-295.

10. Kennedy J., Auclair K., Kendrew S.G., Park C., Vederas J.C., Hutchinson C.R. : Modulation of polyketide synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis. Science 1999, Mai 21; 284(5418) : 1368-72.

11. Komagata D., Shimada H., Murakawa S., Endo A. : Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin L to monacolin J by a monooxygenase of Monascus ruber. J. Antibiot (Tokyo), Mars 1989; 42(3) : 407-12.

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Claims (30)

REVENDICATIONS

1. Molécule d'ADN isolée, comprenant un polynucléotide sélectionné dans le groupe constitué de: a) un polynucléotide qui est mkA comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID No: 2 ; et b) un polynucléotide hybridable avec le polynucléotide a) dans des conditions stringentes.

2. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est mkA et en ce qu'il comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 2 .

3. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 2, dans laquelle le polynucléotide code pour un polypeptide avec une activité sélectionnée dans un groupe constitué de la R-cétoacyle synthétase, acétyle transférase, déshydratase, méthyle transférase, cétoréductase et protéinesupport d'acyle.

4. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 3, dans laquelle le polynucléotide code pour un polypeptide ayant une activité de nonacétide synthétase.

5. Vecteur navette comprenant la molécule d'ADN isolée 25 selon la revendication 1.

6. Molécule d'ADN isolée, comprenant un polynucléotide sélectionné dans le groupe constitué de: a) un polynucléotide qui est mkA comprenant une séquence de 30 nucléotides SEQ ID No: 19 ; et b) un polynucléotide hybridable avec le polynucléotide a) dans des conditions stringentes.

7. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN isolée est mkA, en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 19 et en ce qu'elle code pour un polypeptide avec une activité sélectionnée dans un groupe constitué de la [3-cétoacyle synthétase, acétyle transférase, déshydratase, méthyle transférase, cétoréductase et protéine-support d'acyle.

8. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN isolée est mkA, en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 19 et en ce qu'elle code pour un polypeptide ayant une activité de nonacétide synthétase.

9. Vecteur d'expression comprenant la molécule d'ADN isolée selon la revendication 6.

10. Cellule transformée avec un polynucléotide qui est mkA et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 2 ou 19 .

11. Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle a été transformée en outre avec un polynucléotide 20 sélectionné dans un groupe constitué de: a) un polynucléotide qui est mkB et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 3 ou 20 b) un polynucléotide qui est mkC et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 4 ou 21 c) un polynucléotide qui est mkD et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 5 ou 22 d) un polynucléotide qui est mkE et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 6 ou 23 e) un polynucléotide qui est mkF et comprend une séquence 30 de nucléotides SEQ ID No: 7 ou 24 f) un polynucléotide qui est mkG et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 8 ou 27 g) un polynucléotide qui est mkH et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 9 ou 25 h) un polynucléotide qui est mkI et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 10 ou 26 ; et i) la combinaison de ceux-ci.

12. Cellule selon la revendication 10, dans laquelle la cellule est une bactérie, une levure, une cellule animale, une cellule d'insecte, une cellule végétale ou un champignon filamenteux.

13. Cellule selon la revendication 10, dans laquelle la cellule est Monascus sp.

14. Cellule selon la revendication 10, dans laquelle la 10 cellule est sélectionnée dans un groupe constitué de Monascus pilosus, Monascus ruber et Monascus purpureus.

15. Cellule selon la revendication 10, dans laquelle la cellule est Monascus BCRC 38072.

16. Procédé d'augmentation de la production de lovastatine comprenant: I) la culture d'une cellule produisant la lovastatine transformée avec un polynucléotide qui est mkA comprenant une 20 séquence de nucléotides SEQ ID No: 2 ou 19 ; II) la collecte de la lovastatine de la cellule.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisée en ce que la culture de l'étape I est effectuée avec une cellule produisant la lovastatine qui a été transformée en outre avec un polynucléotide sélectionné dans le groupe constitué de: a) un polynucléotide qui est mkB et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 3 ou 20 b) un polynucléotide qui est mkC et comprend une séquence 30 de nucléotides SEQ ID No: 4 ou 21 c) un polynucléotide qui est mkD et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 5 ou 22 d) un polynucléotide qui est mkE et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 6 ou 23 e) un polynucléotide qui est mkF et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 7 ou 24 f) un polynucléotide qui est mkH et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 9 ou 25 ; et g) la combinaison de ceux-ci.

18. Procédé selon la revendication 16, dans lequel la 5 cellule est un champignon.

19. Procédé selon la revendication 16, dans lequel la cellule est Monascus sp.

20. Procédé selon la revendication 16, dans lequel la cellule est sélectionnée dans un groupe constitué de Monascus pilosus, Monascus ruber et Monascus purpureus.

21. Procédé selon la revendication 16, dans lequel la 15 cellule est Monascus BCRC 38072.

22. Procédé de production d'inhibiteur de HMG-CoA réductase, comprenant: I) la culture d'une cellule produisant l'inhibiteur de HMG-20 CoA réductase transformée au moins avec les quatre polynucléotides consistant en: a) un polynucléotide qui est mkA et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 2 ou 19 ; b) un polynucléotide qui est mkB et comprend une séquence 25 de nucléotides SEQ ID No: 3 ou 20 ; c) un polynucléotide qui est mkE et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 6 ou 23 ; et d) un polynucléotide qui est mkE et comprend une séquence de nucléotides SEQ ID No: 7 ou 24 ; et II) la collecte de l'inhibiteur de HMG-CoA réductase de la cellule.

23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la cellule est un champignon.

24. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la cellule est Monascus sp.

25. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la 5 cellule est sélectionné dans le groupe constitué de Monascus pilosus, Monascus ruber, et Monascus purpureus.

26. Procédé selon la revendication 22, dans lequel la cellule est Monascus BCRC 38072.

27. Molécule d'ADN isolée, comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide sélectionné dans un groupe constitué de.

a) un polypeptide qui comprend une séquence d'acides aminés 15 SEQ ID No: 11 ; et b) un polynucléotide hybridable avec le polynucléotide codant pour le polypeptide a) dans des conditions stringentes.

28. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 27, dans laquelle le polypeptide comprend une séquence d'acides aminés SEQ ID No: 11 et a une activité sélectionnée dans un groupe constitué de la 3-cétoacyle synthétase, acétyle transférase, déshydratase, méthyle transférase, cétoréductase et protéine-support d'acyle.

29. Molécule d'ADN isolée selon la revendication 27, dans laquelle le polypeptide comprend une séquence d'acides aminés SEQ ID No: 11 et a une activité de nonacétide synthétase.

30. Vecteur d'expression comprenant la molécule d'ADN isolée selon la revendication 27.