WO2015111013A2 - Synthetases de la colistine et cluster de genes correspondants - Google Patents

Synthetases de la colistine et cluster de genes correspondants Download PDF

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WO2015111013A2
WO2015111013A2 PCT/IB2015/050571 IB2015050571W WO2015111013A2 WO 2015111013 A2 WO2015111013 A2 WO 2015111013A2 IB 2015050571 W IB2015050571 W IB 2015050571W WO 2015111013 A2 WO2015111013 A2 WO 2015111013A2
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synthetase
gene
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pmxa
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Romain CHEVROT
Fatoumata TAMBADOU
Thibault CARADEC
Sandrine DIDELOT
Cyrille BARTHELEMY
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Centre National De La Recherche Scientifique
Universite La Rochelle
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    • C12N9/93—Ligases (6)
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to bacterial genes and enzymes involved in the synthesis of polymyxin E, an antibiotic molecule used in therapy against Gram-negative bacterial infections.
  • Polymyxins are antibiotic molecules isolated from Bacillus species or Paenibacillus species. These molecules are lipopeptides, consisting of:
  • a peptide chain comprising ten amino acids, organized into a cyclic heptapeptide and a side chain of three amino acids, and
  • polymyxins B and E have antimicrobial activity on most strains of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, as well as all Salmonella strains, Shigellae, and many Gram-negative bacteria. These antibiotics have therefore been used as therapeutic agents in many cases. Unfortunately, their toxic effects are such that they have been gradually replaced by better tolerated antibiotics.
  • Figure 3 shows the general structure of the polymyxins, and the two specific amino acids are X and Y.
  • polymyxin B and E differ by a single amino acid, the residue 'X' being a phenylalanine for polymyxin B and leucine for polymyxin E, the residue 'Y' being leucine, isoleucine or valine.
  • Colistin or polymyxin E is an antibiotic of the family of polymyxins, for treating infections due to Gram-positive bacteria. multi-resistant negatives. Its peptide structure is shown in Figure 1. Administered by injection, colistin is used in the management of neuromeningeal infections, urinary tract infections, urogenital infections, septicemia and superinfections of wounds, burns and ulcers. Administered by inhalation, colistin is used in the management of pulmonary infections, especially those related to cystic fibrosis. Finally, in combination with hydrocortisone and bacitracin, colistin is used to treat bacterial and inflammatory infections of the eye, as well as infections in ophthalmic surgery.
  • Colistin is responsible for many adverse effects, including nephrotoxic and neurotoxic effects. These toxic effects are attributable to the cationic character of this molecule, which contains five positive charges, but also to the low degree of purity of the molecule, produced by fermenter by culturing the original bacterial strain synthesizing it, and purified from the fermentation medium. .
  • polymyxins are currently obtained by isolation and purification from culture media of bacterial strains producing these molecules, including strains of Paenibacillus polymyxa.
  • the purification of the molecule from the fermentation media is unsatisfactory, and this is why new production techniques are being considered.
  • work is being done to identify and clone genes encoding polymyxin synthetases.
  • Polymyxin synthetases belong to the family of "Non-Ribosomal
  • NRPS Peptide synthetases
  • the genes coding for these synthetases are organized in a cluster comprising several modules, the order and specificity of which determine the structure of the peptide product.
  • NRPS allows the synthesis of peptides having a broader structural variety than would be possible if these peptides were translated from messenger RNA by ribosomes.
  • the peptides thus produced can undergo modifications, in particular by the creation of bonds with hydroxylated acids, and oxidation in the peptide chain making it possible to obtain cyclic structures as well as acylations, glycosylations, and N-methylation of the residues.
  • RPS synthetases consist of different modules. Each module is capable of activating an amino acid, possibly modifying it and then transferring it to the activated amino acid in the adjacent module to form a peptide. Each module is composed of several domains and allows the incorporation of a particular amino acid into the peptide being elongated. Each module contains at least 3 domains:
  • An adenylation domain (A): a central domain in the action of peptides synthetases. It allows the attachment of a specific amino acid and its activation through an adenylation reaction of the latter (conversion of the amino acid to aminoacyl adenylated);
  • a thiolation domain allows the peptide being synthesized to remain attached to the synthetase throughout the elongation process via a thioester linkage;
  • Te domain thioesterase
  • This domain will cut the thioester bond which connects the synthesized peptide to the last domain T.
  • This domain also allows the cyclization of certain peptides.
  • amino acid modifications such as epimerization (conversion of an L-series amino acid to the D-series isomer), methylation (addition of a methyl) or formylation (addition of a formyl group).
  • the PmxA module has four adenylation domains, organized in three-dimensional "binding pocket” or "specific binding pockets” each of which incorporates a specific amino acid into the polymyxin molecule;
  • the PmxB module has an adenylation domain, and is responsible for the integration of a single amino acid
  • the PmxE module has five adenylation domains that integrate the five other amino acids that make up the peptide chain of the polymyxin.
  • the article by Choi et al. (Jounal of Bacteriology, 2009) as well as US Pat. No. 8,329,430 describe the isolation of a "cluster" of genes of the Gram-positive strain Paenibacillus polymyxa E681 secreting polymyxin A. Five genes make up this cluster: pmxA , pmxB, pmxC, pmxD and pmxE.
  • the pmxC and pmxD genes encode transport proteins, while the other three genes pmxA, pmxB and pmxE encode synthetases.
  • the present invention describes the isolation of a gene cluster derived from an environmental isolated Paenibacillus alvei strain, producing polymyxin E, and their uses.
  • the present invention relates to a PmxA synthetase involved in the synthesis of polymyxin E, comprising four adenylation domains, characterized in that the second adenylation domain comprises or has a particular peptide sequence represented in SEQ ID NO 1, this sequence forming a specific binding pocket for a leucine, isoleucine or valine residue.
  • the present invention also relates to a PmxE synthetase involved in the synthesis of polymyxin E, comprising five adenylation domains and an epimerization domain.
  • the present application also relates to a group of genes coding for enzymes involved in the synthesis of polymyxin E, comprising a gene coding for the PmxA synthetase, genes coding for the PmxB and PmxE synthetases, and genes encoding the proteins of transport PmxC and PmxD.
  • the present invention also relates to transformed microorganisms expressing at least the pmxA, pmxB and pmxE genes, modified or not, said transformed microorganisms producing polymyxin E or variant molecules of this polymyxin.
  • FIG. 7 (A) MS / MS spectrum corresponding to the fragmentation of the dicharged precursor ion (m / z 578.38). (B) Proposed structure for the corresponding E2 colistin peptide.
  • AG fatty acid (C8H150); L-Dab: L-2,4-diaminobutyric acid; Thr: Threonine; Leu: Leucine.
  • the figures surrounded by squares correspond to the ions produced in the first series.
  • FIG. 8 (A) MS / MS spectrum corresponding to the fragmentation of the dicharged precursor ion (m / z 571.38). (B) Proposed structure for the corresponding Val-E2 peptide.
  • AG fatty acid (C8H150); L-Dab: L-2,4-diaminobutyric acid; Thr: Threonine; Ile: Isoleucine; Leu: Leucine; Val: Valine.
  • the figures surrounded by squares correspond to the ions produced in the first series, those surrounded by circles correspond to the ions produced in the second series.
  • the invention relates to the isolation and identification of novel genes encoding polymyxin E synthetases, in particular a gene coding for the "PmxA" synthetase having a particular adenylation site, forming a pocket of Specific binding allowing the integration in the polymyxin molecule of a leucine or isoleucine residue.
  • polynucleotide refers to a chain of covalently linked nucleotides.
  • this term refers to nucleic acids such as ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA).
  • the "percent identity" between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window may comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain an alignment optimal between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base is observed for the two compared sequences, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleobases by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of nucleotide identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • polypeptide refers to a chain of covalently linked amino acids.
  • polymyxin E synthetases refers to enzymes capable of incorporating a specific amino acid into the amino acid chain forming polymyxin E, and optionally converting the amino acid to form a cyclic structure.
  • adenylation site or "adenylation domain” refers, in the polymyxin synthetase molecule, to the domain that plays a role in the selection and activation of the amino acid, while the “domain of condensation” Catalyzes the formation of a peptide bond and that the "thiolation domain” is responsible for transporting the compounds in formation between the modules.
  • epimerization site designates in a synthetase a domain for converting a residue having a levorotatory chirality 'L' into its dextrorotatory chirality enantiomer 'D', in particular an L, ⁇ , ⁇ -diaminobutyric acid residue (L -Dab) to the residue D- ⁇ , ⁇ -diaminobutyric acid (D-Dab).
  • binding pocket refers to an area of the protein having a three-dimensional "pocket” structure, in which interactions of high specificity with a substrate or, in this case, an amino acid, will allow selection and activation. this amino acid.
  • underlined amino acids being conserved means that even if slight sequence variations can be observed between two proteins having the same catalytic activity, the indicated amino acids are essential to the specificity and activity of this protein. and therefore can not be modified, otherwise lose or reduce the specificity and / or activity of this protein.
  • the present invention relates to a PmxA synthetase involved in the synthesis of polymyxin E, comprising four adenylation sites, characterized in that the second adenylation site has at least 90% identity with the following peptide sequence:
  • amino acids underlined DGFFLGVVYK being preserved and forming a specific binding pocket for a leucine, isoleucine or valine residue.
  • the second PmxA adenylation site has 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity.
  • the underlined amino acids DGFFLGVVYK being conserved and forming a specific binding pocket for a leucine isoleucine or valine residue.
  • the second PmxA adenylation site has a peptide sequence comprising or consisting of the peptide sequence SEQ ID NO 27, the underlined amino acids DGFFLGVVYK being conserved and forming a specific binding pocket for a residue. leucine isoleucine or valine.
  • the PmxA synthetase comprises four specific binding pockets comprising the following amino acids:
  • DAWIVGAIVK (SEQ ID No. 2), specific for a leucine residue
  • DVGEISAIDK (SEQ ID No. 5), specific for a diaminobutyric acid residue.
  • sequences SEQ ID No. 2, 3, 4 and 5 group the essential amino acids forming a functional binding pocket in three-dimensional structure, but are not consecutive amino acids in a peptide sequence.
  • the PmxA synthetase comprises the polypeptide sequence presented in SEQ ID No. 6, and shown in FIG. 5, the adenylation domains being indicated in bold, the amino acids forming the binding pocket being underlined.
  • this sequence may comprise, in addition to the sequence presented in SEQ ID No. 6, additional amino acids at the N- and C-terminal ends.
  • polypeptide sequence of the PmxA synthetase consists of the polypeptide sequence presented in SEQ ID No. 6.
  • the PmxA synthetase has a sequence that comprises, or consists of, the polypeptide sequence shown in SEQ ID NO 25.
  • PmxA synthetase has four adenylation sites at the following positions:
  • the four adenylation sites are in the following positions:
  • the present invention also relates to a PmxE synthetase involved in the synthesis of polymyxin E, comprising five adenylation sites and an epimerization site, characterized in that the epimerization site has at least 90% identity with the Peptide sequence as presented in SEQ ID NO 30.
  • the peptide sequence of the PmxE synthetase comprises or consists of the sequence represented in sequence SEQ ID NO 14.
  • This synthetase is responsible for the integration of residues Nos. 1 to 5 (see FIG. 1 for numbering) in the peptide chain of the polymyxin E molecule.
  • This synthetase has the functional characteristic of being able to convert the L-Dab residue into its D-Dab stereoisomer, and to incorporate said stereoisomer at the 3-position in a polymyxin E peptide chain.
  • Such a polymyxin variant molecule could exhibit improved antimicrobial properties, as has been proposed in the literature (Hong SY et al, Lee DL et al, 2004).
  • the present invention also relates to a nucleic acid comprising an open reading frame, encoding a synthetase involved in the synthesis of polymyxin E, having at least 90% identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 7, provided that the nucleotides encoding the amino acids underlined DGFFLGVVYK sequence SEQ ID NO 1 are preserved.
  • the nucleic acid encoding a synthetase involved in the synthesis of polymyxin E has 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% with the nucleotide sequence SEQ ID NO 7, provided that the nucleotides encoding the amino acids underlined DGFFLGVVYK of the sequence SEQ ID NO 1 are preserved.
  • nucleotides are conserved indicates that these nucleotides encoding the amino acids DGFFLGVVYK of the sequence SEQ ID NO 1 must be identical to those observed in the same position in the sequence SEQ ID NO 7, or different provided that the codons formed by these nucleotides encode the amino acids DGFFLGVVYK underlined in the sequence SEQ ID NO 1.
  • amino acids are essential to the specificity and activity of this synthetase and therefore can not be modified, otherwise lose or reduce the specificity of this binding pocket.
  • the nucleic acid encoding a PmxA synthetase involved in the synthesis of polymyxin E comprises a nucleotide sequence coding for the second adenylation site of this PmxA synthetase, consisting of the nucleotide sequence presented in FIG. SEQ ID NO 28.
  • the present invention also relates to a group of genes coding for enzymes involved in the synthesis of polymyxin E, comprising in particular:
  • this group of genes comprises the pmxE gene coding for a PmxE synthetase comprising an epimerization domain whose peptide sequence comprises or consists of the sequence represented in SEQ ID NO 30.
  • this gene group also comprises genes coding respectively for the transport proteins PmxC and PmxD.
  • the sequences of the PmxC and PmxD proteins isolated from the Paenibacillus alvei strain are shown in SEQ ID NO 12 and NO 13, respectively.
  • this group of genes involved in the synthesis of polymyxin E comprises:
  • a pmxA gene having at least 90% identity with the sequence SEQ ID No. 7, provided that the nucleotides encoding the underlined amino acids DGFFLGVVYK of the sequence SEQ ID NO 1 are preserved,
  • this group of genes involved in the synthesis of polymyxin E comprises:
  • a pmxA gene exhibiting at least 95% identity with the sequence SEQ ID No. 7, provided that the portion of nucleic acid encoding the amino acids underlined DGFFLGVVYK is conserved,
  • this group of genes involved in the synthesis of polymyxin E comprises:
  • a pmxA gene comprising a nucleotide sequence having 100% identity with the sequence SEQ ID No. 7, and in particular comprising a nucleotide sequence as presented in SEQ ID No. 26,
  • a pmxB gene comprising a nucleotide sequence having 100% identity with the sequence SEQ ID No. 8, and
  • a pmxE gene comprising a nucleotide sequence having 100% identity with the sequence SEQ ID No. 9.
  • the present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence SEQ ID No. 10, or a sequence SEQ ID No. 29, representing the complete sequence of the cluster derived from the Paenibacillus alvei strain, comprising the pmxA genes, pmxB, pmxC, pmxD and pmxE involved in polymyxin E synthesis.
  • SEQ ID NO: 1 Protein 523 Peptide sequence of the second acidic site of adenylation of a PmxA synthetase resulting from amines of a strain of Paenibacillus alvei
  • SEQ ID NO 2 Protein 10 acids Binding pocket of the 1 st amino-adenylation domain PmxA, these amino acids forming a specific binding pocket for a leucine residue
  • SEQ ID NO 3 10 A protein acids Binding pocket 2 nd domain amino adenylation of PmxA, these amino acids forming a specific binding pocket for leucine, isoleucine or valine
  • SEQ ID NO 4 10 Protein acids Binding pocket of the 3rd field amino adenylation of PmxA, these amino acids forming a specific binding pocket for diaminobutyric acid residue
  • SEQ ID NO 5 10 Protein acids Binding pocket of the 4 th domain amino adenylation of PmxA, these amino acids forming a specific binding pocket for diaminobutyric acid residue
  • SEQ ID NO 7 DNA 14901 Coding sequence for the PmxA synthetase pairs having the sequence SEQ ID NO 6 bases
  • SEQ ID NO 8 DNA 3306 Coding sequence for PmxB synthetase Paenibacillus alvei issue pairs
  • SEQ ID NO. 9 DNA 18876 Coding sequence for the PmxE synthetase pairs of Paenibacillus alvei issue, presenting the sequence SEQ ID NO 31
  • SEQ ID NO DNA 41169 Sequence encoding a complete 10-pair cluster comprising the pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, and pmxE genes from Paenibacillus alvei
  • SEQ ID NO Protein 1102 Peptide sequence of PmxB 11 acid synthetase from a strain of Paenibacillus alvei
  • SEQ ID NO Protein 608 Peptide sequence of PmxC protein derived from 12 acids of a strain of Paenibacillus alvei
  • PmxA acids from a strain of Paenibacillus amine alvei SEQ ID NO DNA 14997 Coding sequence for PmxA synthetase
  • 29 pairs comprising the pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, and pmxE bases from Paenibacillus alvei
  • SEQ ID NO Protein 431 Complete peptide sequence of the enzyme 31 allowing the biosynthesis of Dab, resulting from a strain of Paenibacillus alvei
  • the present invention also relates to an expression vector comprising a gene coding for a PmxA synthetase as defined above, or a nucleic acid coding for a PmxA synthetase as defined above, and / or a gene coding for a PmxE synthetase as defined above.
  • vector In the context of the invention, the terms “vector”, “expression vector” and “plasmid” are equivalent and are used according to the usual meaning in the field of molecular biology, genetic engineering and microbiology . Very briefly, it is a DNA molecule, non-viral, hosted by a host cell, distinct from the natural chromosomal DNA of said host cell and capable of autonomous replication.
  • a “vector” is obtained by conventional techniques of molecular biology and genetic engineering, and in which one or more exogenous nucleotide sequences have have been inserted (or cloned).
  • the present invention relates to a vector for the expression, by a host cell, of exogenous nucleotide sequences, comprising:
  • the choice of vector and, more particularly, the origin of replication it carries depends on the host cell that will host it. Depending on the type of host cells, multiple copies of a vector and / or more different vectors may be introduced into the same host cell, simultaneously or sequentially.
  • the choice of the vector will also depend on the size of the nucleic acid sequence to be expressed. In particular, for sequences greater than 20 kilobase pairs, the fosmids, vectors capable of containing large nucleic acid sequences (up to 40 kilobase pairs), will be preferred. It is also possible to use several vectors each comprising a portion of a set of genes, and to transfer several vectors in the same host cell, this making it possible to express a whole set of genes in the same strain.
  • vectors that may contain large sequences are cosmids and artificial bacterial chromosomes (BACs).
  • BACs artificial bacterial chromosomes
  • the expression vector comprises totally or partially a group of genes as defined above.
  • the expression vector comprises totally or partially a nucleic acid as defined above, in particular comprising the sequence presented in SEQ ID No. 10 or in SEQ ID No. 29.
  • the expression vector is a fosmid comprising the entire DNA sequence encoding the complete cluster comprising the pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, and pmxE genes from Paenibacillus alvei, having the sequence SEQ ID NO 10.
  • polymyxin enzymes involved in the synthesis of polymyxin, in particular polymyxin E. They are enzymes allowing the biosynthesis of the residue Dab, this residue being the residue predominantly integrated in the peptide chain of polymyxin E, and enzymes allowing the binding of the fatty acid on the peptide part.
  • ⁇ , ⁇ -diaminobutyric acid residue (Dab) was identified and isolated from the bacterial strain of Paenibacillus alvei described in the examples.
  • the peptide sequence of this enzyme comprises or consists of the peptide sequence presented in sequence SEQ ID NO 31.
  • the nucleic acid coding for this enzyme comprises or consists of the nucleotide sequence presented in sequence SEQ ID NO 32.
  • this transaminase-active enzyme can be expressed in a microorganism intended to produce polymyxin E, in combination with the PmxA, PmxB and PmxE synthetases, and preferably also with the PmxC and PmxD transport molecules.
  • This transaminase comprising 431 residues exhibits sequence homology with enzymes having similar functions, derived from other microorganisms, as shown in the following Table 2:
  • Enzymes allowing the binding of the fatty acid to the peptide chain of polymyxin E, thus having acyl transferase activity, have also been identified and isolated from the bacterial strain of Paenibacillus alvei described above.
  • At least one acyl transferase will be expressed in a microorganism intended to produce polymyxin E, in combination with the PmxA, PmxB and PmxE synthetases, and preferably also with the PmxC and PmxD transport molecules, and more preferably also with an enzyme for biosynthesis of the ⁇ , ⁇ -diaminobutyric acid residue (Dab).
  • the binding of the fatty acid on the peptide chain of polymyxin E may also be carried out by chemical coupling, according to one of the techniques well known to those skilled in the art.
  • host cell or "host microorganism” is used in the context of the present invention to designate a cell that has been transformed, that is to say in which exogenous DNA has been introduced, this DNA exogenous being especially in the form of an expression vector comprising a sequence of interest, which will be expressed thanks to the cellular machinery of the host cell, capable of synthesizing from the exogenous DNA the messenger RNAs and the corresponding proteins to this DNA.
  • the present application relates in particular to a microorganism transformed by introduction of a gene or group of genes as defined above, or of one or more expression vectors as presented above.
  • the invention relates in particular to a microorganism transformed by introduction:
  • a gene coding for a PmxE synthetase as defined above or an expression vector comprising a DNA sequence coding for a PmxA synthetase as defined above, in particular the sequence as presented in SEQ ID No. 7 or in SEQ ID No. 26.
  • the invention also relates to a microorganism transformed by introducing a group of genes as defined above, or a nucleic acid encoding all or part of the pmxA, pmxB and pmxE genes, as defined above. above, or at least one expression vector comprising a gene coding for all or part of the pmxA, pmxB and pmxE genes, as defined above.
  • the microorganism is furthermore transformed to comprise at least one nucleic acid encoding an enzyme involved in the biosynthesis of the Dab residue, and in particular a nucleic acid comprising a sequence comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 32.
  • the microorganism is furthermore transformed to comprise at least one nucleic acid encoding an acyl-transferase-active enzyme catalyzing the binding of a fatty acid to the peptide chain of polymyxin E .
  • microorganisms The transformation of microorganisms is a technique commonly used in molecular biology laboratories, allowing the introduction of exogenous DNA into the microorganism.
  • Various techniques allow the transformation of a microorganism, including a competent bacterium, and are all well known to those skilled in the art. In particular mention may be made of electroporation and the use of calcium chloride followed by heat shock.
  • the introduced gene or gene group is overexpressed.
  • the overexpression of a gene can be defined by an increased expression of this gene, that is to say a greater production of messenger RNA and protein encoded by this gene, in the cell.
  • the expression of the protein will notably be increased by 50%, 100%, 150%, 200% or even 300% with respect to the level of endogenous expression observed in a bacterium expressing this gene in a natural way, before any transformation.
  • Overexpression of a gene can be achieved in a number of ways, all well known to those skilled in the art.
  • the vector used will comprise a strong promoter under the control of which the gene will be inserted, and said vector will be present in a large number of copies, in particular 10, 20, 50 or 100 copies in the host cell.
  • a particularly suitable microorganism is a bacterium belonging to the genus Bacillus or Paenibacillus.
  • the B. subtilis and Paenibacillus polymyxa species are particularly suitable for the expression of polymyxin synthetases and for the production of polymyxin E.
  • Strains of the genus Paenibacillus, and in particular Paenibacillus alvei, and more particularly the Paenibacillus alvei strain isolated in the environment by the inventors, can also be used as a host microorganism to be transformed with the vector or the nucleic acid as defined above.
  • synthetic bacteria can also be used in the context of the present invention as host cells.
  • the present application also relates to a method for producing polymyxin E, comprising:
  • appropriate mineral medium denotes a culture medium for the growth of microorganisms, including in particular mineral salts and nutrients.
  • a preferred medium has the following specific composition: anhydrous KH 2 PO 4 0.45% (w / v), K 2 HPO 4 , 3H 2 O 1, 13% (w / v), (H 4 ) 2 SO 4 , 6% (w / v), glucose 0.6% (w / v), thiamine 0.001% w / v, MgSO 4 , 7H 2 O 0.02% (w / v).
  • This medium may also include, where appropriate, a precursor necessary for the synthesis of polymyxin, in particular diaminobutyric acid.
  • the culture is carried out at a temperature of 30 ° C, and lasts at least 25 hours.
  • the culture takes place in 200 ml of mineral medium in flasks of 1 L, with stirring, for 30 h at 30 ° C.
  • the present invention also relates to a method for producing polymyxin E variants, comprising culturing a microorganism as defined above, in an appropriate mineral medium, and purification from the culture medium of or variants of polymyxin E
  • the present invention also relates to polymyxin E variants obtained according to the production method as described above.
  • Polymyxin E variants denote molecules derived from the structure of polymyxin E (see FIG. 1) and which may, for example, have one or more different amino acids, without however being classified as belonging to another type of polymyxin.
  • the types of molecules detected in the culture medium of the Paenibacillus alvei strain BL-R are polymyxin E variants which have the following structural difference: the residue at position 3 can be a D-Dab residue in place and of an L-Dab residue observed in the classical structure of polymyxin E.
  • variant forms can be natural or synthetic.
  • natural variants is meant variants synthesized by unprocessed microorganisms;
  • synthetic variants means variant forms synthesized by transformed microorganisms, which have not been identified in the natural state.
  • polymyxin synthetases encoded by the pmxA, pmxB and pmxE genes can be modified to become specific for the binding of certain amino acids used in the composition of polymyxin E, in order to synthesize polymyxin E variants with less cationic charges. and therefore less toxic to the human body.
  • polymyxin E has advantages and in particular a lower toxicity than polymyxin E.
  • the present invention relates to these variants, as well as their use in the treatment of gram-negative bacterial infections.
  • a colistin-producing microorganism (polymyxins E1 and E2) belonging to the species Paenibacillus alvei was isolated from the environment and cultivated.
  • a genomic DNA library was constructed in Escherichia coli using fosmidic vectors (900 clones). The search for coding genes for the enzymes synthesizing colistin was performed by degenerate PCR. The primers used were defined in order to amplify the specialized domains in the integration of diaminobutyric acid (Dab), the amino acid most represented in the structure of colistin (6 amino acids / 12). Three clones of interest were selected and sequenced (Roche GS FLX). The sequences obtained could be assembled on 50 kb.
  • A, B, C, D and E describe a cluster of about 41 kb with A (14.9 kb), B (3.3 kb), C (1.8 kb), D (1.7 kb) and E ( 18.9 kb) which is represented in FIG.
  • genes A, B and E have been identified as coding for synthetases.
  • An in silico study has predicted the involvement of these synthetases in the colistin assembly (http: // nrps.formatik.uni-tuebingen.de/ and http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps /).
  • Genes C and D could in turn be involved in the export and resistance of the producing microorganism to colistin.
  • oligonucleotides are represented in SEQ ID NO 15 to 24.
  • Example 2 Comparison of adenylation domains of various Paenibacillus strains producing molecules belonging to the family of polymyxins.
  • NRPS non-ribosomal synthetases
  • These synthetases are capable of elaborating a particular peptide without relying on the translation of an mRNA template.
  • the specificity of the peptide chain produced depends on a precise amino acid sequence of the synthetase constituting an adenylation domain.
  • Four adenylation domains have been identified in silico for B-LR synthetase A, one for B and five for E.
  • Each adenylation domain contains a signature of ten amino acids which gives it the specificity of integrating an amino acid accurate to the non-ribosomal peptide being elongated.
  • These signatures were identified in silico and compared to those described in the literature (Table 4) using the program available at the following address: http: // nrps. informatik.uni-tuebingen.de/.
  • Strains E681 and ATCC21830 are described in US Pat. No. 8,329,430. Strain PKB 1 is described in the article by Shaheen et al. , 2011.
  • strain M-1 is described in the article by Niu et al., 2013.
  • the B-LR synthetases are distinguished at the second adenylation domain of the PmxA synthetase and the third domain of the PmxE synthetase.
  • a sequence of 1650 bp beginning at the end of pmxD and ending at the beginning of pmxE was selected and amplified. It has the distinction of having a unique restriction site to the SacII enzyme.
  • the amplified sequence was cloned into plasmid pGEM® 7Z.
  • the gene coding for apramycin resistance has been integrated at the SacII restriction site.
  • This construct was introduced into B-LR by electroporation.
  • the selection of the mutants having undergone a double recombination event was carried out by cultivation on an agar medium supplemented with apramycin.
  • the antimicrobial activity of the mutant supernatant was compared to that of B-LR.
  • the mutant 5 culture supernatant is less active than the wild bacterium B-LR on 5 aeruginosa ( Figure 4).
  • Example 4 Characteristics of the PmxE synthetase from Paenibacittus
  • the peptide sequence of the PmxE synthetase is presented in sequence SEQ ID No. 14.
  • sequence of the epimerization domain is presented in SEQ ID NO.
  • 3205 3665 comprises at least 461 residues between and including the Val to Leu residue of the sequence SEQ ID No. 14.
  • One of the characteristics of the non-ribosomal peptides is the presence of stereoisomeric amino acids (L). Usually, an amino acid (L) is activated by domain A, which then directly incorporates it. But sometimes, this amino acid series (L) can be converted into its form (D) by an epimerization domain, before the formation of the peptide bond. According to in silico predictions, two domains of epimerization were identified in modules 3 and 6 of the pmx cluster. This suggests that a stereochemical change of the amino acids present in these places is possible.
  • the PmxE synthetase according to the invention therefore has the property of converting the L-Dab residue into its stereoisomer (D), and of integrating it in position 3 (see FIG. 1) into the synthesized polymyxin E molecule.
  • Said polymyxin E molecules comprising a D-Dab residue at position 3 are polymyxin E variants.
  • the microorganism (B-LR) produces several types of polymyxin E molecules comprising at position 7 a leucine, isoleucine or valine residue.
  • a 0.0002% colistin sulfate control solution was prepared in the microorganism culture medium (M63T medium). Four fractions were recovered and analyzed by UPLC-MS (Ultra Performance Liquid Chromatography - tandem mass spectrometer). The two peaks corresponding to the E1 and E2 polymyxins present in the positive control were found in the fourth extraction fraction.
  • Strain B-LR has a maximum level of antimicrobial activity at 30 hours of culture. At this time, the culture supernatant was recovered and filtered (0.22 ⁇ m) before being subjected to a solid phase extraction step. The peptides of the fourth fraction were analyzed by UPLC-MS. Seventeen elution peaks were observed in this fourth fraction. Among them, the main peaks with retention times of 1.61 and 1.52 minutes, respectively, have molecular weights [M + H] + of 1169.7727 and 1155.7555 respectively. They correspond respectively to the known polymyxins E1 and E2, having the same peptide structure and differing by their fatty acids, respectively of formula C 9 H 17 O and C 8 H 5 0.
  • Tandem-mode mass spectrometry (MS / MS) is used to determine amino acid linkage through fragmentation of the peptide bond. This technique consists in combining two analyzers separated by a collision cell. A first step is to select an ion from the ionization source in the quadrupole: it is the parent ion or precursor.
  • This ion undergoes fragmentation in the collision cell as a result of bombardment by Argon atoms, and gives 'son' or 'product' ions which will be analyzed and detected by the time-of-flight analyzer ( Time of Flight, TOF).
  • the TOF analyzer is based on the measurement of the time that the ions spend traveling a given distance, which makes it possible to detect the m / z ratios and thus to determine the mass of the corresponding ions.
  • the mass spectra obtained for colistin E 1 , E 2 and val-colistin E 2 have values of [M + 2H] respectively of 585.39; 578.38 and 571.38.
  • the fragmentation of parent ions of E and E 2 colistins gives m / z daughter ions 829, 728, 628, 427, 327 and 227 (FIGS. 6 and 7) which are formed by loss of amino acid fragments.
  • the fragmentation of the parent ion of val-colistin E 2 gives m / z 815, 714, 614, 514, 413, 313 and 213 ( Figure 8) son ions also formed by loss of amino acid fragments.
  • Colistins E 1 and E 2 have the same amino acid sequences with a molecular weight difference of 14 Da which corresponds to a loss of a CH 2 at the level of the fatty acid.
  • strain B-LR produces colistin Ei, colistin E 2 and valine colistin E 2 (Val-E 2 ).
  • Bacillus is a heterologous expression host phylogenetically close to B-LR.
  • the fosmid manipulated to host the entire colistin production cluster is transferred to the recipient strain by electroporation.
  • the transformed strains are selected on agar medium supplemented with antibiotics.
  • the production of colistin is in a liquid medium supplemented with diaminobutyric acid (synthesis precursor).
  • the detection of colistin is carried out after separation of the biomass from the culture supernatant. Extractions make it possible to isolate colistin before its characterization in mass spectrometry.
  • Polymyxin P is the active principle in suppressing phytopathogenic Erwinia spp., By the biocontrol rhizobacterium Paenibacteria polymyxa ⁇ - ⁇ . BMC Microbiol 2013 Jun 18; 13 (1): 137.

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Abstract

Synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1: VTEAEKADLLGRFNDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.

Description

« Synthétases de la colistine et cluster de gènes correspondants »
La présente invention concerne des gènes et enzymes bactériennes impliqués dans la synthèse de polymyxine E, une molécule antibiotique utilisée en thérapie contre les infections à bactéries Gram- négatives.
ART ANTERIEUR
Les polymyxines sont des molécules antibiotiques isolées à partir de Bacillus species ou de Paenibaciïïus species. Ces molécules sont des lipopeptides, constitués :
- d'une chaîne peptidique comprenant dix acides aminés, organisés en un heptapeptide cyclique et une chaîne latérale de trois acides aminés, et
- d'un acide gras fixé à l'extrémité N-terminale du peptide.
Au moins 16 types de polymyxines ont été identifiés depuis la découverte de la polymyxine B en 1947. Parmi elles, les polymyxines B et E ont une activité antimicrobienne sur la plupart des souches d'Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa, ainsi que sur toutes les souches de Salmonelles, Shigelles, et de nombreuses bactéries Gram-négatives. Ces antibiotiques ont donc été utilisés comme agents thérapeutiques dans de nombreux cas. Malheureusement, leurs effets toxiques sont tels qu'ils ont été peu à peu remplacés par des antibiotiques mieux tolérés.
La figure 3 montre la structure générale des polymyxines, et les deux acides aminés spécifiques sont indiqués X et Y. Comme indiqué, la polymyxine B et E diffèrent par un seul acide aminé, le résidu 'X' étant une phenylalanine pour la polymyxine B et une leucine pour la polymyxine E, le résidu 'Y' pouvant être une leucine, isoleucine ou valine.
En raison de la demande croissante de nouveaux antibiotiques pour lesquels il n'existe pas encore de résistance dans la population, de nouveaux agents antibiotiques sont recherchés, et les polymyxines sont de nouveau utilisées en clinique dans la lutte contre les bactéries Gram-négatives multi-résistantes.
La colistine ou polymyxine E, identifiée sous le numéro CAS 1264-72-8, et telle que décrite dans la demande de brevet WO 1998/020836, est un antibiotique de la famille des polymyxines, permettant de traiter les infections dues aux bactéries Gram- négatives multi-résistantes. Sa structure peptidique est indiquée en figure 1. Administrée par voie injectable, la colistine est utilisée dans la prise en charge des infections neuroméningées, des infections urinaires, des infections urogénitales, des septicémies et des surinfections de plaies, brûlures et ulcères. Administrée par inhalation, la colistine est utilisée dans la prise en charge d'infections pulmonaires, notamment celles liées à la mucoviscidose. Enfin, en association avec de hydrocortisone et de la bacitracine, la colistine est utilisée pour traiter les infections bactériennes et inflammatoires de l'œil, ainsi que les infections en chirurgie ophtalmique.
La colistine est responsable de nombreux effets indésirables, notamment des effets néphrotoxiques et neurotoxiques. Ces effets toxiques sont imputables au caractère cationique de cette molécule, qui contient cinq charges positives, mais également au faible degré de pureté de la molécule, produite en fermenteur par culture de la souche originelle bactérienne la synthétisant, et purifiée à partir du milieu de fermentation.
En effet, les polymyxines sont actuellement obtenues par isolement et purification à partir de milieux de culture de souches bactériennes produisant ces molécules, notamment des souches de Paenibaciïïus polymyxa. La purification de la molécule à partir des milieux de fermentation est insatisfaisante, et c'est pourquoi de nouvelles techniques de production sont envisagées. Notamment, des travaux sont menés pour identifier et cloner les gènes codant pour les polymyxines synthétases.
Les polymyxines synthétases font partie de la famille des « Non-Ribosomal
Peptide Synthétases » (NRPS) ; les gènes codant pour ces synthétases sont organisés en cluster comprenant plusieurs modules, dont l'ordre et la spécificité déterminent la structure du produit peptidique. Les NRPS permettent la synthèse de peptides présentant une variété structurale plus large que celle qui pourrait être obtenue si ces peptides étaient traduits à partir d'ARN messager par des ribosomes. De plus, les peptides ainsi produits peuvent subir des modifications notamment par la création de liaisons avec des acides hydroxylés, et des oxydations dans la chaîne peptidique permettant d'obtenir des structures cycliques ainsi que des acylations, des glycosylations, et une N-méthylation des résidus.
De tels complexes NRPS ont été décrits chez de nombreux micro-organismes et sont impliqués dans la production de la tyrocidine, la gramicidine, la vancomycine, la pénicilline, et les fusaricidines. Les synthétases RPS sont constituées de différents modules. Chaque module est capable d'activer un acide aminé, éventuellement de le modifier et de le transférer ensuite sur l'acide aminé activé dans le module adjacent pour constituer un peptide. Chaque module est composé de plusieurs domaines et permet l'incorporation d'un acide aminé particulier dans le peptide en cours d'élongation. Chaque module contient au minimum 3 domaines :
• un domaine d'adénylation (A) : domaine central dans l'action des peptides synthétases. Il permet la fixation d'un acide aminé spécifique et son activation grâce à une réaction d'adénylation de ce dernier (transformation de l'acide aminé en aminoacyl adénylé) ;
• un domaine de thiolation (T ou PCP pour Peptidyl Carrier Protein) : permet au peptide en cours de synthèse de rester fixé à la synthétase tout au long du processus d'élongation via une liaison thioester ;
• un domaine de condensation (C) : permet la formation de la liaison peptidique entre deux acides aminés de modules adjacents.
La libération du peptide est induite par un domaine spécifique, le domaine Te (thioestérase). Ce domaine va couper la liaison thioester qui relie le peptide synthétisé au dernier domaine T. Ce domaine permet également la cyclisation de certains peptides.
Il existe aussi des domaines secondaires facultatifs qui permettent d'effectuer des modifications au niveau des acides aminés comme l'épimérisation (transformation d'un acide aminé de la série L en isomère de la série D), la méthylation (ajout d'un groupement méthyle) ou encore la formylation (ajout d'un groupement formyle).
Dans le cas des polymyxines, et comme indiqué en figure 2, trois synthétases sont essentielles à la synthèse de la chaîne peptidique :
- le module PmxA possède quatre domaines d'adénylation, organisés de façon tridimensionnelle en « binding pocket » ou « poches de liaison spécifique » qui intègrent chacune un acide aminé spécifique dans la molécule de polymyxine ;
- le module PmxB possède un domaine d'adénylation, et est responsable de l'intégration d'un seul acide aminé ;
- le module PmxE possède cinq domaines d'adénylation qui intègrent les cinq autres acides aminés composants la chaîne peptidique de la polymyxine. L'article de Choi et al. (Jounal of Bacteriology, 2009) ainsi que le brevet US 8,329,430 décrivent l'isolement d'un « cluster » (groupe) de gènes de la souche Gram- positive Paenibacillus polymyxa E681 sécrétant de la polymyxine A. Cinq gènes constituent ce cluster : pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE. Les gènes pmxC et pmxD codent pour des protéines de transport, alors que les trois autres gènes pmxA, pmxB et pmxE codent pour des synthétases. Ceci est en particulier démontré par une souche mutante ayant subi une mutation par insertion dans le gène pmxE : cette souche ne produit plus de polymyxine. Inversement, une souche de Bacillus subtilis transformée par l'introduction de ce cluster de gènes devient capable de produire de la polymyxine A, mais seulement en présence d'acide L-2,4-diaminobutyrique (Dab, résidu majoritaire de la chaîne peptidique de la polymyxine).
Dans les polymyxines décrites dans la littérature, il est très rare d'observer la présence de résidus D-Dab, sauf pour les polymyxines A, C et P.
Shaheen et al. (Chemistry and Biology, 2011) ont décrit l'identification et le séquençage d'un cluster de gènes issu de la souche Paenibacillus polymyxa PKB 1. L'implication de ces gènes dans la biosynthèse de la polymyxine B est démontrée par mutation insertionnelle dans le gène pmxE : la souche mutée ne produit plus de polymyxine. Lors de la caractérisation du cluster, Shaheen et al. ont identifié un domaine d'épimérisation dans le troisième module du cluster pmx. Ceci suggère l'intégration d'un D-Dab en position 3. Ainsi, ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse de variants de la polymyxine B, comprenant en position 3 non pas un résidu D-2,4-diaminobutyrate mais son énantiomère le L-2,4-diaminobutyrate.
D'autres clusters de gènes issus de souches de Paenibacillus polymyxa ont été isolés, mais leurs fonctions et spécificités sont uniquement prédictives et en aucun cas démontrées de manière fonctionnelle.
Par ailleurs, des molécules « variantes » présentant de légères différences structurelles avec les polymyxines connues, et des effets toxiques amoindris, ont été rapportées. Ainsi, la demande de brevet WO 2009/098357 ainsi que l'article de Vaara and Vaara (Peptides, 2010) décrivent des variants de polymyxine B ne comprenant que trois charges positives et présentant des effets toxiques diminués. Des variants de polymyxine B ont également été décrits dans l'article de Shaheen et al. (2011). La technique actuellement utilisée pour produire la colistine, basée sur la fermentation de souches bactériennes productrices en milieux riches n'est pas satisfaisante, notamment en termes de pureté de la molécule, qui doit être purifiée à partir du milieu de fermentation.
L'identification des gènes impliqués dans la synthèse de la colistine permettrait, par des procédés de génie génétique, de produire une molécule de polymyxine E plus pure, et également de créer des molécules synthétiques dérivées, présentant moins d'effets secondaires néfastes et/ou une meilleure activité. RESUME DE L'INVENTION
La présente invention décrit l'isolement d'un cluster de gènes issu d'une souche de Paenibaciïïus alvei isolée de l'environnement, produisant de la polymyxine E, et leurs utilisations.
La présente invention est relative à une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre domaines d'adénylation, caractérisée en ce que le second domaine d'adénylation comprend ou présente une séquence peptidique particulière représentée en SEQ ID NO 1, cette séquence formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
La présente invention est aussi relative à une synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq domaines d'adénylation et un domaine d'épimérisation.
La présente demande est également relative à un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour la synthétase PmxA, des gènes codant pour les synthétases PmxB et PmxE, et des gènes codant pour les protéines de transport PmxC et PmxD.
La présente invention concerne également des micro-organismes transformés exprimant au moins les gènes pmxA, pmxB et pmxE, modifiés ou non, lesdits microorganismes transformés produisant de la polymyxine E ou des molécules variantes de cette polymyxine.
FIGURES
Figure 1. Structure peptidique de la polymyxine E Figure 2. Structure du cluster RPS impliqué dans la synthèse de polymyxine E.
Figure 3. Structures chimiques des différentes polymyxine B et E d'après Govaerts et collaborateurs (Govaerts et al., 2002a; Govaerts et al., 2002b).
Figure 4. Effet antimicrobien de 20 μΐ du surnageant de culture de la bactérie
B-LR et du mutant 5 sur un tapis bactérien de P. aeruginosa.
Figure 5. Séquence peptidique PmxA ; en gras : séquences des domaines d'adénylation ; en gras et souligné : motifs spécifiques des « binding pockets ».
Figure 6. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 585,39). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant : colistine El . AG : acide gras (C9H170) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ; Thr : Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série, ceux entourés de ronds correspondent aux ions produits en seconde série.
Figure 7. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 578,38). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant colistine E2. AG : acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ; Thr : Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série.
Figure 8. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 571,38). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant Val-E2. AG : acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ; Thr : Thréonine ; Ile : Isoleucine ; Leu : Leucine ; Val : Valine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série, ceux entourés de ronds correspondent aux ions produits en seconde série.
DESCRIPTION DETAILLEE Polypeptides et polynucléotides
L'invention est relative à l'isolement et l'identification de nouveaux gènes codant pour des polymyxines E synthétases, en particulier d'un gène codant pour la synthétase « PmxA » présentant un site d'adénylation particulier, formant une poche de liaison spécifique permettant l'intégration dans la molécule de polymyxine d'un résidu leucine ou isoleucine.
Tous les termes techniques employés dans la présente demande sont bien connus de l'homme du métier et sont définis dans l'ouvrage de référence Sambrook et al. « Molecular Cloning: a Laboratory Manual ».
Le terme « polynucleotide » désigne une chaîne de nucléotides liés par covalence. Au sens de l'invention, ce terme désigne des acides nucléiques tels que l'acide ribonucléique (ARN) et l'acide désoxyribonucléique (ADN).
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (1 1) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».
Le terme « polypeptide » désigne une chaîne d'acides aminés liés de façon covalente.
Le terme « polymyxine E synthétases » désigne les enzymes capables d'intégrer un acide aminé spécifique dans la chaîne d'acides aminés formant la polymyxine E, et le cas échéant de transformer l'acide aminé pour former une structure cyclique.
Le terme « site d'adénylation » ou « domaine d'adénylation » désigne, dans la molécule de polymyxine synthétase, le domaine qui joue un rôle dans le choix et l'activation de l'acide aminé, tandis que le « domaine de condensation » catalyse la formation d'une liaison peptidique et que le « domaine de thiolation » est responsable du transport des composés en formation entre les modules.
Le terme « site d'épimérisation » désigne dans une synthétase un domaine permettant de convertir un résidu présentant une chiralité levogyre 'L' en son énantiomère de chiralité dextrogyre 'D', en particulier un résidu L-acide α,γ-diaminobutyrique (L-Dab) en résidu D-acide α,γ-diaminobutyrique (D-Dab).
Le terme « poche de liaison » désigne une zone de la protéine présentant une structure tridimensionnelle de « poche », dans laquelle des interactions de haute spécificité avec un substrat ou, dans le cas présent, un acide aminé, permettront de sélectionner et d'activer cet acide aminé.
L'expression « les acides aminés soulignés étant conservés » signifie que, même si de légères variations de séquences peuvent être observées entre deux protéines présentant la même activité catalytique, les acides aminés indiqués sont essentiels à la spécificité et à l'activité de cette protéine et ne peuvent donc pas être modifiés, sous peine de perdre ou diminuer la spécificité et/ou l'activité de cette protéine.
La présente invention concerne une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90 % d'identité avec la séquence peptidique suivante :
VTEAEKADLLGRFNDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYP LNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGT LNTGI
EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG
ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD
CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRL HVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE
LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNN PELTAEKF
VD PFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV
EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE
RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG (SEQ ID NO 1),
les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d'adénylation de PmxA présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d'adénylation de PmxA présente une séquence peptidique comprenant ou consistant en la séquence peptidique SEQ ID NO 27, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants :
- DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ;
- DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique.
Il est bien entendu que ces séquences SEQ ID NO 2, 3, 4 et 5 regroupent les acides aminés essentiels formant une poche de liaison fonctionnelle en structure tridimensionnelle, mais ne sont pas des acides aminés consécutifs dans une séquence peptidique. Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6, et montrée en figure 5, les domaines d'adénylation étant indiqués en gras, les acides aminés formant la poche de liaison étant soulignés. En particulier cette séquence pourra comprendre, en plus de la séquence présentée en SEQ ID NO 6, des acides aminés supplémentaires aux extrémités N- et C- terminales.
Selon un aspect particulier, la séquence polypeptidique de la synthétase PmxA consiste en la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6.
Selon un autre aspect de l'invention, la synthétase PmxA présente une séquence qui comprend, ou consiste en, la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 25.
La synthétase PmxA présente quatre sites d'adénylation aux positions suivantes :
- du résidu 234L au résidu 751 Y ;
- du résidu 1741 V au résidu 2263 G ;
- du résidu 2815P au résidu 3345T ;
- du résidu 3900E au résidu 4428G.
Il est entendu que ces positions sont définies en fonction d'une séquence peptidique particulière, ici selon la SEQ ID NO 6 comprenant 4967 acides aminés, et peuvent être redéfinies pour des séquences de plus grande taille.
Notamment lorsque la synthétase PmxA présente une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO 25, les quatre sites d'adénylation se trouvent aux positions suivantes :
- du résidu 265L au résidu 782Y ;
- du résidu 1772V au résidu 2294G ;
- du résidu 2846P au résidu 3376T ;
- du résidu 3931E au résidu 4459G.
La présente invention est également relative à une synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq sites d'adénylation et un site d'épimérisation, caractérisée en ce que le site d'épimérisation présente au moins 90 % d'identité avec la séquence peptidique telle que présentée en SEQ ID NO 30. Selon un aspect particulier de l'invention, la séquence peptidique de la synthétase PmxE comprend ou consiste en la séquence représentée en séquence SEQ ID NO 14.
Cette synthétase est responsable de l'intégration des résidus n° 1 à 5 (voir figure 1 pour la numérotation) dans la chaîne peptidique de la molécule de polymyxine E. Cette synthétase présente la caractéristique fonctionnelle de pouvoir convertir le résidu L- Dab en son stéréoisomère D-Dab, et d'incorporer ledit stéréoisomère à la position 3 dans une chaîne peptidique de polymyxine E. Une telle molécule variante de polymyxine pourrait présenter des propriétés antimicrobiennes améliorées, comme cela a été proposé dans la littérature (Hong SY et al, 199 ; Lee DL et al, 2004).
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E, présentant au moins 90% d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
L'expression « les nucléotides [... ] sont conservés » indiquent que ces nucléotides codant pour les acides aminés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 doivent être soit identiques à ceux observés dans la même position dans la séquence SEQ ID NO 7, soit différents mais sous réserve que les codons formés par ces nucléotides codent pour les acides aminés DGFFLGVVYK soulignés dans la séquence SEQ ID NO 1.
En effet et comme indiqué ci-dessus, ces acides aminés sont essentiels à la spécificité et à l'activité de cette synthétase et ne peuvent donc pas être modifiés, sous peine de perdre ou de diminuer la spécificité de cette poche de liaison.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E comprend une séquence nucléotidique codant pour le second site d'adénylation de cette synthétase PmxA, consistant en la séquence nucléotidique présentée en SEQ ID NO 28. Cette séquence code pour la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 27 ainsi que pour la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 1 qui présente deux acides aminés de moins que SEQ ID NO 27 à l'extrémité C-terminale du domaine.
La présente invention concerne également un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant notamment :
- un gène codant pour la synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et
- des gènes codant respectivement pour les synthétases PmxB et PmxE.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend le gène pmxE codant pour une synthétase PmxE comprenant un domaine d'épimérisation dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence représentée en SEQ ID NO 30.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC et PmxD. Les séquences des protéines PmxC et PmxD isolées de la souche de Paenibacillus alvei sont montrées en séquences SEQ ID NO 12 et NO 13, respectivement.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés,
- un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et
- un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9.
Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, sous réserve que la portion d'acide nucléique codant les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK soit conservée,,
- un gène pmxB présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et
- un gène pmxE présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
9. Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, et en particulier comprenant une séquence nucléotidique telle que présentée en SEQ ID NO 26,
- un gène pmxB comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et
- un gène pmxE comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9.
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence SEQ ID NO 10, ou une séquence SEQ ID NO 29, représentant la séquence complète du cluster issu de la souche de Paenibacillus alvei, comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE impliqués dans la synthèse de polymyxine E.
Le tableau 1 ci-dessous présente les différentes séquences d'acides nucléiques et protéiques référencées dans la présente demande :
Numéro de Type Taille Définition
séquence
SEQ ID NO 1 Protéine 523 Séquence peptidique du second site acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue aminés d'une souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO 2 Protéine 10 acides Binding pocket du 1er domaine d'adénylation de aminés PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine
SEQ ID NO 3 Protéine 10 acides Binding pocket du 2nd domaine d'adénylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine
SEQ ID NO 4 Protéine 10 acides Binding pocket du 3eme domaine d'adénylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique SEQ ID NO 5 Protéine 10 acides Binding pocket du 4eme domaine d'adenylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique
SEQ ID NO 6 Protéine 4967 Séquence peptidique complète d'une synthétase acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus aminés alvei ; voir également figure 5
SEQ ID NO 7 ADN 14901 Séquence codante pour la synthétase PmxA paires de présentant la séquence SEQ ID NO 6 bases
SEQ ID NO 8 ADN 3306 Séquence codante pour la synthétase PmxB paires de issue de Paenibacillus alvei
bases
SEQ ID NO 9 ADN 18876 Séquence codante pour la synthétase PmxE paires de issue de Paenibacillus alvei, présentant la bases séquence SEQ ID NO 31
SEQ ID NO ADN 41169 Séquence codant pour un cluster complet 10 paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, bases pmxD, et pmxE issu de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO Protéine 1102 Séquence peptidique de la synthétase PmxB 11 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 608 Séquence peptidique de la protéine PmxC issue 12 acides d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 577 Séquence peptidique de la protéine PmxD issue 13 acides d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 6292 Séquence peptidique de la synthétase PmxE 14 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO ADN 20 paires Séquences artificielles - oligonucléotides (voir 15-24 bases tableau 2)
SEQ ID NO Protéine 4999 Séquence peptidique complète d'une synthétase
25 acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus aminés alvei ; SEQ ID NO ADN 14997 Séquence codante pour la synthétase PmxA
26 paires de présentant la séquence SEQ ID NO 25
bases
SEQ ID NO Protéine 525 Séquence peptidique du second site
27 acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue aminés d'une souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO ADN 1575 Séquence codante pour le 2nd domaine 28 paires de d'adénylation de PmxA, présentant la séquence bases SEQ ID NO 27
SEQ ID NO ADN 41172 Séquence codant pour un cluster complet
29 paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, bases pmxD, et pmxE issus de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO Protéine 461 Séquence du domaine d'épimérisation de la
30 synthétase PmxE issue d'une souche de
Paenibacillus alvei
SEQ ID NO Protéine 431 Séquence peptidique complète de l'enzyme 31 permettant la biosynthèse de Dab, issue d'une souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO ADN 1293 Séquence codant pour l'enzyme présentant la
32 paires de séquence SEQ ID NO 31, issue de bases Paenibacillus alvei
Vecteurs d'expression
La présente invention est également relative à un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, ou un acide nucléique codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et/ou un gène codant pour une synthétase PmxE tel que défini ci-dessus.
Dans le cadre de l'invention, les termes « vecteur », « vecteur d'expression » et « plasmide » sont équivalents et sont utilisés conformément à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie moléculaire, du génie génétique et de la microbiologie. Très brièvement, il s'agit d'une molécule d'ADN, non virale, hébergée par une cellule hôte, distincte de l'ADN chromosomique naturel de ladite cellule hôte et capable de réplication autonome. Un « vecteur » est obtenu par des techniques classiques de biologie moléculaire et génie génétique, et dans lequel une ou plusieurs séquences nucléotidiques exogènes ont été insérées (ou clonées). La présente invention concerne un vecteur pour l'expression, par une cellule hôte, de séquences nucléotidiques exogènes, comprenant :
- une origine de réplication,
- des éléments permettant l'expression des gènes introduits, tels qu'un promoteur approprié, des enhancers...
- au moins une séquence nucléotidique dont l'expression est souhaitée.
Le choix du vecteur et, plus particulièrement, de l'origine de réplication qu'il porte dépend de la cellule hôte qui l'hébergera. En fonction du type de cellules hôtes, plusieurs copies d'un vecteur et/ou plusieurs vecteurs différents peuvent être introduits dans la même cellule hôte, simultanément ou séquentiellement.
Le choix du vecteur dépendra également de la taille de la séquence d'acide nucléique à exprimer. En particulier, pour des séquences supérieures à 20 kilo-paires de bases, les fosmides, vecteurs capables de contenir de grandes séquences d'acides nucléiques (jusqu'à 40 kilo-paires de bases), seront préférés. Il est également possible d'utiliser plusieurs vecteurs comprenant chacun une portion d'un ensemble de gènes, et de transférer plusieurs vecteurs dans une même cellule hôte, ceci permettant d'exprimer tout un ensemble de gènes dans une même souche.
D'autres vecteurs pouvant contenir des séquences de grandes tailles sont les cosmides et les chromosomes bactériens artificiels (BAC).
Selon un aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un groupe de gènes tel que défini ci-dessus.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un acide nucléique tel que défini ci-dessus, notamment comprenant la séquence présentée en SEQ ID NO 10 ou en SEQ ID NO 29. De manière préféré, le vecteur d'expression est un fosmide comprenant la totalité de la séquence d'ADN codant pour le cluster complet comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, et pmxE issu de Paenibaciïïus alvei, présentant la séquence SEQ ID NO 10.
Autres enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine
D'autres enzymes sont impliquées dans la synthèse de polymyxine, notamment de la polymyxine E. Il s'agit des enzymes permettant la biosynthèse du résidu Dab, ce résidu étant le résidu majoritairement intégré dans la chaîne peptidique de la polymyxine E, et des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la partie peptidique.
Une enzyme de biosynthèse du résidu acide α,γ-diaminobutyrique (Dab) a été identifiée et isolée à partir de la souche bactérienne de Paenibacillus alvei décrite dans les exemples. En particulier, la séquence peptidique de cette enzyme comprend ou consiste en la séquence peptidique présentée en séquence SEQ ID NO 31. L'acide nucléique codant pour cette enzyme comprend ou consiste en la séquence nucléotidique présentée en séquence SEQ ID NO 32.
De manière préférée, cette enzyme à activité transaminase peut être exprimée dans un micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison avec les synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules de transport PmxC et PmxD.
Cette transaminase comprenant 431 résidus présente une homologie de séquence avec des enzymes présentant des fonctions similaires, issues d'autres microorganismes, comme cela est montré dans le tableau 2 suivant :
Figure imgf000018_0001
ABX39524.1 429 50 diaminobutyrate- Halobacillus
2-oxoglutarate halophilus transaminase DSM 2266
Tableau 2
Des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la chaîne peptidique de la polymyxine E, enzymes présentant donc une activité acyl-transférase, ont également été identifiées et isolées à partir de la souche bactérienne de Paenibaciïïus alvei décrite ci- dessus.
De manière préférée, au moins une acyl-transférase sera exprimée dans un micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison avec les synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules de transport PmxC et PmxD, et de manière plus préférée avec également une enzyme de biosynthèse du résidu acide α,γ-diaminobutyrique (Dab).
Alternativement, la liaison de l'acide gras sur la chaîne peptidique de la polymyxine E pourra également être réalisée par couplage chimique, selon l'une des techniques bien connues de l'Homme du métier.
Cellules hôtes
Le terme « cellule hôte » ou « micro-organisme hôte » est utilisé dans le cadre de la présente invention pour désigner une cellule ayant été transformée, c'est-à-dire dans laquelle de l'ADN exogène a été introduit, cet ADN exogène étant notamment sous la forme d'un vecteur d'expression comprenant une séquence d'intérêt, qui sera exprimée grâce à la machinerie cellulaire de la cellule hôte, capable de synthétiser à partir de l'ADN exogène les ARNs messagers et les protéines correspondants à cet ADN.
La présente demande concerne en particulier un micro-organisme transformé par introduction d'un gène ou groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un ou de plusieurs vecteurs d'expression tel que présentés ci-dessus.
L'invention est notamment relative à un micro-organisme transformé par introduction :
- d'un gène codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, ou
- d'un gène codant pour une synthétase PmxE telle que définie ci-dessus, ou - d'un vecteur d'expression comprenant une séquence ADN codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, notamment la séquence telle que présentée en SEQ ID NO 7 ou en SEQ ID NO 26.
L'invention porte également sur un micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un acide nucléique codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus, ou d'au moins un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus.
Selon un aspect particulier de l'invention, le micro-organisme est de plus transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du résidu Dab, et notamment un acide nucléique comprenant une séquence comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 32.
Selon un autre aspect de l'invention, le micro-organisme est de plus transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme à activité acyl-transférase, catalysant la liaison d'un acide gras sur la chaîne peptidique de la polymyxine E.
La transformation de micro-organismes est une technique couramment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant d'introduire de l'ADN exogène dans le micro-organisme. Diverses techniques permettent la transformation d'un micro- organisme, et notamment d'une bactérie compétente, et sont toutes bien connues de l'homme du métier. On peut en particulier citer l'électroporation, et l'utilisation de chlorure de calcium suivi d'un choc thermique.
Dans un aspect préféré de l'invention, dans le micro-organisme transformé, le gène ou le groupe de gènes introduit est surexprimé.
La surexpression d'un gène peut se définir par une expression augmentée de ce gène, c'est-à-dire une plus grande production d'ARN messager et de protéine codée par ce gène, dans la cellule. L'expression de la protéine sera notamment augmentée de 50 %, de 100 %, de 150 %, de 200 %, voire de 300 % par rapport au taux d'expression endogène observé dans une bactérie exprimant ce gène de façon naturelle, avant toute transformation.
La surexpression d'un gène peut être obtenue de plusieurs façons, toutes bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier : l'utilisation de promoteurs forts pour contrôler le niveau d'expression des gènes et l'augmentation du nombre de copies du gène dans la cellule. De préférence, le vecteur utilisé comprendra un promoteur fort sous le contrôle duquel sera inséré le gène, et ledit vecteur sera présent en un nombre important de copies, notamment 10, 20, 50 ou 100 copies dans la cellule hôte.
L'homme du métier saura choisir le micro-organisme hôte le plus adapté pour l'expression d'un vecteur comportant le ou les gènes selon l'invention. En particulier, les bactéries Gram-positives seront préférées. Un micro-organisme particulièrement adapté est une bactérie appartenant au genre des Baciïïus ou Paenibacillus. Les espèces B. subtilis et Paenibacillus polymyxa sont particulièrement adaptées pour l'expression des polymyxines synthétases et à la production de polymyxine E. Les souches du genre Paenibacillus, et notamment de Paenibacillus alvei, et plus particulièrement la souche Paenibacillus alvei isolée dans l'environnement par les inventeurs, peuvent également être utilisées comme micro-organisme hôte pour être transformées avec le vecteur ou l'acide nucléique tels que définis ci-dessus. Enfin, des bactéries synthétiques peuvent également être utilisées dans le cadre de la présente invention, comme cellules hôtes.
Méthode de production de polymyxine E
La présente demande est également relative à une méthode de production de polymyxine E, comprenant :
- la mise en culture d'un micro-organisme transformé tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et
- la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite. Le terme « milieu minéral approprié » désigne un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes, et comprenant notamment des sels minéraux et des nutriments. Un milieu préféré présente la composition spécifique suivante : KH2PO4 anhydre 0,45 % (p/v), K2HP04, 3H20 1, 13 % (p/v), ( H4)2S04 0,6 % (p/v), glucose 0,6 % (p/v), thiamine 0,001 %o (p/v), MgS04, 7H20 0,02 % (p/v). Ce milieu peut comprendre également, le cas échéant, un précurseur nécessaire à la synthèse de polymyxine, en particulier l'acide diaminobutyrique.
Selon un aspect préféré de l'invention, la culture est effectuée à une température de 30°C, et dure au moins 25 heures. De préférence, la culture a lieu dans 200 ml de milieu minéral dans des flasques de 1 L, sous agitation, pendant 30 h à 30°C.
La présente invention concerne également une méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E.
La présente invention est également relative à des variants de la polymyxine E obtenus selon la méthode de production telle que décrite ci-dessus.
Les « variants de polymyxine E » désignent des molécules dérivées de la structure de la polymyxine E (voir figure 1) et qui peuvent par exemple présenter un ou plusieurs acides aminés différents, sans pour autant être classifiés comme appartenant à un autre type de polymyxine.
En particulier, les types de molécules détectées dans le milieu de culture de la souche de Paenibaciïïus alvei BL-R sont des variants de polymyxine E qui présentent la différence structurelle suivante : le résidu en position 3 peut être un résidu D-Dab en lieu et place d'un résidu L-Dab observé dans la structure classique de la polymyxine E.
Les formes variantes peuvent être naturelles ou synthétiques. Par « variants naturels» on entend des variants synthétisés par des micro-organismes non transformés ; par « variants synthétiques » on entend des formes variantes synthétisées par des micro- organismes transformés, qui n'ont pas été identifiées à l'état naturel.
En particulier, les polymyxines synthétases codées par les gènes pmxA, pmxB et pmxE pourront être modifiées pour devenir spécifiques de la fixation de certains acides aminés entrant dans la composition de la polymyxine E, afin de synthétiser des variants de polymyxine E présentant moins de charges cationiques et étant donc moins toxiques pour l'organisme humain.
Ces variants de polymyxine E présentent des avantages et notamment une plus faible toxicité que la polymyxine E.
Par ailleurs, l'utilisation clinique de différents variants de polymyxine E permet de diminuer l'apparition de résistance aux antibiotiques.
II est probable que, pour les variants comprenant des résidus D-Dab à la place de résidus L-Dab, l'activité antimicrobienne de ces molécules soit augmentée par rapport aux propriétés antimicrobiennes observées avec les polymyxines classiques. La présente invention est relative à ces variants, ainsi qu'à leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries gram négatives.
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention revendiquée mais ne sont pas limitatifs.
EXEMPLES
Exemple 1. Isolement et séquençage du système génétique de production de la colistine.
Un micro-organisme (B-LR) producteur de colistine (polymyxines El et E2), appartenant à l'espèce Paenibaciïïus alvei, a été isolé de l'environnement et cultivé. Une banque d'ADN génomique a été construite dans Escherichia coli en utilisant des vecteurs fosmidiques (900 clones). La recherche des gènes codants pour les enzymes synthétisant la colistine a été effectuée par PCR dégénérées. Les amorces utilisées ont été définies dans le but d'amplifier les domaines spécialisés dans l'intégration de l'acide diaminobutyrique (Dab), acide aminé le plus représenté dans la structure de la colistine (6 acides aminés/12). Trois clones d'intérêts ont été sélectionnés et séquencés (Roche GS FLX). Les séquences obtenues ont pu être assemblées sur 50 kb. Les cadres ouverts de lecture ont été recherchés. Cinq d'entre eux nommés A, B, C, D et E décrivent un cluster d'environ 41 kb avec A (14.9 kb), B (3.3 kb), C (1.8 kb), D (1.7 kb) et E (18.9 kb) qui est représenté en figure 2.
Par homologie de séquences les gènes A, B et E ont été identifiés comme codant pour des synthétases. Une étude in silico a permis de prédire l'implication de ces synthétases dans l'assemblage de la colistine (http://nrps. informatik.uni-tuebingen.de/ et http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/). Les gènes C et D pourraient quant à eux être impliqués dans l'export et la résistance du micro-organisme producteur vis à vis de la colistine.
Tableau 3 : Amorces permettant d'amplifier les gènes d'intérêt du cluster colistine de B-LR
A (F)ATGGCTTTTGAAAAAGAAAC
(R)GAACGCAAATTCGATCGTAT
B (F)ATGAAATCTTTATTTGAAAA
(R)GCTTCCATGCAGTACCCCGG
E (F)ATGGAAATTATGAATCCGGG
(R)GAAAATAATATCAATGGCCT
C (F)ATGGAAGCTGACCGACAGCC
(R)GTGTACGCCACCTCCCTGCG
D (F)ATGAAAAAGGGCGGATGGCT
(R)GCCGTACAGCCGGGCGTAAT
Ces oligonucléotides sont représentés en SEQ ID NO 15 à 24. Exemple 2 : Comparaison des domaines d'adénylation de diverses souches de Paenibacillus productrices de molécules appartenant à la famille des polymyxines.
Les enzymes impliquées dans la production des polymyxines appartiennent à la famille des synthétases non ribosomiques (NRPS). Ces synthétases sont capables d'élaborer un peptide particulier sans s'appuyer sur la traduction d'une matrice d'ARNm. La spécificité de la chaîne peptidique produite dépend d'une séquence précise d'acides aminés de la synthétase constituant un domaine d'adénylation. Quatre domaines d'adénylation ont été identifiés in silico pour la synthétase A de B-LR, un pour B et cinq pour E. Chaque domaine d'adénylation contient une signature de dix acides aminés qui lui confère la spécificité d'intégrer un acide aminé précis au peptide non ribosomique en cours d'élongation. Ces signatures ont été identifiées in silico et comparées à celles décrites dans la littérature (tableau 4) à l'aide du programme disponible à l'adresse suivante : http://nrps. informatik.uni-tuebingen.de/.
Les souches E681 et ATCC21830 sont décrites dans le brevet US 8,329,430. La souche PKB 1 est décrite dans 1 ' article de Shaheen et al. , 2011.
La souche M-1 est décrite dans l'article de Niu et al., 2013.
Tableau 4 : Acides aminés conférant la spécificité des domaines d'adénylation des polymyxines synthétases des souches E681, PKB1, ATCC21830, M-1 et B-LR
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
Pmx E, 5 domaines A
1 2 3 4 5
E681 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab
IDK VHK IDK AIDK AIDK PKB1 DVGEISS Dab DFW GM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK IDK AIDK AIDK
21830 DVGEISS Dab DFW GM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK IDK AIDK AIDK
M-l DVGEISS Dab DFW GM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IVK VHK IDK AIDK AIDK
B-LR DVGEISS Dab DFW GM Thr DVGELS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK SIDK AIDK AIDK
Les synthétases de B-LR se distinguent au niveau du deuxième domaine d'adénylation de la synthétase PmxA et du troisième domaine de la synthétase PmxE.
Les comparaisons avec les séquences protéiques issues de la souche BL-R avec les séquences protéiques déjà connues sont présentées dans le tableau 5 ci-dessous :
Séquences tailles % ID séquences protéiques
pb aa PKB1 E681 ATCC
21830
A 14901 4967 94 90 96
A 14997 4999 94 90 95
B 3306 1102 96 95 96
E 18876 6292 95 96 84
C 1824 608
D 1731 577
Tableau 5
Exemple 3 : Construction d'un mutant pmxE- et analyse de sa production de colistine.
Une séquence de 1 650 pb commençant à la fin de pmxD et finissant au début de pmxE a été sélectionnée et amplifiée. Elle a la particularité de posséder un site de restriction unique à l'enzyme SacII. La séquence amplifiée a été clonée dans le plasmide pGEM® 7Z. Le gène codant pour la résistance à l'apramycine a été intégré au niveau du site de restriction SacII. Cette construction a été introduite dans B-LR par électroporation. La sélection des mutants ayant subi un événement de double recombinaison a été effectuée par culture sur milieu gélose supplémenté en apramycine. L'activité antimicrobienne du surnageant des mutants a été comparée à celle de B-LR. Le surnageant de culture du mutant 5 est moins actif que celui de la bactérie B-LR sauvage sur 5, aeruginosa (Figure 4). Exemple 4. Caractéristiques de la synthétase PmxE issue de Paenibacittus
La séquence peptidique de la synthétase PmxE est présentée en séquence SEQ ID NO 14. La séquence du domaine d'épimérisation est présentée en SEQ ID NO 30, elle
3205 3665 comprend au moins 461 résidus compris entre et incluant les résidu Val à Leu de la séquence SEQ ID NO 14. Une des caractéristiques des peptides non-ribosomiques est la présence d'acides aminés de stéréoisomie (L). Habituellement, un acide aminé (L) est activé par le domaine A, qui ensuite l'incorpore directement. Mais parfois, cet acide aminé de série (L) peut être converti en sa forme (D) par un domaine d'épimérisation, avant la formation de la liaison peptidique. Selon les prédictions in silico, deux domaines d'épimérisation ont été identifiés dans les modules 3 et 6 du cluster pmx. Ceci suggère qu'un changement stéréochimique des acides aminés présents à ces endroits est possible. Ainsi les acides aminés présents en position 3 (Dab-3) et en position 6 (Leu-6) seraient incorporés dans la chaîne peptidique sous leur forme (D). Ceci était connu pour la Leu-6, incorporée sous sa forme (D) dans toutes les polymyxines E, mais est inhabituel pour le résidu Dab-3.
La synthétase PmxE selon l'invention a donc la propriété de convertir le résidu L-Dab en son stéréoisomère (D), et de l'intégrer en position 3 (voir figure 1) dans la molécule de polymyxine E synthétisée.
Lesdites molécules de polymyxine E comprenant un résidu D-Dab en position 3 sont des variants de polymyxine E.
Exemple 5 : Production de polymyxine E par un micro-organisme exprimant la combinaison d'une PmxA, d'une PmxB et d'une PmxE caractérisées dans les exemples précédents
Le microorganisme (B-LR) produit plusieurs types de molécules de polymyxine E comprenant en position 7 un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Ces différents types de molécules ont pu être détectés dans le milieu de culture par spectrométrie de masse, selon le protocole détaillé ci-dessous :
Une solution contrôle de colistine sulfate à 0,0002% a été préparée dans le milieu de culture des micro-organismes (milieu M63T). Quatre fractions ont été récupérées et analysées par UPLC-MS (Ultra Performance Liquid Chromatography - tandem mass spectrometer). Les deux pics correspondant aux polymyxines El et E2 présentes dans le contrôle positif ont été trouvées dans la quatrième fraction d'extraction.
La souche B-LR présente un niveau maximum d'activité antimicrobienne à 30 heures de culture. A ce moment, le surnageant de culture a été récupéré et filtré (0,22 um) avant d'être soumis à une étape d'extraction en phase solide. Les peptides de la quatrième fraction ont été analysés par UPLC-MS. Dix-sept pics d'élution ont été observés dans cette quatrième fraction. Parmi eux, les principaux pics présentant des temps de rétention de 1,61 et 1,52 minutes, ont des masses moléculaires respectivement [M+H]+ de 1169,7727 et 1155,7555. Ils correspondent respectivement aux polymyxines connues El et E2, présentant la même structure peptidique et différant par leurs acides gras, respectivement de formule C9H17O et C8Hi50.
Des analyses MS/MS ont été réalisées afin de confirmer ces structures, comme cela avait été préalablement présenté dans les articles de Govaerts et al, 2002; et de DeCrescenzo et al, 2007. La spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS) est utilisée pour déterminer l'enchaînement des acides aminés grâce à la fragmentation de la liaison peptidique. Cette technique consiste à combiner deux analyseurs séparés par une cellule de collision. Une première étape consiste à sélectionner un ion issu de la source d'ionisation dans le quadripôle : c'est l'ion parent ou précurseur. Cet ion subit une fragmentation dans la cellule de collision sous l'effet d'un bombardement par des atomes d'Argon, et donne des ions 'fils' ou 'produits' qui seront analysés et détectés par l'analyseur à temps de vol (Time of Flight, TOF). L'analyseur TOF est basé sur la mesure du temps que mettent les ions à parcourir une distance donnée, ce qui permet de détecter les rapports m/z et donc de déterminer la masse des ions correspondants.
Au cours de ces expériences, les résidus Leucine et Isoleucine ne peuvent pas être différenciés, en raison de leurs masses moléculaires identiques.
Trois décapeptides avec un cycle à sept acides aminés ont été purifiés à partir du surnageant de B-LR. Leurs poids moléculaires vont de 1140,74 Da à 1168,77 Da. La comparaison de ces molécules montre des homologies au niveau des résidus I à 6 et 8 à l0 et des différences au niveau du résidu 7 ainsi qu'au niveau de l'acide gras. Ces 3 molécules correspondent aux polymyxines (colistines) Ei, E2 et à la Val-colistine E2. Leurs formules chimiques déduites sont présentées dans le tableau 6 suivant. Nom Acide Gras (AG) Y Masse Formule brute
(Da)
Colistine Ei C9H17O Leu/Ile 1168,77 C53H101N16O13
Colistine E2 C8Hi50 Leu/Ile 1154,76 C52H99N16O13
Val-Colistine E2 C8Hi50 Val 1140,74 C51H97N16O13
Tableau 6
Les spectres de masse obtenus pour les colistine Ei, E2 et val-colistine E2 présentent des valeurs de [M+2H] respectives de 585,39 ; 578,38 et de 571,38. La fragmentation des ions parents des colistines Ei et E2 donne des ions fils de m/z 829, 728, 628, 427, 327 et 227 (Figures 6 et 7) qui sont formés par perte de fragments d'acides aminés. La fragmentation de l'ion parent de la val-colistine E2 donne des ions fils de m/z 815, 714, 614, 514, 413, 313 et 213 (Figure 8) formés aussi par perte de fragments d'acides aminés.
Ces ions fils obtenus sont identiques à ceux décrits dans la littérature lors de la fragmentation des colistines Ei, E2 et Val-E2 (Govaerts et al., 2002; DeCrescenzo et al., 2007). Les colistines Ei et E2 ont les mêmes séquences d'acides aminés avec une différence de masse moléculaire de 14 Da qui correspond à une perte d'un CH2 au niveau de l'acide gras.
En conclusion, ces résultats montrent que la souche B-LR produit de la colistine Ei, de la colistine E2 et de la valine colistine E2 (Val-E2).
Exemple 6 : Expression hétérologue des gènes pmxA, B, et E issus de Paenibacillus chez Bacillus subtilis et détection de la colistine.
Bacillus est un hôte d'expression hétérologue phylogénétiquement proche de B-LR. Le fosmide manipulé pour héberger l'ensemble du cluster de production de la colistine est transféré dans la souche receveuse par électroporation. Les souches transformées sont sélectionnées sur milieu gélosé supplémenté en antibiotique. La production de colistine se fait en milieu liquide supplémenté en acide diaminobutyrique (précurseur de synthèse). La détection de la colistine est réalisée après séparation de la biomasse du surnageant de culture. Des extractions permettent d'isoler la colistine avant sa caractérisation en spectrométrie de masse. REFERENCES
BREVETS
US 8,329,430
WO 1998/020836
WO 2009/098357
NON-BREVETS
Sambrook et al. 'Molecular Cloning: a Laboratory ManuaV . Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York
Niu B, Vater J, Rueckert C, Blom J, Lehmann M, Ru JJ, Chen XH, Wang Q, Borriss R. "Polymyxin P is the active principle in suppressing phytopathogenic Erwinia spp. by the biocontrol rhizobacterium Paenibaciïïus polymyxa Μ-Γ . BMC Microbiol. 2013 Jun 18; 13(1): 137.
Choi SK, Park S Y, Kim R, Kim SB, Lee CH, Kim JF, Park SH - "Identification ofi a polymyxin synthetase gene cluster qf Paenibaciïïus polymyxa and heterologous expression of the gene in Bacillus subtilis" J. Bacteriol. May 2009 vol. 191 no. 10 - 3350-3358 M Shaheen, J Li, AC Ross, JC Vederas, SE Jensen - "Paenibaciïïus polymyxa PKB1 Produces Variants of Polymyxin B-Type Antibiotics" - Chemistry & biology, Volume 18, Issue 12, 23 December 2011, Pages 1640-1648
Martti Vaara, Timo Vaara - "Structure-activity studies on novel polymyxin derivatives that carry only three positive charges" - Peptides, Volume 31, Issue 12, December 2010, Pages 2318-2321
Govaerts, C, Orwa, J., Van Schepdael, A., Roets, E. & Hoogmartens, J. Characterization qf polypeptide antibiotics of the polymyxin séries by liquid chromatography electrospray ionization ion trop tandem mass spectrometry. - JPept Sci 8, 45-55. (2002a).
Govaerts, C, Orwa, J., Van Schepdael, A., Roets, E. & Hoogmartens, J. Liquid chromatography-ion trop tandem mass spectrometry for the characterization of polypeptide antibiotics of the colistin séries in commercial samples. J Chromatogr A 976, 65-78. (2002b). Hong SY, Oh JE, Lee KH. Effect of D-amino acid substitution on the stability, the secondary structure, and the activity of membrane-active peptide. Biochem Pharmacol. 1999 Dec 1 ;58(11): 1775-80.
Lee DL, Powers JP, Pflegerl K, Vasil ML, Hancock RE, Hodges RS. Effects of single D- amino acid substitutions on disruption of beta-sheet structure and hydrophobicity in cyclic 14-residue antimicrobial peptide analogs related to gramicidin S. J Pept Res. 2004 Feb;63(2):69-84.
DeCrescenzo Henriksen, D.R. Phillips and J.B. Doran Peterson. Polymyxin E production by P. amylolyticus E. Letters in Applied Microbiology, Volume 45, Issue 5, pages 491- 496, November 2007

Claims

REVENDICATIONS
1. Synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1 :
VTEAEKADLLGRFNDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRL ADLIQRERIS VMFITT AFFNILVDVNVD CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG,
les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
2. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants :
- DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ;
- DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique.
3. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence peptidique SEQ ID NO 6, et de préférence comprend la séquence peptidique SEQ ID NO 25.
4. Synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq sites d'adénylation et un site d'épimérisation, caractérisée en ce que le site d'épimérisation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 30.
5. Acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E selon l'une des revendications 1 à 3, présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
6. Groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, et des gènes codant respectivement pour les synthétase PmxB et PmxE.
7. Groupe de gènes selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC et PmxD.
8. Groupe de gènes selon la revendication 6, comprenant :
- un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés,
- un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence
SEQ ID NO 8, et
- un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9.
9. Acide nucléique de séquence SEQ ID NO 10 ou de séquence SEQ ID NO 29, comprenant un groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E.
10. Vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou un acide nucléique selon la revendication 5, et/ou un gène codant pour une synthétase PmxE selon la revendication 4.
11. Vecteur d'expression comprenant totalement ou en partie le groupe de gènes selon l'une des revendications 6 à 8 ou un acide nucléique selon la revendication 9.
12. Micro-organisme transformé par introduction d'un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou d'un gène codant pour une synthétase PmxE selon la revendication 4, ou d'un acide nucléique selon la revendication 5, ou d'un vecteur selon la revendication 10.
13. Micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes selon l'une des revendications 6 à 8, ou d'un acide nucléique selon la revendication 9, ou d'au moins un vecteur selon la revendication 11.
14. Micro-organisme transformé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le gène ou le groupe de gènes est surexprimé.
15. Micro-organisme transformé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il appartient au genre Baciïïus ou Paenibaciïïus.
16. Méthode de production de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 12 à 15 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite.
17. Méthode de production de polymyxine E selon la revendication 16, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température de 30°C, et dure au moins 25 heures.
18. Méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 12 à 15 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E.
19. Variants de la polymyxine E obtenus selon la méthode de production de la revendication 18.
20. Variants de polymyxine E selon la revendication 19, pour leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries Gram-négatives.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041037B (zh) * 2019-12-23 2022-08-23 天津大学 一种调控多粘菌素b同系物组分的方法
US11913731B2 (en) * 2021-01-08 2024-02-27 Sanisure, Inc. Process cooling rod
WO2022232245A2 (fr) * 2021-04-27 2022-11-03 The Rockefeller University Macolacines et leurs procédés d'utilisation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998020836A2 (fr) 1996-11-15 1998-05-22 Pathogenesis Corporation Colistine pure et biologiquement active, ses composants et formulation de colistine servant a traiter des infections pulmonaires
WO2009098357A1 (fr) 2008-02-08 2009-08-13 Northern Antibiotics Oy Dérivés de polymyxine à queue acide gras court et leurs utilisations
US8329430B2 (en) 2005-12-09 2012-12-11 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Polymyxin synthetase and gene cluster thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8193148B2 (en) * 2008-02-08 2012-06-05 Northern Antibiotics Ltd. Short fatty acid tail polymyxin derivatives and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998020836A2 (fr) 1996-11-15 1998-05-22 Pathogenesis Corporation Colistine pure et biologiquement active, ses composants et formulation de colistine servant a traiter des infections pulmonaires
US8329430B2 (en) 2005-12-09 2012-12-11 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Polymyxin synthetase and gene cluster thereof
WO2009098357A1 (fr) 2008-02-08 2009-08-13 Northern Antibiotics Oy Dérivés de polymyxine à queue acide gras court et leurs utilisations

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI ET AL., JOUNAL OF BACTERIOLOGY, 2009
CHOI SK; PARK SY; KIM R; KIM SB; LEE CH; KIM JF; PARK SH: "Identification of a polymyxin synthetase gene cluster of Paenibacillus polymyxa and heterologous expression of the gene in Bacillus subtilis", J. BACTERIOL., vol. 191, no. 10, May 2009 (2009-05-01), pages 3350 - 3358, XP055139000, DOI: doi:10.1128/JB.01728-08
DECRESCENZO HENRIKSEN; D.R. PHILLIPS; J.B. DORAN PETERSON: "Polymyxin E production by P. amylolyticus E", LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 45, no. 5, November 2007 (2007-11-01), pages 491 - 496
GOVAERTS, C.; ORWA, J.; VAN SCHEPDAEL, A.; ROETS, E.; HOOGMARTENS, J.: "Characterization of polypeptide antibiotics of the polymyxin series by liquid chromatography electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry.", JPEPT SCI, vol. 8, 2002, pages 45 - 55
GOVAERTS, C.; ORWA, J.; VAN SCHEPDAEL, A.; ROETS, E.; HOOGMARTENS, J.: "Liquid chromatography-ion trap tandem mass spectrometry for the characterization of polypeptide antibiotics of the colistin series in commercial samples", J CHROMATOGR A, vol. 976, 2002, pages 65 - 78, XP004388773, DOI: doi:10.1016/S0021-9673(02)00375-8
HONG SY; OH JE; LEE KH: "Effect of D-amino acid substitution on the stability, the secondary structure, and the activity of membrane-active peptide", BIOCHEM PHARMACOL., vol. 58, no. 11, 1 December 1999 (1999-12-01), pages 1775 - 80, XP055155981, DOI: doi:10.1016/S0006-2952(99)00259-2
LEE DL; POWERS JP; PFLEGERL K; VASIL ML; HANCOCK RE; HODGES RS: "Effects of single D-amino acid substitutions on disruption of beta-sheet structure and hydrophobicity in cyclic 14-residue antimicrobial peptide analogs related to gramicidin S", J PEPT RES., vol. 63, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 69 - 84
M SHAHEEN; J LI; AC ROSS; JC VEDERAS; SE JENSEN: "Paenibacillus polymyxa PKBI Produces Variants of Polymyxin B-Type Antibiotics", CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 18, no. 12, 23 December 2011 (2011-12-23), pages 1640 - 1648
MARTTI VAARA; TIMO VAARA: "Structure-activity studies on novel polymyxin derivatives that carry only three positive charges", PEPTIDES, vol. 31, no. 12, December 2010 (2010-12-01), pages 2318 - 2321, XP027451708, DOI: doi:10.1016/j.peptides.2010.09.010
NIU B; VATER J; RUECKERT C; BLOM J; LEHMANN M; RU JJ; CHEN XH; WANG Q; BORRISS R.: "Polymyxin P is the active principle in suppressing phytopathogenic Erwinia spp. by the biocontrol rhizobacterium Paenibacillus polymyxa M-1", BMC MICROBIOL., vol. 13, no. 1, 18 June 2013 (2013-06-18), pages 137, XP021154551, DOI: doi:10.1186/1471-2180-13-137
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: a Laboratory Manual'", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB.
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