CA2944826A1 - Synthetases de la colistine et cluster de genes correspondants - Google Patents

Abstract

Synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1: VTEAEKADLLGRFNDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.

Description

Synthétases de la colistine et cluster de gènes correspondants La présente invention concerne des gènes et enzymes bactériennes impliqués dans la synthèse de polymyxine E, une molécule antibiotique utilisée en thérapie contre les infections à bactéries Gram-négatives.
ART ANTERIEUR
Les polymyxines sont des molécules antibiotiques isolées à partir de Bacillus species ou de Paenibacillus species. Ces molécules sont des lipopeptides, constitués :
- d'une chaine peptidique comprenant dix acides aminés, organisés en un heptapeptide cyclique et une chaine latérale de trois acides aminés, et - d'un acide gras fixé à l'extrémité N-terminale du peptide.
Au moins 16 types de polymyxines ont été identifiés depuis la découverte de la polymyxine B en 1947. Parmi elles, les polymyxines B et E ont une activité
antimicrobienne sur la plupart des souches d'Escherichia cou i et de Pseudomonas aeruginosa, ainsi que sur toutes les souches de Salmonelles, Shigelles, et de nombreuses bactéries Gram-négatives. Ces antibiotiques ont donc été utilisés comme agents thérapeutiques dans de nombreux cas. Malheureusement, leurs effets toxiques sont tels qu'ils ont été peu à peu remplacés par des antibiotiques mieux tolérés.
La figure 3 montre la structure générale des polymyxines, et les deux acides aminés spécifiques sont indiqués X et Y. Comme indiqué, la polymyxine B et E
diffèrent par un seul acide aminé, le résidu 'X' étant une phenylalanine pour la polymyxine B et une leucine pour la polymyxine E, le résidu 'Y' pouvant être une leucine, isoleucine ou valine.
En raison de la demande croissante de nouveaux antibiotiques pour lesquels il n'existe pas encore de résistance dans la population, de nouveaux agents antibiotiques sont recherchés, et les polymyxines sont de nouveau utilisées en clinique dans la lutte contre les bactéries Gram-négatives multi-résistantes.
La colistine ou polymyxine E, identifiée sous le numéro CAS 1264-72-8, et telle que décrite dans la demande de brevet WO 1998/020836, est un antibiotique de la famille des polymyxines, permettant de traiter les infections dues aux bactéries Gram-

2 négatives multi-résistantes. Sa structure peptidique est indiquée en figure 1.
Administrée par voie injectable, la colistine est utilisée dans la prise en charge des infections neuro-méningées, des infections urinaires, des infections urogénitales, des septicémies et des surinfections de plaies, brûlures et ulcères. Administrée par inhalation, la colistine est utilisée dans la prise en charge d'infections pulmonaires, notamment celles liées à la mucoviscidose. Enfin, en association avec de l'hydrocortisone et de la bacitracine, la colistine est utilisée pour traiter les infections bactériennes et inflammatoires de l'oeil, ainsi que les infections en chirurgie ophtalmique.
La colistine est responsable de nombreux effets indésirables, notamment des effets néphrotoxiques et neurotoxiques. Ces effets toxiques sont imputables au caractère cationique de cette molécule, qui contient cinq charges positives, mais également au faible degré de pureté de la molécule, produite en fermenteur par culture de la souche originelle bactérienne la synthétisant, et purifiée à partir du milieu de fermentation.
En effet, les polymyxines sont actuellement obtenues par isolement et purification à partir de milieux de culture de souches bactériennes produisant ces molécules, notamment des souches de Paenibacillus polymyxa. La purification de la molécule à partir des milieux de fermentation est insatisfaisante, et c'est pourquoi de nouvelles techniques de production sont envisagées. Notamment, des travaux sont menés pour identifier et cloner les gènes codant pour les polymyxines synthétases.
Les polymyxines synthétases font partie de la famille des Non-Ribosomal Peptide Synthétases (NRPS) ; les gènes codant pour ces synthétases sont organisés en cluster comprenant plusieurs modules, dont l'ordre et la spécificité
déterminent la structure du produit peptidique. Les NRPS permettent la synthèse de peptides présentant une variété structurale plus large que celle qui pourrait être obtenue si ces peptides étaient traduits à partir d'ARN messager par des ribosomes. De plus, les peptides ainsi produits peuvent subir des modifications notamment par la création de liaisons avec des acides hydroxyles, et des oxydations dans la chaine peptidique permettant d'obtenir des structures cycliques ainsi que des acylations, des glycosylations, et une N-méthylation des résidus.
De tels complexes NRPS ont été décrits chez de nombreux micro-organismes et sont impliqués dans la production de la tyrocidine, la gramicidine, la vancomycine, la pénicilline, et les fusaricidines.

3 PCT/1B2015/050571 Les synthétases NRPS sont constituées de différents modules. Chaque module est capable d'activer un acide aminé, éventuellement de le modifier et de le transférer ensuite sur l'acide aminé activé dans le module adjacent pour constituer un peptide.
Chaque module est composé de plusieurs domaines et permet l'incorporation d'un acide aminé particulier dans le peptide en cours d'élongation. Chaque module contient au minimum 3 domaines :
= un domaine d'adénylation (A) : domaine central dans l'action des peptides synthétases. Il permet la fixation d'un acide aminé spécifique et son activation grâce à une réaction d'adénylation de ce dernier (transformation de l'acide aminé en aminoacyl adénylé) ;
= un domaine de thiolation (T ou PCP pour Peptidyl Carrier Protein) :
permet au peptide en cours de synthèse de rester fixé à la synthétase tout au long du processus d'élongation via une liaison thioester ;
= un domaine de condensation (C) : permet la formation de la liaison peptidique entre deux acides aminés de modules adjacents.
La libération du peptide est induite par un domaine spécifique, le domaine Te (thioestérase). Ce domaine va couper la liaison thioester qui relie le peptide synthétisé au dernier domaine T. Ce domaine permet également la cyclisation de certains peptides.
Il existe aussi des domaines secondaires facultatifs qui permettent d'effectuer des modifications au niveau des acides aminés comme l'épimérisation (transformation d'un acide aminé de la série L en isomère de la série D), la méthylation (ajout d'un groupement méthyle) ou encore la formylation (ajout d'un groupement formyle).
Dans le cas des polymyxines, et comme indiqué en figure 2, trois synthétases sont essentielles à la synthèse de la chaine peptidique :
- le module PmxA possède quatre domaines d'adenylation, organisés de façon tridimensionnelle en binding pocket ou poches de liaison spécifique qui intègrent chacune un acide aminé spécifique dans la molécule de polymyxine ;
- le module PmxB possède un domaine d'adenylation, et est responsable de l'intégration d'un seul acide aminé ;
- le module PmxE possède cinq domaines d'adenylation qui intègrent les cinq autres acides aminés composants la chaine peptidique de la polymyxine.

4 L'article de Choi et al. (Jounal of Bacteriology, 2009) ainsi que le brevet US 8,329,430 décrivent l'isolement d'un cluster (groupe) de gènes de la souche Gram-positive Paenibacillus polymyxa E681 sécrétant de la polymyxine A. Cinq gènes constituent ce cluster : pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE. Les gènes pmxC et pmxD
codent pour des protéines de transport, alors que les trois autres gènes pmxA, pmxB et pmxE codent pour des synthétases. Ceci est en particulier démontré par une souche mutante ayant subi une mutation par insertion dans le gène pmxE: cette souche ne produit plus de polymyxine. Inversement, une souche de Bacillus subtilis transformée par l'introduction de ce cluster de gènes devient capable de produire de la polymyxine A, mais seulement en présence d'acide L-2,4-diaminobutyrique (Dab, résidu majoritaire de la chaine peptidique de la polymyxine).
Dans les polymyxines décrites dans la littérature, il est très rare d'observer la présence de résidus D-Dab, sauf pour les polymyxines A, C et P.
Shaheen et al. (Chemistry and Biology, 2011) ont décrit l'identification et le séquençage d'un cluster de gènes issu de la souche Paenibacillus polymyxa PKB1.
L'implication de ces gènes dans la biosynthèse de la polymyxine B est démontrée par mutation insertionnelle dans le gène pmxE: la souche mutée ne produit plus de polymyxine. Lors de la caractérisation du cluster, Shaheen et al. ont identifié un domaine d'épimérisation dans le troisième module du cluster pmx. Ceci suggère l'intégration d'un D-Dab en position 3. Ainsi, ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse de variants de la polymyxine B, comprenant en position 3 non pas un résidu D-2,4-diaminobutyrate mais son énantiomère le L-2,4-diaminobutyrate.
D'autres clusters de gènes issus de souches de Paenibacillus polymyxa ont été
isolés, mais leurs fonctions et spécificités sont uniquement prédictives et en aucun cas démontrées de manière fonctionnelle.
Par ailleurs, des molécules variantes présentant de légères différences structurelles avec les polymyxines connues, et des effets toxiques amoindris, ont été
rapportées. Ainsi, la demande de brevet WO 2009/098357 ainsi que l'article de Vaara and Vaara (Peptides, 2010) décrivent des variants de polymyxine B ne comprenant que trois charges positives et présentant des effets toxiques diminués. Des variants de polymyxine B ont également été décrits dans l'article de Shaheen et al. (2011).

La technique actuellement utilisée pour produire la colistine, basée sur la fermentation de souches bactériennes productrices en milieux riches n'est pas satisfaisante, notamment en termes de pureté de la molécule, qui doit être purifiée à partir du milieu de fermentation.

5 L'identification des gènes impliqués dans la synthèse de la colistine permettrait, par des procédés de génie génétique, de produire une molécule de polymyxine E plus pure, et également de créer des molécules synthétiques dérivées, présentant moins d'effets secondaires néfastes et/ou une meilleure activité.
RESU1VIE DE L'INVENTION
La présente invention décrit l'isolement d'un cluster de gènes issu d'une souche de Paenibacillus alvei isolée de l'environnement, produisant de la polymyxine E, et leurs utilisations.
La présente invention est relative à une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre domaines d' adénylation, caractérisée en ce que le second domaine d'adénylation comprend ou présente une séquence peptidique particulière représentée en SEQ ID NO 1, cette séquence formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
La présente invention est aussi relative à une synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq domaines d' adénylation et un domaine d' épimérisation.
La présente demande est également relative à un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour la synthétase PmxA, des gènes codant pour les synthétases PmxB et PmxE, et des gènes codant pour les protéines de transport PmxC et PmxD.
La présente invention concerne également des micro-organismes transformés exprimant au moins les gènes pmxA, pmxB et pmxE, modifiés ou non, lesdits micro-organismes transformés produisant de la polymyxine E ou des molécules variantes de cette polymyxine.
FIGURES
Figure 1. Structure peptidique de la polymyxine E

6 Figure 2. Structure du cluster NRPS impliqué dans la synthèse de polymyxine E.
Figure 3. Structures chimiques des différentes polymyxine B et E d'après Govaerts et collaborateurs (Govaerts et al., 2002a; Govaerts et al., 2002b).
Figure 4. Effet antimicrobien de 20 !al du surnageant de culture de la bactérie B-LR et du mutant 5 sur un tapis bactérien de P. aeruginosa.
Figure 5. Séquence peptidique PmxA ; en gras : séquences des domaines d'adénylation ; en gras et souligné : motifs spécifiques des binding pockets .
Figure 6. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 585,39). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant :
colistine El. AG: acide gras (C9H170) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ;
Thr :
Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série, ceux entourés de ronds correspondent aux ions produits en seconde série.
Figure 7. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 578,38). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant colistine E2. AG: acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ;
Thr :
Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série.
Figure 8. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion précurseur dichargé (m/z 571,38). (B) Structure proposée pour le peptide correspondant Val-E2. AG: acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ; Thr :

Thréonine ; Ile : Isoleucine ; Leu : Leucine ; Val : Valine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux ions produits en première série, ceux entourés de ronds correspondent aux ions produits en seconde série.
DESCRIPTION DETAILLEE
Polypeptides et polynucléotides L'invention est relative à l'isolement et l'identification de nouveaux gènes codant pour des polymyxines E synthétases, en particulier d'un gène codant pour la synthétase PmxA présentant un site d'adénylation particulier, formant une poche de

7 liaison spécifique permettant l'intégration dans la molécule de polymyxine d'un résidu leucine ou isoleucine.
Tous les termes techniques employés dans la présente demande sont bien connus de l'homme du métier et sont définis dans l'ouvrage de référence Sambrook et al.
Molecular Cloning: a Laboratory Manual .
Le terme polynucleotide désigne une chaine de nucléotides liés par covalence. Au sens de l'invention, ce terme désigne des acides nucléiques tels que l'acide ribonucléique (ARN) et l'acide désoxyribonucléique (ADN).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW
LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ;
(10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ;
(12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS =
default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES =

8 default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES =
hide .
Le terme polypeptide désigne une chaine d'acides aminés liés de façon covalente.
Le terme polymyxine E synthétases désigne les enzymes capables d'intégrer un acide aminé spécifique dans la chaine d'acides aminés formant la polymyxine E, et le cas échéant de transformer l'acide aminé pour former une structure cyclique.
Le terme site d'adénylation ou domaine d'adénylation désigne, dans la molécule de polymyxine synthétase, le domaine qui joue un rôle dans le choix et l'activation de l'acide aminé, tandis que le domaine de condensation catalyse la formation d'une liaison peptidique et que le domaine de thiolation est responsable du transport des composés en formation entre les modules.
Le terme site d' épimérisation désigne dans une synthétase un domaine permettant de convertir un résidu présentant une chiralité levogyre en son énantiomère de chiralité dextrogyre 'D', en particulier un résidu L-acide cc,y-diaminobutyrique (L-Dab) en résidu D-acide cc,y-diaminobutyrique (D-Dab).
Le terme poche de liaison désigne une zone de la protéine présentant une structure tridimensionnelle de poche , dans laquelle des interactions de haute spécificité
avec un substrat ou, dans le cas présent, un acide aminé, permettront de sélectionner et d'activer cet acide aminé.
L'expression les acides aminés soulignés étant conservés signifie que, même si de légères variations de séquences peuvent être observées entre deux protéines présentant la même activité catalytique, les acides aminés indiqués sont essentiels à la spécificité et à l'activité de cette protéine et ne peuvent donc pas être modifiés, sous peine de perdre ou diminuer la spécificité et/ou l'activité de cette protéine.
La présente invention concerne une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90 % d'identité avec la séquence peptidique suivante :
VTEAEKADLLGRENDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE
LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI

9 DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI
EATDLACVIYT SGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLS S Y SFDG
ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD
CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE
LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF
VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV
EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE
RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG (SEQ ID NO 1), les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d' adénylation de PmxA présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %
d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d' adénylation de PmxA présente une séquence peptidique comprenant ou consistant en la séquence peptidique SEQ ID NO 27, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants :
- DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ;
- DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine isoleucine ou valine;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique.
Il est bien entendu que ces séquences SEQ ID NO 2, 3, 4 et 5 regroupent les acides aminés essentiels formant une poche de liaison fonctionnelle en structure tridimensionnelle, mais ne sont pas des acides aminés consécutifs dans une séquence peptidique.

Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6, et montrée en figure 5, les domaines d'adénylation étant indiqués en gras, les acides aminés formant la poche de liaison étant soulignés. En particulier cette séquence pourra comprendre, en plus de la séquence 5 présentée en SEQ ID NO 6, des acides aminés supplémentaires aux extrémités N- et C-terminales.
Selon un aspect particulier, la séquence polypeptidique de la synthétase PmxA
consiste en la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6.
Selon un autre aspect de l'invention, la synthétase PmxA présente une

10 séquence qui comprend, ou consiste en, la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID
NO 25.
La synthétase PmxA présente quatre sites d' adénylation aux positions suivantes :
- du résidu 234L au résidu 751Y;
- du résidu 1741V au résidu 2263G;
- du résidu 2815P au résidu 3345T;
- du résidu 3900E au résidu 4428G.
Il est entendu que ces positions sont définies en fonction d'une séquence peptidique particulière, ici selon la SEQ ID NO 6 comprenant 4967 acides aminés, et peuvent être redéfinies pour des séquences de plus grande taille.
Notamment lorsque la synthétase PmxA présente une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO 25, les quatre sites d' adénylation se trouvent aux positions suivantes :
- du résidu 265L au résidu 782Y;
- du résidu 1772V au résidu 2294G;
- du résidu 2846P au résidu 3376T;
- du résidu 3931E au résidu 4459G.
La présente invention est également relative à une synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq sites d' adénylation et un site d'épimérisation, caractérisée en ce que le site d' épimérisation présente au moins 90 %
d'identité avec la séquence peptidique telle que présentée en SEQ ID NO 30.

11 Selon un aspect particulier de l'invention, la séquence peptidique de la synthétase PmxE comprend ou consiste en la séquence représentée en séquence SEQ ID
NO 14.
Cette synthétase est responsable de l'intégration des résidus n 1 à 5 (voir figure 1 pour la numérotation) dans la chaine peptidique de la molécule de polymyxine E.
Cette synthétase présente la caractéristique fonctionnelle de pouvoir convertir le résidu L-Dab en son stéréoisomère D-Dab, et d'incorporer ledit stéréoisomère à la position 3 dans une chaine peptidique de polymyxine E. Une telle molécule variante de polymyxine pourrait présenter des propriétés antimicrobiennes améliorées, comme cela a été proposé
dans la littérature (Hong SY et al., 199 ; Lee DL et al., 2004).
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E, présentant au moins 90% d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ
ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO
7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK
de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
L'expression les nucléotides [...] sont conservés indiquent que ces nucléotides codant pour les acides aminés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO

doivent être soit identiques à ceux observés dans la même position dans la séquence SEQ
ID NO 7, soit différents mais sous réserve que les codons formés par ces nucléotides codent pour les acides aminés DGFFLGVVYK soulignés dans la séquence SEQ ID NO
1.
En effet et comme indiqué ci-dessus, ces acides aminés sont essentiels à la spécificité et à l'activité de cette synthétase et ne peuvent donc pas être modifiés, sous peine de perdre ou de diminuer la spécificité de cette poche de liaison.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E comprend une séquence nucléotidique codant pour le second site d'adénylation de cette synthétase PmxA, consistant en la séquence nucléotidique présentée en SEQ ID NO 28. Cette

12 séquence code pour la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 27 ainsi que pour la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 1 qui présente deux acides aminés de moins que SEQ ID NO 27 à l'extrémité C-terminale du domaine.
La présente invention concerne également un groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant notamment :
- un gène codant pour la synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et - des gènes codant respectivement pour les synthétases PmxB et PmxE.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend le gène pmxE codant pour une synthétase PmxE comprenant un domaine d' épimérisation dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence représentée en SEQ ID
NO 30.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC
et PmxD. Les séquences des protéines PmxC et PmxD isolées de la souche de Paenibacillus alvei sont montrées en séquences SEQ ID NO 12 et NO 13, respectivement.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés, - un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
8, et - un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 9.
Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
7, sous réserve que la portion d'acide nucléique codant les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK soit conservéeõ
- un gène pmxB présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 8, et - un gène pmxE présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
9.

13 PCT/1B2015/050571 Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 7, et en particulier comprenant une séquence nucléotidique telle que présentée en SEQ ID NO 26, - un gène pmxB comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 9.
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence SEQ ID NO 10, ou une séquence SEQ ID NO 29, représentant la séquence complète du cluster issu de la souche de Paenibacillus alvei, comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE impliqués dans la synthèse de polymyxine E.
Le tableau 1 ci-dessous présente les différentes séquences d'acides nucléiques et protéiques référencées dans la présente demande :
Numéro de Type Taille Définition séquence SEQ ID NO 1 Protéine 523 Séquence peptidique du second site acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue aminés d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO 2 Protéine 10 acides Binding pocket du l' domaine d'adenylation de aminés PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine SEQ ID NO 3 Protéine 10 acides Binding pocket du 2' domaine d'adenylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine SEQ ID NO 4 Protéine 10 acides Binding pocket du 3ème domaine d'adenylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique

14 SEQ ID NO 5 Protéine 10 acides Binding pocket du 4ème domaine d'adenylation aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche de liaison spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique SEQ ID NO 6 Protéine 4967 Séquence peptidique complète d'une synthétase acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus aminés alvei ; voir également figure 5 SEQ ID NO 7 ADN 14901 Séquence codante pour la synthétase PmxA
paires de présentant la séquence SEQ ID NO 6 bases SEQ ID NO 8 ADN 3306 Séquence codante pour la synthétase PmxB
paires de issue de Paenibacillus alvei bases SEQ ID NO 9 ADN 18876 Séquence codante pour la synthétase PmxE
paires de issue de Paenibacillus alvei, présentant la bases séquence SEQ ID NO 31 SEQ ID NO ADN 41169 Séquence codant pour un cluster complet paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, bases pmxD, et pmxE issu de Paenibacillus alvei SEQ ID NO Protéine 1102 Séquence peptidique de la synthétase PmxB
11 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei aminés SEQ ID NO Protéine 608 Séquence peptidique de la protéine PmxC issue 12 acides d'une souche de Paenibacillus alvei aminés SEQ ID NO Protéine 577 Séquence peptidique de la protéine PmxD issue 13 acides d'une souche de Paenibacillus alvei aminés SEQ ID NO Protéine 6292 Séquence peptidique de la synthétase PmxE
14 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei aminés SEQ ID NO ADN 20 paires Sequences artificielles - oligonucléotides (voir

15-24 bases tableau 2) SEQ ID NO Protéine 4999 Séquence peptidique complète d'une synthétase 25 acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus aminés alvei ;

SEQ ID NO ADN 14997 Séquence codante pour la synthétase PmxA
26 paires de présentant la séquence SEQ ID NO 25 bases SEQ ID NO Protéine 525 Séquence peptidique du second site 27 acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue aminés d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO ADN 1575 Séquence codante pour le 2' domaine 28 paires de d'adenylation de PmxA, présentant la séquence bases SEQ ID NO 27 SEQ ID NO ADN 41172 Séquence codant pour un cluster complet 29 paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, bases pmxD, et pmxE issus de Paenibacillus alvei SEQ ID NO Protéine 461 Séquence du domaine d' épimérisation de la 30 synthétase PmxE issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO Protéine 431 Séquence peptidique complète de l'enzyme 31 permettant la biosynthèse de Dab, issue d'une souche de Paenibacillus alvei SEQ ID NO ADN 1293 Séquence codant pour l'enzyme présentant la 32 paires de séquence SEQ ID NO 31, issue de bases Paenibacillus alvei Vecteurs d'expression La présente invention est également relative à un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, ou un 5 acide nucléique codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et/ou un gène codant pour une synthétase PmxE tel que défini ci-dessus.
Dans le cadre de l'invention, les termes vecteur , vecteur d'expression et plasmide sont équivalents et sont utilisés conformément à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie moléculaire, du génie génétique et de la microbiologie.
Très 10 brièvement, il s'agit d'une molécule d'ADN, non virale, hébergée par une cellule hôte, distincte de l'ADN chromosomique naturel de ladite cellule hôte et capable de réplication autonome. Un vecteur est obtenu par des techniques classiques de biologie moléculaire et génie génétique, et dans lequel une ou plusieurs séquences nucléotidiques exogènes ont

16 été insérées (ou clonées). La présente invention concerne un vecteur pour l'expression, par une cellule hôte, de séquences nucléotidiques exogènes, comprenant :
- une origine de réplication, - des éléments permettant l'expression des gènes introduits, tels qu'un promoteur approprié, des enhancers...
- au moins une séquence nucléotidique dont l'expression est souhaitée.
Le choix du vecteur et, plus particulièrement, de l'origine de réplication qu'il porte dépend de la cellule hôte qui l'hébergera. En fonction du type de cellules hôtes, plusieurs copies d'un vecteur et/ou plusieurs vecteurs différents peuvent être introduits dans la même cellule hôte, simultanément ou séquentiellement.
Le choix du vecteur dépendra également de la taille de la séquence d'acide nucléique à exprimer. En particulier, pour des séquences supérieures à 20 kilo-paires de bases, les fosmides, vecteurs capables de contenir de grandes séquences d'acides nucléiques (jusqu'à 40 kilo-paires de bases), seront préférés. Il est également possible d'utiliser plusieurs vecteurs comprenant chacun une portion d'un ensemble de gènes, et de transférer plusieurs vecteurs dans une même cellule hôte, ceci permettant d'exprimer tout un ensemble de gènes dans une même souche.
D'autres vecteurs pouvant contenir des séquences de grandes tailles sont les cosmides et les chromosomes bactériens artificiels (BAC).
Selon un aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un groupe de gènes tel que défini ci-dessus.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend totalement ou en partie un acide nucléique tel que défini ci-dessus, notamment comprenant la séquence présentée en SEQ ID NO 10 ou en SEQ ID NO 29. De manière préféré, le vecteur d'expression est un fosmide comprenant la totalité de la séquence d'ADN codant pour le cluster complet comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, et pmxE
issu de Paenibacillus alvei, présentant la séquence SEQ ID NO 10.
Autres enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine D'autres enzymes sont impliquées dans la synthèse de polymyxine, notamment de la polymyxine E. Il s'agit des enzymes permettant la biosynthèse du résidu

17 Dab, ce résidu étant le résidu majoritairement intégré dans la chaine peptidique de la polymyxine E, et des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la partie peptidique.
Une enzyme de biosynthèse du résidu acide a,y-diaminobutyrique (Dab) a été
identifiée et isolée à partir de la souche bactérienne de Paenibacillus alvei décrite dans les exemples. En particulier, la séquence peptidique de cette enzyme comprend ou consiste en la séquence peptidique présentée en séquence SEQ ID NO 31. L'acide nucléique codant pour cette enzyme comprend ou consiste en la séquence nucléotidique présentée en séquence SEQ ID NO 32.
De manière préférée, cette enzyme à activité transaminase peut être exprimée dans un micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison avec les synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules de transport PmxC et PmxD.
Cette transaminase comprenant 431 résidus présente une homologie de séquence avec des enzymes présentant des fonctions similaires, issues d'autres microorganismes, comme cela est montré dans le tableau 2 suivant :
Numéro Longueur (AA) identité Fonction Micro-d'accession avec séquence organisme issue de B-LR d'origine (SEQ ID NO
31) CP000154.1 420 73 Diaminobutyrate- P. polymyxa -2-oxoglutarate E681 transaminase EJW20319.1 389 89 Diaminobutyrate- P. alvei DSM
-2-oxoglutarate 29 transaminase EctB
Yi? 005959913.1 420 74 diaminobutyrate- P. polymyxa 2-oxoglutarate M1 transaminase EGG38373 .1 430 50 diaminobutyrate- P. sp. HGF5 -2-oxoglutarate transaminase [
EGL19185.1 434 65 diaminobutyrate- P. sp. HGF7 -2-oxoglutarate transaminase [Paenibacillus sp.

18 ABX39524. 1 429 50 diaminobutyrate- Halobacillus 2-oxoglutarate halophilus transaminase DSM

Tableau 2 Des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la chaine peptidique de la polymyxine E, enzymes présentant donc une activité acyl-transférase, ont également été
identifiées et isolées à partir de la souche bactérienne de Paenibacillus alvei décrite ci-dessus.
De manière préférée, au moins une acyl-transférase sera exprimée dans un micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison avec les synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules de transport PmxC et PmxD, et de manière plus préférée avec également une enzyme de biosynthèse du résidu acide a,y-diaminobutyrique (Dab).
Alternativement, la liaison de l'acide gras sur la chaine peptidique de la polymyxine E pourra également être réalisée par couplage chimique, selon l'une des techniques bien connues de l'Homme du métier.
Cellules hôtes Le terme cellule hôte ou micro-organisme hôte est utilisé dans le cadre de la présente invention pour désigner une cellule ayant été transformée, c'est-à-dire dans laquelle de l'ADN exogène a été introduit, cet ADN exogène étant notamment sous la forme d'un vecteur d'expression comprenant une séquence d'intérêt, qui sera exprimée grâce à la machinerie cellulaire de la cellule hôte, capable de synthétiser à
partir de l'ADN
exogène les ARNs messagers et les protéines correspondants à cet ADN.
La présente demande concerne en particulier un micro-organisme transformé
par introduction d'un gène ou groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un ou de plusieurs vecteurs d'expression tel que présentés ci-dessus.
L'invention est notamment relative à un micro-organisme transformé par introduction :
- d'un gène codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, ou - d'un gène codant pour une synthétase PmxE telle que définie ci-dessus, ou

19 - d'un vecteur d'expression comprenant une séquence ADN codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, notamment la séquence telle que présentée en SEQ ID NO 7 ou en SEQ ID NO 26.
L'invention porte également sur un micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un acide nucléique codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus, ou d'au moins un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus.
Selon un aspect particulier de l'invention, le micro-organisme est de plus transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du résidu Dab, et notamment un acide nucléique comprenant une séquence comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 32.
Selon un autre aspect de l'invention, le micro-organisme est de plus transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme à
activité acyl-transférase, catalysant la liaison d'un acide gras sur la chaine peptidique de la polymyxine E.
La transformation de micro-organismes est une technique couramment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant d'introduire de l'ADN exogène dans le micro-organisme. Diverses techniques permettent la transformation d'un micro-organisme, et notamment d'une bactérie compétente, et sont toutes bien connues de l'homme du métier. On peut en particulier citer l'électroporation, et l'utilisation de chlorure de calcium suivi d'un choc thermique.
Dans un aspect préféré de l'invention, dans le micro-organisme transformé, le gène ou le groupe de gènes introduit est surexprimé.
La surexpression d'un gène peut se définir par une expression augmentée de ce gène, c'est-à-dire une plus grande production d'ARN messager et de protéine codée par ce gène, dans la cellule. L'expression de la protéine sera notamment augmentée de 50 %, de 100 %, de 150 %, de 200 %, voire de 300 % par rapport au taux d'expression endogène observé dans une bactérie exprimant ce gène de façon naturelle, avant toute transformation.
La surexpression d'un gène peut être obtenue de plusieurs façons, toutes bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier : l'utilisation de promoteurs forts pour contrôler le niveau d'expression des gènes et l'augmentation du nombre de copies du gène dans la cellule. De préférence, le vecteur utilisé comprendra un promoteur fort sous le contrôle duquel sera inséré le gène, et ledit vecteur sera présent en un nombre important de copies, notamment 10, 20, 50 ou 100 copies dans la cellule hôte.

L'homme du métier saura choisir le micro-organisme hôte le plus adapté pour l'expression d'un vecteur comportant le ou les gènes selon l'invention. En particulier, les bactéries Gram-positives seront préférées. Un micro-organisme particulièrement adapté
est une bactérie appartenant au genre des Bacillus ou Paenibacillus. Les espèces B.
subtilis et Paenibacillus polymyxa sont particulièrement adaptées pour l'expression des polymyxines synthétases et à la production de polymyxine E. Les souches du genre Paenibacillus, et notamment de Paenibacillus alvei, et plus particulièrement la souche Paenibacillus alvei isolée dans l'environnement par les inventeurs, peuvent également être utilisées comme micro-organisme hôte pour être transformées avec le vecteur ou l'acide nucléique tels que définis ci-dessus. Enfin, des bactéries synthétiques peuvent également 15 être utilisées dans le cadre de la présente invention, comme cellules hôtes.
Méthode de production de polymyxine E
La présente demande est également relative à une méthode de production de polymyxine E, comprenant :

20 - la mise en culture d'un micro-organisme transformé tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et - la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite.
Le terme milieu minéral approprié désigne un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes, et comprenant notamment des sels minéraux et des nutriments. Un milieu préféré présente la composition spécifique suivante :

anhydre 0,45 % (p/v), K2HPO4, 3H20 1,13 % (p/v), (NH4)2SO4 0,6 % (p/v), glucose 0,6 %
(p/v), thiamine 0,001 %o (p/v), MgSO4, 7H20 0,02 % (p/v). Ce milieu peut comprendre également, le cas échéant, un précurseur nécessaire à la synthèse de polymyxine, en particulier l'acide diaminobutyrique.
Selon un aspect préféré de l'invention, la culture est effectuée à une température de 30 C, et dure au moins 25 heures.

21 De préférence, la culture a lieu dans 200 ml de milieu minéral dans des flasques de 1 L, sous agitation, pendant 30 h à 30 C.
La présente invention concerne également une méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme tel que défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et la purification à
partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E.
La présente invention est également relative à des variants de la polymyxine E

obtenus selon la méthode de production telle que décrite ci-dessus.
Les variants de polymyxine E désignent des molécules dérivées de la structure de la polymyxine E (voir figure 1) et qui peuvent par exemple présenter un ou plusieurs acides aminés différents, sans pour autant être classifiés comme appartenant à un autre type de polymyxine.
En particulier, les types de molécules détectées dans le milieu de culture de la souche de Paenibacillus alvei BL-R sont des variants de polymyxine E qui présentent la différence structurelle suivante : le résidu en position 3 peut être un résidu D-Dab en lieu et place d'un résidu L-Dab observé dans la structure classique de la polymyxine E.
Les formes variantes peuvent être naturelles ou synthétiques. Par variants naturels on entend des variants synthétisés par des micro-organismes non transformés ;
par variants synthétiques on entend des formes variantes synthétisées par des micro-organismes transformés, qui n'ont pas été identifiées à l'état naturel.
En particulier, les polymyxines synthétases codées par les gènes pmxA, pmxB
et pmxE pourront être modifiées pour devenir spécifiques de la fixation de certains acides aminés entrant dans la composition de la polymyxine E, afin de synthétiser des variants de polymyxine E présentant moins de charges cationiques et étant donc moins toxiques pour l'organisme humain.
Ces variants de polymyxine E présentent des avantages et notamment une plus faible toxicité que la polymyxine E.
Par ailleurs, l'utilisation clinique de différents variants de polymyxine E
permet de diminuer l'apparition de résistance aux antibiotiques.
Il est probable que, pour les variants comprenant des résidus D-Dab à la place de résidus L-Dab, l'activité antimicrobienne de ces molécules soit augmentée par rapport aux propriétés antimicrobiennes observées avec les polymyxines classiques.

22 La présente invention est relative à ces variants, ainsi qu'à leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries gram négatives.
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention revendiquée mais ne sont pas limitatifs.

23 EXEMPLES
Exemple 1. Isolement et séquençage du système génétique de production de la colistine.
Un micro-organisme (B-LR) producteur de colistine (polymyxines El et E2), appartenant à l'espèce Paenibacillus alvei, a été isolé de l'environnement et cultivé. Une banque d'ADN génomique a été construite dans Escherichia cou en utilisant des vecteurs fosmidiques (900 clones). La recherche des gènes codants pour les enzymes synthétisant la colistine a été effectuée par PCR dégénérées. Les amorces utilisées ont été
définies dans le but d'amplifier les domaines spécialisés dans l'intégration de l'acide diaminobutyrique (Dab), acide aminé le plus représenté dans la structure de la colistine (6 acides aminés/12).
Trois clones d'intérêts ont été sélectionnés et séquences (Roche GS FLX). Les séquences obtenues ont pu être assemblées sur 50 kb. Les cadres ouverts de lecture ont été
recherchés. Cinq d'entre eux nommés A, B, C, D et E décrivent un cluster d'environ 41 kb avec A (14.9 kb), B (3.3 kb), C (1.8 kb), D (1.7 kb) et E (18.9 kb) qui est représenté en figure 2.
Par homologie de séquences les gènes A, B et E ont été identifiés comme codant pour des synthétases. Une étude in silico a permis de prédire l'implication de ces synthétases dans l'assemblage de la colistine (http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ et http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/). Les gènes C et D pourraient quant à eux être impliqués dans l'export et la résistance du micro-organisme producteur vis à
vis de la colistine.
Tableau 3 : Amorces permettant d'amplifier les gènes d'intérêt du cluster colistine de B-LR
A (F)ATGGCTTTTGAAAAAGAAAC
(R)GAACGCAAATTCGATCGTAT
B (F)ATGAAATCTTTATTTGAAAA
(R)GCTTCCATGCAGTACCCCGG
E (F)ATGGAAATTATGAATCCGGG
(R)GAAAATAATATCAATGGCCT
C (F)ATGGAAGCTGACCGACAGCC
(R)GTGTACGCCACCTCCCTGCG
D (F)ATGAAAAAGGGCGGATGGCT
(R)GCCGTACAGCCGGGCGTAAT
Ces oligonucléotides sont représentés en SEQ ID NO 15 à 24.

24 Exemple 2: Comparaison des domaines d'adénylation de diverses souches de Paenibacillus productrices de molécules appartenant à la famille des polymyxines.
Les enzymes impliquées dans la production des polymyxines appartiennent à
la famille des synthétases non ribosomiques (NRPS). Ces synthétases sont capables d'élaborer un peptide particulier sans s'appuyer sur la traduction d'une matrice d'ARNm.
La spécificité de la chaine peptidique produite dépend d'une séquence précise d'acides aminés de la synthétase constituant un domaine d'adénylation. Quatre domaines d'adénylation ont été identifiés in silico pour la synthétase A de B-LR, un pour B et cinq pour E. Chaque domaine d'adénylation contient une signature de dix acides aminés qui lui confère la spécificité d'intégrer un acide aminé précis au peptide non ribosomique en cours d'élongation. Ces signatures ont été identifiées in silico et comparées à
celles décrites dans la littérature (tableau 4) à l'aide du programme disponible à l'adresse suivante :
http ://nrp s informatik.uni-tuebingen. de/.
Les souches E681 et ATCC21830 sont décrites dans le brevet US 8,329,430.
La souche PKB1 est décrite dans l'article de Shaheen et al., 2011.
La souche M-1 est décrite dans l'article de Niu et al., 2013.
Tableau 4 : Acides aminés conférant la spécificité des domaines d'adénylation des polymyxines synthétases des souches E681, PKB1, ATCC21830, M-1 et B-LR
Pmx A, 4 domaines A

E681 DAWIVGAIVK Leu DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab PKB1 DAWTIAAIAK Phe D GFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab 21830 DAWIVGAIVK Leu DGFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab M-1 DAWTIAAIAK Phe DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab B-LR DAWIVGAIVK Leu DGFFLGVVYK Leu/Ileu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab /Val Pmx B, 1 domaine A

E681 DFWNIGMVHK TIn-PKB 1 DFWNIGMVHK Thr 21830 DFWNIGMVHK TIn-M-1 DFWNIGMVHK Tlu-B-LR DFWNIGMVHK Tlu-Pmx E, 5 domaines A

E681 D VGEIS S Dab DFWNIGM Thr D VGEISS Dab D VGEIS Dab D VGEIS Dab IDK VHK IDK AIDK AIDK

PKB1 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK IDK AIDK AIDK
21830 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK IDK AIDK AIDK
M-1 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IVK VHK IDK AIDK AIDK
B-LR DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGELS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab IDK VHK SIDK AIDK AIDK
Les synthétases de B-LR se distinguent au niveau du deuxième domaine d'adénylation de la synthétase PmxA et du troisième domaine de la synthétase PmxE.
Les comparaisons avec les séquences protéiques issues de la souche BL-R
5 avec les séquences protéiques déjà connues sont présentées dans le tableau 5 ci-dessous :
Séquences tailles % ID séquences protéiques pb aa PKB1 E681 ATCC

Tableau 5 Exemple 3: Construction d'un mutant pmxE- et analyse de sa production 10 de colistine.
Une séquence de 1 650 pb commençant à la fin de pmxD et finissant au début de pmxE a été sélectionnée et amplifiée. Elle a la particularité de posséder un site de restriction unique à l'enzyme SacII. La séquence amplifiée a été clonée dans le plasmide pGEM 7Z. Le gène codant pour la résistance à l'apramycine a été
intégré au 15 niveau du site de restriction SacII. Cette construction a été introduite dans B-LR par électroporation. La sélection des mutants ayant subi un évènement de double recombinaison a été effectuée par culture sur milieu gélose supplémenté en apramycine.
L'activité antimicrobienne du surnageant des mutants a été comparée à celle de B-LR. Le surnageant de culture du mutant 5 est moins actif que celui de la bactérie B-LR sauvage 20 sur P. aeruginosa (Figure 4).

Exemple 4. Caractéristiques de la synthétase PmxE issue de Paenibacillus La séquence peptidique de la synthétase PmxE est présentée en séquence SEQ
ID NO 14. La séquence du domaine d'épimérisation est présentée en SEQ ID NO
30, elle comprend au moins 461 résidus compris entre et incluant les résidu Va13205 à
Leu3665 de la séquence SEQ ID NO 14. Une des caractéristiques des peptides non-ribosomiques est la présence d'acides aminés de stéréoisomie (L). Habituellement, un acide aminé
(L) est activé par le domaine A, qui ensuite l'incorpore directement. Mais parfois, cet acide aminé
de série (L) peut être converti en sa forme (D) par un domaine d'épimérisation, avant la formation de la liaison peptidique. Selon les prédictions in silico, deux domaines d'épimérisation ont été identifiés dans les modules 3 et 6 du cluster pmx.
Ceci suggère qu'un changement stéréochimique des acides aminés présents à ces endroits est possible.
Ainsi les acides aminés présents en position 3 (Dab-3) et en position 6 (Leu-6) seraient incorporés dans la chaine peptidique sous leur forme (D). Ceci était connu pour la Leu-6, incorporée sous sa forme (D) dans toutes les polymyxines E, mais est inhabituel pour le résidu Dab-3.
La synthétase PmxE selon l'invention a donc la propriété de convertir le résidu L-Dab en son stéréoisomère (D), et de l'intégrer en position 3 (voir figure 1) dans la molécule de polymyxine E synthétisée.
Lesdites molécules de polymyxine E comprenant un résidu D-Dab en position 3 sont des variants de polymyxine E.
Exemple 5: Production de polymyxine E par un micro-organisme exprimant la combinaison d'une PmxA, d'une PmxB et d'une PmxE caractérisées dans les exemples précédents Le microorganisme (B-LR) produit plusieurs types de molécules de polymyxine E comprenant en position 7 un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Ces différents types de molécules ont pu être détectés dans le milieu de culture par spectrométrie de masse, selon le protocole détaillé ci-dessous :
Une solution contrôle de colistine sulfate à 0,0002% a été préparée dans le milieu de culture des micro-organismes (milieu M63T). Quatre fractions ont été
récupérées et analysées par UPLC-MS (Ultra Performance Liquid Chromatography -tandem mass spectrometer). Les deux pics correspondant aux polymyxines El et présentes dans le contrôle positif ont été trouvées dans la quatrième fraction d'extraction.
La souche B-LR présente un niveau maximum d'activité antimicrobienne à 30 heures de culture. A ce moment, le surnageant de culture a été récupéré et filtré (0,22 um) avant d'être soumis à une étape d'extraction en phase solide. Les peptides de la quatrième fraction ont été analysés par UPLC-MS. Dix-sept pics d'élution ont été
observés dans cette quatrième fraction. Parmi eux, les principaux pics présentant des temps de rétention de 1,61 et 1,52 minutes, ont des masses moléculaires respectivement [M+H] de 1169,7727 et 1155,7555. Ils correspondent respectivement aux polymyxines connues El et E2, présentant la même structure peptidique et différant par leurs acides gras, respectivement de formule C9H170 et C8H150.
Des analyses MS/MS ont été réalisées afin de confirmer ces structures, comme cela avait été préalablement présenté dans les articles de Govaerts et al., 2002; et de DeCrescenzo et al., 2007. La spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS) est utilisée pour déterminer l'enchainement des acides aminés grâce à la fragmentation de la liaison peptidique. Cette technique consiste à combiner deux analyseurs séparés par une cellule de collision. Une première étape consiste à sélectionner un ion issu de la source d'ionisation dans le quadripôle : c'est l'ion parent ou précurseur. Cet ion subit une fragmentation dans la cellule de collision sous l'effet d'un bombardement par des atomes d'Argon, et donne des ions 'fils' ou 'produits' qui seront analysés et détectés par l'analyseur à temps de vol (Time of Flight, TOF). L'analyseur TOF est basé sur la mesure du temps que mettent les ions à parcourir une distance donnée, ce qui permet de détecter les rapports m/z et donc de déterminer la masse des ions correspondants.
Au cours de ces expériences, les résidus Leucine et Isoleucine ne peuvent pas être différenciés, en raison de leurs masses moléculaires identiques.
Trois décapeptides avec un cycle à sept acides aminés ont été purifiés à
partir du surnageant de B-LR. Leurs poids moléculaires vont de 1140,74 Da à 1168,77 Da. La comparaison de ces molécules montre des homologies au niveau des résidus 1 à 6 et 8 à 10 et des différences au niveau du résidu 7 ainsi qu'au niveau de l'acide gras.
Ces 3 molécules correspondent aux polymyxines (colistines) El, E2 et à la Val-colistine E2.
Leurs formules chimiques déduites sont présentées dans le tableau 6 suivant.

Nom Acide Gras (AG) Y Masse Formule brute (Da) Colistine E1 C91-1170 Leu/Ile 1168,77 C53H101N16013 Colistine E2 C8H150 Leu/Ile 1154,76 C52H99N16013 Val-Colistine E2 C8H150 Val 1140,74 C511-197N16013 Tableau 6 Les spectres de masse obtenus pour les colistine E1, E2 et val-colistine E2 présentent des valeurs de [M+2H]2+ respectives de 585,39 ; 578,38 et de 571,38. La fragmentation des ions parents des colistines E1 et E2 donne des ions fils de m/z 829, 728, 628, 427, 327 et 227 (Figures 6 et 7) qui sont formés par perte de fragments d'acides aminés. La fragmentation de l'ion parent de la val-colistine E2 donne des ions fils de m/z 815, 714, 614, 514, 413, 313 et 213 (Figure 8) formés aussi par perte de fragments d'acides aminés.
Ces ions fils obtenus sont identiques à ceux décrits dans la littérature lors de la fragmentation des colistines E1, E2 et Val-E2 (Govaerts et al., 2002;
DeCrescenzo et al., 2007). Les colistines E1 et E2 ont les mêmes séquences d'acides aminés avec une différence de masse moléculaire de 14 Da qui correspond à une perte d'un CH2 au niveau de l'acide gras.
En conclusion, ces résultats montrent que la souche B-LR produit de la colistine E1, de la colistine E2 et de la valine colistine E2 (Val-E2).
Exemple 6 : Expression hétérologue des gènes pmxA, B, et E issus de Paenibacillus chez Bacillus subtilis et détection de la colistine.
Bacillus est un hôte d'expression hétérologue phylogénétiquement proche de B-LR. Le fosmide manipulé pour héberger l'ensemble du cluster de production de la colistine est transféré dans la souche receveuse par électroporation. Les souches transformées sont sélectionnées sur milieu gélose supplémenté en antibiotique.
La production de colistine se fait en milieu liquide supplémenté en acide diaminobutyrique (précurseur de synthèse). La détection de la colistine est réalisée après séparation de la biomasse du surnageant de culture. Des extractions permettent d'isoler la colistine avant sa caractérisation en spectrométrie de masse.

REFERENCES
BREVETS
US 8,329,430 NON-BREVETS
Sambrook et al. 'Molecular Cloning: a Laboratory Mame . Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York Niu B, Vater J, Rueckert C, Blom J, Lehmann M, Ru JJ, Chen XH, Wang Q, Borriss R.
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Govaerts, C., Orwa, J., Van Schepdael, A., Roets, E. & Hoogmartens, J. Liquid chromatography-ion trap tandem mass spectrometry for the characterization of polypeptide antibiotics of the colistin series in commercial samples. J
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production by P. amylolyticus E. Letters in Applied Microbiology, Volume 45, Issue 5, pages 491-10 496, November 2007

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée en ce que le second site d'adénylation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1 :
VTEAEKADLLGRFNDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE
LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI
DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI
EATDLACVIYTSGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLSSYSFDG
ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD
CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE
LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF
VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV
EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE
RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.

2. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants :
- DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ;
- DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique ;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide diaminobutyrique.

3. Synthétase PmxA selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence peptidique SEQ ID NO 6, et de préférence comprend la séquence peptidique SEQ ID NO 25.

4. Synthétase PmxE impliquée dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq sites d'adénylation et un site d' épimérisation, caractérisée en ce que le site d'épimérisation présente au moins 90% d'identité avec la séquence peptidique SEQ
ID NO 30.

5. Acide nucléique comprenant un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E selon l'une des revendications 1 à
3, présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID
NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK
de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.

6. Groupe de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, et des gènes codant respectivement pour les synthétase PmxB et PmxE.

7. Groupe de gènes selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC
et PmxD.

8. Groupe de gènes selon la revendication 6, comprenant :
- un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés, - un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 8, et - un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO 9.

9. Acide nucléique de séquence SEQ ID NO 10 ou de séquence SEQ ID NO
29, comprenant un groupe de gènes impliqués dans la synthèse de polymyxine E.

10. Vecteur d'expression comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou un acide nucléique selon la revendication 5, et/ou un gène codant pour une synthétase PmxE selon la revendication 4.

11. Vecteur d'expression comprenant totalement ou en partie le groupe de gènes selon l'une des revendications 6 à 8 ou un acide nucléique selon la revendication 9.

12. Micro-organisme transformé par introduction d'un gène codant pour une synthétase PmxA selon l'une des revendications 1 à 3, ou d'un gène codant pour une synthétase PmxE selon la revendication 4, ou d'un acide nucléique selon la revendication 5, ou d'un vecteur selon la revendication 10.

13. Micro-organisme transformé par introduction d'un groupe de gènes selon l'une des revendications 6 à 8, ou d'un acide nucléique selon la revendication 9, ou d'au moins un vecteur selon la revendication 11.

14. Micro-organisme transformé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé
en ce que le gène ou le groupe de gènes est surexprimé.

15. Micro-organisme transformé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il appartient au genre Bacillus ou Paenibacillus.

16. Méthode de production de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 12 à 15 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E
produite.

17. Méthode de production de polymyxine E selon la revendication 16, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température de 30°C, et dure au moins 25 heures.

18. Méthode de production de variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme selon l'une des revendications 12 à 15 dans un milieu minéral approprié, et la purification à partir du milieu de culture du ou des variants de la polymyxine E.

19. Variants de la polymyxine E obtenus selon la méthode de production de la revendication 18.

20. Variants de polymyxine E selon la revendication 19, pour leur utilisation dans le traitement des infections bactériennes à bactéries Gram-négatives.