KR101221000B1 - 폴리믹신 ｂ 또는 ｅ 생합성 효소 및 이를 코딩하는 유전자 군 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그람 양성 세균인 패니바실러스(Paenibacillus) 속 균주로부터 분리한 각각 폴리믹신 B 또는 E를 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리믹신 생합성 효소 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 종래 유전공학적 방법으로 생산기술을 향상시키는 것이 불가능하였던 FDA 승인 항생제인 폴리민신 B 및 E를 경제적으로 생산하거나 유도체 등 새로운 항생물질을 개발하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

폴리믹신 Ｂ 또는 Ｅ 생합성 효소 및 이를 코딩하는 유전자 군{Polymyxin B or E synthetase and gene cluster thereof}

본 발명은 그람 양성 세균인 패니바실러스(Paenibacillus) 속으로부터 분리한 폴리믹신 B 또는 E 생합성 효소 및 이를 코딩하는 유전자 클러스터에 관한 것으로서, 구체적으로는 패니바실러스 폴리믹사 F4(Paenibacillus polymyxa F4) 균주 및 ATCC21830(Paenibacillus polymyxa ATCC21830) 균주로부터 분리된 각각 폴리믹신 B 및 폴리믹신 E를 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 효소, 이를 코딩하는 유전자 클러스터, 상기 유전자군을 이용한 폴리믹신 B 또는 E 또는 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

비리보솜 펩티드 합성 효소(non-ribosomal peptide synthetase, 이하 'NRPS'라 약칭함)는 NRPS 복합체를 구성하는 하나 이상의 ORF(open reading frame)로 이루어지며, 각 NRPS 또는 NRPS 서브유닛은 하나 이상의 모듈을 포함한다. 모듈은 하나의 빌딩 블록(예, 하나의 아미노산)을 성장하는 펩티드 체인에 연결하는 촉매 단위로 정의된다. NRPS 단백질 주형을 형성하는 생합성 모듈의 순서 및 특이성은 최종적인 펩티드 생성물의 서열과 구조를 지배한다. 따라서, 유전자 코드에 따른 리보솜-매개 RNA 번역과 관련 없이 독립적으로 이루어지는 NRPS 과정은 리보솜에 의해 RNA 주형으로부터 번역되는 펩티드에 비해 방대한 구조적 다양성을 나타내는 펩티드를 생산할 수 있다. 이들은 D- 및 L-형 아미노산과 히드록시산의 연결, 선형, 고리형 또는 분지 고리형 구조를 형성하는 주 펩티드 체인내의 변이 및 산화, 아실화, 글리코실화, N-메틸화 및 헤테로사이클형 고리 형성을 포함한 부가의 구조적 변형을 포함한다.

NRPS중 하나인 폴리믹신 생합성 효소는 폴리믹신을 구성하는 각 아미노산 모노머를 순차적으로 결합시키며, 필요할 경우 아미노산의 변형을 유도하여 전체 아미노산의 체인을 완성하고 링 구조를 만들어 펩티드 항생제를 합성한다. NRPS의 각 모듈은 최소한 A, C, T 도메인으로 구성되어 있는데 A 도메인(adenylation domain)은 아미노산 모노머를 선택하고 활성화시키며, T 도메인(thiolation domain, PCP라고도 불림)은 아미노산 모노머 기질 및 합성중인 펩티드 중간체를 촉매중심점(catalytic center)에 전달해주는 역할을 수행하고, C 도메인(condensation domain)은 펩타이드 본드 형성을 촉매하는 역할을 담당하고 있다.

최근 그라미시딘(Gramicidin) 생합성 유전자의 페닐알라닌을 인식하는 A 도메인의 3차 구조가 밝혀졌는데 특정 아미노산과 결합하는 부위에 8개의 아미노산 잔기가 관여함이 밝혀졌다(Conti E. et al., EMBO J. 16: 4174-4183, 1997). A 도메인의 아미노산 서열을 기존에 알려진 A 도메인의 아미노산 염기서열과 비교 분석한 결과 같은 아미노산을 인식하는 A 도메인은 상기 8개의 아미노산 잔기가 매우 높은 상동성을 가지고 있음을 확인하였고, 따라서 상기 8개의 아미노산 잔기를 분석하면 특정 A 도메인이 어떤 아미노산을 인식하고 결합하는지 알 수 있게 되었다(Challis G.L. et al., Chem. Biol. 7: 211-224, 2000).

이와 같은 핵심 도메인과 더불어 L- 아미노산을 D-아미노산으로 전환시키는 역할을 하는 광학이성질체화 도메인(E domain 또는 epimerization domain)과 TE 도메인(termination domain)등이 있으며, 상기 도메인들은 일반적으로 특이적인 아미노산 모티프 또는 특징에 의해 구별된다.

유전 공학적 조작 및 생체 내 재조합에 의해 DNA 수준에서 모듈의 수와 순서를 변화시킴으로써 새로운 특이성을 갖는 새로운 효소를 설계하기 위해 모듈 구조를 이용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 기술을 이용하여 이종성 NRPS에서 유래한 도메인을 교환하거나(Schneider et al., Mol. Gen. Genet., 257: 308-318, 1998), A 도메인의 기질 결합 포켓을 형성하는 잔기를 변화시켜 모듈 내에 새로운 기질 특이성을 설계하는 방법 등이 가능하다(Cane et al., Chem. Biol. 6: 319-325, 1999).

폴리믹신은 바실러스 속 혹은 패니바실러스 속으로부터 분리된 항생물질로서, 일반적인 폴리펩티드처럼 유전자에 의해 코딩되어 리보솜에 의해 합성되는 것이 아니라 비리보솜 펩티드 생합성 효소에 의해 합성되는 항생물질이다(Marahiel M.A. et al ., Chem . Rev . 97: 2651-2673, 1997; Doekel S. et al., Metab . Eng. 6: 64-77, 2001).

폴리믹신은 약 1200 Da(1.2 kDa)의 분자량을 가지고 있다(Storm D.R. et al., Ann Rev. Biochem. 46: 723-763, 1977). 기본구조는 7개의 아미노산으로 구성된 다중양이온성 펩티드 링(polycationic peptide ring)과 3개의 아미노산으로 구성된 펩티드 곁가지로 되어 있다. 따라서 모두 10개의 아미노산으로 구성되어있는데 이중 2,4-다이아미노부티릭산(Dab, 2,4-dimainobutyric acid)이 높은 비율로 포함되어 있다. 펩티드 곁가지의 아미노말단(amino terminus)에 지방산이 결합되어 있는데 이 지방산은 주로 6-메칠옥타노익 산(6-methyloctanoic acid) 또는 6-메칠헵타노익 산(6-methylheptanoic acid)이다(도 3 참조). 이러한 구조는 폴리믹신이 물 또는 유기용매 모두에 잘 녹는 성질을 제공한다.

폴리믹신은 세포막의 투과성을 변화시켜 세포를 사멸시키는 항생물질로서 하기와 같은 작용기전을 나타낸다.

먼저, 폴리믹신의 다중양이온성 펩티드 링이 세포막의 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide)를 안정화시키고 있는 칼슘과 마그네슘의 브릿지(bridge)를 치환함으로써 세포에 접촉한 다음, 세포막의 리포폴리사카라이드와 폴리믹신의 지방산 잔기가 반응하여 폴리믹신과 세포막의 결합을 공고히 하게 되어, 최종적으로 폴리믹신이 세포의 외막에 끼어들어 세포막을 파괴하게 된다(Hermsen E.D. et al., Infect. Dis. Clin. N. Am. 17: 545-562, 2003).

1947년 패니바실러스 폴리믹사 균으로부터 처음으로 폴리믹신 B가 분리된 이후 최소한 15종의 폴리믹신이 보고되었다(Storm D.R., et al., Annu. Rev. Biochem., 46: 723-763, 1977; Silaev, A. B. et al., Zh. Obshch. Khim. 45: 2331-2337, 1975; Martin N.I. et al., J. Biol. Chem. 278: 13124-13132, 2003). 상기 폴리믹신을 이용한 항생제인 폴리믹신 B 설페이트(polymyxin B sulfate)는 0.01 ㎍/ml의 농도에서 88 %의 슈도모나스 에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대해 치사 효과를 나타내었으나, 폴리믹신 E(colistin)는 0.1 ㎍/ml의 농도에서 치사 효과를 나타내었다. 폴리믹신 B와 E 둘 다 2 ㎍/ml 미만의 농도에서는 대부분의 대장균(Escheridhia coli) 및 슈도모나스 에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 효과를 나타내었고, 모든 엔테로박터(Enterobacter), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 파스테렐라(Pasteurella), 브루셀라(Brucella) 및 보데텔라(Bordetella) 균에도 살균 효과를 나타내었다. 그러나, 프로테우스(Proteus), 세라치아(Serratia), 프로비덴시아(Providencia) 및 에드워드시엘라 (Edwardsiella) 등에는 200 ㎍/ml의 농도 이상에서도 효과가 나타나지 않았다. 또한, 그람 양성 세균, 곰팡이 및 혐기성 세균에도 효과가 없는 것으로 알려져 있다 (Nord N.M. et al., N. Engl. J. Med. 270: 1030-1035, 1964).

상기와 같은 효과에 의해 폴리믹신은 1970년대 초반까지 이들 병원성 미생물에 의한 질병의 치료제로 많이 사용하였으나, 열, 발진 및 통증 등의 부작용을 동반하며 특히 심각한 신장독성과 신경독성을 유발하기 때문에(Hermsen, E. D. et al. Infect. Dis. Clin. North Am., 17:545-562, 2003; Pedersen M.F. et al., Invest. Urol. 9: 234-237, 1971) 점차 안전성이 높은 다른 항생제에 의해 대체되었고, 그에 따라 사용량이 급격히 줄어들게 되었으며 최근에는 주로 연고제와 같이 국소적인 상처의 치료제로 사용되고 있는 실정이다.

오늘날, 많이 사용하고 있는 항생제들에 대해 저항성을 가진 병원균이 빈번하게 출현함에 따라 병원성 그람 음성 세균에 탁월한 살균효과를 보이며 특히 베타 락탐계, 아미노글리코시드계 및 플루오로퀴놀론계 항생제에 저항성을 보이는 슈도모나스 에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumannii) 등에 탁월한 살균효과를 보이는 폴리믹신이 다시 주목받게 되었다.

레빈 등의 보고에 의하면 기존 항생제에 저항성을 가진 슈도모나스 에어로지노사 및 아시네토박터 바우만니에 의해 발병된 60명의 병원감염증 환자들을 대상으로 정맥주사용 콜리스틴(폴리믹신 E)을 처방한 결과 58%의 환자가 치료되었으며 (Levin A.S. et al. Clin. Infect. Dis. 28: 1008-1011, 1999), 스타인 등은 모든 항생제에 저항성을 가진 슈도모나스 에어로지노사에 의해 발병된 3명의 골수염 환자를 콜리스틴을 이용하여 치료하였다는 보고가 있으며(Stein A. et al., Clin. Infect. Dis. 35: 901-902, 2002), 다른 그룹에서는 항생제 저항성 아시네토박터에 의한 뇌막염을 성공적으로 치료하였다고 보고하였다(Jimenez-Mejias M.E. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 21: 212-214, 2002). 또한 폴리믹신 B를 사용하여 항생제 저항성 클렙시엘라 뉴모니아에 의한 뇌실염(ventriculis)을 치료하였다는 보고도 있다(Segal-Maurer S. et al., Clin. Infect. Dis. 28: 1134-1138, 1999).

상술한 바에 따라 최근 폴리믹신이 기존에 알려진 항생제에 저항성을 가진 그람음성 세균의 치료제로 다시 주목받게 됨에 따라 그 수요가 늘어날 것으로 예상된다.

항생제 생산량 증대의 한 방법으로서 항생제 생합성 유전자를 산업적 대량배양이 용이한 균주에 도입한 예들이 보고되었으며(Eppelmann K. et al., J. Biol. Chem. 276: 34824-34831, 2001; Pfeifer B.A. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 106-118, 2001) 항생제 생합성 유전자의 프로모터를 강한 것으로 치환함으로써 생산성 증대를 이룬 보고도 있었다(Tsuge K. et al., J. Bacteriol. 183: 6265-6273, 2001). 또한, 항생제 생합성 유전자의 모듈 또는 도메인의 재구성을 통하거나(Mootz H.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5848-5853, 2000; Ferra F.D. et al., J. Biol. Chem. 272: 25304-25309, 1997) 도메인 내의 특정 아미노산을 치환하는 방법으로(Eppelmann K. et al., Biochemistry 41: 9718-9726, 2002) 새로운 항생제의 개발도 시도되고 있다. 폴리믹신 생합성 유전자의 경우에는 분리 동정이 어려워 최근까지도 클로닝이 되지 않았으며, 본 발명자들에 의해 최초로 폴리믹신 A(또는 M)을 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 유전자 클러스트가 클로닝되었고(대한민국 특허 제750658호), 상기 유전자 클러스트를 폴리믹신을 생산하지 않는 Bacillus subtilis 균주의 게놈에 도입할 경우, 폴리믹신 A(또는 M)이 생성됨을 입증하였다(Choi et al., J. Bacteriol. 191(10): 3350-3358, 2009).

그러나, 상기 폴리믹신 생합성 유전자에 의해 생산이 되는 폴리믹신은 폴리믹신 A(또는 M)으로서, 실제 FDA 승인을 받은 항생제인 폴리믹신 B 또는 E와는 달리 임상시험 절차를 거친 신약 승인절차를 거쳐야 하기 때문에, 상업적 이용가능성이 떨어지는 단점이 있다. 따라서, 산업상 이용가능성이 큰 폴리믹신 B 또는 E를 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 유전자를 클로닝하는 것이 본 기술분야에서의 시급한 해결과제이다. 그러나, 상기 폴리믹신 A(또는 M) 생합성 유전자의 확보에도 불구하고, 폴리믹신 생합성 유전자의 경우 그 크기가 매우 크고, 상동성이 매우 높은 소단위 또는 모듈이 지속적으로 반복되는 구조를 가지고 있기 때문에, 다른 종류의 폴리믹신 생합성 유전자의 경우, 제대로 폴리믹신을 생합성할 수 있는 수준의 유전자 클러스터를 온전히 확보하는 것은 매우 어려운 일로 평가된다.

이에, 본 발명자들은 폴리믹신 B 또는 E의 생합성 유전자를 분리 동정하기 위해 예의 노력한 결과, 신규 패니바실러스 폴리믹사 균주인 Paenibacillus polymyxa F4 균주(수탁번호: KCTC11667BP) 및 Paenibacillus polymyxa ATCC23830 균주로부터 각각 폴리믹신 B 및 E를 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 유전자를 분리동정하는데 성공하였고, 상기 균주들이 폴리믹신 B 및 E를 각각 생산할 수 있음을 입증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허 제750658호

Ansari et al., Nucleic acids Res. 32: W405-W413, 2004 Cane et al., Chem. Biol. 6: 319-325, 1999 Challis G.L. et al., Chem. Biol. 7: 211-224, 2000 Choi et al., J. Bacteriol. 191(10): 3350-3358, 2009 Conti E. et al., EMBO J. 16: 4174-4183, 1997 Doekel S. et al., Metab. Eng. 6: 64-77, 2001 Eppelmann K. et al., Biochemistry 41: 9718-9726, 2002 Eppelmann K. et al., J. Biol. Chem. 276: 34824-34831, 2001 Ferra F.D. et al., J. Biol. Chem. 272: 25304-25309, 1997 Hermsen E.D. et al., Infect. Dis. Clin. N. Am. 17: 545-562, 2003 Jimenez-Mejias et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 21: 212-214, 2002 Koyama, Y. et al., J. Antibiot., 3: 457-458, 1950 Levin A.S. et al. Clin. Infect. Dis. 28: 1008-1011, 1999 Marahiel M.A. et al., Chem. Rev. 97: 2651-2673, 1997 Martin N.I. et al., J. Biol. Chem. 278: 13124-13132, 2003 Mootz H.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5848-5853, 2000 Nord N.M. et al., N. Engl. J. Med. 270: 1030-1035, 1964 Pedersen M.F. et al., Invest. Urol. 9: 234-237, 1971 Pfeifer B.A. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 106-118, 2001 Schneider et al., Mol. Gen. Genet., 257: 308-318, 1998 Segal-Maurer S. et al., Clin. Infect. Dis. 28: 1134-1138, 1999 Silaev, A. B. et al., Zh. Obshch. Khim. 45: 2331-2337, 1975 Stein A. et al., Clin. Infect. Dis. 35: 901-902, 2002 Storm D.R. et al., Ann. Rev. Biochem. 46: 723-763, 1977 Tsuge K. et al., J. Bacteriol. 183: 6265-6273, 2001

본 발명의 목적은 폴리믹신 B 또는 E를 생합성할 수 있는 폴리믹신 생합성 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 폴리믹신 생합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 비염색체성으로 형질도입되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 삽입되어 제조된 형질전환 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 숙주세포를 이용한 폴리믹신 B 또는 E의 제조방법에 관한 것이다.

1. 용어의 정의

이하 본 발명에서 사용하는 용어를 설명한다:

비-리보좀 펩티드 합성효소(NRPS, non-ribosomal peptide synthetase): 펩티드 합성이 mRNA-tRNA 및 리보좀에 의한 번역과정을 거치지 않고 단위 아미노산을 부가하는 하나 또는 그 이상의 개방판독틀(ORF)에 의해 번역된 효소 또는 효소 소단위체의 복합체를 의미한다. 각 NRPS 또는 NPRS 소단위체는 하나 이상의 모듈을 포함한다.

모듈(module): 하나의 구조 단위(예를 들어, 아미노산)을 신장하는 펩티드 사슬에 부가하는 기능을 수행하는 단위를 의미한다. 각 모듈은 서로 다른 도메인들로 구성된다.

도메인(domain): 상기 모듈 내에서 사슬 신장의 계속을 위한 일련의 반응을 관장하는 단위로서, A(adenylation) 도메인, C(condensation) 도메인, T(thiolation) 도메인, E(epimerization) 도메인, TE(termination) 도메인 등으로 구성되는데, A 도메인은 아미노산 단량체를 선택하고 활성화하는 역할을 수행하고, C 도메인은 펩티드 결합을 매개하는 역할을 수행하며, 펩티딜기 운반 단백질(peptidyl carrier protein, PCP)로도 불리우는 T 도메인은 기질의 이동 및 중간체를 반응 센터로 신장시키는 역할을 수행하고, E 도메인은 L-형 아미노산을 D-형 아미노산으로 변환시키는 역할을 수행하며, TE 도메인은 아미노산의 부가반응을 종결시키는 역할을 수행한다.

폴리믹신(polymyxin): 바실러스속 또는 패니바실러스속 균으로부터 리보좀에 의해 합성되지 않고, NRPS에 의해 합성되는 항생제를 의미한다. 현재까지, 폴리믹신 A, B, E 및 M 등 총 15가지 이상 알려져 있다.

폴리믹신 합성효소(polymyxin synthetase): 각 아미노산 단량체를 단계적으로 결합시키고 상기 아미노산을 전체 아미노산 사슬을 완성하도록 변형시키고 최종적으로 펩티드 항생제를 형성하도록 환구조를 형성하는 NRPS의 일종을 의미한다. 본 발명자들은 상기 폴리믹신 합성효소가 PmxA, PmxB 및 PmxE로 각각 독립적으로 번역되어 복합체를 형성함을 최초로 규명한 바 있다(대한민국 특허 제750658호).

PmxA 폴리펩티드 소단위체(PmxA polypeptide subunit): 폴리믹신 합성효소의 소단위체중 하나이다. 상기 PmxA 폴리펩티드 소단위체는 폴리믹신의 여섯번째 내지 아홉번째 아미노산을 각각 부가하는 네 개의 모듈을 포함한다.

PmxB 폴리펩티드 소단위체(PmxB polypeptide subunit): 폴리믹신 합성효소의 소단위체 중 하나이다. 상기 PmxB 폴리펩티드 소단위체는 마지막 아미노산인 L-쓰레오닌(L-Thr)을 부가하는 모듈을 포함한다. 상기 PmxB 폴리펩티드 소단위체는 TE 도메인을 가지고 있기 때문에, 상기 TE 도메인에 의해 상기 마지막 아미노산의 카르복실기가 네번째 아미노산인 L-Dab의 두번째 아민에 연결된다.

PmxE 폴리펩티드 소단위체(PmxA polypeptide subunit): 폴리믹신 합성효소의 소단위체 중 하나이다. 상기 PmxE 폴리펩티드 소단위체는 N-말단의 다섯 아미노산을 부가하는 다섯 개의 모듈을 가지고 있다. 상기 다섯 아미노산은 N-말단부터 L-Dab, L-Thr, L-Dab (또는D-Dab), L-Dab 및 L-Dab이다.

유전자 클러스터(gene cluster): 유전자 클러스터는 단독 ORF는 아니므로 하나의 전사체로부터 다수의 단백질이 번역되는 오페론과 구분되나, 특정 대사작용에 관련된 유전자들이 게놈 내에 연속적으로 존재하는 일종의 유전자 군을 의미한다. 본 발명의 폴리믹신 생합성 효소는 상기 유전자 클러스터 내에 존재하는 세 가지 유전자인 pmxA, pmxB 및 pmxE의 번역산물의 복합체이다. 폴리믹신 생합성 유전자 클러스터 내에는 폴리믹신의 생합성에는 직접 관여하지는 않으나, 폴리믹신의 분비에 관여할 것으로 추정되는 pmxC 및 pmxD도 존재한다.

2. 발명의 요약

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxA 폴리펩티드 소단위체, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxB 폴리펩티드 소단위체 및 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxE 폴리펩티드 소단위체로 구성되는 분리된 폴리믹신 B 생합성 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxA 폴리펩티드 소단위체, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxB 폴리펩티드 소단위체 및 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxE 폴리펩티드 소단위체로 구성되는 분리된 폴리믹신 E 생합성 효소를 제공한다.

다른 실시태양에서 본 발명은 상기 폴리믹신 B 생합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxA 유전자, 서열번호 8로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxB 유전자 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxE 유전자를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 각각의 유전자들은 하나의 유전자 클러스터 형태로 제공되거나, 서로 구분되는 별개의 벡터에 클로닝되어 제공될 수 있다. 유전자 클러스터의 형태로 제공되는 경우에는 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxC 유전자 및 서열번호 11로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxD 유전자를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나, 상기 pmxC 및 pmxD는 폴리믹신 생합성에 직접 관여하지 않고 단지 폴리믹신의 분비에 관련하는 것으로 추정되므로, 이들 유전자의 중요도는 상대적으로 덜한 것으로 판단된다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 폴리믹신 E 생합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxA 유전자, 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxB 유전자 및 서열번호 14로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxE 유전자를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 각각의 유전자들은 하나의 유전자 클러스터 형태로 제공되거나, 서로 구분되는 별개의 벡터에 클로닝되어 제공될 수 있다. 유전자 클러스터의 형태로 제공되는 경우에는 서열번호 15으로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxC 유전자 및 서열번호 16로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxD 유전자를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나, 상기 pmxC 및 pmxD는 폴리믹신 생합성에 직접 관여하지 않고 단지 폴리믹신의 분비에 관련하는 것으로 추정되므로, 이들 유전자의 중요도는 상대적으로 덜한 것으로 판단된다.

본 발명은 아울러, 상기 폴리믹신 B 또는 E 생합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 일부는 pmxA, pmxB 및 pmxE의 각각 유전자의 암호화 영역(coding region) 전체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

상기 발현벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 외래단백질을 발현시키기 위해 사용되는 것이라면 어떤 것이라도 사용가능하다. 원핵세포용 발현벡터가 바람직하며, 진핵세포용 발현벡터의 경우 효모용, 곤충용 또는 포유동물 세포용 발현벡터의 사용의 사용이 가능하나 효모용 발현벡터가 더욱 바람직하다.

상업적으로 이용가능한 원핵세포용 발현벡터로는 pET 벡터(Novagen, Inc., USA), pQE 벡터(Qiagen, USA) 및 pGEX(Pharmacia Biotech Inc., USA) 등이 존재하나 이에 제한되는 것은 아니고, 상업적으로 이용가능한 진핵세포용 발현벡터로는 pCI Neo(Promega, USA), pMAMneo(Clontech, USA), pcDNA3(InVitrogen, USA), pMClneo(Stratagene, USA), pXT1(Stratagene, USA), pSG5(Stratagene, USA), EBO-pSV2-neo(ATCC 37593), pBPV-1(8-2)(ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt(ATCC 37199), pRSVneo(ATCC 37198), pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC 37460) 및 lZD35(ATCC 37565) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시태양으로 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 비염색체성으로(episomally) 형질도입되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주세포의 염색체 내로 삽입되어 제조된 형질전환 숙주세포를 제공한다.

상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 원핵세포이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 원핵세포는 그람양성균, 그람음성균을 포함하는 진성 세균과 고세균을 모두 포함하며 그람양성균이 더 바람직하다. 상기 그람양성균으로는 바실러스속 세균, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴균, 나병균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균,방선균 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니고, 바실러스속 세균 또는 방선균이 더 바람직하다. 상기 그람음성균은 살모넬라균, 이질균, 티푸스균, 대장균, 콜레라균, 페스트균, 임균, 수막염균, 스피로헤타 등이 포함되며, 대장균이 더 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 일실시태양으로 본 발명은 상기 형질전환 숙주세포를 영양배지 내에서 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 폴리믹신 B 또는 E를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 영양배지는 해당 숙주세포의 배양에 적합한 것이라면 어느 것이라도 사용하는 것이 가능하며, 특별히 이에 제한되는 것이다. 상기 숙주세포가 Dab을 생산하지 못하는 세포주일 경우에는 상기 영양배지 내에 Dab을 추가시킬 수 있다.

본 발명자들은 국내 토양시료에서 포자를 형성하며 대장균과 식물병원성 곰팡이인 Rhizoctonia solani 및 Fusarium oxysporom에 대해 우수한 길항력을 나타내는 균주를 탐색하여 이를 동정한 결과 Paenibacillus polymyxa종의 신규 균주인 것을 규명하였고, 상기 균주가 폴리믹신을 생산하는지 LC/MS 분석을 수행한 결과, 폴리믹신 B를 생산하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 이에 따라, 본 발명자들은 상기 신규 균주를 Paebacillus polymyxa F4 균주(이하, 'F4 균주'로 약칭함)로 명명하고, 한국생명공학연구원 내 생물자원센터의 유전자은행에 2010년 3월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC11667BP를 부여받았다.

상기 F4 균주와 농촌진흥청 농업유전자원센터로부터 구매한 폴리믹신 E(colistin)을 이미 생산하는 것으로 보고된 Paenibacillus polymyxa ATCC21830 균주(이하, 'ATCC21830 균주'로 약칭함)로부터 폴리믹신 생합성 유전자 클러스터를 클로닝하는데 성공하였다.

상기 폴리믹신 B 및 E 생합성 유전자 클러스터는 종래에 본 발명자들이 규명한 Paenibacillus polymyxa E681 균주 유래의 폴리믹신 생합성 유전자와 유사하게 pmxA, pmxB, pmxC, pmxD 및 pmxE의 순서로 구성되어 있었으며(도 2 참조), 상기 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 예측된 폴리믹신의 구조는 폴리믹신 B와 E임을 알 수 있었다(도 3 참조). 그러나, 폴리믹신 B를 생산하는 것으로 확인된 F4 균주의 PmxE의 모듈 3의 경우 Dab을 D 형으로 변환하는 광학이성질체화(epimerization, E) 도메인을 가지고 있었는데, 이는 기존 보고에 의해 폴리믹신 B의 구조중 3번째 사슬의 Dab이 L 형으로 알려져 있으나 F4 균주가 생산하는 폴리믹신 B의 3번째 Dab은 D 형일 가능성이 있음을 의미한다.

본 발명의 폴리믹신 생합성 효소 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 펩티드 항생물질인 폴리믹신 B 및 E를 모균 또는 이종 숙주균을 이용하여 효율적으로 생합성 하거나 유도체 등 새로운 항생물질을 개발하는데 사용할 수 있다는 유리한 효과를 가지고 있다.

도 1은 상업적으로 이용가능한 폴리믹신 B 표준 시료(상부 판넬)와 F4 균주에서 생산된 폴리믹신(하부 판넬)에 대한 LC 및 MS 분석결과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 2는 ATCC21830 균주 및 F4 균주로부터 유래한 폴리믹신 합성효소를 암호화하는 유전자 클러스터의 구조 및 상기 폴리믹신 합성효소의 각 소단위체의 상세한 구조를 보여주는 개요도이다.
도 3은 ATCC21830 균주 및 F4 균주로부터 생산되는 폴리믹신 합성효소 각각의 도메인 구조로부터 예측된 폴리믹신의 구조를 보여주는 개요도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: F4 분리균 확보 및 동정

<1-1> 균분리

충남 공주지역에서 채집한 약 3g의 토양시료를 멸균수 20 ml에 현탁하여 30분간 200 rpm으로 진탕한 후 80℃에서 15분 열처리하였다. 10^-1~10^-3 희석액을 준비하여 Tryptic soy agar(TSA) 플레이트에 100 ul씩 도말하였다. 30℃에서 5일 배양 후 자란 콜로니 중 포자를 형성하며 대장균과 식물병원성 곰팡이인 Rhizoctonia solani 및 Fusarium oxysporom에 대해 우수한 길항력을 나타내는 균을 선발하여 동정하는 과정을 통해 F4 균주를 선발하였다.

<1-2> 균동정

16S rDNA 염기서열 해독 결과 아래와 같은 염기서열(서열번호 17) 얻었으며 BLAST 분석을 통해 Paenibacillus polymyxa균으로 동정되었다. 근연균주와 비교한 결과 P. polymyxa E681균과는 99.6%(1360/1365) 상동성을 나타냈고 P. polymyxa ATCC21830 균과는 99.8%(1332/1335) 상동성을 나타냈다. 상기 균이 신규 균주로 판명됨에 따라, 본 발명자들은 상기 균주를 P. polymyxa F4로 명명하고, 상기 F4 균주를 2010년 3월 16일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터 유전자은행에 수탁번호 KCTC11667BP로 기탁하였다.

F4 균주 16S rDNA 염기서열 (1365 bp)

TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTGTAGAGTAACTGCTACAAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAATCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCGC

실시예 2: F4 균주로부터 폴리믹신의 분리 및 동정

Choi 등이 사용한 배지(J. Bacteriol. 191(10): 3350-3358, 2009)를 이용하여 F4 균주를 호기적 조건에서 30℃, 200 rpm으로 3일간 배양하여, 원심분리(7000 rpm, 10 min) 후 상등액을 얻었다.

LC/MS 분석은 써모 일렉트론사(Thermo electron Co., USA)의 고압 액체 크로마토그래피 시스템과 이온 스펙트로미터(ion spectrometer) 장비를 이용하였으며 역상컬럼(YMC Hydrosphere C18 column)에서 0.1% 포름산(formic acid)이 첨가되어 있는 아세토니트릴(acetonitril)과 물을 용매로 하여 용출속도 0.2 ㎖/min의 조건으로 분석하였다. 분석 결과 F4 균주는 시그마사로부터 구입한 Polymyxin B(제품번호 P0972)의 경우와 동일한 (M+H)⁺ 이온분자량 1203.7, (M+2H)²⁺ 이온분자량 602.6 및 (M+3H)³⁺ 이온분자량 402.0의 값을 확인하였다(도1). 따라서 F4 균주는 폴리믹신 B를 생산함을 확인하였다. 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 구매한 ATCC21830 균주는 이미 polymyxin E를 생산하는 균으로 이미 보고된 바 있어(Koyama, Y. et al., J. Antibiot., 3: 457-458, 1950) 본 발명에서는 LC/MS 분석을 실시하지 않았다.

실시예 3: 폴리믹신 B와 폴리믹신 E 생합성 유전자의 염기서열 결정

<3-1> 라이브러리 제작

ATCC21830 균주 및 F4 균주를 tryptic soy broth(TSB) 배지에서 16시간 배양하여 Genome Analysis, A laboratory manual Vol. III Cloning systems(CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)에 기술된 방법에 따라 염색체 DNA를 분리한 다음 삽입 DNA 절편의 크기가 약 40 kb인 포스미드 라이브러리를 키트(CopyControl^TM fosmid library production kit, Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)를 사용하여 제작하였다. 두 균주로부터 제작된 두 세트의 포스미드 라이브러리에서 임의로 선택된 각각 1500개씩의 클론으로부터 폴리믹신 생합성 유전자군을 함유하는 클론들을 콜로니 교잡(colony hybridization) 방법으로 선별하였다. 이때 프로브로는 pmxC의 3' 말단부위 약 300 bp와 pmxD의 5' 말단부위 약 400 bp를 포함하는 약 700 bp 크기의 PCR 산물을 pmxCC primer(서열번호: 18, 5'-gagcttttctgaaggatg-3'), pmxDN primer(서열번호: 19, 5'-ggtcgttacgtcgttgttc-3')와 Dig-labelling kit(Roche Diagnostics Corporation)를 이용하여 제작하여 사용하였다. 각 라이브러리로부터 1차로 양성반응을 보이는 32개씩의 클론을 선별하였고 이들로부터 포스미드 DNA를 추출한 후 앞에서 사용한 probe를 이용하여 DNA Dot blotting을 실시하였다. 양성반응을 보이는 클론을 13개씩 선정하여 양말단의 염기서열 결정하였고 이를 근거로 삽입된 DNA 단편이 폴리믹신 생합성 유전자군의 어느 부위를 포함하는지 확인하였다.

<3-2> 염기서열 분석

양 말단 염기서열 정보로부터 ATCC21830 균주와 F4 균주의 전체 폴리믹신 생합성 유전자군을 포함하는 클론을 각각 2개씩 선정하여 유전자군 전체 염기서열을 분석,확보하였다. 염기서열 해독은 산탄식 시퀀싱 방법(shotgun sequencing strategy)을 이용하여 수행하였다. 염색체 DNA 절편 준비는 VCX-500 초음파 처리기(Sonics, Newtown, CT, USA)로 19% 강도, 펄스(pulse) on/off 시간은 0.3/3초 조건으로 6회 반복하여 실시하였다. 라이브러리에 삽입될 DNA 절편은 1.5-2 kb 크기를 회수하여 평활말단화 작업을 거쳐 사용하였으며, pUC19 벡터의 Sma I 제한효소 위치에 삽입하였다. 플라스미드 라이브러리를 위한 반응물을 대장균 DH5α에 열충격 방법으로 도입한 다음 X-gal/IPTG/Amp(Ampicillin)이 함유된 LB 한천 배지에 도말하였다. 백색 재조합 콜로니를 LB(Amp) 액체 배지가 든 96 딥-웰 플레이트(deep-well plate)에 접종 후 37℃의 항온 배양기에서 250 rpm으로 16 시간 동안 진탕 배양하여 세포를 회수한 뒤 표준 방법으로 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다.

DNA 염기서열 결정 반응은 BigDye^TM terminator cycle sequencing kit(Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 수행하였으며, 반응물은 ABI 3700 및 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 분석하였다. 서열분석 결과 파일 처리는 Phred/Phrap/Consed 프로그램을 이용하였다 (http://www.phrap.org). 모든 결과 파일은 Phred로 처리하여 염기서열을 할당하였으며, 양질의 결과만을 취한 뒤 벡터 서열을 차폐하였다. 서열 합체 작업에는 Phrap을 사용하였으며 콘티그 확인과 편집 및 프라이머 설계 작업에는 Consed를 사용하였다. 플라스미드 클론 약 200개의 염기서열을 양방향으로 분석하여 유전자군 전체 길이의 약 7 배수에 해당하는 염기서열을 확보하였고 이를 합체하여 약 41 kb 길이의 서열을 완성하였다(서열번호 20). 전체 염기서열에 대한 ORF 분석 결과 F4 균주의 경우 폴리믹신 B 생합성효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 pmxA, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 pmxB, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 pmxC, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 pmxD 및 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 pmxE로 구성된 유전자클러스터인 것으로 밝혀졌다. 또한, ATCC21830 균주의 경우, 폴리믹신 E 생합성효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 pmxA, 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 pmxB, 서열번호 15의 핵산서열을 갖는 pmxC, 서열번호 16의 핵산서열을 갖는 pmxD 및 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 pmxE로 구성된 유전자클러스터인 것으로 밝혀졌다. 상기 구조는 기존에 규명된 P. polymyxa E681 균주 유래의 폴리믹신 생합성 유전자의 구조와 동일한 것이다.

이렇게 완성한 F4 균주와 ATCC21830 균주의 폴리믹신 생합성 유전자의 염기서열을 변환하여 PmxA, PmxB, PmxE의 아미노산 서열을 확보한 후 이를 분석한 결과 두 균의 PmxA는 각각 4959, 4966개(각각 서열번호 1 및 4), PmxB는 두 균 모두 1102개(각각 서열번호 2 및 5), PmxE는 각각 6282, 5789개(각각 서열번호 3 및 6)의 아미노산 서열로 이루어진 것으로 분석되었다.

실시예 4: 폴리믹신 생합성 유전자의 염기서열로부터 폴리믹신 구조 예측

Ansari 등의 방법(Nucleic acids Res. 32: W405-W413, 2004)으로 패니바실러스 ATCC21830 균주와 F4 균주의 폴리믹신 생합성 유전자군을 분석한 결과 모두 도 2과 같이 pmxA, pmxB, pmxC, pmxD 및 pmxE 유전자 구조로 구성되어 있음을 알 수 있었고, PmxA, PmxB 및 PmxE의 각 모듈의 A 도메인은 도 2에 기술된 바와 같이 2,4-diaminobutyric acid(Dab), 류신(Leu), 트레오닌(Thr) 및 페닐알라닌(Phe)의 아미노산을 인식하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 분석을 통해 예측된 폴리믹신의 구조는 도 3에 나타난 것과 같이 폴리믹신 B와 E임을 알 수 있었고, 이는 실시예 2에서 보여준 결과와 일치하였다. 그런데 폴리믹신 B를 생산하는 것으로 확인된 F4균의 PmxE의 모듈 3의 경우 DAB을 D 형으로 변환하는 광학이성질체화(epimerization, E) 도메인을 가지고 있다. 이는 기존 보고에 의해 폴리믹신 B의 구조중 3번째 사슬의 Dab이 L 형으로 알려져 있으나 F4 균주가 생산하는 폴리믹신 B의 3번째 Dab은 D 형일 가능성이 있음을 의미한다.

이상의 결과에서 폴리믹신 B와 E를 생산하는 생합성 효소 유전자군은 폴리믹신 A 생합성 효소 유전자군(Choi et al., J. Bacteriol. 191(10): 3350-3358, 2009)의 경우와 마찬가지로 pmxA, pmxB, pmxC, pmxD 및 pmxE의 5개의 유전자로 이루어져 있고 이중 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 pmxA, pmxB 및 pmxE임을 알 수 있었다. 또한 폴리믹신 생합성 과정에 참여하는 모듈의 순서도 PmxE, PmxA 및 PmxB 순서로서 서로 동일하다. 따라서 이상에서 밝혀진 3종 폴리믹신 생합성 효소의 경우로 미루어 볼 때 다양한 종류의 폴리믹신을 생산하는 생합성 효소는 대부분 이와 같은 구조를 가지고 있을 것으로 예상된다.

본 발명의 폴리믹신 생합성 효소 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 종래에 이를 생산하는 균주 자체로부터 분리하거나 화학합성에만 의존하던 폴리믹신 B 및 E의 생산을 유전공학 기술을 활용하여 외래 숙주세포로부터 더욱 경제적으로 수행할 수 있게 함으로써, 다중 항생제 내성균에 의한 감염증 치료 분야에 매우 효율적으로 사용될 수 있으며, 독성이 더 적은 폴리믹신 유도체의 제조에 활용될 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC11667 20100316

서열목록 전자파일 첨부

Claims (21)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxA 폴리펩티드 소단위체, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxB 폴리펩티드 소단위체 및 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PmxE 폴리펩티드 소단위체로 구성되는 분리된 폴리믹신 B 생합성 효소.
   
2. 삭제
3. 제 1항의 폴리믹신 B 생합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제 3항에 있어서, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxA 유전자, 서열번호 8로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxB 유전자 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxE 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서, 상기 pmxA, pmxB 및 pmxE 유전자는 유전자 클러스터의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
   
7. 제 6항에 있어서, 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxC 유전자 및 서열번호 11로 기재되는 핵산서열을 갖는 pmxD 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리믹신 B 생합성용 발현벡터.
    
14. 제 13항의 발현벡터가 비염색체성으로 형질도입되어 제조된 폴리믹신 B 생합성용 형질전환 숙주세포.
    
15. 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 게놈 내에 삽입되어 제조된 폴리믹신 B 생합성용 형질전환 숙주세포.
    
16. 제 14항의 형질전환 숙주세포를 1) 영양배지에서 배양하는 단계;및 2) 폴리믹신 B를 분리하는 단계를 포함하는 폴리믹신 B의 제조방법.
    
17. 삭제
18. 삭제
19. 제 15항의 형질전환 숙주세포를 1) 영양배지에서 배양하는 단계;및 2) 폴리믹신 B를 분리하는 단계를 포함하는 폴리믹신 B의 제조방법.
    
20. 삭제
21. 삭제

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