FR2863627A1 - Promoteurs et leur usage - Google Patents

Abstract

Promoteurs et leur usage. Deux promoteurs, les promoteurs acuF et hsp, comprennent les séquences de nucléotides de SEQ ID NO : 1 et 2, respectivement.

Description

PROMOTEURS ET LEUR USAGE

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION La présente invention concerne des promoteurs et leur usage.

Du point de vue historique, le genre Monascus a été généralement utilisé en tant qu'additifs alimentaires en Chine et dans les pays d'Asie. Le ferment est obtenu sous la forme de grains écarlate à rouge pourpre qui ont la structure du grain de riz originale bien conservée. En outre, un effet de promotion de la santé est traditionnellement attribué au produit. L'application de Monascus à la fabrication du vin de riz est due à sa forte teneur en alpha-amylase qui favorise la conversion de l'amidon en glucose. Les investigations scientifiques ont confirmé les effets pharmacologiques du ferment de Monascus tels que Monacolin K, Mevinolin, et d'autres. L'effet de conservation du ferment de Monascus a aussi été confirmé.

Les études effectuées dans ce domaine ont été focalisées sur les produits de gènes de l'espèce Monascus, un intérêt croissant concerne le fait que la base de données Monascus EST peut fournir davantage d'informations pour la technologie de recombinaison de l'ADN.

Résumé de l'invention Les auteurs de la présente invention ont recherché dans la base de données EST Monascus BCRC 38072 déposée auprès de l'institut Food Industry Research and Development Institute.' Deux gènes ayant des taux élevés d'expression ont été obtenus et identifiés en tant que gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) et gène de protéine de choc thermique (hsp). Les régions en amont des deux gènes ont été examinées et deux régions promotrices ont été identifiées. La présente invention était alors achevée.

En conséquence, un mode de réalisation de la présente invention fournit une molécule d'ADN isolée comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses. La molécule d'ADN a une activité de promoteur.

Est également fourni un ADN recombinant incluant une région promotrice et une région codante. La région promotrice possède la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses et la région codante possède une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée.

Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un vecteur d'expression comprenant un promoteur. Le promoteur possède la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses.

Un autre mode de réalisation encore de la présente invention fournit une molécule d'ADN isolée comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 2 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses. La molécule d'ADN a une activité de promoteur.

En outre, un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un ADN recombinant comprenant une région promotrice et une région codante. La région promotrice possède la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 2 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses et la région codante possède une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée.

De surcroît, un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un vecteur d'expression comprenant un promoteur ayant la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 2 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses.

Brève description des dessins

Les modes de réalisation de la présente invention peuvent être plus complètement compris et d'autres avantages ressortir lorsqu'il est fait référence à la description suivante et aux dessins annexés dans lesquels: La figure 1 illustre les procédures correspondant à un mode de 30 réalisation d'une région promotrice acuF.

La figure 2 illustre le vecteur recombinant du mode de réalisation d'une région promotrice acuF. Le mode de réalisation de la région promotrice acuF a été cloné dans le vecteur pHygEGFP pour fournir le vecteur recombinant pMS-acuF.

Les figures 3A et 3B illustrent l'expression de EGFP après transformation de pMS-acuF. Figure 3A: champ clair; Figure 3B: sous filtre fluorescent.

La figure 4 illustre les procédures correspondant à un mode de réalisation d'une région promotrice Hsp.

La figure 5 illustre le vecteur recombinant du mode de réalisation d'une région promotrice Hsp. Le mode de réalisation de la région promotrice Hsp a été cloné dans le vecteur pHygEGFP pour fournir pMS-hsp.

Les figures 6A et 6B illustrent l'expression de la EGFP après transformation de pMS-hsp. Figure 6A: sous champ clair; Figue 6B: sous filtre fluorescent.

La figure 7 illustre l'électrophorèse du produit de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). File 1: marqueur de 1 kb (échelle d'ADN Bio1 kbTM) ; files 2 à 5: transformants n 1 à 4; file 6: BCRC 38072 de type sauvage, (-) contrôle; et file 7: pHygEGFP, (+) contrôle.

Description détaillée de l'invention

Deux gènes ayant des taux élevés d'expression ont été obtenus par recherche dans la base de données EST de Monascus BCRC 38072 recueilli par l'institut 'Food Industry Research and Development Institute' et identifiés en tant que gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) et gène de protéine de choc thermique (Hsp). Il a été proposé que les deux gènes soient régulés par de puissants promoteurs en amont, et que les promoteurs puissent être utilisés pour la surexpression de protéines.

On a observé que Monascus BCRC 38072 avait les caractéristiques suivantes: Caractéristiques macroscopiques: CYA, 25 C, 7 jours. Colonies de 25 à 26 mm de diamètre, mycélium blanc initialement, devenant orange rougeâtre clair, revenant orange rouge profond.

MEA, 25 C, 7 jours. Colonies de 48 mm de diamètre, orange rougeâtre clair, revenant orange rouge vif.

G25N, 25 C, 7 jours. Colonies de 28 à 29 mm de diamètre, orange rouge profond, orange jaune profond aux centres.

Caractéristiques microscopiques: Aleurioconidia existant seul ou occasionnellement en courtes chaînes, obpyriforme du globose, 10 à 13 x 8 à 10 pm. Cleistothecia globose, 37 à 72 pm de diamètre. Ascospores hyalines, ellipsoïdes, 4,6 à 6,3 (-6,6) x 3,3 à 4,2 pm.

Conformément au système de classification de Hawksworth & Pitt (1983), BCRC 38072 a été identifié comme ayant des: Caractéristiques morphologiques: BCRC 38072 est entre M. pilosus et M. rubber.

1. BCRC 38072 est similaire au M. pilosus par la couleur des colonies et le taux de croissance.

2. BCRC 38072 est similaire au M. rubber par la morphologie de 15 l'ascospore.

Analyse de la séquence: BCRC 38072, M. rubber, et M pilosus partagent une similarité de séquence de 100 % dans les fragments cl'ADNr ITS et le gène de la ^-tubuline. Identification des espèces: BCRC 38072 a été temporairement dénommé Monascus pilosus K. Sato ex D. Hawksw. & Pitt.

La phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) est importante pour la gluconéogenèse chez les animaux et est exprimée de façon persistante et puissante dans les cellules.

La gluconéogenèse chez un animal comprend les étapes de transfert du pyruvate en oxaloacétate par la pyruvate carboxylase, et de transfert d'oxaloacétate en phosphoénolpyruvate par la phosphoénolpyruvate carboxykinase. Les réactions sont représentées ci-dessous. r

PyruvIe+CO+AIP 111,0 >- C iloaoe te±ALP+f+2+ phosphoenolpyruvate carboxykinase Oxaloacetate+GTP phosphoenolpyruvate+GDP+CO2 Pyruvate+ATP+ GTP+H20 phosphoenolpyruvate+ADP+GDP+Pi+CO2 La protéine de choc thermique (Hsp) est une famille de protéines ayant des gènes hautement conservés et est répandue chez les procaryotes et les eucaryotes. Cette famille de protéines inclut 4 sous-familles: les familles Hsp 90 (83 à 90 KDa), Hsp 70 (66 à 78 KFa), Hsp 60, et de petites Hsp classées en fonction de leurs poids moléculaires. La surexpression de ces protéines chez un animal est induite par des stimuli environnementaux.

Les promoteurs des gènes de acuF et de Hsp ont été comparés à la base de données publiée par un BLAST, et aucune séquence similaire n'a été trouvée. Les vecteurs recombinants ont ensuite été préparés par la recombinaison des promoteurs acuF ou Hsp avec pHygEGFP qui inclut Hph (hygromycine B phosphotransférase) et la protéine de fusion correspondant à la protéine de fluorescence verte amplifiée (EGFP). Il a été prouvé que les deux promoteurs ont l'activité d'activation des gènes en aval à partir de l'observation de l'expression de la protéine EGFP en utilisant ces vecteurs recombinants.

(I) Promoteur acuF En conséquence, un mode de réalisation de la présente invention fournit une molécule d'ADN isolé comprenant une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses. La séquence d'ADN a une activité de promoteur. La molécule d'ADN ayant une activité promotrice peut comprendre entre environ 117 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, en particulier entre environ 367 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, plus particulièrement entre environ 517 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1. En outre, la molécule d'ADN est obtenue à partir de bactéries ou de champignons, en particulier à partir de l'espèce Monascus, plus particulièrement à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus. La molécule d'ADN peut être clonée par manipulation génétique à partir de la séquence en amont du codon d'initiation de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) dans BCRC 38072 déposé auprès de l'institut 'Food Industry Research and Development Institute.' La manipulation génétique inclut la construction d'une collection de fragments d'ADN chromosomique, l'hybridation des colonies, la présentation de l'amorce, ou l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). De plus, il est aisé pour l'homme du métier d'obtenir la séquence d'ADN ou la région promotrice substantielle par amplification en chaîne par polymérase (PCR), hybridation, et synthèse artificielle selon la séquence d'ADN décrite dans la présente invention. Les conditions rigoureuses pour l'hybridation peuvent être consultées dans le brevet européen n 1 325 959 Al P7 [0036].

Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un ADN recombinant comprenant une région promotrice et une région codante. La région promotrice possède la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1, ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses. En particulier, la région promotrice comprend entre environ 117 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, plus particulièrement, entre environ 367 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, ou même entre environ 517 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1. La région promotrice peut être obtenue à partir de l'espèce Monascus, en particulier, à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus, et peut être clonée par manipulation génétique à partir de la séquence en amont du codon d'initiation de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) dans BCRC 38072 déposé auprès de l'institut Food Industry Research and Development Institute.' La région codante comprend une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée. La protéine désirée inclut des enzymes telles que la protéase, la polykétide synthase et la lipase; des facteurs de transcription tels que les activateurs et l'ARN polymérase; et une hormone telle que l'insuline et un facteur de croissance.

Un autre mode de réalisation encore de la présente invention fournit un vecteur d'expression comprenant un promoteur ayant la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 1 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 1 dans des conditions rigoureuses. Le promoteur est tel que défini dans la région promotrice du mode de réalisation de l'ADN recombinant. Le matériel pour construire le mode de réalisation du vecteur d'expression inclut une séquence de molécule adaptée à l'autoamplification dans une cellule hôte ou à l'intégration dans le chromosome hôte, tel qu'un plasmide, un phage ou un virus. Le vecteur d'expression inclut sélectivement une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée, et la protéine désirée inclut des enzymes telles que la protéase, la polykétide synthase et la lipase; des facteurs de transcription tels qu'un activateur et l'ARN polymérase; et une hormone telle que l'insuline et un facteur de croissance.

Un autre aspect de la présente invention concerne un système d'expression comprenant le vecteur d'expression défini, et une cellule hôte adaptée à l'expression de la protéine désirée. Le vecteur est transformé dans la cellule hôte par transformation. La cellule hôte correspond à une cellule hôte quelconque adaptée à l'expression de la protéine désirée. Les cellules hôtes adaptées comprennent les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insectes, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être de l'espèce Monascus, en particulier Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC 38072. La transformation peut être parfaite par application d'une méthode de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en utilisant le système hôte-vecteur normal connu. Voir le brevet européen n 1 325 959 Al P5 [0022].

La présente invention concerne aussi un transformant comprenant une séquence de nucléotide de a) SEQ ID NO: 1, b) entre environ 117 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, c) entre environ 367 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, ou d) entre environ 517 et environ 1 116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1, ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à la séquence de nucléotides définie ci- dessus dans des conditions rigoureuses. Le transformant comprend en outre une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée.

La présente invention concerne aussi une méthode permettant l'expression d'une protéine. La méthode comprend la culture d'un mode de réalisation d'un transformant qui inclut une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée dans un milieu, pour produire et accumuler la protéine désirée à partir du transformant dans le milieu, et récupérer la protéine désirée à partir du milieu.

(II) Promoteur Hsp Un mode de réalisation de la présente invention fournit une molécule d'ADN isolé comprenant une séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 2 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses. La molécule d'ADN a une activité de promoteur. La molécule d'ADN ayant une activité de promoteur peut comprendre entre environ 443 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, en particulier entre environ 759 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, plus particulièrement entre environ 982 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2. La molécule d'ADN peut être obtenue à partir de bactéries ou de champignons, en particulier à partir de l'espèce Monascus, plus particulièrement à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus. L'ADN a été cloné par manipulation génétique à partir de la séquence en amont du codon d'initiation de la protéine de choc thermique (hsp) dans BCRC 38072 déposé auprès de l'institut 'Food Industry Research and Development Institute.' La manipulation génétique inclut la construction d'une collection de fragments d'ADN chromosomique, l'hybridation des colonies, le clonage en aveugle et l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). De plus, la séquence d'ADN ou la région promotrice substantielle peut être obtenue par les hommes du métier par amplification en chaîne par polymérase (PCR), hybridation et synthèse artificielle selon la séquence décrite dans la présente invention. Les conditions rigoureuses pour l'hybridation peuvent être consultées dans le brevet européen n 1 325 959 Al P7 [0036].

Un autre aspect de la présente invention fournit un ADN recombinant comprenant une région promotrice et une région codante. La région promotrice comprend une séquence de nucléotides SEQ ID NO: 2 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses. En particulier, la région promotrice comprend entre environ 443 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, plus particulièrement entre environ 759 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, ou même entre environ 982 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2. La molécule d'ADN peut être obtenue à partir de bactéries ou de champignons, en particulier à partir de l'espèce Monascus, plus particulièrement à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus. L'ADN a été cloné par manipulation génétique à partir de la séquence en amont du codon d'initiation de la protéine de choc thermique (hsp) dans BCRC 38072 déposé auprès de l'institut Food Industry Research and Development Institute.' La région codante comprend une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée. La protéine désirée inclut des enzymes telles que la protéase, la polykétide synthase et la lipase; des facteurs de transcription tels qu'un activateur et l'ARN polymérase; et une hormone telle que l'insuline et un facteur de croissance.

Un autre mode de réalisation encore de la présente invention fournit un vecteur d'expression comprenant un promoteur ayant la séquence de nucléotides SEQ ID NO: 2 ou la séquence de nucléotides pouvant être hybridée à SEQ ID NO: 2 dans des conditions rigoureuses. Le promoteur est tel que défini dans la région promotrice du mode de réalisation de l'ADN recombinant. Le matériel pour construire le mode de réalisation du vecteur d'expression inclut une séquence de molécule adaptée à l'autoamplification dans une cellule hôte ou à l'intégration dans le chromosome hôte, tel qu'un plasmide, un phage ou un virus. Le vecteur d'expression inclut sélectivement une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée, et la protéine désirée inclut des enzymes telles que la protéase, la polykétide synthase et la lipase; des facteurs de transcription tels qu'un activateur et l'ARN polymérase; et une hormone telle que l'insuline et un facteur de croissance.

Un autre aspect de la présente invention concerne un système d'expression comprenant le vecteur d'expression défini, et une cellule hôte adaptée à l'expression de la protéine désirée. Le vecteur d'expression est transformé dans la cellule hôte par transformation. La cellule hôte inclut une cellule quelconque adaptée à l'expression de la protéine désirée. Les cellules hôtes adaptées comprennent les bactéries, les levures, les cellules animales, les cellules d'insectes, les cellules végétales ou les champignons filamenteux. Les champignons filamenteux peuvent être de l'espèce Monascus, en particulier Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus, plus particulièrement BCRC 38072. La transformation peut être parfaite par application d'une méthode de transformation pour les champignons filamenteux appartenant au genre Aspergillus en utilisant le système hôte-vecteur normal connu. Voir le brevet européen n 1 325 959 Al P5 [0022].

La présente invention concerne aussi un transformant comprenant une séquence de nucléotide de a) SEQ ID NO: 2, b) entre environ 443 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, c) entre environ 759 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, d) entre environ 982 et environ 1 478 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 2, ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à la séquence de nucléotides définie cidessus dans des conditions rigoureuses. Le transformant comprend en outre une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée.

La présente invention concerne aussi une méthode permettant l'expression d'une protéine. La méthode comprend la culture d'un transformant qui inclut une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée dans un milieu, pour produire et accumuler la protéine désirée à partir du transformant dans le milieu, et récupérer la protéine désirée à partir du milieu.

Des exemples pratiques sont décrits dans la présente.

Exemple 1: promoteur acuF 1. Matériels: (1) Cellule hôte: Monascus BCRC 38702 (institut Food Industry Research and Development institute').

(2) Cellule compétente: cellules compétentes E. coli DH5111 ECOSTM (Yeastern Biotech Co., Ltd.) (3) Plasmide: pHygEGFP (BD Biosciences), pGEM -T Easy Vector 25 (PROMEGA).

(4) Milieux: a. Pour E. coli: bouillon LB (USB), gélose (USB).

b. Pour l'espèce Monascus et Neurospora crassa: PDA (DIFICO), PDB (DIFICO) , milieu de Vogel (voir *), et gélose supérieure.

(5) Antibiotiques: Ampicilline, Hygromycine B (SIGMA).

* Milieu de Vogel 1. Solution d'oligo-éléments: 5 g d'acide citrique É H2O, 5 g de ZnSO4 É 7 H2O, 1 g de Fe(NH4)2(SO4)2 É 6 H2O, 250 mg de CuSO4 É 5 H2O, mg MnSO4 É H2O, 50 mg de H3BO3, 50 mg de Na2MoO4 É 2 H2O dans 95 ml de ddH2O. Le volume final: 100 ml.

2. Solution de biotine: 5 rng de biotine (Sigma) dans 199 ml d'éthanol à 5 %.

3. 50X la solution saline de réserve de Vogel: 150 g de citrate de Na3 É 5 H2O, 250 g de KH2PO4, 100 g de NH4NO3, 10 g de MgSO4 É 7 H2O, 5 g de CaCl2 É 2 H2O (dissoute lentement dans 20 ml de H2O précédemment) dans 750 ml de ddH2O, ajouter 5 ml de solution d'oligo-éléments et 5 ml de solution de biotine. Le volume final: 1 litre. Après filtration, stérilisation, la solution est stockée à la TA.

4. Milieu de Vogel modifié : glucose à 1 % dans 1 X la solution saline de Vogel.

2. Procédures: Les procédures relatives au promoteur acuF sont telles que représentées sur la figure 1. Un gène hautement exprimé Contig ID: MPT000008457 a été trouvé dans la base de données EST Monascus BCRC 38072 de l'institut Food Industry Research and Development Institute' (FIRDI) et identifié comme étant le gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF). On a spéculé sur le fait que le gène était régulé par un puissant promoteur. On a ensuite mis au point une sonde de 465 pb conformément à la séquence de 5' terminal du gène de acuF. La sonde acuF a été amplifiée par amplification en chaîne par polymérase (PCR) à partir d'un chromosome de Monascus. Après cela, le produit de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) a été ligationné au vecteur pGEM -T Easy Vector, et on a obtenu la sonde acuF par marquage avec de la DIG (Digoxigénine). On a effectué l'hybridation des colonies en utilisant la sonde dans une librairie de fosmides de BRCR 38072 de Monascus, et on a criblé le fosmide contenant le gène de acuF. Le fosmide mpf01014A4 a été séquencé par présentation de l'amorce, et la séquence du promoteur en amont du gène de acuF a été localisée. La séquence du promoteur de 1 116 pb a été séquencée avec succès et ensuite comparée avec la base de données par BLAST mais aucun gène similaire n'a été trouvé. La séquence de promoteur acuF de 1 116 pb a été ligaturée dans pHygEGFP par les sites de restriction E,glll et KpnI et le plasmide résultant a été désigné par pMS-al comme illustré sur la figure 2 (celui de droite). pMS-al a été transformé dans Monascus et l'expression de la EGFP a été observée comme illustré sur la figure 3 dans laquelle la figure 3A est en champ clair et la figure 3B sous un filtre fluorescent. Les résultats ont confirmé que le promoteur acuF a une activité de promoteur. Il convient de remarquer que pMS-al transformé dans DH5^ de E. coli a été déposé sous le nom de PTA-5687 auprès de la base 'American Type Culture Collection' le 10 décembre 2003. Les procédures sont décrites en détail ci-dessous.

A. Obtention du fragment de gène de la sonde acuF La sonde acuF a été clonée par amplification en chaîne par polymérase (PCR) à partir de BCRC 38072.

Les amorces ont été mises au point conformément à la base de données Monascus EST.

Amorce motrice: 5'-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3' (SEQ ID NO: 3) Amorce inverse: 5'- AGTATGCGGTCAGAGCACC-3' (SEQ ID NO: 4) Les conditions de réaction ont été répertoriées ci-dessous.

Matrice Amorce Amorce Polymérase dNT 10x le Mg2 H2 Total d'ADN motrice inverse taq P tampon + O (10 ng/pl) (10 pM) (10 pM) 10 mM pl 2 2 2 1 2 10 13 50 100 Cycle 94 C 53 C 72 C 4 C 1 er passage 1 7 min 2eme 30 1 min 30 s 30 s passage Hème 1 15 min o0 passage Après la réaction, on a extrait les fragments amplifiés avec un volume égal de phénol/chloroforme (24/25) et on les a précipités avec 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volume d'éthanol à 100 %. On a lavé l'ADN précipité avec de l'éthanol à 70 %, on l'a centrifugé et séché à l'air. On a dissous le produit dans de ddH2O et on l'a stocké à -20 C.

B. Recombinaison du plasmide TA-acuF On a purifié et recueilli le produit de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) de la sonde acuF. On a mélangé l'ADN avec le vecteur pGEM -T Easy Vector selon un rapport de 3/1. On a ajouté 1 pl de T4 ADN ligase et de tampon de ligation 10x et on a ajouté une quantité appropriée de ddH2O pour atteindre un volume final de 10 pl. On a effectué la réaction de ligature à température ambiante pendant 1 heure. Après ligature, on a ajouté 5 pl de produit de ligature jusqu'à 100 pl de cellules compétentes E. colt DH5^ ECOSTM pour la transformation. On a criblé et confirmé le plasmide recombinant de 3 483 pb par amplification en chaîne par polymérase (PCR). On a obtenu le plasmide recombinant TA-acuF.

C. Obtention du fragment de promoteur acuF Le gène de promoteur acuF a été cloné par amplification en chaîne par polymérase (PCR) à partir du fosmide: mpf01014A4.

Les amorces et les conditions de réaction utilisées ici sont répertoriées ci-dessous.

Amorce motrice: 5'-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3' (SEQ ID NO: 6) Amorce inverse: 5'-ATGGTACCTGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG-3' (SEQ ID NO: 7) Matrice Amorce Amorce Polymérase dNTP 10x le Mg2 H2 Total d'ADN motrice inverse taq 10 tampon + O (10 ng/pl) (10 pM) (10 pM) mM pl 2 2 2 1 2 10 13 50 100 cycle 94 C 59 C 72 C 4 C Après la réaction, on a extrait les fragments amplifiés avec un volume égal de phénol/chloroforme (24/25) et on les a précipités avec 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volume d'éthanol à 100 %. On a lavé l'ADN précipité avec de l'éthanol à 70 %, on l'a centrifugé et séché à l'air. On a dissous le produit dans de ddH2O et on l'a stocké à -20 C.

D. Préparation de pMS-al recombinant Le produit d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) du promoteur acuF et le vecteur de clonage pHygEGFP ont été digérés séparément par Bglll et Kpnl pendant 4 heures. On a séparé les fragments résultants par électrophorèse de l'ADN et on les a extraits avec le kit d'extraction en gel QlAquick GEL EXTRACTION KIT. On a mélangé le vecteur et le promoteur acuF selon un rapport de 1/3 et on les a ajoutés à de ddH2O pour atteindre un volume final de 10 pI. On a effectué la ligature à 16 C pendant 4 heures. Après ligature, on a ajouté 5 pl de la réaction dans 100 pl de cellules compétentes E. coli DHSo ECOSTM pour la transformation. On a criblé le plasmide avec 6,1 kb et on l'a confirmépar amplification en chaîne par polymérase (PCR). On a obtenu le plasmide recombinant pMS-al.

E. Préparation des protoplastes de Monascus On a déposé une solution de spores de Monascus sur des lamelles de PDA et on les a mises à incuber à 30 C pendant 5 à 7 jours. On a dissocié les spores avec de l'eau stérilisée et on les a filtrées avec un tissu miracloth bicouche stérilisé afin d'éliminer l'hyphe et la gélose. On a compté les spores filtrées en utilisant la microscopie optique avec un hémocytomètre. On a récolté les spores selon une concentration de 10' spores/ml dans 50 ml de milieu de Vogel modifié et on les a mises à incuber à 30 C sous une vibration de 200 tr/min pendant 16 à 18 heures. On a filtré les spores germinées avec un 1 & passage 1 7 min 2ème 30 1 min 30 s 1 min;passage j3eme 1 15 min o0 passage tissu miracloth bicouche et on les a lavées avec de l'eau stérilisée. On a rincé l'hyphe avec un tampon de digestion enzymatique.

On a lavé l'hyphe sur le tissu miracloth avec 10 ml de tampon de digestion enzymatique et on l'a ajouté à 5 ml de mélange enzymatique. On a soumis le mélange à un vortex à température ambiante pendant 30 minutes. On a observé la dégradation de la paroi cellulaire en utilisant la microscopie optique toutes les dix minutes durant le vortex jusqu'à ce que les protoplastes soient libérés à partir de 90 % de l'hyphe. On a filtré le mélange avec le tissu miracloth bicouche, et on a centrifugé la solution filtrée à 1 500 tr/min à 4 C pendant 15 minutes pour recueillir les protoplastes. On a écarté le surnageant, et on a lavé le granule avec un tampon de digestion enzymatique deux fois et ensuite avec du STC deux fois. On a ajouté 1,5 ml de STC, 20 pl de DMSO et 0,4 ml de PTC dans la solution et on a compté les protoplastes en utilisant la microscopie. Les protoplastes étaient distribués selon une concentration de 10' protoplastes/ml et stockés à -80 C.

F. Transformation On a lavé les protoplastes avec du STC deux fois et on les centrifugés à 1 500 tr/min à 4 C pendant 15 minutes. On a écarté le surnageant, et le granule de protoplastes a été résolu dans 50 pl de STC. On a ajouté 1 à 10 pg d'ADN plasmidique dans la solution. On a effectué l'électroporation dans les conditions de 200 Ohms, 25 pF, 0,7 KV. On a ensuite ajouté 1 ml de tampon de régénération dans le mélange, et on a placé le mélange à 30 C jusqu'au lendemain. On a ajouté 10 ml de gélose supérieure à 50 C contenant 30 pg/ml d'hygromycine B au mélange, et on a ensuite versé le mélange sur une gélose supérieure contenant 30 pg/ml d'hygromycine B. Après 3 à 5 jours de culture à 30 C, on peut observer les transformants.

G. Criblage et confirmation des transformants (1) On a produit des échantillons de quelques hyphes et spores du transformant pour les placer sur une lamelle, on a ajouté une goutte d'eau distillée, et on a recouvert la lamelle avec une lame protectrice. On a ensuite observé l'échantillon en utilisant la microscopie optique. On a observé la fluorescence verte de l'hyphe et de la spore sous un filtre GFP (Ex. 430 à 510 nm) ; Em. 475 à 575 nm).

(2) On a fait croître le transformant dans du PDB (bouillon de dextrose de pomme de terre) à 30 C sous une vibration de 200 tr/min pendant 5 à 10 jours. On a homogénéisé la culture et on a extrait l'ADN chromosomique. On a effectué l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) avec une amorce spécifique à HPH-EGFP et on a obtenu un produit de 1 740 pb.

H. Confirmation du fait que le plus petit fragment a une activité de promoteur Afin de confirmer davantage le fait que le plus petit fragment du promoteur acuF (1 116 pb) a une activité de promoteur, on a préparé les produits de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ayant des fragments de 1 000 pb, de 750 pb, de 600 pb et de 500 bp de promoteur acuF à partir de pMS-al. Les amorces pour la préparation de ces produits d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) sont répertoriées cidessous. 1000pb: Amorce motrice: acuF-B2 gaagatctTGTCGATGCAATCGGGCAATCC (SEQ ID NO: 13) Amorce inverse: acuF-Kpnl atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG (SEQ ID NO: 14) 750pb: Amorce motrice: acuF-B3 gaagatctTGATGATTGGGATCGGACTCGG(SEQ ID NO: 15) Amorce inverse: acuF-Kpnl atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG (SEQ ID NO: 14) 600 pb: Amorce motrice: acuF-B4 gaagatctTGCGGATCCGAGGATAAAAC (SEQ ID NO: 16) Amorce inverse: acuFKpnl atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG (SEQ ID NO: 14) 500pb: Amorce motrice: acuF-B5 gaagatctCCCGGTATTGTCCGAGGCTC (SEQ ID NO: 17) Amorce inverse: acuF-Kpnl atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG (SEQ ID NO: 14) Les produits d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ayant des fragments de 1 000 pb, de 750 pb, de 600 pb et de 500 pb de promoteur acuF ont été clonés dans pMS et désignés par pMS-a2, pMS-a3, pMS-a4 et pMS-a5. Ces plasmides ont ensuite été transformés dans Monascus BCRC 38072 et criblés par des plaques de PDA contenant 30 ug/ml de Hygr. Les résultats sont représentés ci-dessous.

Monascus BCRC 38072 taille du Hyg 30 ug/ml' Fluorescence2 promoteur pMSal 1 116 pb R + pMS-a2 1 000 pb R + pMS-a3 750 pb R pMS-a4 600 pb R + pMSa5 500 pb N.R. N.D.

: R: résistance; N.R. : non-résistance.

2: + : positif; - : négatif.

N.D. : non détectée.

Le plus petit fragment ayant une activité de promoteur est celui de 600 pb. La fluorescence peut être détectée dans le transformant contenant le fragment de 600 pb.

Ces plasmides ont aussi été transformés dans Monascus pilosus BCRC 31527 et criblés par des plaques de PDA contenant 50 ug/ml de Hygr. Les résultats sont représentés ci-dessous.

Monascus pilosus BCRC taille du Hyg 50 ug/ml' Fluorescence2 31527 promoteur pMS-a3 750 pb R + pMS-a4 600 pb R + pMS-a5 500 pb N.R. N. D.

: R: résistance; N.R. : non-résistance. 2: + : positif; - : négatif. 20 N. D. : non détectée.

Le plus petit fragment ayant une activité de promoteur est celui de 600 pb. La fluorescence peut être détectée dans le transformant contenant le fragment de 600 pb.

Ces plasmides ont aussi été transformés dans Neurospora crassa BCRC 5 32685 et criblés par des plaques de PDA contenant 50 ug/ml de Hygr. Les résultats sont représentés ci-dessous.

Neurospora crassa BCRC taille du promoteur Hyg 200 ug/ml' pMS-a3 750 pb R pMS-a4 600 pb R pMS-a5 500 pb N.D.

: R: résistance; N.R. : non-résistance.

N.D. : non détectée.

Les résultats ont aussi confirmé que le plus petit fragment ayant une 10 activité de promoteur est celui de 600 pb.

Les plus petits fragments de promoteur acuF ayant une activité de promoteur ont été confirmés comme ayant 600 pb (SEQ ID NO: 18) et peuvent être exprimés dans Monascus BCRC 38072, Monascus pilosus BCRC 31527 et Neurospora crassa BCRC 326.

Exemple 2: promoteur Hsp 1. Matériels: (1) Cellule hôte: Monascus BCRC 38702 (de l'institut Food Industry Research and Development institute').

(2) Cellule compétente: cellules compétentes E. coli DH5^ ECOSTM (Yeastern Biotech Co., Ltd.) (3) Plasmide: pHygEGFP (BD Biosciences), pGEM -T Easy Vector (PROMEGA).

(4) Milieux: a. Pour E. coli: bouillon LB (USB), gélose (USB).

b. Pour l'espèce Monascus et Neurospora crassa: PDA (DIFICO), PDB (DIFICO) , milieu de Vogel (comme répertoriés ci-dessus), et gélose supérieure.

(5) Antibiotiques: Ampicilline, Hygromycine B (SIGMA).

2. Procédures: Les procédures relatives au promoteur Hsp sont telles que représentées sur la figure 4. La protéine de choc thermique (Hsp) obtenue à partir de la collection de fragments d'ADNc chromosomique de Monascus BCRC 38072 a été trouvée hautement exprimée après une incubation de 3 jours à 25 C. On a mis au point une sonde pour Hsp conformément à la séquence génétique 5' terminal de Hsp et on l'a amplifiée à partir du chromosome de Monascus par amplification en chaîne par polymérase (PCR). Le produit d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) a été ligaturé au vecteur pGEM -T Easy Vector, et on a mis au point la séquence résultante sous la forme de TA-Hsp. La TAHsp a été marquée avec de la DIG (Digoxigénine) et amplifiée par amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour produire une sonde avec un marquage à la DIG. On a effectué l'hybridation des colonies dans une librairie de fosmides de Monascus BRCR 38072 en utilisant la sonde, et on a trouvé le fosmide contenant Hsp. La séquence génétique de Hsp et la région 5' ont été localisées à partir du résultat du séquençage du fosmide en utilisant le clonage en aveugle. On a mis au point les amorces à partir de la région 5' du gène Hsp. On a amplifié une région de 1 478 pb à partir du chromosome de Monascus par amplification en chaîne par polymérase (PCR). La région de 1 478 pb a été digéré aux niveaux des sites de restriction Bglll et Xhol et ligaturée à un vecteur commercialisé pHygEGFP. On a mis au point le plasmide résultant sous la forme de pMS-hsp comme illustré sur la figure 5 (celui de droite). Le vecteur pMS-hsp a été transformé dans Monascus BCRC 38072 et les transformants ont été criblés avec de l'hygromycine E3. L'observation de l'expression de la EGFP dans les transformants obtenus en utilisant la microscopie par fluorescence indique que la région de 1 478 pb a une activité de promoteur comme illustré sur la figure 6. La figure 6A est sous un champ clair et la figure 6B est sous un filtre fluorescent. On a extrait l'ADN chromosomique du transformant Monascus BCRC 38072 avec un kit QIAGEN DNeasy Plant kit et on l'a utilisé comme matrice pour l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) avec les amorces spécifiques à HPH-EGFP. On a obtenu un produit d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) de 1 740 pb comme illustré sur la figure 7. File 1: indique un marqueur de 1 kb (ADN échelle Bio-1 kbTM) ; files 2 à 5: transformants n 1 à 4; file 6: BCRC 38072 de type sauvage, (-) contrôle; et file 7: pHygEGFP, (+) contrôle. II convient de remarquer que pMS-hsp transformé dans E. coli DH5^ a été déposé sous le nom de PTA-5688 auprès de la base 'American Type Culture Collection' le 10 décembre 2003. Les procédures sont décrites en détail ci-dessous.

A. Obtention du fragment de gène de la sonde Hsp La sonde Hsp a été clonée par amplification en chaîne par polymérase 10 (PCR) à partir de Monascus BCRC 38072.

Les amorces ont été mises au point conformément à la base de données EST Monascus.

Amorce motrice: mptc3161-A: 5'-GCTTATCTCCAATGCCTCCG -3' (SEQ ID NO: 8) 15 Amorce inverse: mptc3161-B: 5'-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3' (SEQ ID NO: 9) Les conditions de réaction ont été répertoriées ci-dessous.

Matrice Amorce Amorce Polynnéra dNTP 10x le Mg2 H2O Total d'ADN motrice inverse se taq 10 tampon + (10 ng/pl) (10 pM) (10 pM) mM pl 2 2 2 1 2 10 13 50 100 Cycle 94 C 5 5 C 72 C 4 C 1 ef passage 1 7 min 2eme 30 1 min 30 s 30 s passage 3eme 1 15 min co passage Après la réaction, on a extrait les fragments amplifiés avec un volume 20 égal de phénol/chloroforme (24/25) et précipités avec 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volume d'éthanol à '100 %. On a lavé l'ADN précipité avec de l'éthanol à 70 %, on l'a centrifugé et séché à l'air. On a dissous le produit dans de ddH2O et on l'a stocké à -20 C.

B. Recombinaison du plasmide TA-Hsp On a purifié et recueilli le produit de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) de la sonde Hsp. On a mélangé l'ADN avec le vecteur pGEMe-T Easy Vector selon un rapport de 3/1. On a ajouté 1 pl de T4 ADN ligase et de tampon de ligature 10x et on a ajouté une quantité appropriée de ddH2O pour atteindre un volume final de 10 pl. On a effectué la réaction de ligature à température ambiante pendant 1 heure. Après ligature, on a ajouté 5 pl de la réaction de ligature dans 100 pl de cellules compétentes E. col/ DH5^ de ECOSTM pour la transformation. On a criblé et confirmé le plasmide recombinant de 3 482 pb par amplification en chaîne par polymérase (PCR). On a obtenu le plasmide recombinant TA-Hsp.

C. Obtention du fragment de promoteur HISp On a mis au point les amorces du promoteur Hsp à partir de la base de données EST Monascus, et on a cloné le gène du promoteur Hsp par amplification en chaîne par polymérase (PCR) à partir de BCRC 38072.

Les amorces et les conditions de réaction utilisées ici sont répertoriées ci-dessous.

Amorce motrice: Mpsl 7-9259-F: 5'-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3' (SEQ ID NO: 11) Amorce inverse: Mps17-7782-R: 5'-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3' (SEQ ID NO: 12) Matrice Amorce Amorce Polyméra dNTP 10x le Mg2+ H2 Total d'ADN motrice inverse se taq 10 tampon O (10 ng/pl) (10 pM) (10 pM) mM p l 2 2 2 1 2 10 13 50 100 Cycle 94 C 60 C 72 C 4 C Après la réaction, on a extrait les fragments amplifiés avec un volume égal de phénol/chloroforme (24/25) et précipités avec 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et 2 volume d'éthanol à 100 %. On a lavé l'ADN précipité avec de l'éthanol à 70 %, on l'a centrifugé et séché à l'air. On a dissous le produit dans de ddH2O et on l'a stocké à - 20 C.

D. Préparation de pMS-hsp recombinant Le produit d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) du promoteur Hsp et le vecteur de clonage pHygEGFP ont été digérés séparément par Bglll et Xhol pendant 16 heures. On a séparé les fragments résultants par électrophorèse de l'ADN et on les a extraits avec le kit d'extraction en gel QlAquick GEL EXTRACTION KIT. On a mélangé le vecteur et le promoteur Hsp selon un rapport de 1/3, et on a ajouté de ddH2O pour atteindre un volume final de 10 pl. On a effectué la ligature à 16 C pendant 16 heures. Après ligature, on a ajouté 5 pl de la réaction dans 100 pl de cellules compétentes E. coli DH511 ECOSTM pour la transformation. On a criblé et confirmé le plasmide avec 6 215 pb par amplification en chaîne par polymérase (PCR). On a obtenu le plasmide recombinant pMS-hsp.

E. Préparation des protoplastes de Monascus On a déposé une solution de spores de Monascus sur des lamelles de PDA et on les a mises à incuber à 30 C pendant 5 à 7 jours. On a dissocié les spores avec de l'eau stérilisée et on les a filtrées avec un tissu miracloth bicouche stérilisé afin d'éliminer l'hyphe et la gélose. On a compté les spores filtrées en utilisant la microscopie optique avec un hémocytomètre. On a récolté les spores selon une concentration de 10' spores/mi dans 50 ml de milieu de Vogel modifié et on les a mises à incuber à 30 C sous une vibration de 200 tr/min pendant 16 à 18 heures. On a filtré les spores germinées avec un tissu miracloth bicouche et on les a lavées avec de l'eau stérilisée. On a rincé les spores germinées avec un tampon de digestion enzymatique.

1 e passage 1 7 min 2ème 30 1 min 3C) s 1 min passage sème 1 15 min 8 passage On a lavé l'hyphe sur le tissu miracloth avec 10 ml de tampon de digestion enzymatique et on l'a ajouté à 5 ml de mélange enzymatique. On a secoué le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. On a observé la dégradation de la paroi cellulaire en utilisant la microscopie optique toutes les dix minutes de secouage jusqu'à ce que 90 % des protoplastes soient libérés à partir de l'hyphe. On a filtré le mélange avec le tissu miracloth bicouche, et on a centrifugé la solution filtrée à 1 500 tr/min à 4 C pendant 15 minutes pour recueillir les protoplastes. On a écarté le surnageant, et on a lavé le pellet avec un tampon de digestion enzymatique deux fois et ensuite avec du STC deux fois. On a ajouté 1,5 ml de STC, 20 pl de DMSO et 0,4 ml de PTC à la solution et on a compté les protoplastes en utilisant la microscopie. Les protoplastes étaient distribués selon une concentration de 10' protoplastes/ml et stockés à - 80 C.

F. Transformation On a lavé les protoplastes avec du STC deux fois et on les centrifugés à 1 500 tr/min à 4 C pendant 15 minutes. On a écarté le surnageant, et le pellet de protoplastes a été résolu dans 50 pl de STC. On a ajouté 1 à 10 pg d'ADN plasmidique dans la solution. On a effectué l'électro-transformation dans les conditions de 200 Ohms, 25 pF, 0,7 KV. 'On a ensuite ajouté 1 ml de tampon de régénération dans le mélange, et on a placé le mélange à 30 C jusqu'au lendemain. On a ajouté 10 ml de gélose supérieure à 50 C, contenant 30 pg /ml d'hygromycine B, et on a ensuite versé le mélange sur une gélose supérieure contenant 30 pg/ml d'hygromycine B. Après 3 à 5 jours de culture à 30 C, on pouvait observer les transformants.

G. Criblage et confirmation des transformants (1) On a produit des échantillons de quelques hyphes et spores du transformant pour les placer sur une lamelle, on a ajouté une goutte d'eau distillée, on les a recouverts avec une lame protectrice et on les a observés en utilisant la microscopie optique. On a observé la fluorescence verte de l'hyphe et de la spore sous un filtre GFP (Ex. 430 à 510 nm) ; Em. 475 à 575 nm).

(2) On a fait croître le transformant dans du PDB (bouillon de dextrose de pomme de terre) à 30 C sous une vibration de 200 tr/min pendant 5 à jours. On a homogénéisé la culture et on a extrait l'ADN chromosomique. On a effectué l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) avec des amorces spécifiques à HPH-EGFP et on a obtenu un produit de 1 740 pb.

H. Confirmation du fait que le plus petit fragment a une activité de promoteur Afin de confirmer davantage le fait que le plus petit fragment du promoteur Hsp (1 478 pb) a une activité de promoteur, on a préparé les produits de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ayant des fragments de 1 036 pb, de 720 pb et de 497 bp de promoteur Hsp à partir de pMS-HSp. Les amorces pour la préparation de ces produits d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) sont répertoriées ci- dessous.

497 pb: Amorce motrice: CCGAGAGCGCGTATATGTAACG (SEQ ID NO: 19) Amorce inverse: CTGATAGAGCAGATAGATAGATG (SEQ ID NO: 20) 720pb: Amorce motrice: TGAATTGTGTGGGTGCGTGG (SEQ ID NO: 21) Amorce inverse: CTGATAGAGCAGATAGATAGATG (SEQ ID NO: 20) 1036pb: Amorce motrice: CAGTGCATCTTAGCGGTTGG (SEQ ID NO: 22) Amorce inverse: CTGATAGAGCAGATAGATAGATG (SEQ ID NO: 20) 1 478 pb: Amorce motrice: AGTGGCAGCCAACCCTCACC (SEQ ID NO: 23) Amorce inverse: CTGATAGAGCAGATAGATAGATG (SEQ ID NO: 20) On a cloné les produits d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ayant des fragments de 1 478 pb, de 1 036 pb, de 720 pb et de 497 pb de promoteur Hsp dans des vecteurs d'expression et on a ensuite transformé les vecteurs d'expression dans Monascus E3CRC 38072 et on les a criblés avec des plaques de PDA contenant 30 ug/ml de Hygr. Les résultats sont représentés ci-dessous.

taille du promoteur Résistance Hyg' Fluorescence2 1 478 pb R ^ 1 036 pb R N.D.

720 pb R N.D.

497 pb R 1: R: résistance; N.R. : non-résistance.

2: + : positif; - : négatif.

N.D. : non détectée.

Le plus petit fragment ayant une activité de promoteur est celui de 5 497 pb. La fluorescence peut être détectée dans le transformant contenant le fragment de 497 pb.

Ces plasmides ont aussi été transformés dans Monascus pilosus BCRC 31527 et Neurospora crassa BCRC 32685 et criblés avec des plaques de PDA contenant 50 ug/ml ou 200 ug/ml de Hygr. Les résultats sont représentés ci- dessous.

Espèces Résistance Hyg' Fluorescence2 espèce M. BCRC 38072 R ^ M. pilosus R ^ N. crassa R ^ : R: résistance; N.R. : non-résistance.

2: + : positif; - : négatif.

Les plus petits fragments de promoteur Hsp ayant une activité de promoteur ont été confirmés comme ayant 497 pb (SEQ ID NO: 24) et peuvent être exprimés dans Monascus BCRC 38072, Monascus pilosus BCRC 31527 et Neurospora crassa BCRC 326.

Autres modes de réalisation Les modes de réalisation du vecteur d'expression peuvent être obtenus par amplification en chaîne par polymérase (PCR) et ligature du mode de réalisation de la séquence promotrice avec un gène marqueur dans une région en aval de celui-ci. Le gène marqueur peut être, par exemple, le gène de résistance à l'hygromycine ou hyg-GFP et le vecteur d'expression est ensuite construit comme un marqueur pour le criblage de la transformation, par exemple, l'estimation de l'efficacité du clonage du gène.

Les modes de réalisation de la séquence promotrice peuvent aussi être ligaturés à un gène marqueur et à un gène cible désiré au niveau d'une région en aval de celui-ci pour la détection in vivo ou in situ de la réaction de la protéine ou des sites actifs dans la protéine cible.

Dans les modes de réalisation du système d'expression, des transformants, et de la méthode permettant l'expression de la protéine dans la présente invention, le promoteur peut être ligaturé à un gène d'une enzyme désirée telle que la protéase, l'amylase, la chitinase, la phytase, la glucoamylase au niveau d'une région en aval de celui-ci. En utilisant ce système, le temps de production de ces enzymes peut être raccourci et le taux de production peut être considérablement accru. Par exemple, le taux de production accru de la protéase de Monascus amplifie l'efficacité du soja comme milieu de culture, et le coût peut être réduit. En outre, le taux de production accru de l'amylase de Monascus amplifie la saccharification de Monascus durant la fabrication du vin, ce qui a pour résultat l'amélioration du procédé et le développement de nouveaux vins.

Dans d'autres modes de réalisation du système d'expression, des transformants, et des méthodes permettant l'expression de la protéine, le promoteur peut être ligaturé à des gènes de métabolites secondaires tels que le gène de la polykétide synthase, ou de la peptide synthase nonribosomale au niveau d'une région en aval de celui-ci. Ce système permet un temps de production amélioré des métabolites secondaires, augmentant ainsi le taux de production et réduisant considérablement le coût.

De surcroît, les gènes d'activation de la transcription peuvent être insérés dans la partie en aval du mode de réalisation du promoteur dans le vecteur, et les gènes régulés par l'activateur peuvent être activés par l'activateur surexprimé, augmentant ainsi considérablement le taux de production.

Tandis que la présente invention a été décrite au moyen d'exemple et en termes de modes de réalisation préférés, il convient de comprendre que la présente invention n'est pas limitée à ceux-ci.

Référence 1. Système de transformation des champignons appartenant au genre Monascus. Brevet européen n 1 325 959 Al.

2. Lakrod K., Chaisrisook C. et Skinner D. Z., (2003) 'Transformation of Monascus purpureus to hygromycin E3 resistance with cosmid pMOcosX reduces fertility,' Electronic Journal of Biotechnology 6(2) : 143-7.

3. Campoy S., Perez F., Martin J. F., Gutierrez S. et Liras P., (2003) 'Stable transformants of the azaphilone pigment-producing Monascus purpureus obtained by protoplast transformation and Agrobacteriummediated DNA transfer.' Curr. Genet. : 43(6) : 4. Lakrod K., Chaisrisook C. et Skinner D. Z., (2003) 'Expression of pigmentation genes following electroporation of albino Monascus purpureus. ' J.

10 Ind. Microbiol. Biotechnol. 30(6) : 369-74.

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Molécule d'ADN, comprenant une séquence de nucléotides d'environ 517 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses, caractérisée en ce que la molécule d'ADN a une activité de promoteur.

2. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule d'ADN comprend une séquence de nucléotides d'environ 367 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

3. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule d'ADN comprend une séquence de nucléotides d'environ 117 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

4. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule d'ADN comprend une séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

5. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule d'ADN est dérivée à partir de bactéries ou de champignons.

6. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule 5 d'ADN est dérivée à partir de l'espèce Monascus.

7. Molécule d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule d'ADN est dérivée à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus.

8. Molécule d'ADN selon la revendication 7, caractérisée en ce que la molécule d'ADN est dérivée à partir de BCRC 38072 déposé auprès de l'institut Food Industry Research and Development Institute.'

9. Molécule d'ADN selon la revendication 8, caractérisée en ce que la molécule d'ADN est dérivée à partir de la séquence en amont du codon d'initiation du gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) de BCRC 38072.

10. ADN recombinant, comprenant: une région promotrice comprenant une séquence de nucléotides d'environ 517 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses; et une région codante comprenant une séquence de nucléotides codant pour une protéine désirée.

11. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que la région promotrice comprend une séquence de nucléotides d'environ 367 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

12. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que la région promotrice comprend une séquence de nucléotides d'environ 117 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

13. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

14. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que la région 20 promotrice est dérivée à partir de l'espèce Monascus.

15. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que la région promotrice est dérivée à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus.

16. ADN recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce que la région promotrice est dérivée à partir de BCRC 38072 déposé auprès de l'institut Food Industry Research and Development Institute.'

17. ADN recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce que la région promotrice est dérivée à partir de la séquence en amont du codon d'initiation du gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) de BCRC 38072.

18. Vecteur d'expression comprenant un promoteur comprenant une séquence de nucléotides d'environ 517 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

19. Vecteur d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de nucléotides d'environ 367 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

20. Vecteur d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de nucléotides d'environ 117 à environ 1116 nucléotides contigus de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

21. Vecteur d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que le promoteur comprend une séquence de nucléotides de SEQ ID NO: 1 ou une séquence de nucléotides pouvant être hybridée à celle-ci dans des conditions rigoureuses.

22. Vecteur d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que le promoteur est dérivé à partir de l'espèce Monascus.

23. Vecteur d'expression selon la revendication 18, caractérisé en ce que le 15 promoteur est dérivé à partir de Monascus pilosus, Monascus rubber ou Monascus purpureus.

24. Vecteur d'expression selon la revendication 23, caractérisé en ce que le promoteur est dérivé à partir de BCRC 38072 déposé auprès de l'institut Food 20 Industry Research and Development Institute.'

25. ADN recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce que le promoteur est dérivé à partir de la séquence en amont du codon d'initiation du gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (acuF) de BCRC 38072.