KR100520339B1

KR100520339B1 - 면역조절 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR100520339B1
Application number: KR10-1999-7003114A
Authority: KR
Inventors: 알렌잔드로 에이. 아루포; 엔. 쟨 찰룹니; 리핑 첸; 로버트 에스. 미틀러; 월터 더블유. 셔포드; 앤쏘니 더블유 시아닥
Original assignee: 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2005-10-12
Also published as: KR20000049045A; NO991676D0; WO1998016249A1; PL188749B1; BR9712278A; CN1232402A; CA2268340A1; JP2001502325A; NO991676L; AU738981B2; IL129138A0; EP0948353A1; HUP9904697A3; NZ334691A; HUP9904697A2; AU4747097A; RU2192281C2; US6210669B1; PL332699A1; EP0948353A4

Abstract

본 발명은 2개의 항 4-1BB 단일클론 항체가 생체내에서 적어도 T 세포 의존성 항원에 대하여 제1단계 및 제2단계 체액성 반응을 억제할 수 있다는 예기치 않은 결과를 개시하고 있다. 이러한 항체들은 생체내에서 면역 억제와 암 치료에의 신규 접근법을 제공한다.

Description

면역조절 방법 및 조성물 {Methods and Compositions for Immunomodulation}

4-1BB는 신경 성장 인자 수용체 상과에 속하는 유도 가능한 T 세포 수용체이다. 이 신규한 항원은 활성화된 비장 T 세포와 흉선세포의 표면 상에 발현된다. 이러한 I형 막내외 (transmembrane) 단백질의 세포외 도메인은 신경 성장 인자 수용체 상과의 일원들과 상동성이 있다. 세포질 도메인은 T 세포 특이적 티로신 키나아제 p56^lck의 결합 부위와 상동성이 있는 서열을 포함한다.

신호전달 분자로서 T 세포 활성화에 관여한다는 것을 시사하는 증거들이 증가하고 있지만, 4-1BB의 생체내 역할은 불분명한 상태로 남아있다. 예를 들어, 항 CD3 자극 T 세포 상에서 4-1BB와 단일클론 항체 53A2와의 가교결합은 T 세포 증식을 2 내지 10 배 강화시킨다 (Pollok 등 J. Immunol. 151:1255 (1993)). 또한, 문헌 [Zhou 등, Immunol. Letters 41:177-184 (1994)]는 4-1BB가 활성화된 장 상피내 T-임파구 상에 발현되고, 항 4-1BB 단일클론 항체에 의해 유도된 활성화된 IELS가 항 CD4 분비 하이브리도마 세포에 대한 IEL 세포독성 정도를 강화시킬 수 있음을 증명하였다. 항 4-1BB 항체의 가교결합도 IELS의 증식을 강화시킨다.

4-1BB의 리간드 후보 2개 이상이 확인되었다. 문헌 [Chalupny 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10360-10364(1992)]에서는 가용성 4-1BB 면역 글로불린 융합 단백질 (4-1BB Rg)을 사용하여 4-1BB가 세포외 기질 단백질 (EMC)와 결합하는 것을 증명하였다. 문헌 [Goodwin 등, Eur. J. Immunol. 23:2631(1993)]은 TNF, 림포톡신 (LT)-알파 및 베타, CD40-L, Cd27-L, CD30-L 및 Fas-L을 포함하는, C-말단 아미노산 상동성을 지닌 새로운 리간드군의 일원인 쥐 4-1BB의 리간드 (4-1-BB-L)에 대한 cDNA의 단리를 보고하였다.

쥐 4-1BB의 인간 동족체 (hu4-1BB)과 쥐 4-1-BB-L의 인간 동족체 (hu4-1-BB-L)은 클로닝 되었다 (Alderson 등의 Eur. J. Immunol. 24:2219-2227(1994)). hu4-1BB에 대한 단일클론 항체와 hu4-1-BB-L으로 트랜스펙션된 세포는 모두 유사분열촉진제로 공동자극된 일차 T 세포에서 강한 증식 반응을 유발하였다.

그러므로, 4-1BB 길항제의 개발 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성뿐 아니라 그 이상을 해결하려는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 일면은 항 4-1-BB 항체의 유효한 투여량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 항원에 대한 제1단계 및 제2단계 체액 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일면은 단일클론 항체 1D8, 3B8, 또는 3E1을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 면은 항체가 생체내에서 양 적혈구에 대한 항체 반응을 억제하는, 항 4-1-BB 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 면은 항 4-1-BB 항체의 유효한 투여량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 T 세포 의존성 면역 반응을 차단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 면은 항 4-1-BB 항체의 유효한 투여량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 종양 세포의 임파구성 치사를 강화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 면은 항 4-1-BB 항체의 유효한 투여량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 세포독성 T 세포의 발달을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 면은 항 4-1-BB 항체의 유효한 투여량을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포 자기면역 질환을 앓는 숙주를 치료하는 방법에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 쥐 4-1BB 리간드와 고정된 4-1BB의 결합을 나타내는 그래프이다.

도 2는 항 4-1-BB 단일클론 항체 (mAb)에 의해 4-1BB와 그의 리간드의 결합이 차단되는 것을 나타내는 그래프이다.

도 3은 활성화된 T 세포에서 4-1BB의 발현을 자극 후 경과된 시간의 함수로 나타내는 그래프이다. 원은 4-1BB mRNA 농도를 나타낸다. 사각형은 활성화된 T 세포주 D0.11.10의 표면 상에 있는 4-1BB 수용체의 농도를 나타낸다.

도 4는 항 CD3 단일클론 항체 145.2C11과 항 4-1-BB 단일클론 항체의 최적량 미만 투여에 의한 T 세포 활성화의 공동자극을 나타내는 그래프이다.

도 5는 항 4-1BB 단일클론 항체 1D8의 약물동태 (pharmacokinteics)를 나타내는 그래프이다. 각 기호는 상이한 생쥐를 나타낸다.

도 6은 항 4-1BB 항체에 의한 제1단계 및 제2단계 항 양 적혈구 반응의 억제를 나타내는 그래프이다.

도 7은 항 4-1BB 항체에 의한 세포독성 T 세포 생성의 억제를 나타내는 그래프이다.

도 8은 4-1BB에 대한 mAb로 치료한 후에 P815 종양의 퇴보를 나타내는 그래프이다.

도 9는 항 4-1BB mAb로 치료 후에 P815 복수증인 생쥐의 장기 생존율을 나타내는 그래프이다.

도 10은 P815 종양 세포의 1D8 유발성 거부 반응에서 CD4 및 CD8 제거의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 11은 정맥내 주사된 AG104 육종 세포를 수용하는 생쥐의 치료를 나타내는 그래프이다.

도 12(A-C)에서 (A)는 GvHD 중의 생체내 CTC 반응 발생의 억제; (B)는 항 4-1BB mAb에 의한 BDF₁ 비장세포의 CTC 매개성 치사의 촉진; (C)는 GvHD를 겪는 생쥐의 CD8⁺ T 세포의 %증가를 나타낸다.

도 13은 항 4-1BB-PE40 면역독소에 의한 활성화된 쥐 T 세포의 치사를 나타내는 그래프이다.

도 14는 실험용 자기면역 뇌척수염의 진전을 차단하는 항 4-1BB 항체의 능력을 나타내는 그래프이다.

면역 억제 치료는 염증의 억제, 암의 치료, 및 장기의 이식에 보통 사용된다. 부신 피질 호르몬과 그들의 유도 인자, 부신 피질 자극 호르몬, 화학요법제, 및 방사선 치료를 사용하는 것과 같은 전통적인 치료법은 비특이적 면역 억제와 면역 결핍을 초래할 수 있다. 그러므로, 면역 억제를 유도하는 별도의 방법이 실질적으로 필요하다. 본 발명의 항체는 특정 폴리펩티드 즉, T 세포 상에 발현되는 4-1BB를 선택적으로 표적화하는 기회를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "4-1BB"는 쥐 세포 표면 단백질 4-1BB와 인간을 비롯한 다른 종에 존재하는 이 단백질의 상동체를 언급하는 것이다. 상이한 종의 상동체들 간에 다소의 아미노산 서열 상동성이 있을 것으로 예상되지만, 상동성의 정도는 약 50 % 정도로 낮을 수 있다. 그러므로, 4-1BB의 상동체는 쥐 4-1BB에 대하여 50 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 보이는, 활성화된 T 세포 상에 발현되는 막내외 단백질로 정의된다. 더욱이, 4-1BB의 대립 형질과 상동체, 4-1BB와 보존적 아미노산 치환된 상동체, 및 4-1BB의 가용성 형태와 상동체는 4-1BB의 정의에 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "체액성 반응"은 전형적으로 특이적 항체의 존재로부터 기인하는, 혈청으로 전이될 수 있는 면역 반응을 언급하려는 것이다. 용어 "제1단계"와 "제2단계" 면역 반응은 각각 항원에 대한 숙주의 첫번째 노출과 항원에 대한 후속적인 노출을 언급하는 것이다. 전형적으로, 체액성 면역 반응에서, 제1단계 반응 초기에는 (즉, 첫번째 주) 주된 항체가 IgM인 한편, IgG가 제2단계 반응에서 주된 항체이다.

본 발명의 단일클론의 항체가 임의의 종류일 수 있지만, 바람직하게는 IgG 또는 IgM이다.

인간에게 투여하기 위해, 예컨대 생체내 치료를 위한 조성물의 성분으로서, 본 발명의 단일클론 항체는 바람직하게는 면역원성을 최소화하도록 실질상 인간 항체이고, 실질적으로 순수한 형태이다. "실질상 인간 항체"는 조성물의 면역 글로불린 부분이 일반적으로는 약 70 % 이상, 바람직하게는 약 80 % 이상, 가장 바람직하게는 약 90 내지 95 % 이상의 인간 항체 서열을 포함하는 것을 의미한다. "항체"를 언급할 때, 분자가 4-1BB에 결합하는 능력을 유지하는 한 비면역 글로불린 서열이 분자내에 존재할 수도 있다는 것이 이해될 것이다.

인간 4-1BB 상동체에 대항하여 만들어진 쥐 단일클론 항체 등에서 얻은 비인간 단일클론 항체의 항원 결합 영역 (예, F(ab')₂, 가변 또는 초가변 (상보성 결정) 영역)을 재조합 DNA 기술을 사용하여 불변 영역 (Fc) 또는 골격 (framework) 영역에 옮겨 붙임으로써, 실질상 인간 항체 분자를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제 4,816,397호, 유럽 특허 공보 제173,494, 및 239,400호 등에 개시되어 있다. 다른 방법으로는, 문헌 [Huse 등, Science 246:1275-1281 (1989)] 및 본 명세서에 참고로 포함시키는 국제 공개 제WO90/14430호에 설명되어 있는 일반적 프로토콜에 따라서 인간 B 세포로부터 얻은 DNA 라이브러리를 스크리닝하고, 이어서 바람직한 특이성을 지닌 항체 (또는 결합 단편)를 코딩하는 서열을 클로닝하고 증폭시켜서 4-1BB에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 또는 이의 부분을 코딩하는 DNA 서열을 단리할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 4-1BB와 결합하는 단쇄 결합 폴리펩티드를 만들어낼 수 있다. 이러한 단쇄 폴리펩티드는 4-1BB와 결합하는 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝하고 연결시켜서 생산할 수 있다. 단쇄 결합 폴리펩티드의 제조 방법은 본 명세서에 참고로 포함시키는 미국 특허 제 4,946,778호 등에서 상세하게 설명된다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 (1) 바람직하지 못한 증상이나 병리학적 상태의 소인이 있지만 아직 이러한 상태가 된 것으로 진단되지 않는 대상에서 이러한 바람직하지 못한 증상이나 병리학적 상태가 발생하는 것을 방지하고, (2) 바람직하지 못한 증상이나 병리학적 상태를 억제하는 것, 즉, 그의 진전을 저지하는 것, 또는 (3) 바람직하지 못한 증상이나 병리학적 상태를 개선하거나 경감시키는 것, 즉, 바람직하지 못한 증상이나 병리학적 상태의 퇴보를 야기하는 것을 포함한다. 이러한 목표 중 어느 하나를 달성하는 본 발명의 조성물의 양을 "유효한 양"으로 부르며, 조성물의 예방용 및 치료용 용도를 모두 포함하기로 한다.

본 발명의 항체는 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 자기면역성 당뇨병, 류마티즘성 관절염, 이식편 대 숙주 질병, 전신성홍반성낭창, 다른 T 세포 자기면역 질환, 및 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 면역 억제 요법이 유익하게 이용될 수 있는 질환 또는 병리학적 상태의 예방 또는 치료에 유용하다.

본 발명에 유용한 단일클론 항체 또는 다른 화합물은 제약상 효과적인 담체와 함께 단일클론 항체 또는 그의 결합 단편 중 하나 이상의 치료 유효량 또는 예방 유효량을 포함하는 제약 조성물의 성분으로 도입될 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물을 제조하는 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편 또는 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 증명된 치료 화합물을 환자에게 전달하는 데 적합한 상용성, 비독성 물질인 제약 담체를 사용해야 한다. 멸균수, 알콜, 지방, 왁스, 불활성 고체와 심지어 리포좀을 담체로 사용할 수 있다. 제약상 허용되는 보조제 (완충제, 분산제)도 제약 조성물에 포함될 수 있다. 항체와 그의 제약 조성물은 비경구 투여 즉, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 투여에 특히 유용하다. 그러나, 비강내 또는 다른 에어로졸 제제도 유용하다. 투여를 위한 제제 중 항체 등의 화합물의 농도는 약 0.5 % 미만, 보통 1 % 이상에서 15 또는 20 중량 % 이상까지 매우 광범위하게 다를 수 있고, 주로 선택된 특정한 투여 방식에 바람직한 액량, 점도 등을 기준으로 선택될 것이다. 투여 가능한 조성물을 제조하는 실제적인 방법은 당업자들에게 공지되어 있거나 명백할 것이고, 예를 들면, 본 명세서에서 참고로 포함시키는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 17판, Mack Publishing Co., Easton, PA (1985)]에 보다 상세히 설명되어 있다.

항원 또는 항원들에 대한 면역 반응을 억제하는 데 유용한 본 발명의 화합물은 예방용 또는 치료용 치료를 위하여 투여될 수 있다. 예방을 목적으로 하는 치료시에는 조직 이식 (혈액 또는 혈청의 수혈을 포함)을 받은 환자 또는 항생제와 같은 면역원성 화합물을 투여받은 환자와 같이 특정 항원 또는 항원들에 노출되기 쉬운 환자들에게 조성물을 투여한다. 항원 또는 항원들에 노출되기 전, 또는 그와 동시에 본 발명의 화합물의 투여를 행할 수 있다. 재발하는 질병과 그의 후유증을 예방하기 위해서는, 조성물을 매일, 매주 기타 계획적인 유지 요법으로 투여할 수 있다. 투여 방법은 투여량과 그의 유효성, 의도된 용도와 환자의 전반적 건강 상태에 달려 있다. 치료하는 의사, 치과 의사 또는 다른 건강 전문가는 투여 정도와 투여 패턴, 즉, 경로와 단일 또는 다수 투여를 선택할 것이다.

치료 용도로는, 이미 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태를 겪고 있는 환자에게 본 발명의 화합물을 항원(들)에 대한 면역 반응을 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 투여한다. 이를 달성하기에 적합한 양을 "치료 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도에 효과적인 양은 사용되는 화합물, 투여의 경로, 바람직하지 못한 증상 또는 병리학적 상태의 심각함과 환자 건강의 전반적 상태에 달려 있다. 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 본 발명의 화합물의 유효량은 당업계에 잘 알려진 기술로 측정할 수 있다. 예를 들면, 항원 특이성 면역 글로불린의 감소와 이에 따른 피검 조성물의 효능은 잘 열려진 다양한 시험관내 진단 방법으로 모니터할 수 있다.

숙주 환자들이 노출된 항원 (또는 항원들)은 바람직하게는 T 세포 의존성이다. 대부분의 항원들은 T 세포 의존성, 즉 면역학적 반응을 유발하기 위하여 T 세포를 필요로 한다. T 세포 비의존성 항원들은 전형적으로는 다수의, 반복되는 항원결정기를 가진 큰 중합체 분자이다. 흔히, T 세포 비의존성 항원은 유사분열촉진성을 가진다.

본 발명의 추가 실시양태에서는, 본 발명의 항 4-1BB 항체를 4-1BB의 세포외 영역, 4-1BB의 가용성 형태, 및 4-1BB와 면역 글로불린과 같은 다른 분자의 융합물과와 같은 4-1BB 폴리펩티드를 정제하기 위한 친화 크로마토그래피에 사용할 수 있다. 본 발명의 항 4-1BB 항체는 플루오레세인, 알칼리성 포스파타제 등과 같은 리포터 분자로 표지하여, 세포 표면 상에서 4-1BB의 존재를 가시화하는데 사용할 수도 있다. 방사성 표지된 항체를 세포 상의 4-1BB의 양을 정량하는 데 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 4-1BB의 리간드와의 경쟁 분석에 본 발명의 항 4-1BB 항체를 사용할 수 있다. 다음 실시예들은 제한적 수단으로서가 아니라 예증의 수단으로 제공된다.

I. 면역화 및 스크리닝 프로토콜

면역화 처치 및 스크리닝을 위해 쥐 4-1BB 분자의 세포외 부분과 인간 면역 글로불린 (Ig) 불변 영역으로 이루어진 융합 단백질을 구성하였다 (유럽 특허 제0 595 659호의 전체 내용을 본 명세서에서 참고로 포함시킴). 4-1BBIg 융합 단백질은 분자의 4-1BB와 Ig 부분 사이에 프로테아제 트롬빈에 의한 절단 부위를 포함한다. 면역화를 위해 융합 단백질을 트롬빈으로 절단하고, 이어서 단백질 A 칼럼에 통과시켜서 절단되지 않은 단백질과 Ig 단편을 제거하였다. SDS-PAGE 분석에서 몇몇 밴드를 포함하는 것으로 나타난, 이 방법으로부터 생기는 결합되지 않은 물질을 면역화에 사용하였다.

융합 대상으로 면역성 비장 세포와 생쥐 골수종 AG8 (Kearney 등, J. Immunol. 123:1548-1550 (1974)) 세포주를 사용하여 래트-생쥐 하이브리도마를 생성하고 표준 기술을 사용하여 선별하였다. 2개의 별개의 융합으로부터 항체를 얻었다. mAbs 3B8 및 1D8은 Sprague-Dawley 래트에게 0일과 3일에 RIBI 보조제 (RIBI Immunochemical 사) 중의 단백질 20 μg을 두번 발바닥 주사하여 융합으로부터 생산하였는데; 래트는 10일에 PBS 중의 단백질 20 μg으로 세번째 발바닥 주사를 맞고; 13일에 배액 오금 림프절을 제거하고 융합을 수행하였다. 5 개월에 걸쳐 RIBI 중의 20 μg 단백질을 4회 복막내 주사한 후에 비장 세포의 두번째 융합으로 나머지 mAb들을 제조하였다. 30 μg의 정맥내 주사를 융합 17일과 3일 전에 수행하였다.

II. 항 4-1BB 항체의 특성화

항체를 우선 표준 ELISA에서 4-1BBIg 융합물과의 특이적 결합으로 확인하였다. 항체의 특이성은 (1) 전장 4-1BB 분자를 발현하는 COS 세포에는 결합하나 모의 (mock) 트랜스펙션된 대조 COS 세포에는 결합하지 않을 것, (2) 4-1BB를 발현하도록 활성화시킨 (12 시간 동안 10 ng/ml PMA와 이오노마이신 0.5 μg/ml로 활성화) D0-11-10 T 세포 하이브리도마 세포주와 결합할 것이라는 추가 기준에 의해 확증되었다. 4-1BBIg 단백질과의 ELISA에서 아이소타입 특이적 퍼옥시다제 시약 (Zymed)을 사용하여 측정했을 때 3B8 항체의 아이소타입은 쥐 IgM인 한편, 다른 항체는 모두 IgG2a 아이소타입이다.

III. 항체의 정제

3B8 mAb (IgM)을 항 카파쇄 (mAb RG7 (ATCC T1B 172)) 칼럼 상에서 친화도 정제하였다. mAb를 이뮤노퓨어 (Immunopure) Ig 용출 완충액 (Pierce)으로 용출하고 이어서 인산염 완충 염수 (PBS)에 대하여 투석하였다. RG7-정제된 물질은 온전한 항체와 공동 정제되는 일부 자유 경쇄를 포함하지 않았다. 모든 다른 항체들을 단백질 G (Gammabind Plus, Pharmacia) 상에서 정제하였다. 이뮤노퓨어 Ig 용출 완충액을 사용하여 항체를 용출하였다. 용출된 항체를 사용하기 전에 PBS에 대하여 투석하였다.

IV. mAbs에 의한 4-1BB 리간드와 4-1BB 단백질의 결합 억제

카르복실기 말단쪽이 4-1BB 리간드의 세포외 부분이고 아미노 말단쪽이 쥐 CD8의 세포외 부분으로 이루어지는 가용성 융합 단백질을 4-1BB 분자에 대한 리간드 결합의 억제를 연구하는 대용물로 사용하였다. BamHI 부위를 함유하는 상류 프라이머 (5'-GCGGCGGATCCCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCG-3')와 XbaI 부위를 함유하는 하류 프라이머 (5'-CGCTCTAGAGGATAGTTCTCATTCCCATGG-3')를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)에 의하여 쥐 4-1BB 리간드의 세포외 도메인 (잔기 104-309)을 코딩하는 DNA를 생성하였다. CD8의 세포외 도메인에 뒤이어 BamHI 부위를 함유한 CDM7 (B-) 벡터에 상기 쥐 4-1BB 리간드 DNA 단편을 리딩 프레임을 맞추어 클로닝하였다. 이 분자를 본 명세서에서는 4-1BB 리간드 (4-1-BBL)로 칭할 것이다. 4-1BB 분자와의 리간드 결합을 차단하는 항 4-1BB mAb의 능력을 ELISA와 세포 기재의 분석 시스템에서 평가하였다. mAb 53.6 (ATCC TIB 105)을 사용한 항 CD8-친화도 칼럼 상에서 40 % 프로필렌 글리콜/60 % 50 mM Tris (pH 7.0)/1.25 M (NH₄)₂SO₄로 용출시켜 4-1-BBL을 정제하고, 인산염 완충 염수 (PBS)에 대하여 투석하였다. 정제된 물질은 환원 SDS-PAGE에서 추정 분자량 55,000의 우세한 넓은 밴드로 이동하였다. 이 물질은 HPLC 겔 여과로 측정할 때 3개의 피크로 용출되었다. 우세한 피크의 추정 분자량은 300,000이었다.

4-1BBL 결합의 억제에 대한 ELISA 분석을 다음과 같이 수행하였다. 4-1BBIg 단백질을 밤새 4℃에서 PBS 중 0.1 μg/ml로 ELISA 웰 상에 코팅하고, 표본 희석제 (Genetic Systems)로 블로킹하고, 1 시간 동안 정제된 항체와 배양하였다. 이어서 리간드를 가하고 mAb와 리간드의 혼합물을 1 시간 동안 더 배양하였다. 플레이트를 세척하고 비오티닐화 mAb 53.6 (항 CD8), 이어서 스트렙타비딘 양고추냉이 퍼옥시다제 (HPRO) 접합체와 배양하였다. 결합 억제는 ELISA 신호의 약화로 나타났다. 4-1BBIg와 결합하는 리간드의 적정을 도 1에 나타내었다. 쥐 gp39-CD8 융합 단백질 대조물은 4-1BB와 결합하지 않는 반면, 4-1BB 리간드는 투여량 의존 방식으로 4-1BB에 특이적으로 결합하였다. 유사하게 설정된 ELISA에서 4-1BBIg에 대한 리간드의 결합을 차단하는 mAb의 능력은 도 2에 나타났다.

V. 4-1BB 단백질을 발현하게 하는 D0-11-10 세포의 활성화

상이한 시간 동안 PMA (10 ng/ml)와 이오노마이신 (0.5 μg/ml)으로 처리하여 T 세포 하이브리도마 D10-11-10을 활성화시켜 4-1BB 분자를 발현하도록 한 다음 4-1BB mRNA 또는 4-1BB의 세포 표면 발현을 각각 노던 분석 또는 FACS 분석으로 측정하였다 (도 3). 비처리 세포는 4-1BBL 단백질과 결합하지 않았다. 활성화된 세포는 4-1BBL 단백질에 결합하지만, gp39와 Lyta2a의 유사한 융합 단백질 구조물과는 결합하지 않았다 (Hollenbaugh 등의 EMBO J. 11(12):4313-4321 (1992)). 항 4-1BB 항체 1D8과 3B8은 D0-11-10 세포에 세포주가 활성화되었을 때에만 결합하였다. 이러한 mAb를 D10-11-10 세포와 전배양하면 후속적인 4-1BBL과의 결합을 차단할 수 있었다. 세포에 대한 4-1BBL의 결합은 항 CD8 mAb (53.6) 접합된 항혈청 (Biosource)을 사용하여 측정하였다.

추가의 실험에서, T 세포 활성을 공동자극하는 항 4-1BB 항체의 능력을 조사하였다. 휴지 T 세포를 최적량 미만의 항 CD3 mAb 145.2C11과 항 4-1BB mAb 10 μg/ml로 자극했을 때 145.2C11 단독보다 2.5-8 배 증식이 증강되었다 (도 4). 결합 친화력 또는 리간드 결합을 차단하는 능력과 T 세포를 공동자극하는 mAb의 능력 사이에는 상관관계가 거의 없었다.

VI. 항 4-1BB 단일클론 항체 1D8과 3B8에 의한 항 SRBC 항체 반응의 전개 억제

항 4-1BB mAb 1D8의 약물동태를 250 mg/생쥐로 정맥내 주사한 후에 평가하였다. 혈청 샘플을 8일째로부터 42일째까지 수집하고, 항 4-1BB mAb에 대하여 분석하였다. 도 5에 나타나는 바와 같이 그 결과는 ID8의 반감기가 7일인 것을 나타냈다. 이러한 결과는 이들 동물에서 항 래트IgG (항 1D8)가 생성되지 않았음을 나타냈다. 래트 IgM 항체인 3B8의 반감기는 6.5 시간이었다 (데이터는 표시되지 않음).

5마리의 생쥐로 된 그룹에 T 세포 의존성 항원인 양 적혈구 (SRBC)와 1D8 또는 3B8 중 하나를 250 mg으로 정맥내 주사하였다. 항체의 추가 주사를 6일째까지 격일로 투여하였다. 각 생쥐로부터 혈청 샘플을 7주째까지 정기적으로 취하고 항 SRBC 역가에 대하여 분석하였다. 7주째에 생쥐에게 SRBC로 2차로 자극하고 항 4-1BB mAb는 더 투여하지 않았다. 혈청 샘플을 2 주 기간에 걸쳐 수집하고 항 SRBC 항체에 대하여 측정하였다. 1D8과 3B8은 모두 SRBC에 대한 제1단계와 제2단계 자극을 차단하였다 (도 6). 이러한 실험, 특히 3B8의 결과는 이러한 처리가 장기 비반응성을 야기하는 것으로 나타났다.

VII. 세포독성 T 세포의 생성 억제

4-1BB 발현이 다른 T 세포 작동체 기능에 중요한지를 결정하기 위하여, 1D8 mAb와 두번째 융합으로부터 유도된 몇몇 mAbs가 급성 이식편 대 숙주 질병 (GvHD) 시 CTL의 생성에 영향을 주는 능력을 측정하였다. 10⁷ C57BL/6(H-2^b) 비장 T 세포의 정맥내 주사 10일 후에 BDF₁(H-2^db) 생쥐로부터 비장 T 세포를 분리하였다. 재조합 생쥐 IL-2(R & D Systems) 2-10 ng/ml와 조직 배양하여 5일간 증식시킨 후에, Ia^d (P815) 또는 Ia^b (EL4) ⁵¹Cr-표지된 표적에 대한 생존 T 세포의 세포독성에 관하여 분석하였다. 도 7의 결과는 대조 mAb 또는 PBS로 처리된 비장 T 세포가 3:1만큼 낮은 비에서 적절한 MHC 클래스 II 단상형 (Ia^d)를 가진 표적을 효과적으로 파괴하는 것을 보여준다. 이에 대하여, 1D8을 주사한 생쥐에서 얻은 비장 T 세포는 작동체 (E):표적 (T) 비가 50:1이 되어야 파괴할 수 있고, 이 때에도 파괴율이 75 % 감소하였다. mAb 22B6의 경우에도 유사한 결과를 얻었다. mAb 3E1은 완전한 억제력을 지닌 반면, mAb 21E5는 CTL의 생성/생존을 억제하는 데 덜 효과적이었다. EL-4 (Ia^b) 표적에서는 파괴가 관찰되지 않았다 (데이터는 기재하지 않음). 배양물 중 항 4-1BB mAb의 존재로 이러한 관찰 결과를 설명할 수 없는데, 이는 이러한 항체를 CTL 분석에 첨가하는 것이 CTL 파괴를 차단하지 않았기 때문이다. T 세포를 목포물에 첨가하기 전에 배양된 T 세포를 현미경으로 관찰했을 때 활성화된 세포가 전혀 없고, 수많은 작은 휴지 생존 세포와 대조 배양물에는 없는 상당한 양의 고사 또는 죽은 세포가 있는 것이 드러났다.

VIII. 생체내 GvHD 중의 CTL 생성의 강화

상기에 언급된 연구로부터, 항 4-1BB mAb로 처리된 GvHD 생쥐는 IL-2를 첨가하거나 IL-2를 첨가하지 않은 5일간의 시험관내 배양 후에 적합한 표적에 대하여 CTL 활성을 보여주지 못하는 데 반하여 (데이터에 나타나지 않음), 대조 생쥐는 IL-2의 존재시 두드러진 CTL 반응을 전개하였다. 1D8에 의해 유도된 종양 세포의 CTL 파괴가 전이 및 비전이 질환 모두의 독립적인 생체내 종양 모델에서 일관되게 관찰되었기 때문에 이러한 결과는 놀라운 것이다 (도 8, 9, 10 및 11). 더욱이, 항 4-1BB 처리된 GvHD 생쥐로부터 제거된 비장은 Ab 대조 생쥐에서 관찰된 보통 비장 크기의 2-3 배로 확장되어 있다. 이러한 역설적 결과를 설명하기 위하여, GvHD 실험을 전과 같이 반복하지만, 이번에는 비장의 외과적 제거 바로 뒤에 CTL 활성을 분석하여 CTL의 시험관내 IL-2 증식을 배제하였다. 이 실험의 결과는 상기에 보고된 결과와 현저히 달랐다. 도 12A에서, 각각 4-1BB 분자의 상이한 영역에 결합하는 것으로 알려진 2개의 항 4-1BB mAb인 1D8과 22B6이 대조 GvHD 동물에서 관찰되는 것의 거의 4배로 CTL 활성을 강화시킨 것을 볼 수 있다. 이에 대하여, 리간드 결합의 가장 강력한 차단제 중 하나인 mAb 3E1이 CTL 발달을 완전히 억제하는 한편, mAb 21E5는 CTL 생성에 대하여 드러나는 영향을 미치지 않았다. CTL 활성의 발달 강화에 대한 1D8과 22B6의 강력한 영향은 이들 2개의 항체로 처리된 생쥐에서 회수된 총 생존 비장세포의 수가 현저하게 감소되었음을 나타내는 도 12B에서 추가로 증명된다. 더욱이, 비장세포의 표현형 분석은 CD8⁺ T 세포의 %가 1D8 mAb로 처리된 생쥐에서 총 세포 수의 30 %까지 증가한 한편 (도 12C), 아이소타입을 맞춘 비결합 대조물인 6E9를 주사한 GvHD 생쥐, 또는 항체를 전혀 투여하지 않는 생쥐는 5 내지 8 %의 CD8⁺ T 세포를 가지는 것을 나타낸다. 도메인 교환을 수행한 4-1BB 융합 단백질을 사용한 항 4-1BB mAb의 에피토프 매핑 연구는 1D8 mAb가 4-1BBL 결합에 관여하지 않는 4-1-BB 분자의 세포외 도메인의 막 인접 영역과 결합하는 점에서 특이하다는 것을 보여주었다 (데이타는 기재하지지 않음).

IX. 세포독성 T 세포 발달의 가능화

이 실험에서는 항 4-1BB 단일클론 항체를 사용하여 고도로 전이성인 약한 면역원성 및 비면역원성 종양을 파괴하는 세포독성 T 세포의 발달을 가능하게 하였다.

도 8은 5 마리의 Balb/C 생쥐로 된 그룹에 0일에 10⁵ P815 비만세포종 세포를 피하 주사한 실험에서 얻어진 결과를 나타내었다. 대조 생쥐에는 항 인간 CD5 mAb 10.2를 투여하였다. 그러나, 1D8 또는 3E1 (항 4-1BB) mAb를 주사한 생쥐는 신속하게 그들의 종양을 소멸시켰다. 항체를 3일과 6일째에 복강내로 400 mg/생쥐로 주사하였다.

도 9는 P815 종양을 주입하고 1D8 mAb로 처치한 생쥐의 장기 생존율을 나타내었다.

도 10에 나타난 데이터는 P815 종양과 1D8 mAb를 주입한 생쥐에 CD4 또는 CD8 양성의 T 세포 중 어느 하나가 없으면 종양을 소멸시킬 수 없다는 것을 보여준다. 어떠한 이론에도 제한되지 않고, 이러한 결과는 CD4 및 CD8 세포가 모두 mAb 1D8의 유효성을 위하여 요구되는 것을 암시한다.

도 11에 나타난 데이터는 비면역원성 육종 AG104가 1D8 mAb 자극을 통하여 유도된 CTL로 파괴될 수 있는 것을 설명하였다. 이 실험에서는 10 마리의 Balb/C 생쥐로 된 그룹에 10⁵ AG104 종양 세포를 피하에 주사하였다. 단일클론 항체를 상기에 설명된 바와 같이 3일 및 6일째에 피하에 주사하였다. 60일째에 쥐의 70 %가 생존하였다. 이 종양 모델이 매우 공격적이기 때문에 이러한 결과는 주목할 만한 것이다.

X. 활성화된 쥐 T 세포의 파괴

이 실험에서는 1D8 mAb의 가변 영역을 클로닝하고 이로부터 단쇄 Fv를 구성하여 항 4-1BB-PE40 면역독소를 생성하였다. 이어서 SFv를 사용하여 SFv-PE40 (Siegall 등, Drug Dev. Res., 34:210-219 (1995)) 면역독소를 생성하였다. 이 면역독소는 FACS 분석에 의하여 4-1BB⁺ 활성화된 세포에만 결합하는 것으로 나타났다. 도 13의 결과는 이 면역독소가 투여량 의존 방식으로 활성화된 4-1BB⁺ T 세포를 특이적으로 파괴하는 한편, 대조 면역독소는 그렇지 않다는 것을 보여주었다.

XI. EAE의 진전 차단

다음 실험은 T 세포 자기면역성 즉, 실험용 자기면역성 (또는 알레르기성) 뇌척수염 (EAE)의 진전에 대한 쥐과 생쥐 모델을 사용하였다 (예로, Alvord, G.C. Jr., ed. Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis, Liss, NY (1984) 참조).

PL X SJL/F₁ 암컷 생쥐에 0일에 완전 프로인트 (Freund) 보조액 중 1 mg/ml의 토끼 뇌 미엘린 기본 단백질 100 μl를 피내 주사하였다. 백일해 독소의 1 μg/ml 용액 (PBS) 200 μl를 정맥내 주사하였다.

8 마리씩 그룹으로 나눈 생쥐에게 다음의 단일클론 항체 (모두 래트에서 유래한 것이고 IgG_2A 아이소타입임) 중 하나를 포함하는 1 mg/ml PBS 용액 200 μg을 0, 2, 및 4일째에 정맥내 주사하였다: (a) 대조 mAb 6E9 (래트 항인간 gp39 mAb); (b) 항 4-1BB mAb 3E1; (c) 항 4-1BB mAb 3H3. 꼬리 마비에 이은 뒷다리 마비 (이 시점에 동물들을 희생시킴)를 기록하여 생쥐의 EAE 진전을 분석하였다 .

EAE의 진전을 차단하는 항 4-1BB 항체의 능력은 도 14에 표시된 데이터에 의하여 증명된다.

상기 발명이 명확한 이해를 위하여 예시와 실시예로 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구항의 범위 안에서 어느 정도의 변화와 변경이 예상될 수 있음이 명백할 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 모든 점에서 그의 전체 내용을 본 명세서에 포함시킨다.

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4-1BB 리간드의 4-1BB에의 결합에는 관여되지 않은 4-1BB의 세포외 도메인의 막 인접 영역과 특이적으로 결합하는 항 4-1BB 항체의 유효량을 포함하는, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 자기면역성 당뇨병, 류마티즘성 관절염, 이식편 대 숙주 질병, 전신성홍반성낭창, T 세포 자기면역 질환, 암 및 자기면역 뇌척수염을 치료하기 위한 제약 조성물.
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제21항에 있어서, 상기 항 4-1BB 항체가 모노클로날인 제약 조성물.
제21항에 있어서, 상기 항 4-1BB 항체가 4-1BB 리간드의 4-1BB에의 결합에는 관여되지 않은 4-1BB의 세포외 도메인의 영역과 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역 또는 상보성 결정 영역을 포함하는 단쇄 결합 폴리펩티드인 제약 조성물.
제21항에 있어서, 항 4-1BB 항체와 함께 제약상 허용되는 보조제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제21항에 있어서, 항 4-1BB 항체와 함께 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제21항에 있어서, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하내 투여되는 제약 조성물.