KR100507293B1

KR100507293B1 - 열충격 단백질 생성 촉진 성분 및 이를 함유하는 피부미백용 외용제 조성물

Info

Publication number: KR100507293B1
Application number: KR10-2002-0080368A
Authority: KR
Inventors: 김준오; 윤은숙; 안수미; 김수남; 김한곤; 강학희
Original assignee: 주식회사 태평양
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2005-08-09
Also published as: CN100389743C; KR20040053907A; CN1520804A

Abstract

본 발명은 열충격 단백질 생성 촉진 성분 및 상기 열충격 단백질 생성 촉진 성분과 피부 색소 물질인 멜라닌의 형성을 억제하는 성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터 및 자외선에 의해 유발되는 염증 발생 억제 성분을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

열충격 단백질 생성 촉진 성분 및 이를 함유하는 피부 미백용 외용제 조성물{Component accelerating formation of heat shock protein and composition for external application to the skin with whitening effect containing thereof}

[화학식 1]

본 발명에 의해 제공되는 피부 외용제 조성물은 멜라닌 색소 형성 억제 성분, 염증 발생을 억제하는 성분 및 열충격 단백질의 합성을 촉진하는 성분을 함유함으로써, 멜라닌 색소 형성 억제 성분만을 함유하는 것보다 더 우수한 피부 색소 침착 개선 효과를 갖는다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 그리고 헤모글로빈 등과 같이 색상을 갖는 인체 구성 성분들의 양에 의해 결정되며, 이 중에서도 멜라닌이 가장 크게 기여한다. 멜라닌은 피부의 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트에서 합성되며, 멜라노좀의 형태로 주변의 각질세포로 전이됨으로써 피부 색상을 나타내게 된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 피부의 표피에 균일하게 분포되어 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해 주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 역할을 하여 피부 내부에 있는 각종 단백질과 세포의 유전자들을 보호하는 유용한 역할을 한다.

그러나, 여러 가지 피부에 유해한 스트레스에 의해 이미 생성된 멜라닌은 피부세포의 각화 과정을 통하여 외부로 떨어져 나가기 전까지 일정 시간 동안 피부에 남아 있을 수밖에 없기 때문에, 지나치게 많이 생성된 멜라닌은 많은 사람들이 신경을 쓰는 기미나 주근깨 등과 같은 고민 요소로 나타나게 된다. 피부 내에서 일어나는 멜라닌 합성은 타이로신이라는 아미노산이나 도파(DOPA)를 기질로 하여 타이로시네이즈 등의 효소를 촉매로 한 중합 산화 과정을 통해 만들어지며, 피부에 자유 라디칼 생성이 많아지거나, 염증 반응이 있거나, 자외선 등을 받게 되면 이러한 멜라닌 생성은 더욱 증가된다.

멜라닌 형성을 억제하는 성분으로는 카테콜, 리소시놀 등과 같은 폴리하이드록시페놀 화합물, 코직애씨드, 토코페롤, 아스코빌애씨드, 하이드로퀴논 등이 널리 알려져 있다. 그러나 이들은 대부분 자신의 항산화 활성을 통하여, 멜라닌 형성에 관여하는 효소인 타이로시네이즈의 작용을 무력화시키는 것으로서, 효소 활성 억제라는 긍정적인 면과 함께 피부에 적용하였을 때 자극이나 피부 세포에 독성을 나타내는 단점을 동시에 갖고 있다. 특히, 폴리하이드록시페놀 화합물의 경우에는 타이로시네이즈에 의해 쉽게 산화되어 퀴논을 생성하기 때문에 피부 세포에 치명적인 독성을 나타내기도 한다. 또한 앞서 언급한 항산화 활성을 갖는 화합물들의 경우, 실제 피부 외용제 제형에 적용하였을 때 물질 자체의 안정성이 보장되지 않아 색상이 변하거나 향취가 변하는 문제점이 발견되기도 한다.

한편, 생물체에 열충격을 가하면 생물체는 일시적으로 생리적 변화를 통하여 이에 대응한다. 즉, 새로운 스트레스 환경을 극복하기 위하여 필요한 생리적 변화를 일으키는데, 총체적 유전자 발현 조절을 통하여 세포내 손상을 입은 단백질(denatured protein)들을 복구가 가능하면 복구하고, 복구가 불가능하면 분해해서 세포를 정상적인 상태로 되돌리려는 변화가 일어나는데, 이때 생성되는 단백질들을 열충격단백질(heat shock protein, HSP) 또는 스트레스단백질(stress protein)이라 부른다(Crit. Rev. Biochem., 18, 239 (1985), Microbiol. Rev., 57, 402 (1993)). 그리고 세포가 열, 즉 높은 온도, 산화성 스트레스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 8059 (1986)), 영양소 제한(J. Bacteriol., 172, 7157 (1990)), 삼투 충격(Arch. Microbiol., 150, 564 (1988)), 중금속, 자외선 조사, DNA 손상제(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 5749 (1981)), 바이러스 감염 등의 스트레스를 받게 되면, 세포 스스로 자신을 보호하기 위하여 대장균, 고초균 등의 원핵생물로부터 효모, 초파리, 사람 등 고등생물에 이르기까지 매우 보편적으로 열충격 단백질을 만들어낸다는 사실이 알려져 있다(The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1994), Stress proteins in biology and medicine, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1990), Cell Biology and Toxicology, 11, 161 (1995)). 열충격단백질은 모든 생물체에서 매우 보편적으로 존재하며 일부 열충격단백질들은 스트레스 환경 뿐만 아니라 정상 상태에서도 세포의 항상성 유지와 대사 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 6455 (1985)). 주요 열충격 단백질의 종류로는, 높은 온도에 대한 내성(thermotolerance), 세포내 기질의 분해(proteolysis) 촉진 및 전사(transcription) 조절 등의 기능을 담당하는 HSP 100 family(Trends Biochem.Sci., 21, 289 (1996)), 세포질 내에서 레티노익애씨드(retinoic acid), 스테로이드 수용체와 복합체를 이루며, 이들 신호분자(signal molecules)의 작용기작과 연관되어 있으며, 암유전자(oncogene)에 의해 암호화되는 몇 가지 타이로신 카이네이즈(tyrosine kinase)의 기능 조절 및 단백질 해독과정의 조절인자로 작용하는 HSP 90 family(The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1994)), 세포질에서 합성된 단백질이 미토콘드리아 등의 세포기관으로 전이된 다음 세포기관 내에서 oligomer를 형성하는 과정에서 단백질의 folding과 조립에 관여하는 HSP 60 family(Nature, 355, 33 (1992)), collagen의 assembly와 transport에 관여하는 HSP 47(Lasers Med. Sci. 16, 192 (2001)), 세포 내에 활성산소가 증가하게 되면 이를 감지하고 활성산소에 의해 풀어헤쳐진 단백질에 선택적으로 결합해서 이를 수선하는 역할을 하는 HSP 33(FEBS Lett., 489, 19 (2001)), 스트레스 센서로 작용하며 또한 세포의 증식을 유도하는 신호전달 경로에 일종의 브레이크로 작용하는 HSP 70 family(EMBO J. 20, 446(2001)) 등이 있다. 스트레스를 받을 때 가장 많이 유도되는 열충격 단백질은 HSP 72이며, 단백질의 합성, 세포 내 소기관으로 단백질을 전달하는 역할을 수행한다. 그러나 나이가 들어감에 따라 HSP 72의 유도 능력은 점점 감소한다(Br. J. Dermatol., 134, 1035 (1996)). HSP 72는 단백질의 응집을 방지하고 손상을 입은 단백질을 정상 상태로 되돌려 주기도 하며, 많은 논문에서 과잉 생산된 HSP 72는 열충격, 화학적 자극, 자외선 조사, 활성 산소, TNF-α에 의해 유도되는 세포 괴사(apoptosis)를 차단할 수 있다고 보고하고 있다(Mol. Cell Biol., 22, 7721 (2002)).

이에, 본 출원자들은 기존 미백제의 문제점인 피부 자극 및 세포 독성을 현저히 개선하며 화장품 제형에서의 불안정성을 해결할 수 있는 대안으로서, 항산화 효과에 기인하지 않고 미백 효과를 나타내면서 멜라닌 생성은 강력히 억제하는 화합물인 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터(화학식 1)를 비롯한 몇 가지 신물질을 개발하였다. 더 나아가 황재성 등은 이러한 화합물들 가운데, 특히 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터가 우수한 멜라닌 형성 억제 효과가 있음에도 불구하고, 기존의 미백제와는 달리 항산화 작용에 의하여 멜리민 형성을 억제하는 것이 아니라 타이로시네이즈 효소의 발현 자체를 억제하기 때문임을 밝혔다 (International Pigment Cell Conference, Netherlands, 2002).

그렇지만 피부가 멜라닌 색소를 형성하는 데에는 멜라노사이트가 멜라닌을 합성하도록 자극하는 다양한 신호들이 작용하므로 이들을 적절히 통제하지 않으면, 효과적인 미백 효과를 기대하기가 어렵다. 특히 반응성이 매우 높은 활성 산소종(ROS; Reactive Oxygen Species)과 자유 라디칼들은 세포막이나 DNA와 같은 생체 조직에 손상을 가하여 자극과 염증을 유발하게 된다.

염증을 유발하는 주요 매개인자로는 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-8(IL-8), 프로스타글란딘(Prostaglandin), 그리고 히스타민(Histamine) 등이 알려져 있으며, 이들 역시 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 유발하는 작용을 하며, 최근에는 이와 같은 염증후 과색소 침착증(Postinflammatory Hyperpigmentation)에 관한 연구도 활발히 이루어지고 있다. 따라서, 염증을 억제하거나 약화시킬 수 있는 활성 성분에 대하여 광범위하게 연구한 결과, 라스베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물 등을 사용할 경우, 자극의 개선 및 염증 생성 억제 효과가 우수하다는 것을 발견하였다.

한편, 열충격 단백질은 세포가 열, 즉 높은 온도, 산화성 스트레스, 영양소 제한, 삼투 충격, 중금속, 자외선 등의 스트레스를 받게 되면, 세포 스스로 자신을 보호하기 위하여 만드는 단백질이다(Cell Biology and Toxicology, 11, 161 (1995)). 스트레스를 받을 때 가장 많이 유도되는 열충격 단백질은 HSP 72로, 단백질의 합성, 세포 내 소기관으로 단백질을 전달하는 역할을 수행하며, 또한 단백질의 응집을 방지하고 손상을 입은 단백질을 정상 상태로 되돌려 주기도 하며, 과잉 생산된 HSP 72는 열충격, 화학적 자극, 자외선 조사, TNF-α에 의해 유도되는 세포 괴사(apoptosis)를 차단하는 기능을 할 수 있다.

따라서 자외선과 같은 강한 스트레스에 피부가 노출되었을 때, 멜라닌 형성과 더불어 수반되는 화상을 입은 세포(sun burn cell) 생성이나 세포 괴사에 효과적으로 대응하는 활성 성분에 대한 연구가 필요하다. 이에 열충격 단백질 생성을 촉진하는 성분을 폭넓게 연구한 결과, 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드, p-쿠마릭애씨드 등이 열충격 단백질의 합성을 촉진하여 피부 세포를 보호할 수 있음을 발견하였다.

또한 본 발명자들은, 효과적인 미백 방법 및 미백용 조성물을 연구하던 중, 멜라닌 형성 억제제로서 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터에, 염증 발생 억제 성분 및 열충격 단백질 생성 촉진 성분을 부가하여 사용할 경우 피부 안정감이 증가되고 미백효과 역시 예상외로 우수해지는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자외선 또는 열과 같은 스트레스로부터 세포를 보호하는 물질인 열충격 단백질의 생성을 촉진하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터에 염증 발생 억제 성분 및 열충격 단백질 생성 촉진 성분을 부가한 보다 우수한 미백효과를 갖는 피부 미백용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 자외선 또는 열과 같은 스트레스에 피부가 노출되었을 때, 멜라닌 형성과 더불어 수반되는 화상을 입은 세포(sun burn cell) 생성이나 세포 괴사에 효과적으로 대응하여 세포를 보호하는 활성 물질인 열충격 단백질의 생성을 촉진하는 유효성분으로서, 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드, p-쿠마릭애씨드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 열충격 단백질 생성 촉진 성분에 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터 및 염증 발생 억제 성분을 부가하여 미백기능이 향상된 피부 미백용 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 열충격 단백질의 생성을 촉진하는 유효성분으로서 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드, p-쿠마릭애씨드 등을 포함한다.

또한 본 발명은 멜라닌 합성 억제를 위한 유효 성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터 화합물을 포함한다.

[화학식 1]

아울러, 피부에의 자극 또는 염증 발생을 억제하거나 약화시키는 성분 중에서 특히, 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터와 잘 어울리는 라스베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명에 따른 피부 미백용 외용제 조성물은 열충격 단백질의 생성을 촉진하는 성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 20중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다. 0.0001 중량% 미만에서는 열충격 단백질이 효과적으로 생성되지 않으며, 20 중량%를 초과하면 안정한 제형을 유지할 수 없기 때문에 부적절하다.

또한, 화학식 1로 표현되는 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 5중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1중량%를 함유한다. 0.0001 중량% 미만에서는 멜라닌 형성을 효과적으로 억제할 수 없으며, 5 중량%를 초과하면 세포독성을 유발할 수 있기 때문에 부적절하다.

아울러, 자외선에 의해 유발되는 피부에의 자극 및 염증 발생을 억제하는 성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 30중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 10중량%를 함유한다. 0.0001 중량% 미만에서는 염증 발생을 효과적으로 억제할 수 없으며, 30 중량%를 초과하면 변색 및 변취와 같은 제형 안정성에 문제를 유발할 수 있어 부적절하다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

열충격 단백질 생성 촉진 성분으로서 본 발명에 사용된 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드, p-쿠마릭애씨드 등은 세포가 각종 스트레스에 노출되었을 때, 스스로 세포를 보호하기 위한 열충격 단백질의 합성을 촉진하는 효과가 있음이 확인된 성분들이다. 특히 젊고 건강한 세포는 열충격 단백질을 만들어 내는 능력이 강하기 때문에 외부 충격으로부터 자신을 보호할 수 있지만, 늙고 연약한 세포는 열충격 단백질을 만드는 능력이 약화되어 있어 자외선에 의한 멜라닌 형성 증가 이외에도 세포 손상이 심해져 광노화(Photo-ageing)가 촉진되는 문제도 유발하게 된다. 최근에는 열충격 단백질에 의한 세포 보호 효과에 대한 연구가 피부 노화와 관련하여 중요한 연구 주제로 부각되고 있지만 아직까지 이를 미백에 도움을 주는 작용과 연관된 연구 결과는 발표되지 않고 있다.

또한, 멜라닌 색소 형성 억제 성분으로서 본 발명에 사용된 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터는 기존의 항산화 작용에 의존하는 미백제와는 달리 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 타이로시네이즈의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 새로운 기작의 물질이다. 따라서 기존의 상당수의 미백제들이 변색이나 변취와 같은 물리적 변화를 일으키는데 반하여, 상대적으로 안정도가 크게 개선된 제형이 가능하다. 그뿐만 아니라 세포 독성이나 피부 자극, 감작성, 변이성 등을 유발하지 않는 피부에 매우 안전한 성분임을 확인하였다.

아울러, 피부 자극 및 염증 발생 억제 성분으로서 본 발명에 사용된 라스베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물 등은 약 350여종의 원료들을 검색한 결과, 피부 자극 및 염증을 완화 효과가 가장 우수하다고 판단된 것들로서, 특별히 동통, 홍반, 가려움 등에 관여하는 브라디키닌(Bradykinin)과 섭스탄스 P(Substance P)의 작용을 억제하는 효능을 갖고 있음을 확인하였다. 자세히 설명하면, 피부 세포 및 신경 세포주에서 브라디키닌과 섭스탄스 P에 의해서 분비되는 염증매개 사이토카인(Cytokine)인 IL-6과 IL-8의 분비를 이들 추출물들이 억제하였다. 이 중에서 라스베리추출물은 레티놀에 의한 피부 홍반 현상을 억제하였으며, 세정제로 사용되는 계면활성제인 SLS(Sodium Lauryl Sulfate)와 알파하이드록시애씨드(α-Hydroxy acid)의 일종인 젖산(Lactic acid)에 의한 피부 자극을 완화시켜 주는 효과도 갖고 있음을 확인하였다. 한편, 최근 연구 결과에 따르면, 자극 반응에 이어 나타나는 피부 색소 침착 현상이 새로운 연구 분야로 주목받고 있지만, 이런 현상을 이용한 피부 미백용 외용제로의 개발 노력은 그렇게 활발히 이루어지지 않고 있다.

본 발명에서는 열충격 단백질 생성 촉진 성분, 멜라닌 색소 형성 억제 성분으로 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터 및 염증 발생 억제 성분이 서로 조화를 이루며, 이에 따라 미백용 조성물로서 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터만을 사용할 때 보다 우수한 미백효과를 나타낸다.

본 발명의 피부 미백용 외용제 조성물은 멜라닌 생성을 억제함에 있어서 타이로시네이즈의 발현을 억제할 뿐만 아니라, 자외선으로 대표되는 외부 스트레스에 의한 피부 자극 및 염증 발생에 따르는 색소 침착을 방지하며, 열충격 단백질 합성을 촉진함으로써 세포를 보호하여 건강한 피부를 가꾸는 목적으로 사용되는 것으로서, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 팩, 젤 또는 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

또한 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 특별한 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것이 아님을 밝혀 둔다.

<시험예 1> 각질형성세포에서의 열충격 단백질 합성 증가 효과

각질형성세포 내 열충격 단백질의 합성 정도는 웨스턴 블롯 (Western blot) 방법에 의해 측정하였다. 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포를 6-배양용기(well plate)의 각 well에 5×10⁵cells를 넣고 각질형성세포 배양액(Keratinocyte growth media, Clonetics, BioWhittacker사, MD, 미국)에서 24시간 동안 배양시켰다. 배지를 제거한 후 상기의 각질형성세포에 아래 표 1에 정리한 7가지 시험 물질을 포함한 배지로 교체하였다. 또한, 비교를 위해 종래에 열충격 단백질을 생성한다고 알려진 조건인 44℃에서 30분간 각질형성세포에 열을 가하였다. 24시간 경과 후, 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 세포에 세포용해 버퍼(Lysis buffer, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM Na₂EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton, 2.5mM Sodium pyrophosphate, 1mM β-glycerophosphate, 1mM Na₃VO₄, 1μg/ml leupeptin, 1mM PMSF)를 가하여 용해하였다. 용해 후 10초 정도 초음파 분쇄하고, 4℃, 10,000G 에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 단백질 양을 정량하였다. 10% 폴리아크릴아마이드젤(SDS-PAGE gel)에 well 당 10㎍의 단백질을 올리고 125V에서 90분간 전개(running) 한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(Nitrocellulose Membrane)에 옮기고 5% 탈지분유(nonfat milk)를 함유한 트윈 20(Tween 20, Uniqema사, 영국)을 포함한 트리스 완충용액(TBST, Tris-Buffered Saline containing 0.05% Tween 20)에서 적당히 희석된 1차 항체(primary antibody)로 1시간 이상 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 적당히 희석된 고추냉이 퍼록시데이즈(HRP ; Horse radish peroxidase)가 접합된 2차 항체(secondary antibody)로 1시간 이상 반응시켰다. TBST로 3회 washing 한 후 적당한 substrate를 가하여 발색시켰다. 발색의 정도는 덴시토미터(Densitometer)를 사용하여 그 면적을 측정하였으며, 대조군과의 비교치로 나타내었다. 열을 가하지 않은 각질형성세포의 열충격 단백질 합성율을 100%로 하여 상대적인 합성율을 나타내었다.

시험물질	농도(%)	열충격 단백질 합성율(% control)
Heat	-	272
엑토인	0.20	168
화이트윌로우추출물	0.01	143
효모추출물	0.10	223
완두추출물	0.10	180
카야세네갈렌시스추출물	0.10	209
케페익애씨드	0.001	140
p-쿠마릭애씨드	0.001	151

상기 표 1로부터 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드, p-쿠마릭애씨드가 열충격 단백질 합성 효과가 있음을 알 수 있었으며, 특히 효모추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 완두추출물의 열충격 단백질 합성 효과가 우수함을 확인하였다.

<시험예 2> 멜라닌 색소생성세포에서의 멜라닌 생성 억제 효과

3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터의 세포 내 멜라닌 생성 억제 정도는 Dooley의 방법에 의해 측정하였다. 세포주는 C57BL/6의 피부색소세포에서 유래된 Mel-Ab 세포주를 사용하였다. 배양은 10% 소태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일 포볼-13-아세테이트(12-O-Tetradecanoyl Phobol-13-Acetate), 1nM 콜레라 톡신(Cholera Toxin)을 함유한 DMEM 배지상에서 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 이루어졌다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어내고, 24-배양용기(well plate)에 다시 동일한 숫자(1×10⁵cells/well)로 부착시킨 후에, 이틀째부터 3일 동안 계속하여 본 화합물을 0.01%씩 포함한 배지로 교체하였다. 또한, 비교를 위해 종래에 미백제 성분으로 알려져 있는 코직애씨드에 대하여 시험하였고, 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드, 치몰(Thymol)을 각각 처리한 것에 대하여도 시험을 수행하였다. 5일째 이후에 1N NaOH를 처리함으로써 세포에 포함된 멜라닌을 녹여내고, 400㎚에서의 흡광도 측정을 통해 멜라닌의 양을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질	멜라닌 생성율(% control)
코지산	75.0
3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드	96.3
치몰	94.5
3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터	47.8

상기 표 2로부터, 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터의 멜라닌 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

<시험예 3> 라스베리추출물 등의 신경교세포주 U373 MG에서 섭스탄스 P 자극에 의한 IL-6 생합성 억제 효과

사람의 신경교세포주 U373 MG를 10% 우태아 혈청(FBS; Fetal bovine serum)이 함유된 MEM(Minimum Essential Media, GIBCO BRL, Life Technologues사) 배지로 96-배양용기(well plate)의 각 well에 2×10⁴cells를 부착시켜 24시간 동안 배양시켰다. 배지를 제거한 후, 인산완충용액(PBS; Phosphate Buffered Saline) 200㎕로 1회 세척하고 FBS가 함유되지 않은 MEM 배지 200㎕에 아래 표 3에 정리한 5가지 추출물들을 사용하였다. 배양액 25㎕를 취해 IL-6 ELISA(Pharmingen사, OptEIA Human IL-6/IL-8 set 사용)를 통해 섭스탄스 P에 의한 IL-6 유리 억제 효과를 측정하였다. 하기 표 3의 IL- 6 생합성 억제율은 섭스탄스 P를 처리하지 않은 U373 세포와 섭스탄스 P를 처리한 U373 세포의 IL-6 생성량의 차이를 기준으로 계산하였다.

성분	추출물 농도	IL-6(pg/10⁵cells)	IL-6 생합성 억제율 (%)
(-) Substance P(1M)	-	10.5±32	-
(+) Substance P(1M)	-	981.4±61	-
(+) Substance P(1M) + 라즈베리추출물	0.01%	505.7±41	49.0
(+) Substance P(1M) + 블루베리추출물	0.01%	582.5±65	41.1
(+) Substance P(1M) + 블랙베리추출물	0.01%	697.4±53	29.3
(+) Substance P(1M) + 크랜베리추출물	0.01%	658.9±38	33.2
(+) Substance P(1M) + 스트로베리추출물	0.01%	738.1±45	25.1

* (+): Substance P 처리, (-): Substance P 미처리

상기 표 3으로부터 라즈베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물 등이 사람의 신경교세포 U373에서 섭스탄스 P 자극에 의한 IL-6의 생합성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, 특히 라즈베리추출물과 블루베리추출물의 IL-6 생합성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

<시험예 4> 라즈베리추출물 등의 피부섬유아세포에서 브라디키닌 자극에 의한 IL-6, IL-8 생합성 억제 효과

사람의 표피조직으로부터 분리, 배양한 피부섬유아세포(Fibroblast)를 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media, GIBCO BRL, Life Technologues사) 배지로 96-배양용기(well plate)의 각 well에 2×10⁴cells를 부착시켜 24시간 동안 배양시켰다. FBS를 넣지 않은 DMEM으로 24시간 정도 세포를 배양한 후에 1% 우태아 혈청이 함유된 DMEM으로 시험예 3에서 사용한 추출물들을 처리한 후, 5시간 배양한 다음 배양액을 취하고 각 배양액 25㎕에 대하여 IL-6과 IL-8에 대한 ELISA를 수행하였다. 이 실험으로부터 브라디키닌에 의한 IL-6, IL-8의 생합성 저해능을 평가하였다. 하기 표 4의 IL-6 또는 IL-8의 생합성 저해능은 브라디키닌을 처리하지 않은 피부섬유아세포와 브라디키닌을 처리한 피부섬유아세포의 IL-6 또는 IL-8 생성량의 차이를 기준으로 계산하였다.

성분	추출물 농도	IL-6(pg/10⁵cells)	IL-6생합성 저해능(%)	IL-8(pg/10⁵cells)	IL-8생합성 저해능(%)
(-) Bradykinin	-	0.86±0.27	-	2.93±0.99	-
(+) Bradykinin	-	2.63±0.32	-	6.71±1.37	-
(+) Bradykinin + 라즈베리추출물	0.01%	1.57±0.13	59.9	5.62±0.07	28.8
(+) Bradykinin + 블루베리추출물	0.01%	1.46±0.05	66.1	5.23±0.38	39.2
(+) Bradykinin + 블랙베리추출물	0.01%	1.62±0.18	57.1	5.92±0.26	20.9
(+) Bradykinin + 크랜베리추출물	0.01%	1.70±0.10	52.5	5.87±0.48	22.2
(+) Bradykinin + 스트로베리추출물	0.01%	1.68±0.25	53.7	5.80±0.19	24.1

* (+): Bradykinin 처리, (-): Bradykinin 미처리

상기 표 4로부터 라즈베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물 등이 피부섬유아세포에서 브라디키닌 자극에 의한 IL-6과 IL-8의 생합성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있으며, 특히 블루베리추출물과 라즈베리추출물의 IL-6과 IL-8 생합성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

<시험예 5> 라즈베리추출물 등의 각질형성세포에서 자외선 자극에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과

사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포를 24-배양용기(well plate)의 각 well에 5×10⁴cells를 넣고 24시간 동안 배양시켰다. 상기의 각질형성세포에 최종 농도가 500mM이 되도록 아스피린(Aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(Prostaglandin H2 synthetase, 또는 Cyclooxygenase 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어 있는 각 well을 PBS로 2회 세척하고, 각 well에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B 램프(F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, 일본)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 well에 각질형성세포 배양액(Keratinocyte growth media, Clonetics, BioWhittacker사, MD, 미국)을 250㎕ 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 천연물 추출물을 표 5에 정리한 농도로 처리한 후, 16 ~ 20시간 동안 배양하였다. 일정 시간 경과 후, 배양액 상층을 적당량 취하여 16 ~ 20시간 동안 생합성된 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 정량함으로써, 천연물 추출물의 프로스타글란딘 억제 효과를 판단하였다. PGE2의 양은 효소면역분석법(Enzyme immunoassay)을 이용하여 정량하였다. 하기 표 5의 프로스타글란딘 생합성 억제율은 자외선을 조사하지 않은 각질형성세포와 자외선을 조사한 각질형성세포의 PGE2 생성량의 차이를 기준으로 계산하였다.

성분	추출물 농도	PGE2(pg/10⁵cells)	프로스타글란딘 생합성 억제율
(-) UV B	-	37.5±8.5	-
(+) UV B	-	287.4±18.6	-
(+) UV B + 라즈베리추출물	0.01%	84.7±15.2	81.1
(+) UV B + 블루베리추출물	0.01%	105.1±20.7	72.9
(+) UV B + 블랙베리추출물	0.01%	114.9±27.3	69.0
(+) UV B + 크랜베리추출물	0.01%	121.6±21.9	66.3
(+) UV B + 스트로베리추출물	0.01%	118.8±31.1	67.5

* (+): UVB 조사, (-): UVB 미조사

상기 표 5의 결과로부터, 라즈베리추출물, 블루베리추출물, 블랙베리추출물, 크랜베리추출물, 스트로베리추출물 등이 매우 낮은 농도에서 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 프로스타글란딘은 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있기 때문에 이상의 천연 추출물들은 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다.

<시험예 6> 인체 피부에 대한 미백효과 시험

건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소홍반량(MED; Minimum erythma dose)의 1.5 ~ 2배 정도의 자외선 B를 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 자외선 조사 후, 한 부분은 아래 표 6의 4가지 미백 조성물을 각각 용매로 1,3-부틸렌글리콜:에탄올=7:3 사용하여 1% 농도로 8주 동안 발라주고 나머지 부분은 아무 것도 바르지 않고 놔두었다, 1주 단위로 피부의 색깔을 Chromameter CR2002(일본, 미놀타社)로 측정하였고, 바르지 않은 부분과의 "L"값의 차이, 즉, 증가 정도(ΔL)를 평가하였다. 또한, 비교를 위해, 코직애씨드 1% 및 용매(Vehicle)를 발라주는 것도 함께 시험하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

활성성분	미백조성물1	미백조성물2	미백조성물3	미백조성물4
3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터	5.0	5.0	5.0	5.0
라즈베리추출물	50.0	-	-	20.0
블루베리추출물	-	50.0	-	20.0
블랙베리추출물	-	-	50.0	15.0
효모추출물	45.0	-	-	15.0
완두추출물	-	45.0	-	15.0
카야세네갈렌시스추출물	-	-	45.0	10.0

시험물질	피부색 밝기 정도(ΔL)
용매(Vehicle)	0.50 ± 0.15
코직애씨드	0.99 ± 0.11
미백조성물1	1.61 ± 0.25
미백조성물2	1.57 ± 0.13
미백조성물3	1.39 ± 0.11
미백조성물4	1.78 ± 0.18

상기 표 7로부터, 미백 조성물 1 ~ 4는 종래의 미백 성분인 코직애씨드보다 피부색 밝기를 나타내는 L 값의 증가가 현저하게 나타나 피부에 대한 미백 효과가 우수함을 확인하였다.

<제형예 1 ~ 5 및 비교 제형예 1>

본 발명의 화합물을 함유한 제형에서의 임상적인 미백효과를 평가하기 위하여, 하기 표 8과 같이 피부 외용제로 제형화하였다. 먼저 원료 A, B 및 C군을 각각 평량한 다음, B군에 A군를 서서히 가하면서 호모저나이저(Homogenizer)를 이용하여 1차 유화하고, 다시 C군를 서서히 가하여 2차 유화를 실시한 후, 교반 및 냉각하여 최종 제형을 얻었다.

<시험예 7> 미백 임상 효과

얼굴에 기미와 같은 색소 침착이 있어 고민하는 피검자 70명을 대상으로, 본 발명의 미백 조성물이 함유된 제형예 1 ~ 5 및 이미 널리 알려져 있는 대표적인 미백제인 코직애씨드가 함유된 비교 제형예 1을 아침, 저녁으로 1회씩, 3개월 동안 얼굴의 기미 부위에 바르게 하였다. 또한, 대조군으로 어떤 미백 활성 성분도 함유하지 않은 제형에 대하여 평가하였다.

<평가 방법>

상기 제형을 사용한 후의 색소 침착의 개선 정도를 아래에 기술한 기준에 따라 판정하고, 10명의 사용자의 판정치를 평균한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

- 효과 탁월 (3): 색소 침착이 거의 눈에 띄지 않게 되었다.

- 효과 있음 (2): 색소 침착이 아주 연해졌다.

- 약간 효과 있음 (1): 색소 침착이 연해졌다.

- 효과 없음 (0): 아무런 변화가 없었다.

시험물질	미백 효과 판정 평균
대조군	0.4 ± 0.12
비교 제형예 1	1.2 ± 0.21
제형예 1	1.8 ± 0.22
제형예 2	2.3 ± 0.10
제형예 3	2.3 ± 0.38
제형예 4	2.1 ± 0.14
제형예 5	2.6 ± 0.23

상기 표 9로부터, 본 발명의 화합물을 함유한 피부 외용제의 경우, 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드만을 포함한 제형도 코직애씨드를 함유한 것보다 우수한 미백 효과를 나타냈으며, 특히 제형예 5에서와 같이 자극이나 염증을 억제하는 성분과 열충격 단백질의 합성을 촉진시키는 성분들을 함께 함유한 제형이 가장 우수한 미백 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.

<시험예 8> 인체 첩포 시험

지금까지 피부 자극에 대하여 과민 반응을 보인 경험이 없는 평균 연령 25.3세의 건강한 여성과 남성 30명을 대상으로, CTFA Guideline(The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc. Washington, D.C. 20036, 1991)에 따라 인체 피부를 대상으로 다음과 같은 일차자극 시험을 실시하였다. 우선, 아래 표 10과 같이 구성된 기본 처방에 조성물 1 ~ 4를 각각 1중량%씩 함유한 시험 물질 20㎕씩을 핀 챔버(Finn chamber) 내에 적하한 다음, 시험 부위인 전박(forearm) 피부에 부착시키고, 마이크로 테잎(micro tape)으로 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 실시하였으며, 핀 챔버를 제거한 후에는 마킹 펜(marking pen)으로 시험 부위를 표시하고, 1시간 및 24시간 후에 각 시험 부위를 관찰하였다. 피부 반응을 하기 표 11과 같이 평가하여, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

성분	원료명	함량
오일(Oil) 및 왁스(Wax)	글리세릴스테아레이트	1.50
	하이드로제네이티드폴리데센	10.00
	세틸옥타노에이트	6.00
	세테아릴알콜	2.00
계면활성제	세테아릴글루코사이드	2.00
계면활성제	솔비탄스테아레이트	1.20
점증제(Thickner)	카보머	0.13
폴리올(Polyol)	글리세린	10.00
pH 조절제	트리에탄올아민	0.13
물	증류수	To 100

등급	기호	판정 기준
0	-	무자극(No visible reactions)
1	±	약자극(Mild erythema)
2	+	강자극(Intense erythema)
3	++	부종을 동반한 강자극(Intense erythema with edema)
4	+++	수포, 부종을 동반한 강자극(Intense erythema with edema & vesicle)

시험물질	반응이 나타난 피검자수(명)										평균반응도(n=30)
	24시간 후					48시간 후
	-	±	+	++	+++	-	±	+	++	+++
미백조성물1	30	0	0	0	0	29	1	0	0	0	0.42
미백조성물2	28	2	0	0	0	30	0	0	0	0	0.83
미백조성물3	29	1	0	0	0	30	0	0	0	0	0.42
미백조성물4	30	0	0	0	0	30	0	0	0	0	0.00

수학식 1에 의해 구한 평균 반응도 또한 표 12에 나타내었다. 상기 표 12로부터, 본 발명에 따른 피부 미백용 외용제 조성물은 인체 자극 시험 결과, 평균 반응도 값이 모두 0 ~ 0.83으로 나타나 일반적으로 무자극으로 판정하는 1보다 작으므로 인체에 안전한 조성물이라고 할 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명의 열충격 단백질 생성 촉진 성분은 자외선 또는 열과 같은 외부의 스트레스로부터 세포를 효과적으로 보호하며, 또한 본 발명의 미백 조성물은 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 피부 자극이나 염증을 억제 또는 완화시키며, 더 나아가 각종 외부 스트레스로부터 세포를 보호하는 열충격 단백질의 합성을 증가시키는 효과가 있으며, 이를 함유하는 피부 외용제 조성물은 피부의 색소 침착을 개선시켜 우수한 미백 효과를 나타내면서, 피부에 어떤 자극도 일으키지 않으므로 피부 미백용 외용제로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

삭제
열충격 단백질 생성 촉진 성분에 하기 화학식 1로 표시되는 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터 및 피부의 자극 또는 염증의 발생을 억제하는 성분을 부가하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.

[화학식 1]
제 2항에 있어서, 상기의 외용제 조성물은 외용제 조성물 총 중량에 대하여 3,4,5-트리메톡시신나믹애씨드치몰에스터를 0.0001 ~ 5중량%, 자극 또는 염증 발생 억제 성분을 0.0001 ~ 30중량%; 및 열충격 단백질 생성 촉진 성분을 0.0001 ~ 20중량%; 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.
제 2항에 있어서, 상기의 피부의 자극 및 염증을 억제하는 성분으로는 라즈베리추출물, 블루베리추출물, 크랜베리추출물, 블랙베리추출물 또는 스트로베리추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.
제 2항에 있어서, 상기의 열충격 단백질 생성 촉진 성분으로는 엑토인, 화이트윌로우추출물, 효모추출물, 완두추출물, 카야세네갈렌시스추출물, 케페익애씨드 또는 p-쿠마릭애씨드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 외용제 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 외용제 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 타입의 경피 투여형 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.