KR100463630B1 - 고상 펩티드 합성용 반응기 및 방법_ - Google Patents

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말린크로트, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 고상 펩타이드 합성 반응기 시스템(1) 및 그 반응기의 작동방법을 제공한다. 반응기 시스템(1)은 하우징내의 축 둘레를 회전가능한 바스켓(17)과 하우징(7)에 유체를 전달하고 하우징으로부터의 유체를 수집하는 섬프/수용체(5)를 포함한다. 바스켓(17)은 펩타이드 합성용 수지케이크(R)이 형성되는 천공 측벽(23)을 갖는다. 반응기(7)와 섬프/수용체는 용액인 순환되는 회선 또는 루프를 형성한다. 용액의 순환은 반응기(7)가 넘치는 것을 방지하여 바스켓(17)이 용액에 잠기지 않게하고 보다 적은 액체를 사용하게 한다. 따라서, 보다 높은 아미노산 농도가 사용될 수 있다. 방법으로는 바스켓(17)의 벽(23) 상에 일정한 깊이의 수지케이크(R)을 형성하고 바스켓이 회전하는 동안 수지케이크에 용액을 스프레이 하는 것을 포함한다. 용액은 수지케이크(R)을 통과하여 시스템을 통하여 순환 또는 재순환되거나 시스템으로부터 배출된 섬프(5)로 배수된다. 후속 용액이 반응기 시스템(1)으로 유입되기 전에 기존의 용액은 용액에 대한 펩티드의 노출시간을 조절하기위해 시스템으로부터 퍼지된다.

Description

고상 펩티드 합성용 반응기 및 방법
본 발명은 고상 펩티드 합성에 관한 것으로, 특히 반응기 시스템과 고상 펩티드 합성이 현재 이용가능한 것들보다 산출량과 수율의 증가와 함께 대규모로 수행될 수 있는 신규한 고상 반응기 시스템을 이용하는 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드, 올리고데옥시뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고사카라이드, 단백질등과 같은 고형 물질에 대한 단계적 합성을 포함하는 다른 액체-고체 반응에 대한 본 발명의 시스템과 방법의 보다 넓은 이용가능성은 본 기술분야에 통상의 지식을 가진자에게 명백하다.
고상 펩티드 합성(SPPS)은 1963년에 메리필드(Merrifield)에 의해 개발되었다. 기본과정을 잘 알려져 있다. SPPS 방법은 전형적으로 디비닐 벤젠과 가교결합된 부분적으로 염소화된 폴리스티렌과 같은 폴리머겔로 시작한다. 보호된 아미노산의 C-말단은 초기에 예를들면 아미노산의 벤질 에스테르에 의해 수지에 결합된다. 다른 결합제도 물론 사용될 수 있다. 펩티드는 보호된 아미노산의 C-말단으로부터의 서열에서 합성된다. 아미노산의 아미노기와 모든 반응성 측쇄 관능기는 바람직하지 않은 부반응을 방지하기 위해 안정한 블로킹 그룹에 의해 보호되어야 한다. 블로킹 그룹은 아미노기가 측쇄 보호기 또는 C-말단과 수지 사이의 결합을 방해하지 않고 보호해제 되도록 선택되어야 한다. 아미노기는 예를들면 boc(t- 부톡시 카르보닐) 또는 fmoc(9- 플루오레닐 메톡시 카르보닐)기에 의해 보호될 수 있다.
펩티드 합성은 전형적으로 하기 과정에 의해 수행된다 : 수지-결합 펩티드의 N-말단(boc에 의해 보호된)은 예를들면 디클로로메탄(DCM)에 있는 트리플루오로아세트산(TFA)의 용액에서 블록해제된다. 서열에서 다음 아미노산은 예를들면 DCM과 디메틸 포름아미드(DMF)의 용액에서 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같은 커플링제와 함께 수지-결합 펩티드에 결합된다. 1-하이드록시벤조트라졸(HOBt)와 같은 활성화제가 커플링 반응의 속도와 선택성을 개선시키고 라세믹화를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 미반응 아미노산, 시제 및 부산물은 세척과 여과에 의해 수지로부터 제거된다. 이때 세척과 여과 과정이 반복된다. 펩티드의 N-말단은 블록해제되고 또 다른 펩티드가 쇄에 부가되며 그 후 시스템은 세척 및 여과된다. 이 과정은 모든 소정의 아미노산 모두가 원하는 정도로 펩티드 쇄에 부가될때까지 반복된다. 이때 남아있는 블로킹 그룹이 펩티드로부터 제거되고 펩티드는 수지로부터 개열되어(cleaved) 수집된다.
SPPS는 원래 수지가 분산되는 플라스크를 흔들거나 교반하여 수행되었고 여전히 종종 수행되고 있다. 수지를 유체상으로 현탁 및 혼합하기 위해 수지가 흡수하거나 보유할 액체 양의 몇배가 시스템에 요구된다. 따라서, 수지가 10ml의 액체를 보유한다면 50-100ml의 액체가 수지를 분산시키고 현탁시키기 위해 요구된다. 증가된 액체량은 아미노산이 비씨기 때문에 비용을 최소화하기 위해 희석용액(전형적으로 150mmol 아미노산/용액의 리터)을 사용하게한다. 희석용액으로는 고 농도의 아미노산 및 아미노산과 성장 쇄의 빠른 화학반응을 얻기 어렵다. 또한, 수지가 배치 희석을 거쳐 (플라스크에서) 세척 및 여과될 때 제한된 수의 배치세척으로는 사용된 모든 DCM과 TFA를 수지로부터 제거하는 것은 사실상 불가능하다. 그 결과, DCM 및 TFA와 펩티드 쇄의 접촉시간이 정확하게 조절될 수 없다.
반응기 개발전에 있어서 많은 설계 문제가 펩티드 합성에 독특한 것이다. 고상 펩티드 합성에 사용된 수지는 보통 낮은 정도의 가교결합을 갖는 겔 수지이다. 이들 수지는 특정 용매(DCM과 같은)에서 팽윤하고 다른 용매(메탄올과 같은)에서 수축한다. 수지 체적은 또한 펩티드 쇄 길이의 성장에 따라 증가하는 경향이 있다. 또한, 이들 수지는 자연적으로 매우 연화되는 경향이 있고 따라서 물리적 마찰에 민감하다. 이들 특성을 수용하는 반응기가 요구된다. 합성에 사용된 펩티드-수지와 용매 및 반응물 사이의 노출시간의 양도 매우 중요할 수 있다. 수지-결합 펩티드의 보호해제는 최상의 수율을 얻기 위해 완료되어야 하지만 결과로 생긴 카보카티온(carbocation)은 발생할 수 있는 바람직하지 않은 부반응 때문에 펩티드와 접촉한 상태로 유지되어서는 안된다. 불행하게도, 수지 슬러리 현탁액으로부터 용액을 유출시키기 위해 요구되는 시간은 여과시 형성된 수지상의 깊이에 따라 증가한다. 결과적으로, 카보카티온에 대한 수지-결합 펩티드의 노출시간은 상 깊이 증가에 따라 증가한다. 그 결과, 킬로그램 규모 반응을 위한 여과시간은 벤치규모 반응에서 마주치는 것들보다 훨씬 길고, 따라서 카본카티온과의 반응으로 인한 펩티드의 손상 위험은 배치 크기에 따라 증가한다. 따라서, 여과시간을 최소화하기 위한 방법으로 보다 큰 규모의 반응기가 설계되어야 한다. 이 문제에 대한 몇가지 해결책이 반응기 설계 방법에 의해 그리고 반응기 설계에 의해 허용된 수지 입자 특성을 통해 선택될 수 있다.
화학반응을 발생시키기 위해서는 반응물종이 비드내의 반응 부위에 존재해야 한다. 커플링 단계에 포함된 반응은 반응물 (DOC 및 커플링 반응기의 벌크 액상으로부터의 중간체)이 내부 반응 부위로 수지의 표면과 공극을 통해 침투하는 속도에 의해 제한될 수 있다. 알려진 바와같이, 전형적으로 폴리스티렌 수지인 수지는 효과적으로 다공성 구형으로 형성된다. 형성될 펩티드 쇄의 초기 아미노산은 수지 매트릭스 전체에 걸쳐 내부 부위에 결합된다. 그후 펩티드 쇄는 반응물 종이 그 부위에 도달할 때 이들 부위에서 성장을 시작한다.
벌크액체에서 수지내의 이 부위로 반응물의 물질이동 속도는 용매를 통한 용질의 확산 계수가 곱해진 농도 구배에 비례(Fick's Law)하지만 저항의 개념으로 물질이동을 고려하는 것이 편리하다. 이종의 고체-액체 공정에서 물질이동에 대한 저항은 두 위치 : (1) 수지 입자의 표면에 있는 정체된 액체 막에 걸쳐 ; 그리고 (2) 수지 입자의 공극내에서 명백하다. 수지와 관련하여 유체 속도를 증가시키는 것은 막저항을 감소시킨다. 수지내에서 물질이동에 대한 저항을 감소시키기 위해서는 수지 비드가 작고 겔 상태(즉, 5-100μ)인 것이 바람직하다. 보다 젤라틴성인 수지의 사용은 1mmol의 활성부위(또는 펩티드 쇄)/gm 수지를 초과하고 고 수율과 전환에서 2-4mmol/gm에 근접하는 장착을 허용하게 한다. 작은 수지 입자의 사용은 세척 용매와의 효과적인 매트릭스 교환을 얻는 것이 더 쉽기 때문에 수지의 보다 우수하고 빠르며 완전한 세척을 용이하게 할 것으로 기대된다. 더욱이, 수지비드는 그들의 공극을 개방하기 위해 소량의 가교결합을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 약간의 가교결합이 수지에 형상을 제공하고 수지비드에 강도를 부여하기 위해 수지에 요구된다. 0.2-1.0%의 가교 결합을 갖는 수지비드가 충분하다.
아미노산이 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)에 의해 활성화되는 합성 방법에서는, 수지 코어내로의 분산에 대한 저항이 기본적으로 커플링 반응동안 사용된 DCM에 있는 50% DMF용액에 불용성인 디사이클로헥실우레아 (DCU)의 형성에 의해 크게 증가한다. 불용성 DCU의 쉘은 수지상에 형성할 수 있다. DCU의 이러한 침착은 반응물과 세척물이 수지 비드의 표면과 코아 사이로 이송되는 것을 방해한다. 극단적인 경우에는 벌크 액상으로부터 유리 아민으로의 확산이 불가능하고, 커플링을 위해 이용가능한 boc-아미노산만이 DCC의 첨가전에 수지내에 초기에 존재하는 물질이라는 것을 발견할 수 있다.
수지로의 반응물의 확산은 펩티드 쇄 그자체의 형성에 의해서도 방해될 수 있다. 다공성 입자에서 이종 반응은 일반적으로 입자의 외부 표면에 대해 방사상으로 내향하여 성장한다고 알려져 있다. 이것을 고상 합성에 적용하는 것이 당연하다. 비드는 반응된 펩티드의 성장 쉘과 수축하는 미반응 코어를 수축시키는 것을 포함할 수 있다. 유리아민과 활성화된 중간체 사이의 반응속도가 수지 공극을 통한 확산 속도에 비해 빠르면, 반응된 펩티드의 쉘 및 가능하게 DCU가 입자 표면으로부터 방사상으로 내향하여 성장한다. 반응은 수지 비드내의 수축 코어의 표면에서 발생한다. 따라서, 반응물은 수지 비드의 반응하지 않은 코어에 도달하기 위해 펩티드와 DCU의 증가하는 두꺼운 층을 통해 확산되어야 한다.
DCU의 침전에 대한 하나의 해결책은 반응 시스템의 화학물질의 변화이다. DCU로 막힌 공극을 통한 확산에 대한 저항은 개별 반응기에서 대칭 안하이드라이드, o-아실 이소우레아 및 HOBt 활성에스테르를 형성하고 (즉, 아미노산을 예비활성화함) 합성이 수행되는 주 반응기로 유입하기전에 용액으로부터 DCU를 여과하므로서 감소 또는 제거될 수 있다. 커플링 반응동안 불용성 생성물을 형성하지 않는 다른 커플링제(DIC와 같은)가 사용된다면 유사한 잇점이 실현될 수 있다.
DCU과 같은 불용성 화합물의 형성에 의한 방해를 감소시키는 것 이외에 공극 확산 제한도 보다 작은 입자를 사용하므로서 감소될 수 있다. 물질이동 저항을 감소시킨 결과, 반응물의 보다 낮은 농도가 같은 반응속도를 얻는데 요구된다. 이것은 생성물의 그램당 요구되는 아미노산, HOBt 및 DCC의 사용을 매우 감소시킬 수 있다.
입자로 그리고 입자를 통한 많은 확산의 분석이 도 3과 도 4에 도시되어 있다. 반응물의 농도는 입자의 표면에서 가장 높고 입자내의 반응물 농도는 반응물이 수지 입자로 확산 또는 통과할 때 시간에 따라 증가한다. 도 3과 4는 시간(τ)에 따른 농도 증가 속도가 수지 입자의 표면에 있는 막을 통하는 물질이동 계수(H) 및 농도가 측정되는 입자를 통하는 상대적인 거리 제타=(r/R)에 좌우되는데 여기에서 R은 입자의 전체 반경(입자크기)이고, r 은 입자의 중심으로부터 측정된 지점이 다고 제시한다. 따라서, 입자의 표면에서 r/R=1이고 입자의 중심에서 r/R=0이다. 도 3에서, 4개 곡선 각각은 입자표면에서 막 저항성(H=∞)도 없을 때 주어진 시간 (τ)에서의 농도 프로파일을 나타난다.
도 4는 도 3과 유사한 2개의 플롯이지만 여기에서는 입자표면의 막을 통하는 물질이동에 대한 저항성이 증가된다(즉, H가 감소된다). 도 4의 2개 플롯(H=1 과 H=3)을 비교하므로서 입자내의 농도가 입자의 표면에서의 보다 낮은 막 저항성(즉, 보다 높은 H)에서 보다 빨리 상승한다.
도 3과 4는 상당한 저항성(표면에서와 입자의 공극 모두에서)에서는 입자내의 농도 증가가 보다 느리다는 것을 나타낸다. 이것은 입자에 및 입자를 통한 반응물로의 물질이동이 증가될 수 있도록 내부 공극 저항성과 외부 표면 막 저항성을 모두 감소시킬 필요성을 지적한다. 수지 결합 유리 아민으로의 반응물의 물질이동은 액상에 있는 반응물의 농도를 증가시키고 공극길이를 감소시키므로서 (보다 작은 직경의 수지 입자를 사용하므로서) 강화될 수 있다. 또한, 막을 통한 물질이동에 대한 저항성은 구형 본체에 대한 막 계수가 유체속도의 함수이기 때문에 수지 입자에 대한 벌크 유체의 속도를 증가시키므로서 감소될 수 있다. 이들 확산 문제들을 동시에 언급하는 반응기 설계는 현재 입수가능하지 않다.
1963년 메리펠드에 의해 고상 펩티드 합성(SPPS)의 초기 개발 이래로 펩티드 합성용 반응기 설계에 많은 혁신이 이루어져 왔다. 초기 반응기는 교반 플라스크에 기초를 두고 있는 반면에 최근 반응기 설계는 교반-탱크 반응기, 원심분리 반응기, 관형 반응기를 포함한다. 이들 모두는 액상으로 현탁되거나 넘치는 수지 비드로 작동된다. 교반 탱크 반응기 (STR's)는 일반적으로 펩티드 합성에 사용되지만 그들은 특정 한계를 갖는다. 비드가 현탁액으로 있기 때문에 교반 탱크 반응기에 있는 입자와 관련하여 액체 속도를 증가시키기 위한 기회는 극도로 제한된다. 이것은 현탁된 입자상에 있는 이동액체에 의해 부과된 불활성 및 점성력이 액체와 함께 입자를 끌어당기는 경향이 있기 때문이다. 그러나, 입자에 대한 유체 속도장은 충전 상 반응기에서 쉽게 증가되는데 여기에서 수지 입자는 고정된 상태를 유지하지만 액체는 수지상을 통하는 힘을 받게된다. 그러나, 수지로부터 액상을 여과하기 위해 요구되는 교반 탱크와 충전 상-반응기에 있는 하부 프리트(frit)는 여과 를 위해 요구되는 압력차를 견딜 수 있어야 한다. 반응기 크기가 증가할때는, 프리트가 기계적인 실패를 피하기 위해 점진적으로 강화된 물질로 제조되어야 한다. 이에반해, 만약 반응기 직경이 일정하게 유지된다면, 필터 프리트상의 수지 깊이는 배치크기가 증가할 때 매우 증가한다. 증가된 수지깊이는 점진적으로 보다 긴 배수와 반응물, 반응중간체 및 용매에 대한 수지 결합 펩티드의 보다 긴 여과 시간 및 보다 긴 노출시간을 가져온다. 이러한 이유 때문에, 붙박이 필터를 갖는 교반 탱크 반응기 또는 충전 상 반응기 모두 거대한 (수 킬로그램) 크기 SPPS공정을 위한 최상의 효율적인 반응기 형태를 대표하지 않는다.
반응 과정에 걸쳐 입자크기의 변화가 약간의 설계 어려움을 가져왔지만 충전 상 반응기와 같은 관형 반응기는 아직까지도 다른 반응기에 비해 약간의 잇점을 제공한다. 충전 상 반응기는 반응기 입구와 수지 비드사이의 "데드(dead) 용적"의 양이 최소화된다면 STR에서와 같은 희석 작업 보다는 대체작업으로서 세척을 진행할 수 있게 한다. 액체 속도가 수지 비드에 대해 빠르다면 관형 반응기에서 레이놀즈 (Reynolds) 수(Re)가 매우 높다. 그러나, 높은 유속은 반응기내에 고압을 제공하고 고압은 수지에 불리한 효과를 가질 수있다. 그럼에도 불구하고, 물질이동 계수는 레이놀즈 수가 증가함에 따라 증가하기 때문에 관형 반응기는 교반 탱크, 현탁 반응기보다 물질이동에 대해 액체막 저항성을 가질 수 있다.
그러나, 충전 상의 사용은 그 자체의 문제를 갖는다. 수지는 DCM으로 세척될 때 원래 크기의 3×까지 팽창할 수 있고 메탄올로 세척할 때 원래크기의 1/3로 수축될 수 있다. 이것은 수지상의 전체 체적의 9× 변화에 이를 수 있다. 따라서, 데드 체적의 제거 또는 최소화를 달성하기 매우 어렵다. 직경보다 훨씬 긴 높이를 갖는 충전 상은 수지상의 팽창과 수축을 방해하는 많은 양의 벽표면적을 갖는다. 수지상이 팽창될 때, 이것은 용기의 벽에 채워져서 수지 입자들 사이의 빈 공간을 감소시킨다. 따라서, 요구되는 시간에서 상을 통해 모든 세척물을 밀어내기위해 고압이 요구된다. 고압은 수지상을 손상시킬 수 있고 필터를 막을 수 있는 미세 입자를 만들 수 있고 잠정적으로 필터 프리트를 잠재적으로 손상 또는 파손시킬 수 있다. 만약 고압이 사용되지 않는다면 상을 통하는 흐름이 매우 느리고 펩티드는 너무 오랫동안 반응하여 부 반응을 겪을 수 있다. 약간의 아미노산 또는 펩티드 커플링단계는 반응 시간에 매우 민감하다. 예를들면, 아르기닌은 펩티드 쇄에의 커플링 대신에 사이클릭 구조를 형성하기 위해 그 자체와 반응할 수 있다. 따라서, 노출시간은 매우 중요한 요소일 수 있다.
수지에 의해 부과된 구속을 극복한 관형 반응기를 고안하기 위해 몇가지 시도가 행해졌다. 이들 기존의 시도는 하기를 포함한다.
(1) 수지 팽윤에 따른 문제를 무시. 벌룬더(Verlunder)등의 미국 특허 제 4,192,798호는 반응기 압력 저하가 최소한 200psi, 10,000psi 이하 또는 그 이상인 접근을 기술하고 있다. 그들은 정량적인 수율을 청구하고 다른 반응기에서 수시간 걸리는 반응이 몇분내에 완료되었다. 이 형태의 반응기가 갖는 어려움은 수지의 감성, 출구 프리트의 차단, 규모 증가시 칼럼전체에 걸쳐 일정한 축 흐름 유지, 데드 체적으로인한 세척의 비효율성 및 칼럼과 고압 펌프의 비용을 포함한다.
(2) 칼럼의 축 팽창 허용. 바루(Baru)등의 WO88/909010.6, SU4117080은 반응기의 한 단부가 수지와 함께 부유되도록한 제로 데드체적 반응기를 발전시켰다. 반응기의 부유 헤드(head)에 일정한 힘을 제공하기 위해 적은 중량이 반응기의 상부 피스톤에 첨가되었다. 그 결과, 칼럼은 상부 헤드 주위로 용매가 흐르는 것을 피하기 위해 저압 저하로 작동되어 출구 프리트의 차단에 매우 민감하게 한다. 압력저하를 증가시킬 수 있는 상 또는 프리트내의 DCU 축적은 안정성과 환경적인 결과를 가질 수 있다. 또한, 저압 저하의 구속은 낮은 액체 속도를 요구하여 낮은 레이놀즈 수와 액체 흐름의 가능한 불균형한 분포를 가져온다. 낮은 액체 속도 또한 반응물과 세척물에 대한 보다 긴 노출시간을 가져온다.
(3) 강성 폴리머에 의해 지지된 겔의 사용. 아테톤(Atherton)등의 JCS Chemical Communications, p. 1151(1981)은 겔이 거대 공극내에 함유될 수 있는 강성 폴리머를 개발했다. 겔은 팽윤 및 수축할 수 있지만 강성 폴리머 비드의 체적은 일정하게 유지된다. 그 결과, 높은 액체 유속, 저압 저하 및 일정한 수지 체적이 얻어질 수 있었다. 그러나, 반응물의 확산경로는 막첨가 및 지지물을 통한 공극확산 후 증가하기 때문에 물질이동의 감소가 이들 형태의 지지된 수지에서 발생하기 가장 쉽다. 또한, 이들 형태의 수지는 비싸다.
(4) 데드 체적 허용. 라플루예(Lapluye)와 포이슨(Poisson)의 PCT공개 제 WO92/115867은 프리트화된 단부를 갖는 피스톤형 반응기를 개발했다. 이러한 형태의 반응기에서는 수지는 용매와 반응물의 가득찬 보다 큰 실린더내에서 상, 하향 사이클을 가진 중공 피스톤에 위치된다. 이러한 형태의 반응기는 근본적으로 진탕기 또는 유동된 상 반응기와 유사하고 피스톤 반응기의 혼합 운동은 수지와 용매의 밀도 차이를 보상한다. 세척 효율은 STR에서와 같거나 약간 우수하거나 보다 작은 유체상 체적인 것으로 보인다. 그러나, 수지 물질과 관련하여 사용된 용매의 부피는 전형적인 관형 반응기에 의해 요구되는 것보다 아마도 상당히 더 크다. 레이놀즈 수는 아마도 매우 낮고 기계적인 부분의 규모를 증가시키기 어려울 수 있다. 또한, 열이 액체를 통과하는 피스톤 운동에 의해 발생되는 "점성 소산" 효과로 인해 생산될 수 있어서 약간의 부가적인 냉각 수단이 요구된다.
이점에서, 비용, 안전성 또는 효율에서 어떤 심각한 제한을 갖지 않는 관형 반응기인 것으로 보이지 않는다.
회전 보울(bowl)의 설계에 기초한 반응기도 개발되어 왔다. 회전 보울 또는 원심분리 반응기는 수지 입자와 관려하여 액체 속도를 증가시킬 수 있다. 비르(Birr)의 독일 특허 제 2,017,351호는 다공성 바스켓에 수지가 초기에 장전된 후 바스켓이 액체에 침수되는 동안 중간속도로 회전하는 "세척기계" 반응기를 기술하고 있다. 원심력은 수지 입자가 바스켓의 내부 벽에 상을 형성하도록 하고 수지 상을 통한 중간정도의 유체 재순환을 야기한다. 보울은 수지상인것과 같이 넘친다(즉, 액체로 채워진다). 액체 조에 의해 바스켓에 부과된 견인력은 구동 모터에 높은 토크를 부과하여 열의 발생을 야기한다. 이러한 이유 때문에, 비르 반응기외 회전 속도는 상대적으로 느리고 상대적인 고체 대 유체속도는 제한된다. 회전 속도의 제한은 상부에서는 얕고 하부근처에서는 깊은 비균일한 수지상을 거의 확실히 가져온다. 재순환 액체는 가장 적은 저항 경로를 따르는 경향이 있고 따라서, 상의 보다 얕은 부분을 통해 "단락(short-circuit)" 된다. 그 결과, 반응물 이 풍부한 액체와 수지 사이의 접촉은 반응기 전체에 걸쳐 일정하지 않을 것이다. 또한, 수지에 대한 액체의 보다 낮은 속도는 입자를 둘러싼 표면 막을 통하는 보다 낮은 물질이동을 가져올 것이다. 최종적으로, 회전하는 바스켓을 침수시키는데 요구되는 용매량은 수지 충전물을 침지시키는데 요구되는 량과 비교할 때 크다. 따라서, 이것은 수지 물질에 비해 많은 양의 반응물을 요구한다. 이렇게 많은 양은 낮은 농도의 용액 사용을 가져오고 결과적으로 보다 느린 반응속도와 보다 긴 반응시간을 가져온다. 따라서, 적당한 반응속도를 가져오는 수준으로 아미노산 농도를 유지시키기 위해 보다 많은 양의 아미노산을 요구한다.
넘치는 "중공로터"에 기초한 원심분리 반응기의 또다른 형태는 앤더슨(Anderson)의 미국 특허 제 5,186,824호에 의해 개발되었다. 앤더슨등의 반응기에서 액체 흐름 경로는 방사상이라기 보다는 축상이고 기하학적 형태는 액체 유장에있어서 불규칙하다. 액체가 유입되는 지점은 가장 최근에 첨가된 액체의 밀도와 관련한 액체의 밀도에 좌우된다. 또한, 수지의 팽창을 위한 실(room)이 거의 제공되지 않는다. 팽창과 수축의 결과, 액상에 대한 수지의 노출은 비균일하기 쉽다. 완전하고 균일한 접촉과 로터로부터 액체의 제거는 달성하기 매우 어려울 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 현재 이용가능한 것보다 높은 산출량과 수율을 생성하는 SPPS를 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
또다른 목적은 다양한 시제와 펩티드 쇄의 접촉 시간이 보다 정확하게 조절될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또다른 목적은 반응속도가 증가된 방법을 제공하는 것이다.
또다른 목적은 사용된 아미노산의 증가없이 (그리고 가능하게는 보다 적은 양의 아미노산을 갖는 보다 높은 농도를 사용하여) 현재 가능한것보다 높은 농도의 아미노산을 사용할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또다른 목적은 이러한 방법을 위한 반응기를 제공하는 것이다.
또다른 목적은 고상을 통하는 액체의 물질이동이 증가되는 반응기를 제공하는 것이다.
또다른 목적은 수지의 팽창과 수축을 방해하지 않고 수지의 마찰을 일으키지 않는 반응기를 제공하는 것이다.
또다른 목적은 수지상을 통하는 유체 흐름이 일정하도록 수지상의 두께가 거의 일정한 반응기를 제공하는 것이다.
또다른 목적은 용매 폐기를 감소시킬 수 있는 반응기 시스템을 제공하는 것이다.
또다른 목적은 원심력에 의해 수지로부터 용매를 "압착(squeeze)" 시킬 수 있는 능력을 가지므로서 성장 펩티드의 응집을 야기하고 수지를 손상시킬 수 있는, 알콜로 수지 입자를 화학적으로 수축시키는 단계를 제거한 반응기를 제공하는 것이다.
또다른 목적은 펩티드 형성에 이로운, 다른 입자 크기 및 가교 결합 특성을 갖는 수지의 광범위한 선택을 허용하는 것이다.
이들과 다른 목적은 하기 도면과 첨부된 상세한 설명을 고려할 때 본 기술분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 명백해질 것이다.
일반적으로 언급되는 본 발명에서 본 발명자들은 상기 언급된 목적을 달성하는 반응기 시스템과 그 시스템을 작동하기 위한 방법을 제공했다. 반응기 시스템은 하우징과 하우징내에 설치된 회전가능한 바스켓을 갖는 반응기를 포함한다. 바스켓은 수지 케이크가 합성 과정에서 그 상부에 형성되는, 천공되고, 다공성이며 또는 작은 구멍이 많은 측벽을 갖는다. 필터 클로쓰(cloth) 또는 스크린이 바스켓 벽의 내표면에 위치되고 케이크는 필터 클로쓰에 형성된다. 시스템은 또한 용액 공급 탱크 또는 반응기에 유입되는 용액을 회수하는 수용체/섬프(sump)를 포함한다. 용액 공급 탱크는 입구와 출구를 포함한다. 용액 공급 탱크와 반응기는 상호연결되어 용액이 순환되는 루프 또는 회선을 한정한다. 반응기 시스템은 반응기 바스켓이 용액에 잠기지 않도록 작동된다. 따라서, 반응기는 용액이 넘치지 않고 모든 용액은 수지 케이크를 통과한다.
시스템은 반응기와 공급 탱크를 상호연결하는 라인에 있는 폐기물 수집기와밸브를 갖는 퍼지 시스템을 포함한다. 밸브는 시스템으로부터 제 1용액을 퍼지하고 제 2용액의 유입전에 제 1용액이 폐기물로 향하도록 작동된다. 퍼지 시스템은 반응기 입구에 공급 탱크출구를 연결하는 라인에 있는 제 1밸브 및 반응기 출구와 공급탱크 입구를 연결하는 라인에 있는 제 2밸브를 포함한다. 제 1밸브는 제 1용액의 순환 시간이 완료된 후 그리고 제 2용액이 공급탱크내로 유입되기 전에 제 1용액이 폐기물을 향하도록 작동된다. 제 2밸브는 상에 남아있는 어떤 제 1용액이 제 2용액을 함유하는 그 지점에서 공급 탱크로 들어가는 것을 방지하기 위해 제 2용액의 순환 초기의 짧은 시간동안 순환 용액이 폐기물로 향하도록 작동된다.
바람직하게, 반응기 시스템은 또한 용액이 제조되는 (즉, 아미노산 용액이 예비활성화되고 수지 슬러리가 제조되는 등) 보급탱크를 포함한다. 공급탱크는 반응기 및 용액 공급탱크와 유체가 통하게 연결된다. 밸브는 보급탱크의 내용물이 용액 공급탱크와 반응기로 선택적으로 향하도록 작동가능하다. 보급탱크로부터의 밸브는 수지 슬러리가 직접적으로 반응기로 향하고 아미노산 용액, 세척액등이 공급 탱크를 향하도록 작동된다. 필터는 보급탱크와 공급탱크 사이에 위치되는데 그것을 통하여 예비활성화된 아미노산 용액이 통과된다. 필터는 활성화 반응의 불용성 부산물(DCU와 같은)을 여과하여 제거하기 위해 제공된다. 필터 우회 라인은 세척액, 블록해제제 등이 필터를 통과하지 않도록 제공된다.
시스템 작동 방법은 하기를 포함한다. (a) 바스켓의 천공 벽에 거의 균일한 두께 (예를들면, 2cm-5cm 두께)의 케이크를 축적시키기 위해 소정의 회전속도로 바스켓을 회전시키고 반응기 바스켓에 활성화된 수지의 슬러리를 공급한다. 수지는 수지에 결합된 제 1아미노산을 함유하거나 그러지 않으면 유도되는 것이 바람직하다. 제 1 아미노산이 수지에 결합되지 않는다면 이때 수지에 결합된다. (b) 수지 결합된 펩티드의 N-말단을 보호해제하기 위해 회전 바스켓에 보호해제용액을 제공한다. (c) 케이크로부터 보호해제 용액을 세척하기 위해 회전 바스켓에 세척용액을 제공한다. (d) 펩티드 쇄에 다음 아미노산을 부가시키기 위해 회전바스켓에 펩티드 쇄에 부가될 다음 아미노산의 아미노산 용액과 커플링 용액을 제공한다. 단계 (b)-(d)는 펩티드 쇄가 완성될 때까지 반복된다.
용액 (즉, 보호해제 용액, 세척용액, 아미노산 용액 및 커플링 용액)은 모든 용액이 바스켓 주위의 하우징에서 축적되지 않도록, 공급된 용액이 바스켓 마주상부 지점의 하우징에 축적되지 않는 속도로 회전 바스켓으로 유입된다. 따라서, 바스켓은 각 펩티드 합성 단계동안 넘치지 않는 상태로 있다. 사용된 수지는 바람직하게 100μ이하의 직경을 갖는 폴리스티렌 비드로 제조되고 바람직하게 0.2%-1.5% 가교 결합된다. 작은 비드 크기와 비드내의 낮은 가교결합 퍼센트는 비드를 통하는 물질이동을 용이하게 하고 따라서, 반응 속도가 가능한한 높게 되도록 한다. 보다 큰 수지 비드가 이 시스템에 사용될 수 있지만 보다 큰 물질이동 저항을 도입한다.
바스켓이 넘치지 않은 상태로 작동가능하게 하기 위해 용액 대부분은 외부 섬프 탱크에서 유지되고 용액은 케이크를 통과하도록 반응기로 펌프된 후 섬프 탱크로 되돌아온다. 용액은 소정의 시간동안 반응기 수지 상을 통해 재순환된다. 이것은 필요한 만큼 긴 접촉을 제공한다.
각 단계 사이에서(즉, 다음 또는 제 2용액의 도입전) 기존 또는 제 1용액이 소정의 시간 이상 펩티드와 제 1용액이 접촉하는 것을 방지하기 위해 시스템으로부터 배수되어 퍼지된다. 용액 순환이 정지된 후 배수 단계는 거의 모든 유리 배수 제 1용액이 원심분리 작용에 의해 케이크에서 빠져나와서 공급탱크로 돌아가는 것을 보장하기 위해 바스켓을 계속 회전시키는 것을 포함한다. 퍼지 단계는 회수물 또는 폐기물로 섬프 탱크에 있는 용액이 향하도록 제 1밸브를 작동시키는 것을 포함한다.
소량의 제 1용액은 제 2순환의 초기에 수지에 남아있을 수 있다. 제 2용액이 시스템에 유입될 때 제 2밸브는 제 2용액의 순환 초기에 짧은 기간 동안 폐기물로 개방된다. 케이크로부터 나오지 않은 제 1용액 중 어떤 것은 제 2용액에 의해 케이크로부터 빠져나오거나 세척된다. 퍼지로서 폐기물로 제 2밸브를 개방시키는 것은 시스템으로부터 제 1용액의 잔류물을 제거한다.
바람직하게, 아미노산은 예비활성화되고 활성화단계로부터의 불용성 부산물은 아미노산 용액이 시스템에 도입되기 전에 아미노산 용액으로부터 여과된다.
도 1은 본 발명에 사용된 셋업(set up)된 장치의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 반응기의 확대 개략도이다.
도 3은 액체 막에서 물질이동에 대한 어떤 저항도 없는 시간의 네지점에서 입자의 중심으로부터 거리의 함수로서 ("제타"로 명명된) boc-아미노산의 농도를 도시하는 챠트이다.
도 4는 물질이동에 대한 높은 막 저항과 낮은 막 저항 있는 동안의 시간의 네지점에서 수지 비드의 중심으로부터 거리의 함수로서 boc-아미노산의 농도를 도시하는 2개의 챠트이다.
도 5는 수지 상에 걸친 압력 저하에 대한 수지를 통하는 계산된 유속을 챠트화한 그래프이다.
본 발명의 예시적인 장치의 셋업이 도 1에 개략적으로 도시되었다. 시스템(1)은 아미노산을 용해시키기 위한 교반기가 제공된 보급탱크(3)를 포함한다. 기계적인 교반기가 바람직하게 사용되지만 다른 형태의 교반기도 사용될 수 있다. 합성 작업동안 사용된 용매와 시제는 이 탱크에 순차적으로 채워져서, 혼합되고 임의적으로 가열 및 냉각을 위해 내부 코일(도시됨) 또는 외부 쟈켓으로 소정의 작동온도로 조절된다. 바람직하게 보급탱크(3)는 아미노산을 예비활성화시키기 위해 서도 사용된다. 라인(4)에 있는 펌프(P1)는 수지 슬러리, 아미노산 용액 또는 용매를 라인(6)을 거쳐 수용체/섬프(5) 또는 라인(8)을 거쳐 반응기(7)로 전달하기 위해 3방향 밸브(V1)로 보급탱크(3)로부터 반응물을 전달한다. 예비활성화된 아미노산이 수용체/섬프(5)로 전달되면 아미노산은 예비활성화된 아미노산 용액으로부터 DCU와 같은 불용성 부산물을 제거하기 위해 충분히 미세한 필터(F1)를 통과한다. 여과된 예비활성화된 아미노산은 라인(9)을 거쳐 섬프/수용체(5)로 전달된다. 상기한 바와같이, DCU는 쇄에 첨가되는 다음 아미노산의 활성 부산물로서 수지 비드 뿐만아니라 스프레이 노즐과 펌프와 같은 시스템 장치를 막을 수 있다. 따라서, 반응기(7)에 아미노산 용액을 유입하기 전에 DCU를 제거하기 위해 필터(F1)를 통해 예비활성화된 아미노산 용액을 통과시키는 것이 바람직하다.
라인(11)은 수용체/섬프(5)의 출구로부터 반응기(7)의 입구까지 이른다. 바람직하게, 라인(11)은 필터(F2), 측정 펌프(P2) 및 열 교환기(H1)에 제공된다. 2개의 밸브(V2,V3)는 시제가 "폐기물" 또는 "회수물"로 향하도록 펌프(P2)의 반대편에 제공된다. 바람직하게, 밸브(V2)는 필터(F2)의 상류에 위치된다.
마지막으로, 반응기(7)의 출구는 라인(13)을 거쳐 섬프/수용체로의 입구에 연결된다. 제 4밸브(V4)는 반응기(5)로부터의 시제가 "폐기물" 또는 "회수물"로 향하도록 라인(13)에 위치된다.
알 수 있는 바와같이 섬프/수용체(5)와 반응기(7)는 라인(11,13)에 의해 한정되거나 완성된 루프의 일부분이다. 따라서 수용체/섬프(5)는 반응기(7)로부터의 배출물을 수용하고 반응기를 통해 다시 재순환하기 위한 세척용매 또는 아미노산 용매의 재고품을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 하기에서 언급되듯이 이것은 반응기에 액체가 저장되는 것이 거의 없게 한다.
반응기(5)는 도 2에 보다 상세하게 도시된다. 회전가능한 바스켓(17)이 회전을 위해 장치된 하우징(15)을 포함한다. 하우징(15)은 바람직하게 반응물과 세척액의 증발을 막기 위해 대기압에 가깝다. 공간(18)은 바스켓(17)과 하우징(15) 사이에 한정된다. 바스켓(17)은 축(19)에 설치된다. 축(19)은 바스켓(17)을 회전시키기 위해, 바스켓 표면에서 최소한 10중력(g's)의 가속도를 생성하기 위해 적당한 크기의 모터(M)에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게, 가속도는 15g's 이상이고, 보다 바람직하게는 바스켓의 표면에서의 가속도는 50g's 이상이다. 바스켓 외주에서 50g's의 가속도를 달성하기 위해서는 15cm의 반경을 갖는 바스켓이 546rpm의 속도로 회전해야 한다. 얻어질 수 있는 가속도는 반응기의 기계적인 강도와 수지의 압축성에 의해 제한된다.
바스켓(17)은 고체바닥(21), 천공된 실린더 벽(23) 및 벽(23)의 상부로부터 내부로 연장하는 립(22)을 갖는다. 측벽(23)의 구멍은 바람직하게 2-5mm 범위이다. 필터클로쓰 또는 메쉬라이너(25)는 바스켓 벽(23)의 내부표면에 제공되는데 벽(23)을 통한 수지(R)의 통과를 방지하기위한 크기이다. 메쉬 라이너(25)는 바람직하게 바스켓에 비드를 유지하지만 액체는 통과시키도록 대략 1/10(0.10)- 1/3(0.33)의 수지 입자 직경의 메쉬 크기를 갖는다. 슬러리 유입 파이프(24)는 고상의 슬러리를 유입하기 위해 라인(8)을 거쳐 3방향 밸브(V1)에 연결된다. 파이프(24)는 바람직하게 바스켓(17)의 벽(23)에 대해 슬러리가 향하도록 그 말단에 엘보(elbow)(26)를 갖는다. 바스켓 회전으로부터 발생된 원심력은 일반적으로 바스켓 벽에 부드러운 수지 케이크를 형성하기에 충분하다. 그러나, 파이프(24)는 벽(23)상에 균일한 케이크 깊이를 얻기 위해 슬러리를 분산시키기 위한 기계적인 수단을 포함할 수 있다. 기계적인 분산 수단은 예를들면 바스켓 벽(23)으로부터 소정의 거리에 설정되도록 바스켓에서 방사사상으로 이동가능한, 축상 또는 방사상으로 연장하는 블레이드를 포함한다. 라인(11)에 연결된 반응물 공급파이프(27)는 바스켓(17)으로 연장하고 고체의 회전상 위로 아미노산 용액 또는 세척용액을 고르게 스프레이하는 다수의 스프레이 노즐(29)를 포함한다. 복귀 라인(13)은 반응물과 세척액이 반응기(7)에서 빨리 방출되어 수용체/섬프(5)로 복귀하도록 바스켓(17)을 통과하게 한다. 이 방법으로, 반응기(5)는 바스켓을 접촉하거나 침수시키는 액체의 풀을 함유하지 않는다. 즉, 반응기의 유체 수준은 하우징(15)에서 바스켓(17)의 하부(21)로 상승하지 않는다. 반응기 쉘이 넘치지 않기 때문에 더 힘든 작업을 위한 모터(M)를 요구하는 인력을 만들 어떤 유체도 없다.
기계사용은 보급탱크(5)로 소정의 량의 액체를 자동적으로 충전하고 수용체/섬프(5)에 있는 액체의 재고를 모니터하고, 반응기(7)로의 액체 유속을 모니터하기 위해 제공될 수 있다. 또한, 임의적인 배치 시퀀서(S)가 전체 작업을 보다 완전히 자동화시키기 위해 부가될 수있다. 기계사용(IR 검출기와 같은)은 합성이 실시간에 모니터될 수 있도록 블록해제와 세척의 진행을 추적하기 위해 제공될 수 있다. 또한, IR검출기는 자동화된 방법의 통합부로서 제공될 수 있고 반응되지 않은 유리 아민에 대한 시험이 IR검출기가 반응이 중지 되었다는 것을 나타내자마자 수행될 수 있다.
비-금속 또는 고도로 부식 저항성 습윤 표면을 사용하는 설계가 어떤 생성물을 위한 필요성을 입증한다. 이러한 경우에, 반응기 시스템(1)의 부품은 비 반응성 물질로 제조되거나 이것으로 라이닝될 수 있다. 이러한 물질은 예를들면 Haynes Int'l Inc. of Kokomo, Ind.로부터 입수가능한 Hastelloy와 같은 고 니켈 합금, E.I du Pont deNemours로부터 입수가능한 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅물인 TeflonR 또는 316 스테인레스 강을 포함한다.
합성은 하기와 같은 수행될 수 있다. 수지와 슬러리 용매를 보급 탱크(3)의 채우고 교반기를 켰다. 수지 슬러리용으로 사용된 비드는 바람직하게 직경 100μ이하의 작은 비드이고 0.2-1.5% 가교결합되었다. 예를들면, 수지는 boc-Pro-RCM (Sigma Chemical 로부터 입수가능한 것과 같은 수지결합 boc-Proline을 갖는 Merrifield 수지)로 이루어질 수 있고 용매는 디클로로메탄(DCM)일 수 있다. 온도는 탱크(3)상의 온도 조절기(TIC)에 의해 소정의 온도 (30℃와 같은)로 조절될 수 있다. 수지 슬러리가 교반되는 동안 바스켓(17)은 회전하기 시작하여 최소한 10g's, 바람직하게는 15g's이상, 보다 바람직하게는 50g's 이상의 가속도를 생생하도록 소정의 회전 속도 (1000rpm과 같은)로 조절된다. 수지 슬러리는 라인(8)과 파이프(24)를 통해 반응기에 직접 채워진다. 바스켓(17)은 슬러리가 바스켓에 도입될 때 액체가 없다. 수지에 작용하는 원심력은 수지가 바스켓의 내부표면에 상대적으로 평평한 케이크(R) (도 2)를 형성하게 한다. 케이크(R)는 바람직하게 2-6cm 사이의 초기 깊이로 축적한다. 다른 깊이도 물론 사용될 수 있다. 추가적인 슬러리 용매 또는 여과물의 재순환물이 잔류 수지를 반응기(7)로 보내기 위해 보급탱크(3)로 도입될 수 있다. 측정 펌프(P2)는 균일한 케이크가 반응기에서 형성되는 것을 보장하기 위해 반응기를 통해 슬러리 용매를 재순환하도록 활성화된다. 케이크(R)가 소정의 두께에 도달할 때 남아있는 슬러리 용매는 3방향 밸브(V3)를 폐기물로 전환시키고 수용체/섬프(5)가 빌때까지 펌프(P2)를 작동시키므로서 폐기물로 이송된다.
상기 언급된 블레이드 또는 나이프는 고른 두께의 상이 생성되는 것을 보장하기 위해 측벽상에 슬러리의 분산을 용이하게 할 수 있다. 슬러리가 바스켓의 벽(23)에 부착될 때 슬러리가 원하는 것보다 깊은 깊이로 축적되면 블레이드는 알 수 있는 바와같이 여분의 슬러리를 분산시킨다. 그러나, 상기한 바와같이 이러한 기계적인 분산수단은 일반적으로 평탄한 수지상을 만들기 위해서는 요구되지 않는다.
수지 결합된 펩티드의 N-말단을 보호해제시키기 위한 용액은 보급탱크(3)에서 제조된다. 보호해제 용액의 예로는 순수한 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 TFA와 DCM(디클로로메탄)의 용액을 포함한다. 보호해제 용액은 라인(6)을 통해 수용체/섬프(5)로 이송된다. 펌프(P2)는 활성화되고 보호해제 용액은 수용체/섬프 루프를 통해 순환된다. 용액은 라인(11)과 파이프(27)를 통해 수용체/섬프(5)로부터 반응기내로 펌프된다. 보호해제 용액은 노즐(29)에 의해 슬러리 상으로 향해지고 상을 통해 바스켓(17)과 하우징(15) 사이의 공간(18)으로 통과한다. 용액은 반응기(7)에서 나와서 라인(13)을 통해 수용체/섬프(5)로 복귀한다. 라인과 수지상에 있는 어떤 잔류 슬러리 용매는 반응기(7)에서 방출되는 물질의 제 1 부분을 라인(13)의 밸브(V4)를 통해 폐기물 또는 회수물로 향하게하므로서 퍼지될 수 있다. 이는 슬러리 용매가 섬프/수용체(5)에서 보호해제 용매와 혼합되는 것을 방지한다. 슬러리 용매의 퍼지에 이어 남아있는, 반응기(7)에서 방출되는 물질은 반응기(7)로 재순환시키기 위해 수용체/섬프(5)로 향하게된다. 재순환은 소정의 시간동안(바람직하게는 약 3분) 지속된다. 보호해제에 이어 용액은 슬러리 용매에 대해 상기 기술된 바와같이 밸브(V3)을 통해 폐기물 또는 회수물로 향하게된다.
원할 경우 제 2 보호해제 단계는 수지 결합된 펩티드의 N-말단의 완전한 보호해제를 보장하기 위해 수행될 수 있다.
수지는 보호해제 용액을 제거하기 위해 세척(예를들면 DCM으로) 될 수 있다. 세척은 보급탱크(3)에 요구되는 양의 용매를 채우고 용매를 펌프(P1)로 수용체/섬프(5)로 이송하고 펌프(P2)를 작동시키므로서 수행된다. 세척용액은 소정의 시간, 즉 3분동안 반응기(7)와 수용체/섬프(5)를 통해 순환된다. 상기에서와 같이 밸브(V4)는 초기에 시스템으로부터 남아있는 보호해제 용액을 제거하기 위해 폐기물에 셋팅된다. 밸브(V4)는 순환을 위해 셋팅되고 세척물은 시스템을 통해 순환된다. 세척이 완료된 후 세척물은 밸브(V3)을 통해 시스템으로부터 퍼지된다.
추가 세척(예를들면, 이소프로판올로)이 수지를 수축시키기 위해 수행될 수 있다.
펩티드는 약 20분동안 디이소프로필 에틸아민(DIEA)와 같은 염기용액으로 수지를 세척하므로서 보호해제된다.
추가적인 DCM세척은 DIEA염기를 제거하기 위해 수행될 수 있다.
수지는 메탄올(MeOH) 또는 디메틸포름아미드(DMF)로 세척하므로서 수축될 수 있다.
수지는 DCM으로 세척하므로서 팽윤될 수 있다.
펩티드 쇄에 부가될 다음 아미노산(예를들면, boc-아르기닌)은 보급탱크(3)에 채워진다. 이것은 바람직하게 예비활성화되고, 보급탱크(3)에서 아미노산이 채워짐과 동시에 DCM과 DMF와 같은 적당한 용매 또는 용매들이 채워진다. DCC 또는 DIC와 같은 커플링제는 보급탱크(3)에 있는 아미노산 용액에 첨가된다. 대부분의 불용성 부산물이 형성되는 예비활성화 후 밸브(V1)는 활성화 공정의 불용성 부산물을 제거하기 위해 필터(F1)를 통해 수용체/섬프(5)로 활성화된 아미노산이 향하도록 작동된다. 필터(F1)는 활성화 반응의 불용성 부산물 중 거의 모두를 제거하는 크기이다. 여과된 아미노산 용액은 상기 언급된 바와같이 커플링이 완료될 때까지 반응기를 통해 재순환된다.
하우징 또는 바스켓 모두 반응동안 넘치지 않기 때문에 교반 탱크 반응기, 진동 플라스크 반응기 또는 심지어 넘치는 회전 바스켓 반응기에서 요구되는 것보다 적은 액체가 요구된다. 보다 적은 액체를 사용할 수 있는 능력은 많은 아미노산을 사용하지 않고, 따라서 작업 비용을 증가시키지 않고 보다 높은 농도의 아미노산을 사용할 수 있게 한다. 따라서, 아미노산 농도는 예를들면 사용된 원료 아미노산의 증가없이도 300mmo/lℓ의 용액으로 증가될 수 있다. 알려진 바와같이 반응속도는 반응물 농도의 함수이다. 따라서, 보다 적은 액체를 사용할 수 있는 능력은 커플링단계의 반응속도를 증가시킨다. 활성화된 아미노산의 온도는 열 교환기(H1)를 통해 재순환할때 보급탱크(3)에서 조정 및 조절될 수 있다. 커플링 반응의 최종점은 반응기로부터 회수된 수지 샘플을 시험하므로서 확인될 수 있다.
수지는 DMF와 같은 용매로 세척될 수 있다.
불용성 부산물은 MeOH로 세척하므로서 수지로부터 제거될 수 있다.
메탄올은 DCM과 같은 용매로 세척하므로서 수지로부터 제거될 수 있다.
이 과정을 차례로 다음 아미노산에 대해 반복한다. 알 수 있는 바와같이, 필터 클로쓰와 바스켓의 천공 측벽은 교반 탱크 또는 관형 SPPS 반응기 시스템에 사용된 여과 프리트를 대체한다. 배출경로에서 작고 개별적인 필터 프리트의 기하학적인 구속의 제거는 프리트(즉, 설계자가 프리트를 손상시키는 것에 대해 걱정할 필요 없는)에 의한 시스템에 부과된 압력 속박으로부터 반응기 시스템을 자유롭게한다. 시스템이 노출될 수 있는 최대 압력은 수지 비드의 강도와 수지비드의 깊이(압력은 너무나 커서 수지비드를 손상시키거나 크게 압축시킬 수 없다) 및 바스켓(17)의 강도에 의해 조정된다.
각각의 단계 사이에서(즉, 수용체/섬프(5)가 다음 용액으로 채워지는 동안) 바스켓(17)은 회전을 계속한다. 이것은 다음 용액이 반응기(7)에 유입되기 전에 원심력에 의해 대부분의 앞 용액이 케이크(R)로부터 빨리 제거되는 것을 보장한다. 또한, 상기한 바와같이 밸브(V4)는 각 순환 초기의 짧은 기간동안 "폐기물"로 개방된다. 이것은 바스켓의 연속된 회전에 의해 케이크(R) 외부로 빠져나오지 않은 그리고 현재 용액에 의해 가압되는 어떤 기존 용액의 시스템을 퍼지한다. 이것은 기존 용액의 최소량 이하만이 시스템에 남아서 반응물과 세척액에 펩티드 쇄가 노출하는 것의 조절을 용이하게 하는 것을 보장한다.
상기한 바와같이, 바스켓과 수지상은 넘치지 않는다. 따라서 바스켓으로 유입되는 모든 반응물과 액체는 우수한 속도로 케이크(R)를 통과한다. 즉, 케이크(R)를 통한 용액의 통과는 바스켓과 반응기 하우징 사이의 공간(18)에 있는 액체에 의해 방해받지 않는다. 따라서, 반응물 또는 세척액과 펩티드의 접촉시간은 연속적으로 바스켓을 회전시키고 펌프(P2)의 작동기간을 맞추므로서 신중하고 엄밀하게 조절될 수 있다.
입자에 대한 액체의 상대적인 속도는 시스템 성능, 제품 수율 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 가변적인 설계이다. 반응물질 또는 세척액이 바스켓(17)에 도입되었을 때 액체는 상기한 바와같이 수지와 필터 클로쓰를 거쳐 수용체/섬프로 다시 재순환되기 위해 하우징(15)으로 통과한다. 액체가 반응기를 나가는 속도가 반응기로 유입되는 속도와 동일하거나 그 속도를 초과하는 한 반응기가 넘치지 않는다. 반응기 바스켓의 하부와 하우징 하부 사이의 공간에 따라 액체가 바스켓 하부 수준에 도달하기 전에 사이클이 종료할 시간이라면 액체공급 속도가 액체 유출 속도보다 느릴 수 있다. 용액이 수지와 필터 클로쓰를 통하여 통과할 수 있는 속도는 액체통과에 대한 수지의 저항(Kp)과 액체 통과에 대한 필터 클로쓰 저항(B)의 함수이다. Kp와 B는 하기식에 따라 계산된다 :
Kp=μa5 2Δ및B=μmΔ (1)
여기에서, μ = 액체의 속도 ;
C5 = 액체에 있는 고형물의 농도 ;
A = 바스켓에 사용된 필터 클로쓰의 면적과 동일한 여과의 면적 ;
ΔP= 수지상을 통과하는 압력강하 ;
α = 용액의 통과에 대한 케이크(수지의) 고유저항(m/kg)으로서 다공성
의 함수이다 ;
Rm = 용액의 흐름에 대한 필터 클로쓰의 저항.
원심분리기에서 본체에 작용하는 힘은 하기식으로 설명될 수 있다. ω rad/초로 회전하는 반경(R)의 원심분리기에 있는 물체의 가속도는 하기식으로 얻어질 수 있다.
a = Rω2 (2)
상기 식은 중력에 기인한 가속도 (980cm/sec2)로 가속도를 나누므로서 중력으로 표현될 수 있다.
수지의 상에 걸친 압력 강하는 하기 방법으로 얻을 수 있다. 유체에 작용하는 정압은 하기 식으로 대표된다 :
dp = ρgdz (3)
여기에서, P는 압력, g는 중력이고, z는 유체의 높이이다. 식 3의 중력가속도에 식 2를 대입하면 다음과 같다 :
dp = ρω2RdR (4)
상 깊이의 내경과 외경사이의 적분은 하기 표현으로 나타난다.
Pi-Po=ρo2 i 2 o 2 (5)
상기 식은 하기의 전환에 의해 초당 라디안으로 보다 편리한 개념(분당 회전)으로 표현될 수 있다 :
o=π (6)
다공성 매체를 통하는 압력강하는 하기식으로 대표될 수 있다 :
Pi-Po=qμ(ca2+m) (7)
여기에서, q는 유체 체적 유량, μ 는 유체속도, mc는 케이크의 질량, α는 유속에 대한 케이크의 고유저항, Rm은 유속에 대한 필터 매체의 저항 및 A는 여과 면적이다. 케이크 저항(α)은 케이크가 압착될 경우 압력의 함수이다. 케이크와 매체 저항에 대한 상수는 정압 배치 여과 실험을 수행하고 수집된 여과물의 양 대 여과물의 양으로 나누어진 경과시간을 플롯하므로서 얻어질 수 있다. 결과적인 라인의 슬로프는 케이크 저항에 비례하고 인터셉트는 매체저항에 비례한다.
바스켓(17)은 바스켓의 중심에서 립(22)의 반경 내단까지의 거리와 동일한 내경(IR) (도 2)과 바스켓의 중심에서 바스켓의 천공벽(23) 까지의 거리와 동일한 외경(OR)을 갖는다. 사용된 바스켓에서 외경(OR)은 약 15cm였으며 립은 약 7.5cm의 폭을 가졌다. 사용된 바스켓의 내경은 약 7.5cm였다. 다른 크기의 바스켓도 사용될 수 있다. 반응물 또는 세척액이 바스켓(17)으로 도입될 때 용액의 작은 방울들이 합쳐져서 수지케이크의 내표면상에 액체벽을 형성하고 이 액체 벽에는 원심력에 의하여 수지를 통해 힘이 가해진다. 바스켓으로의 용액의 흐름이 증가할 때 액체벽의 깊이가 증가한다. 바스켓의 중심에서 이 액체벽의 내표면까지의 거리 (하기 표 1에서 R[내부])가 바스켓의 내경(7.5cm) 이하가 되도록 충분히 깊을 때 용액은 바스켓의 립(22)을 과류한다. 이러한 상태에서 바스켓이 효과적으로 넘치게된다. 하기 표 1에서 알 수 있는 바와같이 500rpm의 회전속도에 있어서는 바스켓이 5.5cm의 수지상 깊이에서 102.8㎖/sec와 115.7㎖/sec 사이의 유입유속으로 넘치기 시작한다. 2.5cm의 수지상 깊이에서는 유속이 217.8㎖/sec 와 244.9㎖/sec 사이일 때 넘치기 시작한다. 100rpm의 회전속도에서는 유속이 훨씬 더 높아질때까지 바스켓이 넘치지 않는다. 5.5cm의 상 깊이에서는 유속이 449.8㎖/sec와 514.1㎖/sec 사이일 때 까지 바스켓이 넘치지 않는다. 2.5cm의 상깊이에서는 유속이 952.5㎖/sec 와 1088.6㎖/sec 사이일 때까지 바스켓이 넘치지 않는다.
하기 표 1의 값은 63.62cm2의 벽면적을 갖는 원심분리기에 적용된, 실험적으로 얻어진 값 KP와 B를 사용하여 일련의 여과계산으로부터 얻어졌다. KP와 B의 값은 바스켓과 하우징 사이의 공간(18)에서의 Hg로 11의 정압 미분(P1)에 대해 얻어졌다. 그렇게 얻어진 여과 파라메터는 15cm의 반경을 갖는 원심분리기 및 1413cm2의 바스켓 벽면적에 적용되어 다양한 회전속도에 있어서의 압력강하(액체 높이로)를 얻도록 액체 유속이 계산되게 하였다. 압력(P1)과 여과면적의 변화는 여과계수 KP와 B에 영향을 미친다.
수지상에 걸친 압력 강하에 대한 계산된 유속
필터 클로쓰 면적 63.62 cm^2 A2/A1 22.21
바스켓면적 1413 cm^2 P1(in. Hg) 11
KP 0.00038 s/cm^6
B 0.0051 s/cm^3 바스켓용량 8884.00 (cm)
필터량 400 ml 케이크높이 5.5
압력(cm. DCM) P2(in. Hg) 유속(ml/s) 유속(ml/s) P2/P1 Kp B R [내부] cm
상깊이(cm) 5.50 2.50 1000RPM 500RPM
10.17 1 12.85 27.21 0.091 8.4738E-06 2.53E-03 14.84 14.36
20.35 2 25.70 54.43 0.182 4.2369E-06 1.26E-03 14.68 13.69
30.52 3 38.56 81.64 0.273 2.8246E-06 8.42E-04 14.52 12.98
40.69 4 51.41 108.86 0.364 2.1185E-06 6.31E-04 14.36 12.24
50.86 5 64.26 136.07 0.455 1.6948E-06 5.05E-04 14.19 11.45
61.04 6 77.11 163.29 0.545 1.4123E-06 4.21E-04 14.03 10.59
71.21 7 89.97 190.50 0.636 1.2105E-06 3.61E-04 13.86 9.66
81.38 8 102.82 217.72 0.727 1.0592E-06 3.16E-04 13.69 8.64
91.56 9 115.67 244.93 0.818 9.4154E-07 2.81E-04 13.52 7.47
101.73 10 128.52 272.15 0.909 8.4738E-07 2.53E-04 13.34 6.08
111.90 11 141.37 299.36 1.000 7.7035E-07 2.30E-04 13.16 4.27
122.08 12 154.23 326.58 1.091 7.0615E-07 2.10E-04 12.98
132.25 13 167.08 353.79 1.182 6.5183E-07 1.94E-04 12.80
142.42 14 179.93 381.01 1.273 6.0527E-07 1.80E-04 12.62
152.59 15 192.78 408.22 1.364 5.6492E-07 1.68E-04 12.43
162.77 16 205.64 435.44 1.455 5.2961E-07 1.58E-04 12.24
172.94 17 218.49 462.65 1.545 4.9846E-07 1.49E-04 12.05
183.11 18 231.34 489.87 1.636 4.7077E-07 1.40E-04 11.85
193.29 19 244.19 517.08 1.727 4.4599E-07 1.33E-04 11.65
203.46 20 257.05 544.30 1.818 4.2369E-07 1.26E-04 11.44
213.64 21 269.90 571.51 1.909 4.0352E-07 1.20E-04 11.24
223.80 22 282.75 598.73 2.000 3.8517E-07 1.15E-04 11.03
233.98 23 295.60 625.94 2.091 3.6843E-07 1.10E-04 10.81
244.15 24 308.45 653.16 2.182 3.5308E-07 1.05E-04 10.59
254.32 25 321.31 680.37 2.273 3.3895E-07 1.01E-04 10.37
264.50 26 334.16 707.58 2.364 3.2592E-07 9.71E-04 10.14
274.67 27 347.01 734.80 2.455 3.1385E-07 9.36E-04 9.90
284.84 28 359.86 762.01 2.545 3.0264E-07 9.02E-04 9.66
295.02 29 372.72 789.23 2.636 2.922 E-07 8.71E-04 9.42
305.19 30 385.57 816.44 2.727 2.8246E-07 8.42E-04 9.16
356.05 35 449.83 952.52 3.182 2.4211E-07 7.22E-04 7.78
406.92 40 514.09 1088.59 3.636 2.1185E-07 6.31E-04 6.08
도 5는 바스켓(17)에 있는 수지상에 걸친 압력강하에 대한 계산된 유속을 플롯한 챠트이다.
도 5에서 알 수 있는 바와같이 넘침이 발생하기전의 최대 유속은 바스켓의 립(22) 반경폭과 상깊이의 함수이다. 따라서, 립(22)의 폭을 증가시키거나 상깊이를 감소시키므로서 최대의 가능한 액체 유속이 증가될 수 있다. 반응기의 작동은 수지상 위의 어떤 표면액체에 의해 방해 받지 않는다(실질적인 양의 액체가 립(22)을 넘어 상을 우회하도록 통과하지 않는다면). 중요한 것은 바스켓이 침수되지 않는 것이다(즉, 바스켓 벽과 하우징 사이의 공간(18)을 채우는 액체가 없는 것이다). 이 표면 액체는 회전 바스켓내의 약간 더 많은 액체량의 비용으로 수지상을 통하는 흐름속도를 증가시키도록 제공될 수 있다. 회전속도를 변화시키는 능력은 제한 세트없이 (바스켓이 침수되지 않기 때문에) 침수된 실린더가 넘치는 탱크 또는 쉘에서 회전될 때 보다 높은 유체 속도를 얻게한다.
액체와 고체의 일정한 접촉은 반응기의 효율적인 작동에 필수적이다. 액체와 수지의 만족스러운 접촉은 수지상에 고르게 분산된 스프레이, 일정한 상깊이로 그리고 액체 유속과 바스켓 회전속도의 신중한 선택에 의해 달성될 수 있다. 고체 상을 통하는 액체의 유속은 종종 비드를 가로지르는 압력강하에 정비례하고 상깊이에 반비례한다. 그러나, 수지는 약간 젤라틴성이다. 높은 원심력은 수지상이 압축되게 하여 수지상을 통하는 흐름에 대한 저항을 증가시킨다. 상이 충분히 높은 압력으로 압축되면 상을 통하는 액체 흐름은 압력 강하가 증가함에 따라 감소할 수 있다. 따라서, 액체의 흐름을 최대화하는 한정된 회전속도가 있을 수 있다.
상기 표 1은 각각 41,123cm/sec2 (41.9g's)와 164,494cm/sec2 (167.8g's)의 바스켓 벽의 내표면에서의 원심 가속도에 상응하는, 15cm의 반경을 갖는 바스켓에서의 500 과 1000rpm의 회전속도이다. 그러나, 원심력에 의한 비드의 압축이 수지상을 통하는 액체의 흐름을 방해하기 전에 훨씬 더 높은 속도의 가속도에 수지상을 노출할 가능성이 있다. 비드 압축은 수지의 가교결합 정도에 관련된 비드 강성의 함수이다.
가변속도 모터, 스텐레스강 바스켓 및 Cole-Palmer Masterflex Model 7518-12 연동 펌프가 장치된 IEC 원심분리기를 반응기로 사용했다. 바스켓은 13㎝의 내부직경 및 5㎝의 높이를 가졌다. 액체스트림을 일련의 큰 방울로 만드는 바스켓 허브의 상부로 액체의 흐름을 향하게 하는 Masterflex Phar-Med 호스, 타입 6485-24를 통하여 원심분리기에 액체를 첨가했다. 이러한 설계는 일정한 스프레이로 수지 표면을 완전하거나 충분하게 커버하는 것을 허용하지 않았다. 액체흐름은 약 200ml/분이었다. 아미노산과 HOBt를 DCC로 예비활성화시켰다. 반응기에 첨가하기 전에 활성화된 아미노산 용액으로부터 불용성 DCU를 진공여과하여 제거했다. 예비활성화 단계에서 대부분의 DCU가 제거되었기 때문에 알콜(메탄올)세척은 요구되지 않았다. 방법은 달리 기술되지 않으면 하기 표Ⅱ에 설명된 것과 동일하게 했다. 바스켓 회전은 대략 500 RPM 이었는데 이것은 약 18.2g's의 가속도에 해당한다. 상기 조건하에서 1.0의 비중을 갖는 1㎝액체에 걸친(넘치는)압력 강하는 1645N/㎝2 (0.24psi)였다. 반응기에 대한 원심분리 여과 면적은 204㎝2 이고 빈 바스켓의 최소 표면 액체 속도는 0.98㎝/분이다. 수지 비드를 가로지르는 실제 유속은 케이크 공극에 반비례하고 이러한 예상 유속에 10-100배 이어야 한다.
두 셋트의 실험을 수행했다. 제 1셋트는 화학반응의 부존재시에 수지의 특성을 평가하기 위해 이루어졌다. 이 수지를 DCM 또는 DMF에 분산시키고 폴리프로필렌 1-3μ 필터 클로쓰(cloth)로 라이닝된 원심분리기에 충전시켰다. 수지는 클로쓰상에 일정한 상(bed)를 형성했으며 이것은 DCM, DMF 및 MeOH에 노출되었을 때 팽윤 및 수축되었다. 케이크는 원심분리가 중지된 후 짧은 기간동안 떨어지는 경향이 없었다. 케이크는 건조되었을 때 갈라졌지만 그것은 아주 좁게 형성되었다. 경우에 따라 공간이 형성되었지만 다음의 용매 세척동안 빠르게 사라졌다. 수지 비드의 표면에 액체에 도입은 표면을 평탄하게 하는 것으로 알려졌다. 따라서, 이러한 약간의 갈라짐과 공간의 형성은 케이크를 통과하는 액체의 흐름에 영향을 주는 것으로는 믿어지지 않으며 케이크를 통과하는 액체의 흐름은 균일한 것으로 믿어진다. 또한, 세척초기의 유출액에서 수지가 발견되었지만 유출액은 재순환 되었을 때 빠르게 깨끗해졌다. 액체 재순환은 용매의 순축적이 원심분리기 내에 발생하지 않았으며 빠른 흐름 접촉이 원하는 만큼 길게 이루어지게 되기 때문에 극히 잘 이루어졌다. 이송 및 세척단계의 초기에서 원심분리기로부터의 약간의 고형물 손실은 정상이며 계지링이 바스켓의 벽에 클로쓰를 고정시키는데 사용되지 않았기 때문에 이 실험에서 예상되었었다. 제 1실험의 결과는 매우 긍정적이어서 반응기 시스템의 기계적 가능성을 확인했다.
제 2실험에서는 적은 펩티드에 대한 반응장치의 가능성을 입증하기 위해 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지상에서 디펩티드 boc-Arg-Gly를 합성했다. Leuprolide(pGlu-His-Trp)의 최종 세 아미노산을 중간길이의 펩티드에 대한 반응장치의 가능성을 입증하기 위해 Leuprolide를 형성하도록 커플링시켰다. 사용된 방법은 하기 표 2에 기술된 것과 같다.
고상 합성 방법
단 계 작 업 대략적인 시간
1 1×DCM 세척(제 1아미노산 단독) 3분
2 Cys를 도입한 후 0.5% DTE와 1.0% 2-메틸인돌을 함유하는 1×50% TFA/DCM으로 세척 3분★
3 Cys를 도입한 후 0.5% DTE와 1.0% 2-메틸인돌을 함유하는 1×50% TFA/DCM으로 세척 20분
4 2×DCM 세척 3분★
5 2×5% DIEA/DCM 중성화 각 4분★
6 1×DCM 세척 3분★
7 2×MeOH세척(제 1아미노산에 대해서만) 각 3분
8 2×DMF 세척 각 3분★
9 예비활성화된 boc-아미노산과 반응시킴 최소 30분
10 닌하이드린 시험
11 닌하이드린 시험(필요한 경우)
12 2×DMF 세척 각 3분★
13 2×DMF 세척 각 3분★
★세척시간은 Leuprolide에 대해서 5분으로 증가되었다.
제 1(즉, boc-Arg-Gly)합성에서는 1meq의 단백질/g 수지의 도입속도를 갖는 MBHA 수지 20g을 출발물질로서 사용했다. 제 1커플링에는 boc-Gly, HOBt 및 DCC 60mmol(3eq)를 사용했다. 아미노산을 15분동안 예비활성화 시키고 여과하여 DCU를 제거했다. 1시간의 반응시간 후 원심분리기를 정지시키고 샘플링한 후 닌하이드린 시험으로 유리아민을 시험했다. 샘플은 닌하이드린 시험을 통과했다. 배치를 DCM과 TFA로 블록해제시키고 밤새 방치했다.
boc-Gly로의 상기에서 설명한 것과 같은 과정으로 6mmol의 boc-Arg(TOS)로의 다음 커플링을 수행했다. 커플링 반응으로 1시간과 2시간에서 취한 샘플은 닌하이드린 실험을 실패했다. 배치를 3분동안 예비활성화된 1.5eq의 boc-Arg(TOS), HOBt 및 DCC로 재커플링했다(락탐으로의 사이클화를 최소화하기 위해서). 이때 닌하이드린 시험을 통과했다.
실험의 제 2파트에서는 Leuprolide에 있는 최종 세 개의 아미노산(Glu-His-Trp)를 첨가하는 것을 포함했다. Pre-Leuprolide(후-ser)을 얻었다. 펩티드-수지는 이 시점에서 약 0.5meq의 수지의 펩티드/gm을 함유했다. 사용된 방법은 둥근바닥 플라스크와 침지튜브를 갖는 밀봉된 불투명 유리헤드로 이루어진 용매 재순환 용기가 부가된 것을 제외하고는 상기 표Ⅱ에 설명된 방법과 동일하게 했다. 원심분리기의 상부에 있는 개구를 슬롯컷을 갖는 플라스틱 비이커로 막아서 공급호스를 고정시켰다. 증발에 의한 용매의 손실을 감소시키기 위하여 이러한 변화를 행하였다.
새롭게 셋업된 제 1커플링은 boc-Trp로였다. 샘플은 첫 번째 시간이 지난후 닌하이드린 시험을 통과했다. 제 2커플링은 boc-His(BOM)으로 였다. 펌프속도를 증가시키고 배치를 추가시간동안 반응시켰다. 추가반응 시간에 이어 케이크의 상부, 중간 및 하부 각각으로부터 취한 세 개의 수지샘플을 유리아민에 대해 개별적으로 시험했다. 닌하이드린 시험은 각 샘플에 대해 매우 강하게 긍정적이었다. 배치를 1.5eq의 boc-His(BOM)과 재커플링했는데 배치는 1시간 후에 닌하이드린 시험을 통과했다. 최종커플링은 p-Glu였다. 배치를 1시간동안 커플링했고 샘플은 닌하이드린 시험을 통과했다. 건조된 펩티드-수지의 최종중량은 32g이었다. 2.0g의 펩티드-수지를 에틸아민으로 개열하여 802mg의 보호된 펩티드를 생산했다. 조 펩티드를 역상 HPLC로 시험했는데 전형적인 조 Leuprolide 피크를 나타냈다.
제 1셋트 실험의 결과는 수지가 원심분리기의 벽상에 일정한 상을 형성하고 적은 파손 및 탈락 경향을 갖는 것으로 나타난다. 또한, 수지상은 최소의 갈라짐을 나타낸다. 공간 및 갈라짐은 세척시에 사라지고 수지통과는 일반적으로 아주 적다. 여과물에 있는 미세입자의 수지통과는 마지막 커플링단계시를 제외하고 커플링 실험시 거의 존재하지 않는다. 필터매체를 밀폐하는 더 좋은 방법을 이용할 수 있는데 이 방법은 이러한 문제를 해결할 수 있을 것으로 예상된다.
상기한 바와같이 상기 반응기 시스템 및 그 작동방법은 용매와 반응물질이 반응기에서 넘치는 것을 막고 수지를 통한 빠른 유체 속도를 허용한다. 이러한 시스템의 잇점은 많은데 하기를 포함한다;
·활성화, 커플링 및 보호해제시 보다 정밀하게 온도를 제어할 수 있다. 이것은 바스켓이 넘치는 하우징에 잠기지 않기 때문에 가능하다. 따라서, 제어될 필요가 있는 것은 라인(11) 및 유입파이프(26)에 있는 액체의 온도가 전부이다.
·STR에서의 경우와 같이 용매를 하우징(15)에 채우거나 수지를 분산시킬 필요가 없기 때문에 용매의 사용이 감소된다.
·아미노산의 사용이 감소되고 반응속도가 증가된다. 반응속도는 반응물질의 농도에 비례하다. 용매량이 감소될 수 있기 때문에 동일한 농도를 얻기 위해서 아미노산 요구도 감소된다. 아미노산 양이 감소되지 않으면 농도가 보다 높게 되고 따라서, 반응속도가 증가된다.
·고화염성의 용매가 제거된다. 아미노산이 예비활성화되어 여과되기 때문에 수지에 있는 DCU수준이 매우 적다. 그 결과, 메탄올과 이소프로판올세척이 불필요하다. 알콜세척의 제거는 수지비드를 감성시킬 수 있는 수지의 "압착(Squeezing) "을 제거한다. 이것은 물론 펩티드에 대한 각 아미노산의 커플링에 필요한 전체 시간을 감소시킨다. 추가의 잇점으로서, 구핵성(nucleophilic)용매가 공정으로부터 제거되고 이것은 가능한 교차오염 또는 이들 "반응성(reactive)"종의 불충분한 제거에 의한 위험을 제거한다.
·교반용기에 비드를 현탁시키기 위한 교반기의 전단 및 연마작용에 의해 야기된 수지의 손상을 제거한다. 수지는 STR에서와 같이 교반에 의해 압력이 가해지지 않는다. 따라서, 고속 교반기 팁 블레이드에 의한 수지비드의 전단 파손이 적다.
·보호해제 반응에 의해 생성된 열을 제거할 능력을 갖는다. 재순환 액체는 외부열교환기에 의해 냉각될 수 있고 따라서, 수지는 DCM/TFA용액을 냉각시키기 위하여 연속적으로 노출될 수 있다.
·보호해제 반응시 제 1 TFA 충전에 의해 생성된 카보카티온을 빠르게 제거하므로서 펩티드의 품질 및 수율을 개선할 능력을 갖는다. 이것은 세척액이 수집 및 재순환 또는 반응기를 통한 단일통과후 버려지므로서 수행될 수 있다.
·수지 입자 크기를 감소시키고, 자유롭게 회전하는 비침수 바스켓에 의해 조정가능한 압력 강하와 함께 안정한 상에 있는 입자에 대한 상대적으로 높은 유체 속도를 유지할 능력을 갖는다.
·수지의 예비활성화가 여과에 의한 DCU의 제거를 포함하기 때문에 벌크액과 수지의 활성부위 사이로 반응물질의 전달 속도를 개선시킨다.
·비침수 바스켓에서 보다 짧고, 보다 조절된 유체 접촉시간 및 보다 빠른 여과시간을 갖는데 이것은 보다 짧은 시간의 사이클 및 펩티드 -수지에 대한 보다 제어된 노출시간을 가져온다.
·수지단편 또는 불용성 부산물을 파손시키거나 이것으로 차단될 수 있는 프리트를 제거할 수 있다.
·수지가 세척물들 사이에서 상대적으로 건조하게 회전될 수 있으며 다음 세척 용매의 제 1부분이 재순환되기 보다는 버려질 수 있기 때문에 보다 효율적인 세척이 이루어진다. 이것은 상기 용매의 수지를 빠르게 퍼지하는 효과를 갖는다.
·일정한 바스켓 케이크를 갖는 수지상의 수축 및 팽윤을 조정할 수 있다. 관형 반응기와 달리 필터면적(즉, 바스켓 벽)에 대한 수지상의 부피가 낮다.
상기 설명은 단지 설명을 위해 기술된 것으로서 제한할 의도는 아니다. 첨부된 청구범위의 범위내에서 당업자가 변형을 이룰수 있음이 명백하다. 예를들면, 활성화제로서의 DCC는 DIC로 대체될 수 있다. DIC의 사용은 수지를 방해하는 불용성 부산물(DCU와 같은)을 생성하지 않는다. 따라서, 활성화제로서 DIC의 사용은 메탄올 세척 및 예비활성화의 필요성을 제거하는데 이것은 펩티드의 합성에 요구되는 전체시간을 감소시킨다. 보급 탱크(3)가 시스템에서 제거될 수 있고 모든 용액은 수용체/섬프 탱크(5)에서 제조될 수 있다. 이것은 보급탱크와 관련된 제어가 수용체/섬프탱크에 연관되고 필터(F1)가 라인(11)에 또는 라인(11)에 있는 필터루프에 위치되도록 하는 것이 요구된다. 바스켓은 수직 축 둘레를 수평으로 회전되지만 바스켓은 그 쪽에 있도록 수평축 둘레를 회전하거나 경사진 축(즉, 수직에 대해 90도 이하의 각)둘레를 회전할 수 있다. 이러한 예는 단순히 설명적인 것이다.

Claims (27)

  1. 하우징(15)을 갖는 합성 반응기(7)와 다공성 벽(23)을 갖는 하우징에 있는 바스켓(17)을 포함하는데 바스켓이 하우징보다 작은 직경을 가지며 바스켓과 하우징이 바스켓의 외표면과 하우징의 내표면 사이의 공간(18)을 한정하는 반응기 시스템(1)에서 고상 펩티드 합성을 수행하는 방법에 있어서, 소정의 회전속도로 비스켓을 회전시키고 ; 회전하는 반응기 바스켓에 수지 슬러리를 공급하여 바스켓의 벽상에 거의 일정한 두께의 케이크(R)를 축적하고 ; 회전 바스켓에 보호해제 용액을 공급하여 수지 결합 펩티드의 N-말단을 보호해제시키고 ; 회전 바스켓에 하나 이상의 세척용액을 공급하여 케이크로부터 보호해제 용액을 세척하고 ; 회전 바스켓에 펩티드 쇄에 부가될 다음 아미노산의 아미노산 용액 및 커플링 용액을 공급하여 펩티드 쇄에 다음 아미노산을 부가하고 ; 펩티드 쇄가 완성될 때까지 단계 (c)-(d)를 반복하는 단계를 포함하며, 보호해제용액, 세척용액, 아미노산 용액 및 커플링제 용액은 공급된 용액이 반응기 하우징에 모여서 바스켓을 잠기게 하지 않는 비율로 회전 바스켓에 도입되고, 바스켓은 펩티드 합성의 각 단계시에 넘치지 않는 상태로 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 수지 결합 펩티드를 생성하기 위하여 수지의 활성 부위에 소정의 펩티드 서열로 이루어진 제 1아미노산을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 수지가 스티렌 비드로 이루어진 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 비드가 100μ이하의 직경을 가지며 0.2%-1.5% 가교 결합된 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 바스켓을 회전시키는 단계가 바스켓의 벽에 수지 케이크를 유지시키기에 충분한 원심력을 발생시키기에 충분히 빠른 속도로 바스켓을 회전시키는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 바스켓이 최소한 약 10g's의 바스켓 내표면에서의 원심력을 얻기에 충분한 속도로 회전되는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 반응기 시스템이 수용체/섬프(5)를 포함하며 ; 반응기(7)는 수용체/섬프로 입구와 제 1파이프(13)를 통하여 유체가 통하게 있는 하우징에 있는 출구를 가지며, 수용체/섬프가 반응기의 입구(27)와 제 2파이프(11)을 통하여 유체가 통하게 있는 출구를 가지며, 상기 수용체/섬프, 반응기 및 제 1, 제 2 파이프가 회선을 한정하며 ; 반응기로 용액들을 공급하는 단계가 상기 수용체/섬프(5)로 용액을 공급한 후 그 용액을 반응기로 이송하는 단계를 포함하고 ; 상기 용액은 케이크를 통하여 반응기 공간(18)으로 보내지게되고, 상기 용액은 제 1파이프(13)를 통해 수용체/섬프로 다시 유동하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 회전 바스켓으로 용액을 공급하는 단계가 결정된 시간동안 상기 회선을 통하여 용액을 순환시키는 것을 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 제 2용액이 반응기로 도입되기 전에 반응기 시스템으로 부터의 제 1용액을 실질적으로 퍼지하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 수용체/섬프(5)가 수집기와 통하게 위치될 수 있고, 상기 퍼지 단계가 반응기(7)에 있는 어떤 용액을 수용체/섬프(5)로 이송하고, 상기 수용체/섬프(5)를 수집기와 통하게 위치시키고 수용체/섬프(5)의 내용물을 수집기로 전환시키는 것을 포함하며, 상기 이송단계는 결정된 순환 시간이 지나간 후 그리고 제 2용액의 도입이 시작되기 전에 소정의 속도로 바스켓을 회전시키는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 제 1튜브(13)는 수집기와 유체가 통하게 위치될 수 있고, 반응기 시스템으로부터의 제 1용액을 퍼지하는 단계가 반응기로 제 2용액을 공급하는 단계 중 소정의 시간동안 수집기와 통하게 제 1튜브를 위치시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 용액의 온도를 조절하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 케이크를 축적시키는 단계가 케이크를 2cm-6cm 사이의 깊이로 축적시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 반응기에 아미노산을 공급하기 전에 첨가될 아미노산을 예비활성화시키는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 예비활성화된 아미노산을 여과하여 용액을 반응기에 공급하기 전에 용액으로부터 불용성 부산물을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 7항에 있어서, 반응기 시스템이 반응기(7)와 수용체/섬프(5) 사이에 위치된 필터를 포함하며, 용액이 회선을 통하여 이송되었을 때 용액을 여과하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 반응기에 용액을 공급하는 단계가 수지 케이크에 대하여 용액을 노즐(29)을 통하여 스프레이하는 것을 포함하는 방법.
  18. 고상 펩티드 합성을 수행하기 위한 반응기 시스템에 있어서, 입구, 출구 및 하우징내에 있으며 케이크가 형성되는 다공성 측벽(23)을 갖는 회전가능한 바스켓을 포함하는 하우징을 갖는 반응기(7) ; 펩티드 합성을 위한 용액이 도입되며, 입구와 출구를 갖는 용액 공급 탱크(5)를 포함하며, 반응기의 출구는 제 1라인(13)을 거쳐 공급 탱크의 입구와 유체가 통하게 되어 있으며 공급탱크의 출구는 제 2라인(11)을 거쳐 반응기의 입구와 유체가 통하게 되어 있고 ; 반응기 시스템은 반응기 바스켓(17)이 흘러넘치지 않는 상태로 유지되도록 작동 가능하여 상기 용액이 반응기 바스켓을 넘어가지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 반응기 시스템.
  19. 제 18항에 있어서, 제 2용액이 시스템에 첨가되기 전에 펩티드 합성에 사용된 제 1용액의 반응기 시스템을 실질적으로 퍼지하는 수단을 포함하는 반응기 시스템.
  20. 제 19항에 있어서, 수집기와 제 2라인(11)에 있는 제 1밸브(V2)를 포함하는데, 제 1밸브(V2)는 공급탱크를 나오는 용액이 반응기로 들어가는 제 1위치와 공급탱크를 나오는 용액이 수집기로 통과하는 제 2위치 사이를 스위칭 가능하며, 상기 퍼지수단은 반응기, 섬프 및 밸브를 포함하고, 반응기 바스켓은 용액의 순환이 완료된 후에 회전되어 바스켓에 있는 어떤 용액이 용액 공급탱크로 통과되도록 하고 용액공급탱크의 내용물은 이때 제 1 밸브를 통하여 수집기로 전환되는 반응기 시스템.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 퍼지수단이 제 1라인(13)에 있는 제 2밸브(V4)를 더 포함하는데, 제 2밸브는 반응기 출구가 공급탱크와 통하게 있는 제 1위치와 반응기 출구가 수집기와 통하게 있는 제 2위치 사이를 선택적으로 스위칭 가능하며, 제 2밸브가 제 2용액을 반응기로 공급하는 동안 소정의 시간동안 제 2위치로 스위칭되도록 작동되는 반응기 시스템.
  22. 제 18항에 있어서, 반응기 및 용액 공급 탱크와 통하게 되어 있는 보급탱크(3) 및 용액 공급탱크와 반응기 중 하나로 보급탱크의 내용물이 향하게 선택적으로 작동가능한 밸브(V1)를 포함하는 반응기 시스템.
  23. 제 22항에 있어서, 수지 슬러리가 보급탱크에서 제조되며, 상기 밸브(V1)는 반응기로 상기 슬러리가 향하도록 작동되고, 반응기는 슬러리 입구 파이프를 포함하는 반응기 시스템.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 슬러리 입구 파이프가 슬러리를 반응기 바스켓의 벽으로 향하게 하는 반응기 시스템.
  25. 제 24항에 있어서, 반응기 벽상에 두께가 거의 일정하고 거의 평탄한 슬러리 상의 형성을 용이하게 하기 위한 스프레더를 포함하는 반응기 시스템.
  26. 제 22항에 있어서, 용액중의 아미노산이 보급탱크에서 예비활성화되며, 아미노산은 상기 밸브를 통하여 용액 공급탱크로 향하게 되는 반응기 시스템.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 밸브(V1)와 용액 공급 탱크 사이에 위치된 필터(F1)를 포함하며, 아미노산 용액이 필터를 통하여 통과되는 반응기 시스템.
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