KR100388941B1 - 조직시료로부터세포물질을직접추출하는방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조직 시료로 부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법에 관한 것으로, 현미경을 이용하여 조직 시료의 세포에 대한 화상 장을 형성시키는 단계; 상기 세포의 화상 장으로 부터 인접한 세포 영역과는 다른 세포 타입을 포함하는 적어도 하나의 대상 세포 영역을 동정시키는 단계; 및 상기 조직 시료로 부터 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역을 추출시키는 단계를 포함한다. 상기 추출된 세포 영역을 동정, 추출, 이동, 및 분석하는 전체 공정은 완전히 자동화될 수 있다.
Description
많은 질병은 지금 현재 분자적이고 유전적인 수준에서 이해된다. 이와 같은 분자 분석은 질병 진단 및 예측에 중요하다. 조직 시료로부터 세포 조직 물질을 직접 추출하는 종래 방법은 단지 질병과 결합된 마커(marker)의 평균 함량만을 반영하기 때문에 제한된다. 실제로, 조직는 매우 이질적이며, 상기 조직중 가장 진단이 수월한 부분은 손상에서 벗어난 백개 이하의 세포로 한정된다.
인간 암의 분자적 연구는 최근 그것의 특성에 이용 가능한 기술 및 모델(model) 시스템에 의해 제한된다. 인간의 암 세포에서의 단백질 또는 핵산의 발현을 양적으로 또는 질적으로 평가하는 연구는 벌크(bulk) 암 표본에 존재하는 다양한 세포 집단에 의해 제한을 받는다. 침투성 암의 조직학 분야는 암 세포, 간질 세포, 내피 세포, 정상 내피 세포 및 염증 세포를 포함하는 전형적인 다수 세포타입을 나타내고 있다. 상기 암 세포는 흔히 전체 세포 집단중 상대적으로 작은 비율이므로, 이것의 표본에서 네트(net) 단백질 또는 핵산 변형의 의미를 해석하는 것은 어렵다.
암의 침투 및 전이 과정은 암 세포를 침투시키는 단백 분해 활동의 증가에 따른다. 기질 금속단백질 분해효소, 카텝신(cathepsin) B, D와 L, 및 플라즈미노겐(plasminogen) 활성제는 전이성 케스케이드(cascade)에 관련되었다. 카텝신 D는 유방암에 있어서 독립 진단 마커(marker)로 제시되었다. 단백질 분해 효소는 매우 전이적인 암 세포계에서 증가된 단백질 분해 효소의 활성 및/또는 변형된 단백질 분해효소의 부차세포의 분포, 면역조직화학 및 암 조직 균질물의 검정물 모두에 의해 결정된 것으로서, 침투성의 인간 암에서의 증가된 단백질 분해 효소의 발현, 및 인간의 암에서의 증가된 MRNA 수준을 포함하는 암 침투에 있어 중요하다는 개념을 지지하는 상관 관계가 다수 있다.
이러한 기술 전부는 인간 암내에서 단백질 분해 효소 발현에 관하여 중요한 정보를 주었다. 하지만, 이것은 단백질 분해 효소가 암 침투가 발생하는 특정 영역에서 상위로 조절된다는 결정적인 증거를 제공하지 못하였다.
현대 문명에서 인간 암 세포의 연구는 숙주 세포 및 세포외 기질을 포함하는 상기 암 세포의 복잡한 상호작용과 이것이 암세포 단백질 분해 효소 생산성 또는 활성을 어떻게 조절하는지를 설명하지 못한다. 면역조직화학적 염색법은 암 침투의 영역에서 효소 분포를 조사하는 것을 가능하게 하지만, 결과는 조직의 고정 및 항체-항원 친화력에 따라 변하며, 단지 단백질 수준의 반정량적 평가를 제공한다. 더욱, 염색 결과물의 정량적 해석은 조직 절편물내의 염색 패턴(pattern)의 다양성, 염색 강도의 주관적인 산정, 및 간질 염색의 의미를 해석의 차이에 의해 복잡하게 된다. 추가로, 단백질 분해 효소의 연구에 이용되는 많은 항체는 활동 효소종과 전효소를 구별 짓지 못한다. 인간 암의 균질물로 부터의 효소 또는 MRNA 수준의 분석물은 상기 표본내 세포의 혼합 집단이나 조직에서 발생될 수 있는 수반된 병리생리학적 과정 모두 설명하지 않는다.
본발명은 이러한 분야내에서 특정 조직학 분야 및 세포 집단을 조사할 수 있는 세포 조직의 현미 절편에 대한 시료 채취 기술에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 세포 조직 시료내의 특정 세포를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 조직 시료로 부터 특정 세포를 직접 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 조직 시료내의 특정 세포를 동정하는 자동화된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 조직 시료로 부터 특정 세포를 직접 추출하는 자동화된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 조직 시료로 부터 순수 세포 집단을 얻는 방법을 제공하는 것이다.
다음의 다음 절차를 나타냄으로써 명확하게 될 본 발명의 상기 목적에 따라,본 발명은 다음의 공정을 포함하는 조직로 부터 세포 물질을 직접 추출하기 위한 방법을 제공하는 것이다:
a) 슬라이드에 올려놓은 조직 시료를 제공하는 단계;
b) 현미경을 이용하여 상기 조직 시료의 세포에 대한 화상 장을 형성시키는 단계;
c) 상기 세포의 화상 장으로 부터 인접한 세포 영역과는 다른 세포 타입을 포함하는 적어도 하나의 대상 세포 영역을 동정시키는 단계; 및
d) 상기 조직 시료로 부터 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역을 추출시키는 단계.
본 발명은 세포 시료의 분석을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 순수 집단 또는 특정 세포(cell) 타입의 부차집단으로 부터 효소인 MRNA 및 DNA의 분석을 위한 다수의 다른 기술과 결합되어 사용될 수 있는 세포 시료의 현미절개(microdissection) 및 분석을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
본 발명은 다음의 제한 없는 실시예를 통해 첨부된 도면에 관하여 기술될 것이다.
제 1도는 조직 시료가 현미경에 의해 어떻게 화상 처리되고 표시 모니터에 표시되는지, 그리고 상기 화상 처리된 영역이 추후의 현미절편 및 분석을 위해 어떻게 선택되고 동정되는지를 나타내는 기능 시스템을 나타낸 개략도,
제 2a 내지 2c도는 본 발명의 일실시예에 따라 조직 시료의 영역이 상기 슬라이드에 올려놓은 조직 시료로 부터 어떻게 추출되는가를 나타내는 일련의 기능 시스템을 나타낸 개략도,
제 3도는 슬라이드에 올려놓은 조직 시료로 부터 시료 영역을 추출시키기 위한 선택적인 장치의 개략도,
제 4a 및 4b도는 본 발명에 따라 제 3도의 추출 장치와 함께 사용될 수 있는 수동 추출 도구 조작기의 개략도,
제 5도는 시료 조직의 영역이 적절한 분석 프로토콜(protocol)로 진행되는지를 나타내는 기능 시스템을 나타낸 개략도,
제 6a 및 6b도는 동일한 환자로 부터 정상 콜론닉(colonic) 점막과 비교하여 열가지의 침투성 콜론암의 경우(제 6a도) 및 침투성 유방암의 다섯가지 경우에서의 MMP-2의 발현을 나타낸 도면,
제 7도는 MMP-2 활성 부위의 SSCP 분석을 나타낸 도면.
본 발명은 현미경 하단의 조직 시료 내에 세포 영역을 가시화시키고, 흥미있는 세포 물질을 동시에 용해, 추출 및/또는 유지시키는 표면과 동정된 면적을 접촉시키며, 상기 흥미 있는 세포 물질을 적당한 분석 시스템으로 이동시키는 것을 포함하는 분자적이거나 유전적인 수준하에 세포 물질을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 국소 조직 효소, 항원, DNA, RNA, 및 이와 같은 것의 분석에 특히 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 조직를 화면상에 가시화 시킬 수 있는 완전히 자동화된 시스템에 관한 것인데, 이것은 정확하게 흥미 있는 세포 영역이 다양한 라벨(label)에 의하여 동정되고, 국한되며, 그 다음 자동적으로 추출 및 분석되기 위함이다.
제 1도는 조직 시료가 현미경에 의해 어떻게 화상 처리되고 표시 모니터에 표시되는지, 그리고 상기 화상 처리된 영역이 추후의 현미절편 및 분석을 위해 어떻게 선택되고 동정되는지를 나타내는 기능 시스템응 나타낸 개략도이다. 제 1도에서 나타난 것과 같이, 조직 시료(1)을 현미경 조사 및 화상 처리를 위해 유리 슬라이드(slide)(2)에 놓는다. 아가로오즈 겔(algarose gel)을 이용하여 유리 슬라이드에 부착시키고, 상기 조직시료를 파라핀(paraffin)으로 고정시키는 등의 통상적인 방법에 따라, 상기 시료 조직(1)을 유리 슬라이드(2)에 고정시킬 수 있다.
슬라이드 위에 시료 조직(1)이 올려진 유리 슬라이드(2)는 현미경 단상에 놓는다. 일반적으로, 기준숫자(3)으로 표시되는 현미경은 상기 조직 시료(1)의 화상을 받는다. 비디오 카메라(나타나지 않음)을 현미경(3)과 연결한다. 이러한 비디오 카메라는 현미경(3)으로 부터 시료 조직(1)의 화상을 받고, 표시 모니터(4)에 상기 조직 시료의 화상을 표시한다.
상기 시료 조직(1)의 화상은 주어진 화상에 대해 현미경(3)의 "장"으로 제한된다. 제 1도에 나타난 것과 같이, 상기 시료 조직 화상의 장은 상기 조직 시료를 염색하기 위해 적절한 염료를 사용함으로써 과학적으로 구별될 수 있는 상이한 세포 타입 "A", "B", "C", 및 "D"의 몇개 장을 포함할 수 있다. 전형적인 목적에 대하여, 제 1도 및 제 2a 내지 2b도에서는 "B" 영역이 대상 세포 물질 영역인 것이 추정된다. 표시 모니터(4)위의 화상은 상기 대상 조직 시료 1의 하나 또는 그이상의 영역을 선택하고, 동정하기 위해 조작자에 의해 사용된다. 본 발명의 일예에 따라, 상기 대상 영역이 선택되고, 동정된 후, 조작자는 유리 슬라이드(2)로 부터 동정된 영역을 추출하기 위한 장치를 수동으로 작동시킨다. 시료 물질의 추출된 영역에는 분석시료를 포함된다. 그렇지 않으면, 상기 동정되고 추출된 영역은 폐기 예정인 영역을 포함할 수 있으며, 유리 슬라이드(2)에 남아 있는 나머지 영역은 후에 분석될 수 있다.
다음에 더욱 상세히 거론되는 수동 조작 외에도, 본 발명의 다른 일예에 따라, 비디오 카메라(또는 현미경)으로 부터 화상의 디지탈화된(digitized) 신호를 받고 상기 시료가 놓인 현미경(3)의 단의 기준 위치를 받는 컴퓨터를 사용하여 결정된 상대적 위치의 시료 영역을 선택하고 동정하기 위해 표시 모니터(4)상의 화상을 이용하는 것이 가능하다.
이와 같은 위치 탐지 및 인식 시스템은 당업계에서 통상적이며, 본 발명의 시료 준비 방법을 자동화시키는데 쉽게 적용될 수 있다. 본 발명의 이러한 자동화된 예에서, 위치 탐지와 인식을 실행하는 컴퓨터를, 또한 조직 영역을 추출하는 사용되는, 그리하여 상기 시료 제거를 자동화시키는 아래에서 거론된 장치의 움직임을 조절하는데 사용할 수 있다. 추가로, 상기 시료의 화상을 공지된 기술 및 장치를 사용하여 예정된 또는 관련된 염색 정도를 갖는 영역을 자동적으로 동정하기 위해 전기적으로 조사할 수 있다. 그러므로, 바람직한 일실시예에서는, 컴퓨터를 흥미 있는 영역과 이와 같은 영역의 상대적 위치를 사용할 수 있는데, 그 이유는 자동화된 방법으로 이와 같은 영역을 제거하기 위해 장치를 조작하기 위함이다. 제 2a 내지 2c도는 본 발명의 일실시예에 따라 조직 시료의 영역이 상기 슬라이드에 올려놓은 조직 시료로 부터 어떻게 추출되는가를 나타내는 일련의 기능 시스템을 나타낸 개략도이다. 제 2a도에서 접촉 탐침(5)를 상기와 같이 되도록 수동으로나 컴퓨터 조절에 의해 위치시키고, 추출시키기 위해 시료 영역("B")에 정렬시킨다.제 2a도로 부터 쉽게 이해될 수 있듯이, 상기 접촉 탐침 가장자리의 표면적(및 접착/추출제)은 추출되기 위한 영역의 표면적에 비해 대략 동일하거나 작을 필요가 있다. 그렇지 않으면, 인접한 조직 영역을 초가하여 제거할 수 있다.
접촉 탐침(5)의 가장자리가 추출을 위해 시료 영역("B")에 정렬되면, 가장자리의 접착/추출제(6)을 시료 영역에 접촉시키기 위해 접촉 탐침(5)를 낮춘다(제 2b도).
상기 접착/추출제(6)이 상기 시료 영역에 부착되는 것으로 선택한다. 접촉 탐침(5)를 시료 영역(제 2b도)에 접촉시키고 시료 영역을 그것과 부착시킨다면, 상기 접촉 탐침(5)를 접촉 위치(제 2b도에서 설명됨)로 부터 수축시키고 제 2c도에 나타낸 것처럼 이동시킨다. 상기 접착/추출제의 접착 강도가 유리 슬라이드 위에 시료를 올려놓는데 사용되는 힘보다 강하기 때문에, 접촉 탐침(5)는 물러나거나 수축될 때 유리 슬라이드로 부터 시료 영역"B"를 끌어 당긴다. 본 발명의 일실시예에 따라, 유리 피펫(pippette)의 가장자리는 피콜라이트/자일렌(piccolyte/xylene) 용액에 상기 유리 피펫의 가장자리를 담그므로써 피콜라이트(568 g/l) 및 자일렌(437.5 g/l)의 용액으로 코팅되었다.
상기 유리 슬라이드(2)로 부터 시료 영역을 제거하는 것 외에, 상기 접촉 탐침(5)를 제 2c도로 표시되는 것과 같은 분석 용기(7) 또는 폐기 용기, 배양 배지 등과 같은 장소로 상기 추출된 시료 영역을 이동시키는데 사용한다. 바람직한 일실시예에서, 상기 접촉 탐침(5)를 시료 영역의 바람직한 분석을 미리 실행하도록 설계된 자동화된 임상 분석기에 시료가 올려진 단(stage)으로 접수시키는 시료로 추출된 시료 영역을 이동시키는데 사용한다. 그러므로, 본 발명은 슬라이드에 올려 놓은 시료에서 시료 영역을 동정시키고, 상기 슬라이드에 올려놓은 시료로 부터 대상 시료 영역을 제거시키며, 추출된 시료 영역의 자동 분석을 미리 실행할 수 있는 자동 분석기에 추출된 시료 영역을 이동시키기 위한 완전히 자동화된 방법 및 시스템을 제공할 수 있다고 이해된다.
제 2c도에서는, 상기 추출된 시료 영역은 예를 들어, 추출된 시료 영역의 분석이 개시되거나 미리 실행될 수 있는 시험 튜브 또는 유사한 용기일 수 있는 용기(7)에 분배된 것과 같이 표시된다. 제 2c도에서 나타낸 것 처럼, 접촉 탐침 가장자리로 부터 추출된 시료 영역의 전체나 바람직한 성분을 제거하는 시약 용액(8)은 상기 추출된 시료 영역이 침전되기 전에 용기(7)에 놓일 수 있다. 예를 들어, DNA 분석의 경우에, 트리스 (Tris, 50 mM, pH 8.5), EDTA (1mM), 트윈 20 (Tween 20, 0.5%), 및 단백질 분해 효소 K (0.2 mg/㎖)의 용액은 상기 접촉 탐침(5)의 가장자리로 부터 추출된 시료 영역을 제거하고 분석 목적으로 상기 조직 물질을 용해 시키는데 사용될 수 있다.
제 2a 내지 2c도에 나타낸 접촉 탐침외에, 구멍 흡인 탐침 또한 슬라이드에 올려놓은 조직 시료로 부터 시료 영역을 추출하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 흡인 탐침은 시료 영역이 천공되고 흡인력에 의해 추출될 수 있는 날카로운 고리상의 가장자리를 가지고 있을 수 있다.
제 3도는 슬라이드에 올려놓은 조직 시료(1)로 부터 시료 영역을 추출시키기 위한 선택적인 장치의 개략도이다. 제 3도에서 나타내고 있는 추출 장치(9)는 절단용 칼(10)과 잡기용 암(arm)(11)을 포함한다. 상기 잡기용 암(11)은 상기 절단용 칼(10)에 대하여 반대 방법으로 제거될 수 있다. 상기 잡기용 암(11)을 제 3도에서는 개방 상태로 나타내고 있다. 상기 잡기용 암은 개방 상태와 잡기용 암(11)의 가장자리가 절단용 칼(10)과 접촉하는 닫힌 상태 사이를 움직일 수 있다. 잡기용 암(11)의 운동은 잡기용 암(11)의 시작점에 위치된 도르래을 통과하는 전선에 장력을 적용시킴으로써 잡기용 암(11)이 시작점의 중심이 되는 전선 및 도르래 시스템에 의해 조절될 수 있다. 상기 전선상의 장력은 공지된 방법에서 전선에 장력이 적용된 장치상에 레버(lever)를 작동시키거나 버튼(button)을 누름으로써 적용될 수 있다. 이와 같은 작동시키는 기계적 구조는 잡는 장치의 당업계에서 공지된 것이다.
제 3도 장치의 조작에서, 장치의 중심축에 관하여 둔각을 이루는 절단용 칼은 추출될 조직 시료 일부분의 끝에 절단용 칼(10)을 놓음으로써 조직 시료의 일부분을 절단하고 떠올리며, 그 다음 상기 잡기용 암(11)을 닫힌 상태로 이동시킬 수 있다. 상기 잡기용 암(11)이 상기 조직 시료와 접촉하게 될 때, 절단용 칼을 시료쪽으로 끌어 당기고, 시료의 일부분을 절단용 칼(10)쪽으로 밀므로써, 절단용 칼(10)과 잡기용 암(11) 사이에 접촉된 시료를 시료로 부터 절단하고 떠올리는 원인이 된다.
제 3도 장치의 더욱 선택적인 일실시예에서, 잡기용 암(11)의 운동에는 도르래 대신에 톱니 기어(gear) 및 전선 대신에 조합 톱니 막대를 사용할 수 있다. 이와 같은 기계 구조는 잡기 기술의 당업계에 공지된 것이다.
제 4a 및 4b도는 본 발명에 따라 제 3도의 추출 장치와 함께 사용될 수 있는 수동 추출 도구 조작기의 개략도이다. 제 4a도에서 추출도구 조작기는 현미경 단의 버팀 또는 지지 부분의 장치를 제거 가능하도록 부착시키기 위한 조임 수단(14)를 구비한 베이스(base)(13)을 갖는 것으로 나타나고 있다. 조임 메카니즘(mechanism)은 베이스(13)의 하단에서 홈이 난 구멍(17)을 통해 홈이 난 축(16)을 조여진 조임판(15)를 포함한다. 조임 손잡이(18)을 홈이 난 축(16)의 말단에 제공한다. 조임 손잡이(18)을 돌리면 베이스(13)의 상단 부분에 대해 조임판(15)가 움직인다. 그러므로, 상기 추출 도구 조작기를 제 4b도에서 나타난 것처럼, 현미경(20)의 단 일부에 조일 수 있는 데, 이것은 조임판(15) 및 베이스(13)의 상단(19) 사이의 현미경(20)의 단에 버팀 또는 지지 부분(21)을 위치시키고 손잡이(18)을 돌려서 현미경(20)의 단의 버팀 또는 지지 부분(21)에 반하여 조임판(15)를 조임으로써 이루어 진다.
상기 추출 도구 조작기는 추출 도구(24)의 축을 받기 위한 과통 구멍(23)을 갖는 도구 지지대(22)를 포함한다. 이상적으로, 상기 도구 지지대(22)는 추출 도구의 완충된 전후 운동이 가능하여야 한다. 따라서, 바람직한 실시예에 따르면, 도구 지지대(22)의 통과 구멍(23)은 도구 잠금 스크루(screw)(24)에 의해 도구축에 반하여 조이도록 조작할 수 있는 부싱(bushing)을 함유한다.
상기 도구 지지대(22)는 도구 지지대(22) 및 베이스(13)을 360° 완충 회전 이음새(26) 및 (27)에 의해 반대 말단에 연결되는 지지축(25)로 지지된다. 360° 완충 회전 이음새(26) 및 (27) 사이의 지지축(25)의 길이는 조절이 가능하다. 지지대(25)의 조절가능한 길이 및 통과 구멍(23)내의 도구 위치와 함께 독립적인 360° 완충 회전 이음새(26) 및 (27)의 조절은 현미경의 단에 위치된 슬라이드에 올려놓은 시료에 관하여 추출 도구 운동을 높은 정도까지 가능케 한다. 따라서, 조작자는 압출 도구 조작기에 의해 유지되는 추출 도구를 조작하며, 고정밀도를 가지고 슬라이드에 올려놓은 조직 시료로 부터 선택된 조직 영역을 제거할 수 있다.
제 5도는 시료 조직 영역이 적절한 분석 프로토콜(protocol)로 진행되는지를 나타내는 기능 시스템을 나타낸 개략도이다. 제 5도에서 나타난 것과 같이 조직 시료 영역의 미소 추출물은 상기에서 거론된 것처럼 슬라이드에 올려놓은 조직 시료(1)에서 취하고, 대상 시료가 분석을 위해 추출되고 포집될 수 있는 시료 준비단(28)에 이동시킬 수 있다. 절단된 세포는 또한 이 단에서 용해될 수 있다. 만약 상기 대상 세포가 DNA 또는 RNA를 함유한다면, 절단된 시료는 바람직하게 폴리머라제(polymerase) 연쇄 반응(PCR) 증폭 및 교잡, 가닥 입체 구조의 다형 현상, 및 서던(southern) 및 노던(northern) 블로팅(blotting)에 지배된다. 만약 세포가 단백질을 함유한다면, 상기 추출된 시료는 효소 지모그라피(zymography), 면역학적 분석물, 또는 생화학적 분석물에 지배될 수 있다.
본 발명에 따라, 동결 조직 절편의 선택적 추출 또는 미세절개는 활성 효소 및 MRNA 모두의 복원과 분석을 가능하게 한다. 추가적으로, 이러한 절편으로 부터 복원된 DNA는 자연 상태에 존재하며, DNA 지문과 같은 연구에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 파라핀이 덮힌 조직은 하나 이상의 고출력 장, 또는 낭포성 공간을 연결하는 상피 세포의 단일충으로 나타내는 순수 세포 집단으로 부터 DNA의 PCR 증폭시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 동결된 절편의 미세절개의 일반적인 제조를 위하여, 미세절개 슬라이드를 표준 조직학 슬라이드 및 1% 아가로오즈를 올려놓고 커버 유리를 덮으므로써 제조할 수 있다. 단시간, 예를 들어, 5분후 슬라이드 위에 얇은 겔을 남기고 덮개 유리를 제거한다. 예를 들어, 25 마이크론(micron) 두께의 동결된 조직의 소절편을 아가로오즈 겔위에 올려놓고, 에오신(eosin)으로 간단히 염색시킨다. 이러한 조직 또한 작용제로 처리하여 추후의 추출법에 의존하는 RNase를 변성시킨다. 직접 현미경을 통한 가시영상 하에서 특정 대상 세포 집단 또는 부차 집단은 위에 거론된 기술을 이용하여 조직 절편으로 부터 제조된다.
효소 분석을 위하여 상기 얻어진 조직 표본을 대상 효소에 의존하는 적절한 완충액에 놓는다. 지오그라피 및 특정 형광 측정 기질을 포함하는 몇가지 방법에 의해 효소 수준을 측정할 수 있다. 특정 세포 집단에서의 적당한 효소 발현 수준을 결정할 수 있다.
전령 RNA을 위하여 상기 조직 표본을 아가로오즈 위에 놓고, 만일 필요하다면 작용제로 처리하여 RNase를 변성시킬 수 있다. 상기 얻어진 조직 표본을 질소 용액에서 순간 동결시킨다. 조직를 즉시 사용하거나, 몇 개월 동안 -70℃에서 저장시킬 수 있다. 상기 MRNA를 올리고(oligo) dT 칼럼(column) (Micro-Fast track MRNA Isolation Kit, Invetrogen Co.)를 사용하여 추출할 수 있다. 순수 세포 집단의 복원된 MRNA를 PCR 기술을 사용하여 확대시키고 검색할 수 있다.
DNA 분석을 위하여 50 mM의 트리스(pH 8.5), 1 mM의 EDTA, 0.5%의 트윈 20,및 0.2 mg/㎖의 단백질 분해 효소의 단일 단계 완충용액에 놓고, 37℃에서 네시간 동안 보온한 후 95℃에서 10분 동안의 보온이 뒤따른다. 상기 복원된 DNA를 PCR 기술로 증폭시키고 분석한다. 만약 천연 DNA가 DNA 지문을 위해 요구된다면, 상기 단백질 분해 효소 K를 DNase 후에 첨가할 수 있다.
파라핀 절편 미세절개를 위하여 통상적인 포르말린(formalin)이 고정되고 파라핀이 덮힌 조직 절편을 파라핀을 제거하고 간단히 에오신으로 염색한후, 미세절개시킨다. 조직 절편을 직접 현미경으로 볼 수 있으며, 대상 세포 집단 또는 부차 집단을 위에서 거론된 접착제가 코팅된 가장자리를 갖는 변형된 유리 피펫을 사용하여 제조한다. 세포만큼 작은 조직 표본을 이와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 절개의 특이성은 현재 공지된 기술에 있어서 현저하게 발전하고 있다. 파라핀이 덮힌 DNA 분석을 위하여 절개된 조직 표본을 갖는 유리 피펫을 50 mM의 트리스(pH 8.5), 1 mM의 EDTA, 0.5%의 트윈 20, 및 상기 피펫의 가장자리로 부터 제거한 0.2 mg/㎖의 단백질 분해 효소의 단일 단계 완충용액에 놓는다. 상기 시료의 크기에 따라 37℃에서 24시간 동안 보온되고, 이후 95℃에서 10분동안의 보온이 뒤따른다. 그 다음 상기 유리 피펫 가장자리를 살균하고 재사용한다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다, 실시예에서 사용되는 퍼센티지(%)는 다른 언급이 없는 한 중량%이다.
만일 본 발명이 인간 암가 침투하는 동안 단백질 분해 효소 분포를 더욱 명확하게 연구하는데 사용될 수 있는가를 확인하기 위한 시도가 하기의 실시예에 기재되어 있다.
이러한 영역의 효소가 동일한 환자의 정상 세포와 비교하여 정량적으로 증가되었는지를 평가하기 위해 침투성 유방 및 콜론 암 영역에서의 MMP-2 및 카텝신 B의 수준을 측정하였다.
하기의 실시예에서, 외과적 절개를 통해 확보한 콜론 및 유방 조직의 정상 및 암 시료를 분석시까지 동결 상태(-70℃)로 유지시켰다. 침투성 유방 및 콜론 암의 조직 절편을 조직학적 평가에 기초하여 선택하였다. 암 절편에 있어서, 침투성 암 및 간질을 포함하는 조직의 조직학 장을 선택하였으나, 정상 상피 또는 염증 세포의 상당수는 아니었다. 정상 조직의 조절 절편은 상피와 기초 간질의 얇은 절편을 포함하였다. 상피 및 간질 조직의 비율은 정상 절편이나 암 절편 모두 유사하였다. 실시예에서 미세절개 슬라이드를 200 마이크로리터(microliter)의 따뜻한 아가로오즈(1%)를 포함하는 표준 조직학 슬라이드를 덮고, 그 위에 덮개 유리를 올려 놓음으로써 준비하였다. 5분후에 상기 덮개 유리를 상기 슬라이드 상에 아가로오즈의 얇은 베드(bed)를 형성한 후 제거하였다. 20 마이크론 두께로 동결된 절편을 저온조에서 제조하여 상기 아가로오즈 겔위에 올려 놓았다. 상기 조직를 에오신에 간단히 침수시켰다. 각 절편 말단에서 시작하여 체계적으로 절개하고 제 3도의 미세절개 장치를 이용하여 조직학적 장을 절개함으로써 최적의 미세 절개를 성공하였다. 흥미 있는 영역을 추후 분석을 위해 슬라이드 위에 남겨 두었다. 상기 표본의 DNA 함량은 260nm에서 분광 광도계를 이용하여 측정함으로써 결정하였다. 각 시료의 DNA 함량은 각 조직학적인 절편에서 산정된 세포 수에 비례하였다.
실시예 1
본 실시예에서는, 세포수가 동일한 정상 및 암 조직의 시료를 각 주제별로 분석하였다. MMP-2 수준을 아르커스(Arcus) 검색기를 사용하여 지모그라프하고 검정함으로써 결정하였다. 스투던트(student) t-시험법을 사용하여 결과를 통계적으로 분석하였다. 카텝신 B 수준을 기질 Z-Arg-Arg-NIIMec에 반한 Vmax로 결정하였다.
침투성 콜론암/정상 상피 및 침투성 유방암/정상 상피의 조화된 쌍에서의 카톱신 B 활성을 목록화함으로써 본 실시예의 결과를 하기 표 1로 나타낸다. 활성 측정치를 Vmax, nmol/min×mg DNA로 표시하였다. 카텝신 B 활성은 평균적으로 콜론암에서는 2.3배(p<0.005) 및 유방암에서는 6.9배(p-0.077) 증가하였다.
표 1
침투성 인간 콜론암에서의 카렙신 B활성
침투성 인간 유방암에서의 카렙신 B
표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 다섯개의 유방암 시료 모두 및 열개의 콜론암 시료중 아홉 시료가 동일한 환자로 부터의 조화된 정상 세포수와 비교하여 볼때 카텝신 B의 활성이 증가하는 것으로 나타났다(표 1). 상기 콜론암의 증가된 활성 범위는 19% 내지 283%인데, 이것은 암의 평균 증가율는 2배를 초월하였다. 카텝신 B 활성의 증가는 유방암에서는 평균 증가율이 7배에 다소 못미치는 것을 더욱 확인하였다.
실시예 2
본 실시예에서는, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석법을 실시하였다. 공지된 72kDa 타입 IV 콜라게나제(collagenase)의 cDNA 배열을 기초로 하여, 센스(sense) 및 안티센스(antisense)의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer)를 효소 활성 부위의 증폭을 위해 합성하였다(M. Onisto et al, "Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Pheotyping of Metalloproteinases and Inhibitors in Tumor Matrix Invasion", Diagn. Mol. Pathol, 2(2):74~80, 1993). 상기 쌍을 이룬 올리고뉴클레오타이드 배열은 다음과 같다:5'-CAA TAC CTG AAC ACC TTC TA, 3'-CTG TAT GTG ATG TGG TTC TTG. 단일 가닥의 입체적 구조 다형 현상(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)에 대한 라벨된 PCR을 10 마이크로리터 반응에서 다음의 것을 결합시킴으로써 얻었다: 1 마이크로리터의 10X PCR 완충액(100 mM의 트리스-HCl(pH 8.3); 500 mM의 KCl; 15 mM의 MgCl2; 0.1 %w/v의 젤라틴(gelatin); 1 마이크로리터의 DNA 추출 완충액; 50 pmol의 각 프라이머; 각 20 nmol의 dCTP, dGTP, dTTP, 및 dATP; 0.2 마이크로리터의 [32P]dCTP (6000 Ci/mmol); 및 0.1 단위의 타크(Taq) DNA 폴리머라제. 상기 증폭 반응을 30 s 동안95℃, 30 s 동안 60℃ 및 30 s 동안 72℃에서 30 사이클(cycle)동안 실시하였다.
제 6a도는 동일한 환자로 부터 정상 콜론닉(colonic) 점막과 비교하여 열가지의 침투성 콜론 암의 경우에서의 MMP-2의 발현을 나타낸 도면이다. 막대 그래프는 대략 72kDa 효소의 전(pro)-형태(p<0.001)에서 세배 및 62kDa 효소의 활성 형태(p<0.001)에서 열 배 만큼 증가되었음을 나타낸다.
제 6b도는 침투성 유방암의 다섯 경우에서의 MMP-2의 발현을 나타낸 도면이다. 막대 그래프는 대략 72kDa 효소의 프로-형태(p<0.05)에서 세배 및 62kDa 효소의 활성 형태(p<0.05)에서 열 배 만큼 증가되었음을 나타낸다.
동일한 환자로 부터의 정상 조직과 비교하여, 콜론암의 열 시료 및 유방암의 다섯 시료 모두에서 72 kDa 전-타입 IV 콜라게나제 및 62kDa 효소의 활성 형태가 증가되었다. 정상 조절 조직와 비교하여, 콜론 및 유방암 모두에서 평균 열배 증가되었던 62kDa 효소의 활성 형태에서 더욱 큰 증가가 있었다. 72 kDa 전효소 수준을 암의 두타입 모두에서 평균 세배 증가하였다. 유방 및 콜론암 모두에 있어서, 상기 62 kDa 활성 효소에서의 증가가 상기 전효소에서의 증가율보다 더욱 산포가 컸다. 62 kDa 암의 활성 효소에서의 증가율은 3 내지 20배 범위인데 반해서, 72 kDa 전효소에서의 증가율은 일정하게 3 내지 20배이었다. 인간의 유방암 분석에서 본 실시예의 결과는 최근의 데이비스 등의 연구 결과물("Activity of Type IV Collagenases in Benign and Malignant Breast Disease", Br. J. Cancer, 67:1126~1131, 1993)과 유사하다. 상기 학자는 인간의 유방암 환자로 부터의 조직 절편의 지모그람(zymogram) 분석법을 실시하였다. 이러한 분석법은 상기 62kDa 활성 형태로 존재하는 총 MMP-2의 분획물이 악성 질병에서 통계적으로 증가되었고, 이러한 활성 효소중의 높은 비율이 높은 등급의 암에서 탐지되었다는 것을 설명하고 있다. 본 발명은 침투성 암의 특정 영역에서의 72kDa 및 62kDa 형태 모두와 동일한 환자로 부터의 조화된 정상 조절 상피를 비교하고 정량화시킴으로써 상기 분석법을 확대시킨다.
실시예 3
본 실시예에서는, 가닥의 입체적 구조 다형 현상(SSCP)을 실시하였다. 라벨된 증폭 DNA를 포름아미드(formamide) 적재 염료(95%의 포름아미드; 20mM의 EDTA; 0.05%의 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 및 0.05%의 자일렌 시안올(cyanol)의 동일한 부피와 혼합시켰다. 상시 시료를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 6%의 아크릴아미드(acrylamide)(49:1의 아크릴아미드:비스(bis)), 5%의 글리세롤(glycerol), 및 0.6X의 TBE로 이루어진 겔위로 이동시켰다. 시료를 상온에서 밤새도록 8W로 전기 영동 시켰다. 겔을 3 mm의 왓트만(Whatman) 종이로 이동시켜, 건조시킨후, 코닥 X-OMAT 필름으로 자기 방사술을 실시하였다.
제 7도는 MMP-2 활성 부위의 SSCP 분석을 나타낸 도면이다. 상기 도면에서는 정상 콜론의 대표적인 경우는 침투성 콜론암에 비교된 점막, 및 침투성 유방암에 비교된 정상 유방암이다는 것을 나타낸다. 정상 및 암종 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 각 레인(lane)에서의 두 밴드(band)는 DNA의 단일 이중 형태를 나타낸다. 열 개의 콜론암 및 네 개의 유방암에서 유사한 결과가 나왔다.
활성 MMP-2의 증가된 암 수준이 효소내의 돌연변이에 기인한 것인지를 평가하기 위해, PCR을 상기 콜론 및 유방암으로 부터 젤라티나제(gelatinase) A의 활성 부위에 대해 코딩(coding)된 DNA 배열을 중폭시키기 위해 사용되었다. 상기 활성 부위는 상기 효소의 N-말단으로 부터 10 kDa에 위치하며, 상기 72 kDa 전효소를 상기 62 kDa 활성종으로 변환시키는 분할 부위를 포함한다. PCR 및 SSCP에 의한 이러한 영역의 증폭 및 분석은 연구된 열 개의 콜론암 또는 네 개의 유방암의 어떤 것에서도 돌연변이를 발견할 수 없었다. 이러한 결과로 침투성 암의 증가된 활성 효소의 수준이 암에 조합된 활성시키는 종에 기인하는 것 같다는 제시하고 있다. 미세절개된 동결 조직 절편으로 부터 DNA의 PCR 증폭의 민감성을 하나의 고출력 장 이하가 되도록 결정하였다. DNA의 증폭과 유사하게, 소(小)세포 집단으로 부터 mRNA를 증폭시켜 역 PCR을 사용하여 본 발명에 따라 실행하였다.
종래의 연구에서는 MMP-2가 인간 콜론암에서 상위로 조절됨을 나타내었다. 하지만, 생체 정상 부위에서의 조잡 분석법을 사용하여 최근에 몇 학자들은 암 세포와 반대로 인간 콜론 암에서의 MMP-2의 MRNA 수준이 증가됨을 보고하고 있다. 이러한 가능성을 해결하기 위하여, 동결된 조직 절편을 미세절개하여 암 및 간질 세포에서 분리시킨 MMP-2의 효소 수준을 측정하였다. 단일 고출력 장으로 부터 충분한 조직이 회복되어 지모그라피에 의해 효소 수준을 정량화하였다. 이러한 세가지의 경우로 부터 침투성 암 세포 및 인접한 간질에 대한 연구에서는 72 kDa 전-MMP-2 및 활성 62 kDa 형태를 암 세포 및 간질 세포 집단 모두와 결합시키는 것을 나타낸다. 최고 효소 수준이 암-간질 계면에 있다고 예비 데이타에서 제시하고 있다.
상기 결과는 동결된 조직 절편의 미세절개는 선행 기술보다 인간의 암내의세포 집단의 더욱 명확한 분석을 가능케 하는 것을 가르킨다. 미세절개법은 특정 세포 타입의 순수 집단 또는 부차 집단으로 부터 효소, MRNA 및 DNA의 분석을 가능케 하는 다수의 상이한 기술과 결합하여 사용될 수 있다. 이러한 시료 기술은 인간의 암 침투동안 단백질 분해 효소 분포를 특정화시키고, 암 침투성의 지표로서 암 및/또는 간질 세포에서의 단백질 분해 효소의 발현을 정확하게 결정하며, 또한 암-간질 계면에서 단백질 분해 효소 활성을 저해하는 항 단백질 분해 효소 치료제의 효과를 모니터(monitor)하는 데에 이용할 수 있다. 추가적으로, PCR, RT PCR, 특정 디스플레이 및 SSCP를 이용한 이러한 미세절개 기술의 결합은 이질의 인간 암 시료에서의 명백하지 않을 암 또는 간질 세포의 특정 부차집단에서 유전적인 변형을 확인할 수 있다.
본 발명은 특정 수단, 재료 및 예에 관하여 전술되었지만, 당업계에서의 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확인할 수 있으며, 여러 변화 및 변형은 후술된 청구 범위에 나타낸 것처럼 본 발명의 정신과 범위에 벗어남 없이 여러 사용 및 특성을 적용할 수 있도록 이루어질 수 있다.
Claims (9)
- a) 슬라이드에 올려놓은, 복수의 세포 영역을 갖는 기관(organism)으로부터 유래되는 조직 시료를 제공하는 단계, 상기 세포는 결합조직으로부터 유래하는 점착력(adhesive force)을 갖고 있음;b) 현미경을 이용하여 상기 조직 시료의 세포에 대한 화상 장을 형성시키는 단계;c) 상기 세포들에 대한 화상 장(image field) 내에서 인접한 세포 영역과는 다른 세포 타입을 갖는 적어도 하나의 대상 세포 영역을 동정시키는(identifying) 단계;d) 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역의 표면적과 같거나 작은 접촉면적을 갖는, 선단이 점착 상태에 있는 탐침(adhesive-tipped probe)으로 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역을 접촉시키는 단계, 상기 탐침은 접착/추출제를 갖고 있음;e) 주변의 세포들로부터 대상 세포의 점착력을 단절시키기 위하여 상기 선단이 점착 상태에 있는 탐침을 상기 조직 시료로부터 수축하는 단계, 상기에서 세포들의 화상 장 내의 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역은 선단이 점착 상태에 있는 탐침의 접촉 면적에 부착되어 있음; 및f) 분자 수준에서 상기 적어도 하나의 세포 영역을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역이 동일한 세포 타입을 다수 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직 시료로부터 상기 적어도 하나의 대상 세포영역을 추출하는 단계가 자동화되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분석 단계가 자동화된 분석기에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 추출된 대상 세포 영역이 자동적으로 상기 자동화된 분석기로 이송되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출된 세포 영역이 효소, 항원, DNA 또는 RNA에 대하여 분석되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 화상이 표시 모니터에 표시되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직 시료가 화상 장을 형성하기에 앞서 염색되고, 상기 염색이 세포들의 화상 장으로부터 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역을 동정하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 조직 시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 대상 세포 영역이 자동 대조 동정법에 의하여 상기 세포들의 화상 장으로부터 동정되는 것을 특징으로 하는 조직시료로부터 세포 물질을 직접 추출하는 방법.
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Families Citing this family (72)
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| US6469779B2 (en) | 1997-02-07 | 2002-10-22 | Arcturus Engineering, Inc. | Laser capture microdissection method and apparatus |
| US5859699A (en) * | 1997-02-07 | 1999-01-12 | Arcturus Engineering, Inc. | Laser capture microdissection analysis vessel |
| US6495195B2 (en) | 1997-02-14 | 2002-12-17 | Arcturus Engineering, Inc. | Broadband absorbing film for laser capture microdissection |
| US6100051A (en) | 1997-06-27 | 2000-08-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method utilizing convex geometry for laser capture microdissection |
| US5985085A (en) * | 1997-10-01 | 1999-11-16 | Arcturus Engineering, Inc. | Method of manufacturing consumable for laser capture microdissection |
| US7075640B2 (en) * | 1997-10-01 | 2006-07-11 | Arcturus Bioscience, Inc. | Consumable for laser capture microdissection |
| SE9704186D0 (sv) * | 1997-11-14 | 1997-11-14 | Astra Ab | New composition of matter |
| WO1999028725A1 (en) * | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Ozo Diversified Automation, Inc. | Automated system for chromosome microdissection and method of using same |
| US6720191B1 (en) | 1998-02-03 | 2004-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mechanical handling systems for laser capture microdissection |
| DE19815400C2 (de) | 1998-04-06 | 2002-02-07 | Max Planck Gesellschaft | Vorrichtung zur Probenaufnahme aus polymeren Trägermaterialien |
| JP4387594B2 (ja) | 1998-07-30 | 2009-12-16 | アメリカ合衆国 | 短いパルス時間幅を用いる精密レーザー捕獲微小切出し |
| JP3582390B2 (ja) * | 1999-01-13 | 2004-10-27 | 松下電器産業株式会社 | 微細物体の自動探索装置 |
| US6969614B1 (en) * | 1999-02-16 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for the isolation and analysis of cellular protein content |
| US6528248B2 (en) | 1999-04-29 | 2003-03-04 | Arcturus Engineering, Inc. | Processing technology for LCM samples |
| US6690470B1 (en) | 1999-11-04 | 2004-02-10 | Arcturus Engineering, Inc. | Automated laser capture microdissection |
| US6929907B2 (en) * | 1999-12-31 | 2005-08-16 | North Carolina State University | Methods and compositions for determining the purity of chemically synthesized nucleic acids |
| WO2001061311A1 (en) | 2000-02-16 | 2001-08-23 | Arcturus Engineering, Inc. | Transfer film for laser microcapture |
| DE10015157A1 (de) | 2000-03-27 | 2001-10-18 | P A L M Gmbh | Verfahren zur Bearbeitung einer biologischen Masse und Steuersystem für eine Vorrichtung zur Bearbeitung einer biologischen Masse |
| WO2001079810A1 (fr) * | 2000-04-13 | 2001-10-25 | Seiko Instruments Inc. | Appareil a faisceaux d'ions focalises et procede de detachement d'un morceau d'echantillon |
| DE10018251C2 (de) * | 2000-04-13 | 2003-08-14 | Leica Microsystems | Laserschneid-Vorrichtung mit Mikroskop |
| WO2001081892A2 (en) | 2000-04-26 | 2001-11-01 | Arcturus Engineering, Inc. | Laser capture microdissection (lcm) extraction device and device carrier and method for post-lcm fluid processing |
| US6699721B1 (en) * | 2000-05-09 | 2004-03-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Surface coatings for hot-melt adhesive film |
| DE10102134A1 (de) * | 2001-01-18 | 2002-08-01 | Christoph Viebahn | Glasschneidegerät für Objektträger |
| US20030228639A1 (en) * | 2001-03-19 | 2003-12-11 | Wright George L | Prostate cancer markers |
| DE10119461C2 (de) * | 2001-04-17 | 2003-06-12 | Ufz Leipzighalle Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zum Heraustrennen von Analysematerial aus einem Holzbohrkern |
| US20020182647A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-12-05 | Emmert-Buck Michael R. | Histoscreen method |
| US7749388B2 (en) * | 2001-06-15 | 2010-07-06 | Life Technologies Corporation | Low volume filtration column devices and methods of filtering therewith |
| US7556733B2 (en) * | 2001-06-15 | 2009-07-07 | Mds Analytical Technologies (Us) Inc. | Low volume filtration column devices and methods of filtering therewith |
| US7229595B2 (en) * | 2001-06-15 | 2007-06-12 | Molecular Devices Corporation | Filtration column devices and methods of filtering therewith |
| US20040038240A1 (en) * | 2001-07-13 | 2004-02-26 | Akhouri Sinha | Method and materials for assessing cancer aggressiveness |
| DE10152404C5 (de) * | 2001-10-24 | 2017-06-08 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Laser-Mikrodissektionssystem |
| US8346483B2 (en) | 2002-09-13 | 2013-01-01 | Life Technologies Corporation | Interactive and automated tissue image analysis with global training database and variable-abstraction processing in cytological specimen classification and laser capture microdissection applications |
| US8722357B2 (en) | 2001-11-05 | 2014-05-13 | Life Technologies Corporation | Automated microdissection instrument |
| US10156501B2 (en) | 2001-11-05 | 2018-12-18 | Life Technologies Corporation | Automated microdissection instrument for determining a location of a laser beam projection on a worksurface area |
| US20060088830A1 (en) * | 2002-02-21 | 2006-04-27 | Eastern Virginia Medical School | Protein biomarkers that distinguish prostate cancer from non-malignant cells |
| DE10217858C1 (de) * | 2002-04-22 | 2003-10-02 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Trennung einer in einer Probe enthaltenen Zellgruppe in Einzelzellen |
| AT412239B (de) * | 2002-10-31 | 2004-11-25 | Oridis Biomed Forschungs Und E | Verfahren und vorrichtung zur manipulation mit proben |
| WO2004068104A2 (en) * | 2003-01-24 | 2004-08-12 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target activated microtransfer |
| US7695752B2 (en) * | 2003-01-24 | 2010-04-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target activated microtransfer |
| EP1676116B8 (de) * | 2003-10-21 | 2012-07-04 | Leica Microsystems CMS GmbH | Verfahren zur automatischen erzeugung von laser-schnittlinien in der laser-mikrodissektion |
| DE102004051508B4 (de) * | 2003-10-21 | 2006-09-21 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zur automatischen Erzeugung von Laser-Schnittlinien in der Laser-Mikrodissektion |
| US7132242B2 (en) * | 2003-11-10 | 2006-11-07 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and device for targeted delivery of materials to selected single cells |
| US8012693B2 (en) | 2003-12-16 | 2011-09-06 | 3M Innovative Properties Company | Analysis of chemically crosslinked cellular samples |
| DE102004005100A1 (de) * | 2004-02-02 | 2005-08-25 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Gmbh | Verfahren zur Herstellung Festphasen-gebundener Bioreagenzien |
| DE102004022484B4 (de) | 2004-05-07 | 2007-12-20 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Mikroskoptisch |
| DE102004023262B8 (de) | 2004-05-11 | 2013-01-17 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und Steuersystem |
| CA2580025A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-23 | Molecular Devices Corporation | Laser microdissection apparatus and method |
| CA2584989A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Sydney David Finkelstein | Molecular analysis of cellular fluid and liquid cytology specimens for clinical diagnosis, characterization, and integration with microscopic pathology evaluation |
| US20110177492A1 (en) * | 2005-06-16 | 2011-07-21 | 3M Innovative Properties Company | Method of classifying chemically crosslinked cellular samples using mass spectra |
| DE102005061561A1 (de) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Laser-Mikrodissektionsverfahren, Steuersystem für eine Laser-Mikrodissektionsvorrichtung und Trägervorrichtung |
| CN100528100C (zh) * | 2006-12-29 | 2009-08-19 | 山东省寄生虫病防治研究所 | 中国昆虫形态鉴别仪 |
| US8818018B2 (en) | 2009-01-24 | 2014-08-26 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | System and method for enhancing security printing |
| US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
| EP2668487A4 (en) | 2011-01-24 | 2017-09-27 | Nils B. Adey | Devices, systems, and methods for extracting a material from a material sample |
| WO2012178069A1 (en) | 2011-06-22 | 2012-12-27 | The Johns Hopkins University | System and device for characterizing cells |
| US20130130930A1 (en) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Bhairavi Parikh | Methods and devices for obtaining and analyzing cells |
| US9341628B2 (en) | 2012-11-30 | 2016-05-17 | Interpace Diagnostics Corporation | Methods for measuring carcinoembryonic antigen |
| US9429560B2 (en) * | 2013-09-06 | 2016-08-30 | IonOptix LLC | Cell grabber with unitary construction |
| WO2015199976A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Target activated microdissection |
| US11091810B2 (en) * | 2015-01-27 | 2021-08-17 | BioSpyder Technologies, Inc. | Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology |
| US9625355B2 (en) | 2014-12-01 | 2017-04-18 | General Electric Company | Extraction of materials from regions of interest in a sample |
| WO2016120433A1 (en) | 2015-01-31 | 2016-08-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Systems and methods for meso-dissection |
| JP6836994B2 (ja) * | 2015-01-31 | 2021-03-03 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | メソダイセクションのためのシステム及び方法 |
| CA3004504A1 (en) * | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Ventana Medical Systems, Inc. | Tissue homogenisation for representative diagnostics |
| JP7059295B2 (ja) | 2016-11-09 | 2022-04-25 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 自動化された組織ダイセクション機器、およびそれを用いる方法 |
| CN111089775B (zh) * | 2019-12-04 | 2020-12-29 | 南京航空航天大学 | 一种陶瓷基小复合材料垂直冷镶嵌装置及镶嵌方法 |
| US20240037736A1 (en) * | 2021-03-25 | 2024-02-01 | Nec Corporation | Inspection assistance device, inspection assistance method, and recording medium |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6285840A (ja) * | 1985-10-11 | 1987-04-20 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 走査型電子顕微鏡を用いた試料処理方法および装置 |
| JPH05127099A (ja) * | 1991-10-30 | 1993-05-25 | Shimadzu Corp | ゲル状ビーズの選別装置 |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1074885B (de) * | 1960-02-04 | Gewerkschaft Brigitta Hannover | Vorrichtung zum Auslesen von Mikrofossilien aus Sedimenten oder fein zer trummertem Gestein | |
| US2659981A (en) * | 1951-08-13 | 1953-11-24 | Jefferson R Beckham | Scribing gauge |
| US3989591A (en) * | 1973-01-15 | 1976-11-02 | Liotta Lance A | Test method for separating and/or isolating bacteria and tissue cells |
| SE371885B (ko) * | 1973-08-28 | 1974-12-02 | Lkb Produkter Ab | |
| DE2644281C2 (de) * | 1976-09-30 | 1979-02-01 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Verfahren und Vorrichtung zur Entnahme und Gewinnung von Probenmaterial, insbesondere für wissenschaftliche oder diagnostische Untersuchungen |
| US4485706A (en) * | 1980-10-27 | 1984-12-04 | Disharoon Dale R | Methods and apparatus for cutting a substrate |
| US4366245A (en) * | 1980-12-03 | 1982-12-28 | Maurice Lalonde | Method for the isolation of symbiotic microorganisms from host plants using an osmium tetraoxide fixative |
| US4500509A (en) * | 1981-03-11 | 1985-02-19 | Lawrence Kass | Metachromatic dye sorption and fluorescent light emmisive means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes |
| US4629687A (en) * | 1982-07-29 | 1986-12-16 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Positive selection sorting of cells |
| US4624915A (en) * | 1982-07-29 | 1986-11-25 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Positive selection sorting of cells |
| US4545831A (en) * | 1982-09-13 | 1985-10-08 | The Mount Sinai School Of Medicine | Method for transferring a thin tissue section |
| US4635791A (en) * | 1983-01-31 | 1987-01-13 | Bio-Innovations | Container package for staining biological specimens |
| DE3376359D1 (en) * | 1983-02-25 | 1988-05-26 | Stocker Winfried | Processes and devices for examinations on immobilised biological material |
| CH666850A5 (de) * | 1983-06-30 | 1988-08-31 | Inst Biokhim I Fiziol Mikroorg | Verfahren zur durchfuehrung von mikrooperationen an zellen und einrichtung zu dessen verwirklichung. |
| US4628026A (en) * | 1983-11-15 | 1986-12-09 | Dietlind Gardell | Method and apparatus for automated double fluorochromization analysis in lymphocytotoxicity testing |
| US4649109A (en) * | 1984-02-16 | 1987-03-10 | Brandeis University | Methods for isolating mutant microorganisms from parental populations |
| US4665021A (en) * | 1984-09-21 | 1987-05-12 | Schnaper H William | Diagnostic method of screening for immune deficiency in a nephrotic patient by determination of SIRS in the urine |
| US4767717A (en) * | 1985-05-02 | 1988-08-30 | Baisden C Robert | Method of detecting and quantitating cell malignancy in biological tissue |
| US4741043B1 (en) * | 1985-11-04 | 1994-08-09 | Cell Analysis Systems Inc | Method of and apparatus for image analyses of biological specimens |
| US5281517A (en) * | 1985-11-04 | 1994-01-25 | Cell Analysis Systems, Inc. | Methods for immunoploidy analysis |
| US5023172A (en) * | 1986-07-14 | 1991-06-11 | The Research Foundation Of State University Of New York | Predictive assay for tumor control |
| DE3718066A1 (de) * | 1987-05-29 | 1988-12-08 | Zeiss Carl Fa | Verfahren zur mikroinjektion in zellen bzw. zum absaugen aus einzelnen zellen oder ganzer zellen aus zellkulturen |
| US5188963A (en) * | 1989-11-17 | 1993-02-23 | Gene Tec Corporation | Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids |
| US4960224A (en) * | 1989-03-24 | 1990-10-02 | Thomas Boenisch | Closure and container for regent and slides |
| US5252487A (en) * | 1989-05-19 | 1993-10-12 | Cell Analysis Systems, Inc. | Method and apparatus for determining the amount of oncogene protein product in a cell sample |
| GB8915759D0 (en) * | 1989-07-10 | 1989-08-31 | Shandon Scient Ltd | Cell block preparation |
| US5264341A (en) * | 1989-08-30 | 1993-11-23 | Eli Lilly And Company | Selective cloning for high monoclonal antibody secreting hybridomas |
| JPH0648975B2 (ja) * | 1989-10-02 | 1994-06-29 | 俊郎 樋口 | 微小インジェクション装置及びそのインジェクション制御方法 |
| FR2659981B1 (fr) * | 1990-03-22 | 1992-07-24 | Vef Sa | Procede et dispositif d'analyse bacteriologique. |
| US5235522A (en) * | 1990-10-10 | 1993-08-10 | Cell Analysis Systems, Inc. | Method and apparatus for automated analysis of biological specimens |
| US5218645A (en) * | 1991-03-29 | 1993-06-08 | Cell Analysis Systems, Inc. | Method and apparatus for separating cell objects for analysis |
| US5428690A (en) * | 1991-09-23 | 1995-06-27 | Becton Dickinson And Company | Method and apparatus for automated assay of biological specimens |
-
1994
- 1994-03-01 US US08/203,780 patent/US5843644A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-01 ES ES95911965T patent/ES2138727T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 DE DE69510925T patent/DE69510925T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-01 EP EP95911965A patent/EP0748439B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 KR KR1019960704792A patent/KR100388941B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-01 MX MXPA96003822A patent/MXPA96003822A/es unknown
- 1995-03-01 AT AT95911965T patent/ATE182405T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-01 CN CN95191912A patent/CN1143413A/zh active Pending
- 1995-03-01 JP JP52296395A patent/JP3732510B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-01 WO PCT/US1995/002432 patent/WO1995023960A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-01 AU AU19337/95A patent/AU691263B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6285840A (ja) * | 1985-10-11 | 1987-04-20 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 走査型電子顕微鏡を用いた試料処理方法および装置 |
| JPH05127099A (ja) * | 1991-10-30 | 1993-05-25 | Shimadzu Corp | ゲル状ビーズの選別装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0748439A1 (en) | 1996-12-18 |
| EP0748439B1 (en) | 1999-07-21 |
| US5843644A (en) | 1998-12-01 |
| AU691263B2 (en) | 1998-05-14 |
| AU1933795A (en) | 1995-09-18 |
| JPH10500205A (ja) | 1998-01-06 |
| DE69510925T2 (de) | 2000-02-17 |
| WO1995023960A1 (en) | 1995-09-08 |
| ES2138727T3 (es) | 2000-01-16 |
| DE69510925D1 (de) | 1999-08-26 |
| MXPA96003822A (es) | 2004-08-17 |
| JP3732510B2 (ja) | 2006-01-05 |
| ATE182405T1 (de) | 1999-08-15 |
| CN1143413A (zh) | 1997-02-19 |
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