TW202018295A - 用於預分析基板處理的系統和方法 - Google Patents

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Abstract

在此發明中所提出的一些實施例有關自動組織解剖(ATD)系統。ATD系統係一站式，且潛在地，低成本的系統，用以使用非接觸及／或機械的方法從基板上之病理學家數位標記或筆標記來執行基板上的解剖，用於以(a)僅ROI或ROIs做為將要保存的區域；及(b)去除或分解不感興趣區域(RONI)中的核酸含量並將所有組織取樣從標準顯微鏡基板收集到特定容器內，來提取福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織取樣。

Description

用於預分析基板處理的系統和方法
本發明大致關於組織學及／或病理生物學的領域。更特別地，本發明關於預分析基板處理系統及相關方法，在一些實施例中，其可有用以分離及隔離例如，諸如組織學標本之生物基板的基板中之感興趣的區域(ROI)及不感興趣的區域(RONI)。
各種方法已被提議用以解決刮削程序的繁瑣性質，以供用於下游分析之組織學取樣的製備及／或處理之用。例如，已推薦真空噴砂技術；惟，該等技術僅可在工業設定中部署，且因此，需要昂貴的工具及儀器。而且，目前並沒有可與安裝在顯微鏡載玻片上之基板相容的真空噴砂技術。同樣地，諸如例如，具有二氧化矽粒子、二氧化矽塗層粒子、或聚合物塗層鐵磁珠粒之噴砂法的基於粒子之噴砂方法需要在下游分析步驟的實施之前從感興趣區域(ROI)來分離該等粒子。
使用剃刀刀片以直接從基板收集“S”(亦即，ROI)區域之目前的組織解剖過程係完全手動的。例如，用於基板提交的傳統工作流程包括完全手動過程，其中使用者使用標準現成標記筆以手動地轉移染色載玻片上之病理學家感興趣區域標記到未染色載玻片。然後，該使用者使用剃刀刀片或其等效物以刮去所標記之未染色基板上的感興趣區域並收集到容器內。
此所敘述之手動過程由於完全依賴操作者的手／眼睛協調而限制了操作者準確度，其影響到組織刮削法的一致性及準確性。此過程亦引入人體工學／安全問題，因為將被施加到玻璃表面的恆定力可隨著操作者而導致裂傷及人體工學問題(例如，腕隧道症候群)。
當前的數位病理學實施已改善了組織學／病理學工作流程的許多區域。然而，仍存在一些未滿足需求的重要區域。一個未滿足的需求在於無法使用商業數位病理學系統以數位地處理某些基板提交。大量的情況仍需要手動的玻璃工作流程處理。因此，需要有一種方式來轉換此過程以實現完整的數位工作流程。
在此發明中所提出的一些實施例有關自動組織解剖(ATD)系統。ATD系統係一站式，且潛在地，低成本的系統，用以使用非接觸及／或機械的方法從基板上之病理學家數位標記或筆標記來執行基板上的解剖，用於以(a)僅ROI或ROIs做為將要保存的區域；及(b)去除或分解不感興趣區域(RONI)中的核酸含量並將所有組織取樣從標準顯微鏡基板收集到特定容器內，來提取福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織取樣。
依據本發明之某些態樣，ATD係與數位病理學過程合併用以刮削基板上的ROI。而且，所揭示的係用於以可行的方式收集所需的“S”(亦即，ROI)區域或去除不需要的“X”區域之系統及方法。所敘述之該等系統及方法提供了低成本的靈活系統以數位化載玻片影像及簡化下游刮削過程。
在一些實施例中，該等系統能夠執行以下：(a)以合適的放大率捕獲染色及未染色的載玻片影像，(b)使筆標記數位化成為數位標記，(c)執行基於對象或其他的演算法以使基板上的標記座標與相關聯的基板匹配，(d)提取所標記之取樣ROI到容器內，(e)去除RONI中的取樣或分解RONI中的核酸含量並將所有取樣(例如，組織)收集到容器內，及(f)裂解該取樣及輸出裂解物。
此技術可係有用的，因為當前的手動過程可能具有某些缺點或限制，諸如：(a)較差品質，(b)操作者限制，(c)工作危害，(d)人體工學，及／或(e)安全性。例如，手動解剖方法完全依賴個別的操作者之手／眼睛協調，其可影響到結果的一致性及準確性。他們也可能需要專業的培訓計畫以實現一致的準確性。以施加到玻璃表面的恆定力執行手動解剖亦可隨著操作者而在時間週期內導致人體工學的問題；例如，諸如腕隧道症候群的手腕受傷。因此，在許多實驗室中，操作者亦必須限制他們執行手動解剖所花費的工作時數以便有助於防止受傷。就安全性而言，例如，亦存在來自損壞刀片之剃刀刀片受傷的風險，其可導致裂傷。儘管如此，在當前的實驗室過程中經常使用完全手動的方法，例如，其使用標準現成的標記筆以手工標記來自病理學家之感興趣區域，其中終端使用者可使用剃刀刀片或其等效物(亦即，手術刀)以刮削基板上的感興趣區域。
用於取樣解剖的自動化系統是可用的；惟，該等系統可係昂貴及／或低產量的。例如，AVENIO® MILLISECTTM 系統(Roche GmbH)係研磨機器，其執行基板上之感興趣區域的自動收集，且因此，避免隨著手動收集的上述問題。然而，該系統係昂貴的，操作緩慢的，且對於高容量實驗室可能需要許多的系統和操作者。因而，此系統並不適用於高通量的取樣分析。雷射捕獲解剖系統亦可從幾個製造商處獲得(例如，Leica LMD6-7系統)。在該等系統中，UV雷設被使用來切割(例如，剖析或劃分邊界) ROI以及IR雷射用於使黏合劑帽膨脹而從基板去除ROI(例如，改善標本從基板的釋放)；該等系統亦需要可被收集以供後續分析之用的訂製基板。
此揭示解決了可能造成困難度之取樣解剖的幾個區域，且實施例可包含不同位準的系統複雜性。本系統及方法提供了用以分離基板上之感興趣區域(ROI)的方式，其可提供較高的產量，且因此，更快的取樣解剖，同時避免了手動的分離，以及使用標準的載玻片裝備。
例如，本發明包括用以處理附加至基板上之取樣的系統，其包含：(a)夾持器單元，用以固定基板；(b)相機，定位於該夾持器單元附近；(c)處理元件，組構用以去除附加至該基板上之取樣的一部分；以及(d)計算裝置，通訊地連接到該夾持器單元。
依據態樣，該相機及該處理元件可包括：(a)影像捕獲引擎，組構用以使用該相機來獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像及具有第二附加取樣之第二基板的第二影像，(b)數位標記引擎，組構用以允許使用者產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓，(c)影像疊加引擎，組構用以映像將該標記影像疊加到該第二影像上，使得該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓旋轉及對齊，以及(d)取樣去除引擎，組構用以控制該夾持器單元及該處理元件的定位，使得僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分被去除。
從而，在此之一些系統實施例包含用以使描繪取樣(在此亦稱作“S”取樣)及載玻片上之其他取樣(在此表示“X”取樣)上的一或多個ROI間之介面的標記數位化的裝置。例如，該等介面包括演算法，其藉由虛擬跟蹤相同取樣上或已與該取樣手動對齊的平行取樣上之先前放置的手動標記，或藉由自動對齊平行之先前手動標記的取樣與目標取樣以及將標記從一取樣虛擬跟蹤到另一取樣，而允許在取樣上之虛擬標記的創建。該裝置亦包括用以執行該等動作所需的機械組件。
在此之一些系統實施例包含用以藉由經過機械過程以選擇性地去除或切除X取樣而不影響到ROI，從載玻片上之任一X取樣來分離一或多個ROI的裝置。該裝置包括例如，諸如脈波雷射的雷射、水刀、或能裂解或切除動物細胞之射頻、研磨、電流、超音波、微噴砂、微珠粒噴砂、粒子噴砂、噴砂、切除、或熱能的來源。例如，該裝置亦包括用以採用可特定地指導諸如雷射或水刀之機制到X取樣，同時避免ROI的該等方法及演算法所需的機械組件。
在此之一些系統實施例包含用以藉由選擇性地化學分解X取樣或其中的細胞或巨分子而從X取樣來分離一或多個ROI的裝置。例如，該裝置包括選擇性地指向X取樣而不是載玻片上的ROI之漂白劑、強酸、強鹼、或一或多種酶，以及用以採用可將化學品特定地導向X取樣，同時避免ROI的該等方法及演算法所需的機械組件。
在一些系統實施例中，該系統亦包含用於在基板上直通收集一或多個ROI的裝置。例如，直通可包括沒有標記，因為所有取樣都被收集。一旦X的取樣被斷開或去除，則當收集所有剩餘的取樣(例如，只有S區域)時，可利用該直通方法。例如，例示性的裝置包括粒子噴砂、諸如剃刀刀片的刀片，手術刀、刮匙、刮刀、打孔器、用以允許真空抽吸器來去除取樣的真空抽吸源，或用以為ROI取樣提供對抗表面或介質或溶液(例如，粒子微噴砂)的帶電表面或介質，或使用黏合劑介質以自載玻片提取ROI。該裝置亦包括用以自動控制上述元件之使用所需的其他機械組件。
在一些實施例中，該系統包括用以將ROI取樣放置到容器內的裝置。例如，例示性的裝置包括可自動控制從載玻片取出所去除之ROI取樣並將其放到諸如井孔結構、試管、或小玻璃瓶的容器內或容器上之過程的機械組件。
本發明之態樣描述用以處理附加至基板上之取樣的方法，包含：(a)獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像；(b)獲得具有第二附加取樣之第二基板的第二影像；(c)產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓；(d)使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊；以及(e)使用處理元件以僅去除該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分。
本發明之進一步態樣描述用以處理附加至基板上之取樣的系統，包含：(a)夾持器單元，用以固定該基板；(b)相機，定位於該夾持器單元附近；(c)處理元件，組構用以供應核酸變性劑以使附加至該基板上之該取樣的一部分上之核酸變性；以及(d)計算裝置，通訊地連接到該夾持器單元。
依據態樣，該相機及該處理元件可包括：(a)影像捕獲引擎，組構用以使用該相機來獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像及具有第二附加取樣之第二基板的第二影像，(b)數位標記引擎，組構用以允許使用者產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓，(c)影像疊加引擎，組構用以使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊，以及(d)核酸變性引擎，組構用以控制該夾持器單元及該處理元件的定位，使得僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的X或(RONI)部分中之核酸被變性，該核酸變性引擎包含用以執行化學分析的化學分析儀、質譜儀、及／或用以執行細胞分析的細胞分析儀。
額外的態樣描述用以處理附加至基板上之取樣的方法，包含：(a)獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像；(b)獲得具有第二附加取樣之第二基板的第二影像；(c)產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓；(d)使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊；以及(e)使用處理元件以使僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分中之核酸變性。
在另一態樣中，揭示用以處理例如，FFPE載玻片或固定組織之組織學取樣的系統、方法、及設備。該等系統、方法、及設備克服了現有粒子微噴砂器(PMB)及電腦數值控制(CNC)研磨技術的限制，並大大地增進了易用性和分析工作流程的靈敏度及／或特異性。尤其，本發明有關PMB及CNC研磨技術中的變化，其允許來自組織學取樣之不感興趣區域(RONI)的有效率去除或允許從組織學取樣收集感興趣區域(ROI)，且同時使來自該ROI之分析物(例如，核酸、蛋白質、及其他巨分子)的損失最小化。所描述之該等方法很簡單且可以與下游分析程序無縫地整合。
依據本發明，組合噴砂技術係使用以處理安裝在例如，載玻片之基板上的生物標本。噴砂材料(亦即，粒子)及加壓空氣的組合被強制饋入至系統內且被導向病患組織ROI。PMB係以使得所噴砂之病患組織包含在該PMB的壁內之方式建構。其次，真空抽吸器係接著使用以自該區域取出所噴砂之組織並將其累積到容器內。過濾器可被使用以分隔容器，用以允許真空建立並停止部件到達真空泵。此方法皆可被使用到廢棄區域(〝X〞)或感興趣區域(〝S〞)之噴砂，或所有感興趣的內容物。噴砂介質可由不同的材料所製成，包括例如，氧化鋁；二氧化矽；金屬基粒子；磁性或鐵磁性粒子；鹽；離子粒子；冷凍乾燥試劑粒子。
在與需要將粒子和最終感興趣目標分離的現有PMB技術相較之下(例如，在下游處理之前)，本發明之系統及方法並不需要將粒子和所處理的取樣分離，因為該等粒子本身被使用於下游過程中。
本方法亦優於現有方法，因為它允許將多重處理步驟整合成為單一步驟，其有助於減少交叉污染且亦允許以高度流線的、高效率的、及廉價的方式從組織標本收集諸如核酸的分析物。藉由降低操作者的考慮，本發明之系統及方法有助於減少變異性及／或增加諸如免疫組織化學、核酸酶保護測定、等等之組織學測定的可重現性。
本技術的另一優點在於本發明之系統及／或方法可被模組化地應用到現有的分析工作流程，例如，諸如顯微鏡、雜合測定、排序、色層分析法、光譜測定法、ELISA、等等的下游分析程序。此意味著本發明之系統及／或方法可在各種預處理及後處理步驟處被無縫地整合。若需要時，該等系統及方法亦可做為支架被應用於各種下游分析步驟中。
本方法可被容易地修正或修改以利用各種切除粒子，例如，可根據目標組織構造及／或組成而選擇不同尺寸、形狀、或材料之粒子。例如，取決於感興趣的目標，可使用諸如疏水性、極性、非極性、離子交換能力之粒子、親合特定粒子、電介質粒子、冷凍乾燥粒子、等等之替代類型的材料。而且，因為在此所採用之試劑及系統係相對便宜的，所以可容易地將本技術整合於分析工作流程中，以顯著地增進性能而不過度提高測定的成本。
因此，本發明部分地涉及以下非限制性的實施例：
在一些實施例中，本發明有關用於生物測定之生物取樣的處理方法，包含(a)在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；以及(b)從該生物取樣去除該接觸介質。較佳地，該生物取樣被處理用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該生物取樣包含穿刺活檢標本、針活檢標本、新鮮組織、組織培養、冷凍組織標本、中性福馬林處理組織、器官、胞器、福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織、蠟固定包埋組織、乙醇固定石蠟包埋(EFPE)組織、蘇木精和伊紅(H&E)染色組織、或戊二醛固定組織。較佳地，該生物取樣包含FFPE或EFPE組織。較佳地，該生物取樣包含來自腫瘤組織、退化性組織、發炎組織(例如，來自患有諸如類風溼性關節炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩病(Crohn's disease)、等等的炎性疾病之病患的組織)的細胞。
本發明有關取樣研磨裝置，其包括第一及第二組件。該第一組件具有在兩端上的開口。該第二組件係固定到該第一組件的一端且具有取樣收集開口，該取樣收集開口背離該第二組件被固定到該第一組件的位置。該取樣收集開口具有沿著該取樣收集開口的周邊突出的一或多個取樣刮削元件。真空通道延伸穿過該第一及第二組件，用以連接該取樣收集開口與該第一組件的另一端上之真空連接開口。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，包含使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)、不感興趣區域(RONI)、或所有區域與該接觸介質接觸；較佳地，使感興趣區域(ROI)與該接觸介質接觸。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該生物取樣包含選自基因組DNA(gDNA)、甲基化DNA、特定甲基化DNA、信使RNA (mRNA)、碎片DNA、碎片RNA、碎片mRNA、線粒體DNA (mtDNA)、葉綠體DNA(ctDNA)、病毒RNA或病毒DNA、微RNA、核醣體RNA、原位PCR產物、多腺苷酸化(polyA) mRNA、RNA／DNA雜合體、脂質、醣、蛋白質、醣蛋白、脂蛋白、磷蛋白、蛋白質的特定磷酸化或乙醯化變種、或病毒外殼蛋白之診斷感興趣的至少一分析物；較佳地，選自mRNA、gDNA、病毒DNA、或病毒RNA的核酸。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中在該噴砂介質中的該顆粒物質包含氧化鋁；二氧化矽；金屬基粒子；磁性或鐵磁性粒子或其組合。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該顆粒物質能結合到該生物取樣中的分析物或非分析物；較佳地，該顆粒物質能經由選自離子相互作用、極性-非極性相互作用、疏水相互作用、凡得瓦相互作用、化學耦合、電介質或兩性離子相互作用或其組合的相互作用來結合到該分析物。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該接觸介質包含選自加壓之氦、氬、氙、氮、二氧化碳、或其組合的加壓空氣。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該生物取樣被安裝在基板上，例如，該基板係選自玻璃、矽、多聚賴氨酸塗層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環烯烴共聚物(COCs)、環烯烴聚合物(COPs)、聚丙烯、聚乙烯、紙及／或聚碳酸酯。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該生物取樣包含核酸分析物以及該接觸介質包含包括二氧化矽的顆粒物質。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，進一步包含微解剖，例如，雷射微解剖。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該接觸介質係經由真空抽吸、壓力差動或梯度、重力、輸送介質(例如，液體或氣溶膠或氣體)、或選自磁場或電場的轉移介質，而從該生物取樣被去除。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，包含(a)使該生物取樣中之不感興趣區域(RONI)與該接觸介質選擇性接觸，其中該選擇性接觸較佳地包含使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)保持不變；(b)使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)與該接觸介質選擇性接觸，其中該選擇性接觸較佳地包含使該生物取樣中之不感興趣區域(RONI)保持不變；或(c)使該生物取樣中之ROI及RONI二者與該接觸介質接觸。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，包含收集該接觸介質中之該顆粒物質；(c)選擇地製備該顆粒物質以供分析之用；以及(d)進一步選擇地分析該顆粒物質。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該製備該顆粒物質以供分析之用包含以緩衝劑(例如，裂解緩衝劑)處理該顆粒物質以及洗滌該顆粒物質以去除非分析物。較佳地，在此實施例中，顆粒物質的該分析包含聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR(qPCR)、逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、基於核酸序列擴增(NASBA)、環介導等溫擴增(LAMP)、滾環擴增(RCA)、免疫測定、免疫PCR(iPCR)、酶活性測定、染色、成像、全基因組擴增(WGA)、原位PCR、原位WGA、聚合酶群落形成、排序、單分子排序、奈米孔分析、奈米孔排序、單分子成像、DNA球形成、電泳、微機電系統(MEMS)電泳、質譜術、色層分析法(例如，HPLC)、鄰近連接測定、電化學偵測、電漿共振(SPR)、雜合測定(例如，諸如螢光原位雜合(FISH)的原位雜合測定)FRET、細胞分類(例如，FACS)、電化學發光ELISA、及化學發光ELISA。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該方法進一步包含使該接觸介質與富集介質混合。較佳地，在此實施例中，該富集介質包含特定結合到該生物取樣中之感興趣分析物的物質，例如，特定結合到感興趣之蛋白抗原的抗體或特定雜合到感興趣之核酸的核酸。
本發明有關依據上述或以下實施例之用於生物測定之生物取樣的處理方法，例如，用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析，其中該生物取樣包含二維組織(例如，組織剖面或切片)或三維組織(例如，組織塊)，其包含感興趣區域(ROI)及／或不感興趣區域(RONI)之明確界定的空間位置；較佳地，感興趣區域(ROI)及不感興趣區域(RONI)二者。
在一些實施例中，本發明有關用於生物取樣中之分析物的測定方法，包含藉由以下來處理該生物取樣：(a)在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；以及(b)從該生物取樣去除該接觸介質以獲得處理的生物取樣；並測定該處理的生物取樣或該去除的接觸介質中之該分析物。
在一些實施例中，本發明有關生物分析系統，包含(a)第一組件，用以在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣或其中之區域與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；(b)第二組件，用以從該生物取樣去除該接觸介質；以及(c)選擇地，第三組件，用以分析該接觸介質或該處理的生物取樣或該接觸介質及該處理的生物取樣二者中之該組分。
本發明有關依據上述或以下實施例之生物分析系統，其中該第一組件包含加壓粒子微噴砂器(PMB)，該加壓粒子微噴砂器(PMB)包含該接觸介質。
本發明有關依據上述或以下實施例之生物分析系統，其中該第二組件包含真空抽吸器、壓力差動或梯度、用以輸送該顆粒物質的介質(例如，液體或氣溶膠)、或選自磁場或電場的轉移介質。
本發明有關依據上述或以下實施例之生物分析系統，其中該選擇的第三組件包含選自聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR(qPCR)、逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、基於核酸序列擴增(NASBA)、環介導等溫擴增(LAMP)、滾環擴增(RCA)、免疫測定、免疫PCR(iPCR)、酶活性測定、染色、成像、全基因組擴增(WGA)、原位PCR、原位WGA、聚合酶群落形成、排序、單分子排序、奈米孔分析、奈米孔排序、單分子成像、DNA球形成、電泳、微機電系統(MEMS)電泳、質譜術、色層分析法(例如，HPLC)、鄰近連接測定、電化學偵測、電漿共振(SPR)、雜合測定(例如，諸如螢光原位雜合(FISH)的原位雜合測定)FRET、細胞分類(例如，FACS)、電化學發光ELISA、及化學發光ELISA的儀器。
在此發明中所提出的一些實施例有關自動組織解剖(ATD)系統。ATD系統係一站式，且潛在地，低成本的系統，用以使用非接觸及／或機械的方法從基板上之病理學家數位標記或筆標記來執行基板上的解剖，用於以(a)僅ROI或ROIs做為將要保存的區域；及(b)去除或分解不感興趣區域(RONI)中的DNA並將所有組織取樣從標準顯微鏡基板收集到特定容器內，來提取福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織取樣。
定義
本文所使用的一些術語係如本節中所述地定義。其他之術語則在本發明中的其他地方被定義或例示。除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學的術語具有與熟習於本發明所屬技藝中之一般人士所通常瞭解之意義相同的意義。
在此申請中，“或”的使用意味著“及／或”，除非另外聲明。在多項依附的申請專利範圍之上下文中，“或”的使用僅在替代方案中涉及多於一個的在前所述之獨立項或依附項的申請專利範圍。
“大約”之單詞意味著該值之正或負10%的範圍，例如，“大約5”意指4.5至5.5，“大約100”意指90至100，等等，除非本發明之上下文另外指出，或者係與該闡釋不一致的。例如，在諸如“大約49，大約50，大約55”之數值的列表中，“大約50”意味著延伸至小於前一個與後一個值之間的間隔之一半，例如，大於49.5到小於52.5的範圍。此外，考慮到本文所提供之用語“大約”的定義，應可理解到片語“小於約”的值或“大於約”的值。
在本發明中提供一範圍之值的情況下，所意圖的是，在該範圍的上限與下限間之各中介值以及在該聲明的範圍中之任何其他所聲明的或中介的值係包含在本發明內。例如，若聲明1微米(μm)至8微米的範圍時，則亦打算揭示2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、及7微米。
如本文所使用之“複數個”的用語可係2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個。
如本文所使用之“偵測”的術語意指藉由測量取樣中之一或多個參數來決定與取樣相關聯的一值或一組值之過程，且可進一步包含將測試取樣與參考取樣進行比較。依據本發明，腫瘤的偵測包括識別、測定、測量、及／或量化一或多個標記。
如本文所使用之“可能性”的術語通常意指機率、相對機率、存在或不存在、或程度。
如本文所使用之“包含”(或其變體)、“含有”(或其變體)、“具有”(或其變體)、或“包括”(或其變體)的用語並未意圖為限制的，係包含性或無限度的且不排除額外之未引用的添加物、組件、整數、元件、或方法步驟。例如，包含特徵之列表的過程、方法、系統、組成、套件、或設備無需一定要僅受限於該等特徵，而是可包括未明確列表的或為該過程、方法、系統、組成、套件、或設備所固有的其他特徵。
如本文所使用之“取樣”的術語意指獲自或衍生自感興趣受試者的組成，其包含將根據例如實體、生化、化學、及／或生理的特徵而被特徵化及／或被識別之細胞及／或巨分子實體。較佳地，該取樣係“生物取樣”，其意味著來自於生命實體的取樣，例如，細胞、組織、器官、及類似物。在一些實施例中，組織取樣的來源可係血液或任何血液成分；體液；如來自新鮮、冷凍、及／或保存之器官或組織取樣或活檢或抽吸的固體組織；以及來自受試者的姙娠或發育中之任何時間或血漿的細胞。取樣包含，但未受限於原代或培養的細胞或細胞系、細胞上清液、細胞裂解液、血小板、血清、血漿、液體(例如，淋巴液、羊水、乳汁、全血、尿液、CSF、唾液、痰液、淚液、汗液、黏液、腫瘤裂解液、及細胞培養基)、均質組織、腫瘤組織、及細胞提取物。取樣進一步包含已被操縱的生物取樣，例如，經由以試劑處理，溶解或富集諸如蛋白質或核酸之某些組分，或包埋於半固體或固體基質中以供切片目的之用，例如，在組織學取樣中之薄片的組織或細胞。取樣可包含環境組分，諸如例如，水、土壤、泥漿、空氣、樹脂、礦物質、等等。較佳地，生物取樣包含獲自受試者(例如，人或其他哺乳動物的受試者)之DNA(例如，gDNA、mtDNA)、RNA(例如，mRNA、tRNA)、蛋白質、或其組合。
如本文所使用的“細胞”之術語係與“生物細胞”之術語可互換地使用。生物細胞的非限制性實例包括真核細胞、植物細胞、動物細胞、諸如哺乳動物細胞、爬行動物細胞、禽細胞、魚細胞、或類似物、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞、或類似物、自諸如肌肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝、肺臟、神經組織、及類似物之組織解離的細胞、免疫細胞、諸如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、及類似物、胚胎(例如，受精卵)、卵子、精子細胞、雜合瘤、培養細胞、來自細胞系的細胞、癌細胞、感染細胞、轉染及／或轉化細胞、報告細胞、及類似物。例如，哺乳動物細胞可來自人、小老鼠、大鼠、馬、山羊、綿羊、牛、靈長類動物、或其類似者。
如本文所使用之“腫瘤”的術語包括，在與正常或野生型細胞相較之下，可能在遺傳、細胞、或生理位準上經歷轉化的任何細胞或組織。該術語通常表示腫瘤生長，其可係良性的(例如，不會形成轉移並破壞鄰近的正常組織之腫瘤)或惡性的／癌症(例如，會侵入周圍的組織，並經常能夠產生轉移，在嘗試移除之後可能復發，且除非充分地治療，否則可能導致宿主的死亡之腫瘤)。請參閱Steadman's Medical Dictionary, 28th Ed Williams & Wikins, Baltimore, MD (2005)。
“癌症”之術語意味著異常細胞生長，特別地，在本質上係惡性的癌症及上皮癌、肉瘤、腺瘤、淋巴瘤、白血病、實體及淋巴癌、等等。不同類型之癌症的實例包括，但未受限於肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、卵巢癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮癌、睪丸癌、神經母細胞瘤、頭部、頸部、子宮頸及陰道的鱗狀細胞瘤、多發性骨髓瘤、軟組織及骨性肉瘤、直腸癌、肝癌、腎癌(例如，RCC)、胸膜癌、子宮頸癌、肛門癌、膽管癌、胃腸道類癌瘤、食道癌、膽囊癌、小腸癌、中樞神經系統的癌症、皮膚癌、絨毛膜癌、骨性肉瘤、纖維肉瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、等等。
如在“正常細胞”的上下文中所使用之“正常”的術語意指的是，未轉化之表型的細胞或顯現出將被檢查之組織類型的未轉化細胞之型態的細胞(例如，PMBC)。在一些實施例中，如本文所使用之“正常取樣”包括非腫瘤取樣，例如，唾液取樣、皮膚取樣、毛髮取樣、或其類似物。應注意的是，本發明之方法可無需使用正常取樣而實施。
如本文所使用之“異常”的術語通常意指以某種程度偏離正常(例如，野生型)之生物系統的狀態。異常狀態可在生理或分子位準上發生。代表性之實例包括例如，生理狀態(疾病、病理學)或遺傳畸變(突變、單核苷酸變異、拷貝數變異、基因融合、插入缺失、等等)。疾病狀態可係癌或前癌。異常的生物狀態可與異常之程度(例如，指示遠離正常狀態之距離的定量測量)相關聯。
如本文所使用之“標記”的術語意味著特徵，其可被客觀地測量做為正常生物過程、致病過程、或對例如，以抗癌劑治療的治療干預之藥理學反應的指標。標記之代表性的類型包括例如，在結構(例如，序列)中的分子改變或標記的數量，包含例如，基因突變、基因重複、氨基酸取代、添加、或缺失、或者複數個差異，諸如在DNA中的體細胞改變、拷貝數變異、串聯重複、易位、或其組合。
如本文所使用之“遺傳標記”的術語意味著多核苷酸序列，其具有在基因組上的特定位置或對應於基因組中的特定位置(例如，與基因組位置之序列互補的轉錄物)。因此，亦可使用“遺傳標記”以意指例如，由基因組序列所編碼的cDNA及／或mRNA，以及意指該基因組序列本身。遺傳標記可包括兩個或更多個等位基因或變體。遺傳標記包括核酸序列，其對基因產物(例如，蛋白質)進行或不進行編碼。特別地，該等遺傳標記包括單核苷酸多態性／變異或拷貝數變異或其組合。較佳地，該遺傳標記包括，在與參考取樣相較之下，在DNA中的體細胞變異，例如，sSNV或sCNV、插入缺失、SVs、或其組合。
如本文所使用之“蛋白質標記”或“蛋白質組標記”的術語意味著多肽或其片段的序列，例如，多肽的生物活性片段，其對應於轉錄物(例如，由轉錄物所編碼)，進而，其可對應於基因組序列(例如，由DNA序列所轉錄的轉錄物)。
本文之“福馬林固定蠟包埋”或“福馬林固定石蠟包埋”或“FFPE”組織取樣被廣泛闡釋為意指已以福馬林或其等效物質固定並以諸如石蠟之蠟或其等效物質包埋的取樣。本文之FFPE組織可以來自任何人類、動物、或植物來源。
本文之“載玻片”可係能夠保持FFPE組織用於分析之任何類型的表面，並可由任何合適的材料所製成。
本文之“感興趣區域”或“ROI”意指使用者可能希望分析的基板上之取樣的一部分，諸如評估基因之序列、結構、或表達位準中的改變。在基板上的取樣可包含所有ROI、沒有ROI、一個ROI、或超過一個ROI。ROI亦在本文被稱作“S”取樣。在基板上之RONI取樣在本文被稱作“X”取樣。
如本文所使用之“顆粒”物質的術語意指由諸如實質球狀的粒子或不規則形狀的粒子之粒子所組成的物質。通常，該等顆粒物質具有大約10奈米(nm)至大約100微米(μm)的直徑；較佳地，從大約50到大約400奈米；特別地，從大約100到大約200奈米。
如本文所使用之“測定”的術語係用於物質之數量、存在、或不存在的測試或試驗。
如本文所使用之“加壓”空氣的術語意指已以例如，大於大氣壓力之壓力壓縮的空氣。在該加壓中的“空氣”組分通常係選自氦、氬、氙、氮、二氧化碳、或其混合氣的惰性氣體。如在加壓系統中典型地，該“空氣”組分可以是液體、半液體、或氣體的形式。
如本文所使用之“接觸”意指的是，將包含試劑(例如，接觸介質)的組成導入至試管、燒瓶、組織培養物、芯片、陣列、板、微孔板、毛細管、等等中之包含目標的取樣內，且在足以允許該目標與該試劑之相互作用的溫度及時間中使孵育。
就體內診斷或治療的情況而言，“接觸”意指的是，將活性成分(例如，化合物或藥物)導入至受試者內，並允許該活性成分與體內之例如，上皮組織之受試者的目標組織接觸。
如本文所使用之“受試者”的術語意指任何動物，較佳地，哺乳動物，例如，人類、獸醫的或農場動物、家畜動物或寵物，包括一般使用於臨床研究的動物。特別地，該受試者係人類受試者，例如，被診斷患有諸如癌症之疾病的人類病患。受試者可能具有，潛在地具有，或被懷疑具有與疾病相關聯之一或多個特徵、與該疾病相關聯之症狀、相對於該疾病之無症狀、或未確診的該疾病。特別地，該受試者可能具有癌症，該受試者可能顯示與癌症相關聯的症狀，該受試者可能沒有與癌症相關聯的症狀，或該受試者可能未被診斷出患有癌症。
如本文所使用的“噪聲”之術語就其最廣泛的意義而言，意指任何不受歡迎的擾動(例如，與真實事件並無直接關聯的信號)，儘管如此，其仍可被處理或接收做為真實事件。噪聲係從人造及自然來源引入至系統內之不需要或干擾能量的總和。噪聲可使信號失真，以致使該信號所承載的資訊變差或變得不可靠。該術語與“信號”係對比的，信號係傳達關於某些現象之行為或屬性資訊的函數，例如，標記(SNV、CNV、插入缺失、SV)與諸如癌症之疾病間的機率性關聯。
如本文所使用的“估計”之術語在標記位準的上下文中係以廣泛的意義被使用。因此，“估計”之術語可意指實際值(例如，每mbp DNA 1個變異)、值的範圍、統計值(例如，平均的、中值的、等等)、或其他的估計手段(例如，機率性地)。
如本文所使用的“實質地”之術語意指足以達到預期的目的。因此，“實質地”之術語允許從絕對或完美的狀態、尺寸、測量、結果、或類似物之較少的、不顯著的變化，諸如將由本領域之人士或普通技術人員所期望的，但不會影響到整體性能。當相對於可被表示為數值之數值或參數或特徵而使用時，“實質地”意味著在10%以內。
如本文所使用的“組分”之術語意指系統的組成部分。例如，在細胞系統中，組分可包括多肽(例如，小肽以及大蛋白質)、核酸(例如，DNA或RNA)、碳水化合物(例如，小糖以及諸如澱粉的巨分子)、脂質、以及諸如維生素及膽固醇的其他組成部分。
如本文所使用的“轉移”之術語就其最廣泛的意義而言，意指系統的組分經由諸如結合、黏合、吸收、等等之過程而從其自然環境(例如，在線粒體DNA的情況中之線粒體)移動到非自然環境(例如，二氧化矽粒子的表面)。該術語包括諸如該組分與該非自然系統之間的共價或非共價相互作用的過程。
如本文所使用的“共價”相互作用之術語涉及鍵合的原子間之電子的共享。相較之下，“非共價”相互作用可包括例如，離子相互作用、靜電相互作用、氫鍵相互作用、生理化學相互作用、凡得瓦(van der Waal)力、路易斯酸／路易斯鹼相互作用、或其組合。
如本文所使用的“分析物”之術語通常意指使用本文所揭示之方法或系統來偵測的目標分子。該分析物可係DNA分析物、RNA分析物、核酸分析物、巨分子、或小分子，如在本項技藝中所使用之該等術語。特別地，巨分子可包括例如，多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂質、或該等之一種或多種的組合。一般而言，巨分子的分子量係至少約300道爾頓(Dalton)且可以是數百萬道爾頓。小分子係具有分子量高達大約300道爾頓的有機化合物。在某些情況中，該分析物係核酸分析物。
如本文所使用之“探針”係物質，例如，分子，其可辨識特定目標或由特定目標所特別地辨識。潛在的探針／目標或目標／探針結合配偶體的類型包括受體／配體；配體／抗配體；核酸(多核苷酸)相互作用，包括DNA／DNA、DNA／RNA、PNA(肽核酸)／核酸；具有基板、小分子、或效應分子的酶、其他催化劑、或其他物質；等等。由本發明所考慮之探針的實例包括，但未受限於肽、酶(諸如蛋白酶或激酶)、酶基板、輔因子、藥物、凝集素、糖、核酸(包括寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、或修飾或取代的核酸)、寡糖、蛋白質、酶、多克隆及單克隆抗體、單鏈抗體、或其片段。探針聚合物可係線性的或環狀的。探針可借助於差異活性、差異結合，或透過結構標記的識別來區分不同的目標。本發明之探針較佳地係核酸分子，尤其較佳地係DNA。在某些情況中，“探針”可作用為“目標”且“目標”可作用為“探針”，例如，互補DNA(cDNA)可做為與目標基因序列之一部分雜合的探針；惟，cDNA本身對應於該目標序列，因為它與該基因序列的mRNA產物相匹配。
如本文所使用的“分析”之術語以及“偵測”之用語可意指關於分析物之感興趣參數的定性或定量決定，例如，分析物的量、位準、濃度、或活性(絕對的和相對的)。
如本文所使用的“診斷”之術語意指可決定受試者是否可能患有既定的疾病或病情的方法。本項技藝之技術人士通常根據一或多個診斷指標來進行診斷，例如，標記、存在、不存在、量、或其量的改變指示疾病或病情的存在、嚴重性、或不存在。其他的診斷指標可包括患者病史；身體症狀，例如，不明原因的體重減輕、發燒、疲勞、疼痛、或皮膚異常；表型；基因型；或環境或遺傳因素。本項技藝之技術人士將瞭解的是，“診斷”之術語意味著某一病程或結果將發生的機率增大；也就是說，當與並未表現出特徵的個體相較時，病程或結果會在表現出例如，診斷指標的存在或位準之既定特徵的病患中更可能發生。本發明的診斷方法可被獨立地或與其他診斷方法組合地使用，用以決定病程或結果是否會在表現出既定特徵的病患中更可能發生。
如本文所使用的“核酸”之術語通常意指DNA或RNA，無論是擴增的產物、合成創造的產物、RNA之逆轉錄的產物、或天然存在的產物。通常，核酸係單鏈或雙鏈分子且係由天然存在的核苷酸所組成的。雙鏈核酸分子可具有3'或5'突出端，且因此，不需要或假設在其整個長度上為完全雙鏈的。再者，“核酸”之術語可由非天然存在的核苷酸及／或對天然存在之核苷酸的修飾所組成。實例係在此列出，但不受限於：用以分別允許連接或預防外切核酸酶降解／聚合酶延伸之5'或3'核苷酸的磷酸化；用於共價及近共價連接的氨基、硫醇、炔烴、或生物素基修飾；螢光團及猝滅劑；用以預防降解之核苷酸間的硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、及磷酸酯鏈連接；甲基化；以及修飾的鹼基。
當使用於本文時之“多肽”的術語意指肽、蛋白質、或多肽，其係可互換使用的且其包括既定長度的氨基酸鏈，其中氨基酸殘基係由共價肽鍵所連接。“多肽”的術語亦意指，並且不排除多肽的修飾。修飾包括糖基化、乙醯化、醯化、磷酸化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、配方、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、荳蔻醯化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、磷酸鹽化、諸如精氨酸化之氨基酸的轉移-RNA介導添加到蛋白質、以及泛蛋白質化。
如本文所使用的“隔離的”或“提取的”之術語在分子的情況中意指實質不含雜質的分子。當分子(諸如DNA或RNA)從取樣中之其他組分純化出來時，它已被“隔離”或“提取”。純化意指將目標與亦存在於取樣中之一或多個外來的組分分離。與未純化或未提取的取樣相較之下，從混合的標本或取樣所隔離、提取、或純化出的組分通常被純化或富集至少50%、至少60%、至少75%、至少90%、或至少98%或甚至至少99%。
“合成的”之術語意指已使用本項技藝瞭解的技術所化學合成的分子，例如，使用亞磷醯胺化學或合成化學。
“雜交”或“雜合”之術語在核酸的上下文中係廣泛地包括雙鏈體以及能夠形成該等雙鏈體的分子。在此情況中，鹼基配對超過多個鹼基的單鏈核酸被稱作“雜合”。雜合通常係在生理或生物的條件下決定(例如，細胞內：pH 7.2，140mM鉀離子；細胞外：pH 7.4，145mM鈉離子)。
如本文所使用的“類似物”之術語包括，但未受限於例如，具有在其中合成引入之諸如DNA序列內的核糖核酸殘基之殘基或連接基的寡核苷酸、諸如甘油的分支連接劑、或氨烷基連接基。“加合物”包括例如，O6-烷基-dG以及O6-Me-dG。同樣地，在一實施例中之“綴合物”的術語意指共價或非共價地結合到一或多種多核苷酸的目標識別劑。在另一實施例中之“綴合物”的術語意指與一或多個螢光染料分子共價或非共價之線性、分支、或樹枝狀的多核苷酸。
如本文所使用之“目標”意指的是，希望決定其存在、活性、及／或量並且對既定探針具有親和力的物質。目標可係人造的或天然存在的物質。此外，它們可在其未改變的狀態中使用或做為與其他物種在一起的聚集物使用。目標可直接地或經由特定的結合物質而共價或非共價地連接到結合成員。可在本發明中使用之目標的實例包括，但未受限於核酸或多核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、ESTs、cDNA、衍生自RNA或DNA的PCR擴增產物、以及其突變、變體、或修飾)；蛋白質(包括酶，諸如負責切割神經傳遞質、蛋白酶、激酶、等等的該等者)；酶基板；肽；輔因子；凝集素；糖；多醣；細胞(其可包括細胞表面抗原)；細胞膜；細胞器；等等，以及可以以複合的、共價鍵合交聯的、等等的形式存在之其他該等分子或其他物質。目標亦可被稱作反探針。
其中探針與目標序列結合的該結合可係“特定的”或“選擇性的”。一般而言，若探針具有一個且僅一個結合伴侶(例如，目標)時，則它具有“特定性”的屬性。在實用性中，絕大多數的探針都是“選擇性的”而不是“特定的”，因為大多數的探針將與許多目標結合，特別是在高濃度時。因此，該等術語可互換地使用。結合的特定性及選擇性可使用常規方法來決定。例如，其中目標是特定的mRNA之探針可係例如，寡核苷酸，其在選定的雜合條件下與該目標而不與干擾RNA或DNA特定地結合。熟習於本項技藝之人士可使用本領域所認可的方法來實驗性地決定將與該目標最佳地雜合，而以最低限度與非特定的干擾DNA或RNA雜合之寡核苷酸的特徵(例如，請參閱上文)。通常，用以區分存在於大量過多的非目標RNA背景中之目標mRNA的寡核苷酸探針之長度可在長度範圍上從大約8個到大約50個核苷酸，較佳地，大約18個、20個、22個、或25個核苷酸。在其中並沒有大的競爭目標之背景的生化測定中所使用的寡核苷酸探針可以比8個核苷酸更短。使用本項技藝所認可的程序(例如，電腦程式BLAST)，可選定寡核苷酸探針的序列以致使它們與已知遺傳學資料庫中之潛在的干擾序列相互不相關且不相似。將允許寡核苷酸探針與RNA目標之特定雜合的雜合條件之選擇可使用本項技藝所認可的程序來常規地決定。
如本文所使用之“引物”的術語意指諸如包含九個或更多個核苷酸之DNA寡核苷酸的短核酸分子，在一些實例中，其係用以引發較長核酸序列的合成。較長的引物可係在長度上大約10、12、15、20、25、30、或50個核苷酸、或更多個。引物亦可被使用於偵測中。
本文之從基板“機械地去除或切除”某些取樣意味著，藉由機械手段從基板分離該取樣或蒸發或以其他方式分解該取樣，以致使其不再存在於該基板上。
本文之化學地“分解”巨分子意指變性或分解諸如RNA、DNA、及／或蛋白質的巨分子或將它們化學地修飾，足以使它們將不會污染ROI組織中之RNA、DNA、及／或蛋白質的稍後分析。
由病理學家或實驗室使用者或者是其他的個人在載玻片上所製作的“標記”係在本文中稱作“手動標記”。該標記可藉由可用的裝置來製作，諸如用筆或蝕刻裝備。相反地，由系統所自動地製作的標記在此可被稱作“虛擬標記”或“數位標記”，用以指示其並非被手動地製作而是使用一或多個演算式來製作。
“數位的”、“數位化”、“自動化”、及“自動地”、等等之術語在此表示由系統所執行的動作，例如，由演算法及／或由使用者與電腦使用者介面之間的互動所控制，而不是由使用者所手動執行的動作。
如本文所使用之“表面”的術語意指提供部位而允許感興趣的分析物或探針間之相互作用的任何物質。較佳地，該表面係固態支撐體的表面，例如，硝化纖維素、反應盤的孔壁、多孔板、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜、及微粒子(諸如乳膠粒子)。用以允許偵測試劑進入之具有足夠孔隙率之任何合適的多孔材料及用以固定捕獲試劑(例如，寡核苷酸)之合適的表面親和力係由此術語所涵蓋。例如，硝化纖維素的多孔結構具有對例如，捕獲試劑之各種試劑的優異吸收性及吸收品質。尼龍具有相似之特徵且亦係合適的。微孔性結構係有用的，具有在水合狀態中之凝膠結構的材料亦係有用的。有用的固態支撐體之進一步實例包括天然聚合碳水化合物及其合成修飾的、交聯的或取代的衍生物，諸如瓊脂、瓊脂糖、交聯海藻酸、取代及交聯的瓜爾膠、特別地具有硝酸及羧酸之纖維素酯、混合纖維素酯、及纖維素醚；含氮的天然聚合物，諸如蛋白質及衍生物，包括交聯或改性明膠；天然烴聚合物，諸如乳膠及橡膠；諸如乙烯基之可以以合適多孔的結構製備之合成聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸鹽、上述縮聚物的共聚物及三元共聚物、諸如聚酯、聚醯胺、及其他聚合物、諸如聚氨酯或多環氧化物；諸如鹼土金屬和鎂的硫酸鹽或碳酸鹽之多孔無機材料，包括硫酸鋇、硫酸鈣、碳酸鈣、鹼金屬和鹼土金屬的矽酸鹽、鋁及鎂；和鋁或矽氧化物或水合物，諸如黏土、氧化鋁、滑石、高嶺土、沸石、矽膠、或玻璃(該等材料可用作上述聚合物材料的過濾器)；以及上述類別的混合物或共聚物，諸如藉由在預先存在的天然聚合物上初始化合成聚合物的聚合所獲得的接枝共聚物。
如本文所使用之“署名”的術語意指標記的集合，其指示感興趣的表型，例如，包含
Figure 02_image001
3個突變的癌症署名指明的是，窩藏突變的細胞或組織係腫瘤細胞。在一些實施例中，署名包含例如，腫瘤標記之標記的存在、不存在、及／或大量組合。藉由組合各種探針組，可設計出用於感興趣表型之偵測的可靠方法。做為單一測定的該署名測試可為評估及瞭解各種標記間之相互作用提供很大的益處。
“擴增”的術語通常意指從目標核酸產生複數個核酸分子，其中引物與目標核酸分子上的特定部位雜合，以便提供聚合酶之延伸的起始部位。擴增可藉由本項技藝所普遍已知的任何方法來執行，諸如但未受限於標準PCR、長PCR、熱啟動PCR、qPCR、RT-PCR、和即時PCR。
如本文所使用之“抗體”的術語意指諸如IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM之完整的免疫球蛋白，或意指諸如Fab、Fv、或Fc之抗體的片段(特別地，抗原結合片段)，或融合抗體，融合抗體片段，或抗體之任何其他的衍生物。“標誌抗體”之術語意指以酶、螢光染料、化學發光物質、生物素、抗生物素蛋白、或放射性同位素標誌的抗體。
“表位”的術語意指諸如蛋白質、碳水化合物、或脂質之化合物的抗原區。該抗原區通常由5到8個氨基酸所組成。表位係藉由各個抗體的抗原結合部位來加以特定地辨識。
“固定組織或細胞”的術語係如熟習於本項技藝之專家所已知地在本文中使用，並意指藉由化學固定方法來防止腐爛的生物組織或細胞。該等方法防止該生物組織或細胞內的自溶或腐敗。固定可終止生化反應並增加所處理之組織的機械穩定性。
“免疫組織化學”或“IHC”的術語意指用於以能夠在組織學取樣中特定地結合到該抗原之抗體來偵測抗原之存在的技術。抗體-抗原複合物的偵測通常藉由以酶標誌之抗體的顯色反應或藉由螢光標誌之抗體來進行。
如本文所使用之“宏觀解剖”的術語意指藉由使用諸如手術刀或刮刀之類的工具而從安裝在諸如顯微鏡載玻片之固態支撐體上的組織切片刮出感興趣區域的過程。如本文所使用之“顯微解剖”的術語意指從組織取樣切割及分離一或多個特定細胞或感興趣區域的過程。例如，顯微解剖可使用雷射捕獲顯微解剖(LCM)而藉由以雷射切割相關區域來執行。
如本文所使用之“膜載玻片”的術語意指用於雷射捕獲顯微解剖(LCM)中的固態支撐體或顯微鏡載玻片。對於顯微解剖，可使用覆蓋有膜的玻璃載玻片或覆蓋有各種膜之金屬框架所組成的框架載玻片。
“聚賴氨酸”的術語意指包含多達數百個重複單元的分子，且係適用以增加諸如組織切片之取樣與其上安裝該取樣之膜側間的親和力。依據本說明的聚賴氨酸係聚-L-賴氨酸。依據本說明的聚-L-賴氨酸具有70到300kDa的分子量。聚-L-賴氨酸可被蛋白酶消化。依據本說明的另一聚賴氨酸係例如，聚-D-賴氨酸。依據本說明的聚-D-賴氨酸具有70到300kDa的分子量。聚-D-賴氨酸對蛋白酶具有抗消化性。
“qPCR”的術語通常意指被稱為即時定量聚合酶鏈反應、定量聚合酶鏈反應、或動力學聚合酶鏈反應的PCR技術。此技術使用PCR來同時擴增及量化目標核酸，其中該量化係借助於嵌入螢光染料或包含螢光報告分子的序列特定探針，它們僅在與目標核酸雜合時才能被偵測到。
“RNA”的術語係如熟習於本項技藝之專家所已知地在本文中使用，並意指前體mRNA、前體mRNA轉錄物、mRNA、轉錄處理中間體、用於來自一個基因或多個基因的轉譯及轉錄物之成熟的mRNA、或自其衍生的核酸。轉錄處理包括諸如拼接、編輯、修改、及降級。包含取樣的mRNA包括例如，mRNA、該基因或多個基因的mRNA轉錄物、使用逆轉錄之源自mRNA的cDNA、由擴增DNA所轉錄的RNA、由cDNA所轉錄的cRNA、擴增自該等基因的DNA、等等。
可包含本文取樣的“容器”被廣義地闡釋為意指任何類型、形狀、或尺寸的容器，包括表面、井孔結構、試管、或小玻璃瓶。容器無需具有任何特殊的形狀或尺寸以由任何特定的材料所製成，且僅做為能夠分析或操縱位於其內部或上面之組織的實體結構。
本文之“染色的”載玻片／基板意指已經被處理的基板，用以協助顯示ROI取樣與其他取樣間之差異，使得病理學家或其他受過訓練的個人可標記該基板以表示該基板上之任何ROI之輪廓。“未染色的”載玻片／基板係未被如此處理，但可能經歷或可能未經歷其他類型之處理的基板。
本文之從基板上之X取樣“分離出”一或多個ROI的術語包括以使其自基板被實體地去除，被切除(例如，蒸發、燃燒、或實體地分解)，或被化學地處理，以致使其不會污染該ROI取樣中之分子的稍後分析之方式來處理X取樣的手段。
本文之“基板”的術語意指各種載玻片，包括，但未受限於FFPE載玻片、組織載玻片、標準載玻片、容器、染色載玻片、未染色載玻片、活組織、等等。
本文之“取樣”的術語意指細胞組織、標本、組織取樣、FFPE組織、或使用標準分子生物學方法所附加的其他生物材料。
“電腦處理器”或“計算裝置”或“電腦”在本文中被廣義地闡釋為意指將執行其所需功能的任何硬體及／或軟體組合。例如，處理器可係可編程數位微處理器，諸如以電子控制器、主機、伺服器、或個人電腦(桌上型或可攜式)的形式提供。在處理器可編程的情況下，合適的編程可從結合到電腦本體內或在處理器之遠程位置處的使用者介面來傳達，或可被先前地儲存在電腦程式產品中(諸如可攜式或固定式電腦可儲存媒體，無論是以磁性、光學、或固態裝置為基礎)。例如，磁性媒體或光碟可帶有編程且可由合適的閱讀器所讀取，該閱讀器係在其對應的使用者介面處與每個處理器通訊。本文之“使用者介面”被廣義地闡釋為意指實體結構，其允許使用者對電腦進行編程，且從而透過該電腦來控制系統的某些操作。實例包括主機或膝上型電腦鍵盤及監視器、諸如墊類型或智慧型手機類型裝置之其他類型的視覺監視器及鍵盤系統、或其他的遠程裝置。使用者介面可係電腦本體的實體部分，實體地位在系統中的其他位置，或實體地遠離電腦，並能夠透過有線或無線連接來與電腦處理器通訊。 用以在未染色基板上數位標記ROI的方法
取樣分析及解剖通常涉及包含平行取樣切片之一系列的載玻片。例如，可對一組中之一或多個載玻片進行染色以顯示細胞核及／或幫助區分不同類型的細胞，諸如在腫瘤學應用中，癌細胞及非癌細胞。病理學家可檢查基板並以筆或其他合適的標記裝置在載玻片上標記感興趣的區域(ROI)。接著，可將該等ROI或相關聯的筆標記與來自相鄰取樣切片的基板映像(旋轉及對齊)，最終地進行分析，諸如提取DNA用於基因組排序、提取RNA用於RNA表達分析、或執行細胞的原位分析、等等。在手動取樣解剖方法中，病理學家的筆標記係由手轉移到基板且剃刀刀片被使用以從載玻片上的周圍取樣中切出ROI。
不僅涉及感興趣的區域還涉及調查研究中之器官的周圍組織之組織學切片的宏觀解剖技術已被漸增地部署在許多病理學的調查研究中，諸如腫瘤分型、炎性疾病的診斷、及退化性疾病的決定。在宏觀解剖中，感興趣的病患組織(〝S〞區域)係收集自例如，載玻片的組織學標本且同時排除不需要的區域(〝X〞區域)，使得只有〝S〞區域被使用做為用於下游測定的輸入材料。在某些情況中，來自病理學家之複合的〝S〞形狀定義可導致來自組織學技術人員之困難的刮削操作。經常地，需要複雜的刮削技術，如第1圖中所示。本發明有關用以處理生物取樣的系統及方法，以致使其中之分析物可被更準確地偵測，較佳地不受來自非分析物的干擾。因此，藉由改善信號品質及／或減少噪聲，本發明之系統及方法將大大地增進生物測定的結果，尤其是在分析諸如FFPE的異質取樣中之分析物的情況中。
藉由改善諸如信號品質及噪聲降低的測定參數，本發明之系統及方法亦改進測定目標，例如，將生物標記的存在／不存在或位準或活性與例如，種族性狀(用於法醫學)或疾病性狀之感興趣的性狀相關聯。
本發明之系統及方法係部分地根據粒子噴砂器用於目標的用途，和去除生物標本(例如，組織學載玻片)中之組織的特定區域，及選擇性地收集含信號(〝S〞)的組織區域。該方法包含使用粒子及受控的加壓空氣或其他氣體流來將該等粒子引導至ROI。該方法較佳地係乾式法，其減少取樣之污染及／或取樣中分析物之稀釋的機會。
本發明之方法可用於各種設置。例如，在其中需要宏觀解剖的第一實施例中，可將基板(例如，組織學載玻片)中的〝X〞區域選擇性地微噴砂，且同時僅保持該基板上的〝S〞區域不變。之後，可使用下游處理方法從該基板移除〝S〞區域。在其中亦需要宏觀解剖的第二實施例中，可將基板(例如，組織學載玻片)中的〝S〞區域選擇性地微噴砂，且同時僅保持該基板上的〝X〞區域不變。來自〝S〞區域的組織可從基板移除，且該等粒子接著被聚集到將使用下游處理予以處理的容器內。然而，在其中不需要宏觀解剖的另一實施例中，可將基板的所有區域(〝X〞，及〝S〞區域)微噴砂，並將這兩個區域的含量收集在容器中以供下游處理之用。
第2圖描繪用以數位處理其中無法均勻地控制品質及組織厚度之未染色載玻片提交(USS)的例示性過程。該過程可包括兩個平行過程，其中三條路徑可致使該等平行過程合併。
依據一態樣，沿著第一平行路徑，可將USS安裝到夾持器上。所安裝的USS可儲存於貯存單元中以等待路徑檢查。該USS的掃描影像被創建。該USS從該貯存單元提取。然後，可執行自動化取樣解剖程序。
依據一態樣，沿著第二平行路徑，該USS被染色以產生參考載玻片。掃描該參考載玻片以創建影像。創建數位化標記，其包括該參考載玻片上的感興趣區域(ROI)。然後，決定該標記是否能被上傳到影像管理系統(IMS)。如果是的話，則第二平行路徑透過路徑1與第一平行路徑合併。
在路徑1中，提交基板透過當前數位病理學解決方案而成功地轉移其標記。該USS可透過路徑1而在當前數位工作流程中被最早地處理。
如果不是的話，則應用外部標記轉移演算法。若該標記能被轉移時，則路徑2將第二平行路徑連接到第一平行路徑。例如，在路徑2中，提交基板需要開發當前數位病理學解決方案之外的標記轉移演算法。此路徑係假設需要外部標記轉移演算法(例如，當前數位病理學解決方案內的能力)。
最後，可經由路徑3來手動地轉移標記。例如，在路徑3中，自提交基板之直接標記轉移並不可用，且需要病理學家個別地在每個相關聯的基板上手動地執行數位標記。此路徑係在路徑1及路徑2皆無法繼續進行之情況中的後退解決方案。該過程仍然能夠在自動化取樣刮削系統中最低限度地進行處理。
第3圖描繪收集“S”區域或去除“X”區域的方法。依據一態樣，去除“X”區域並且僅留下“S”區域以允許用於取樣收集之直通(從載玻片收集所有取樣)方法。此係有效率的方法，因為通常只有很小的“X”區域。例如，大約50%的情況係直通的(例如，沒有“S”區域)。在大多數的情況中，“X”區域係遠小於“S”區域(例如，要去除的“X”區域較少)。
額外的態樣包括分解“X”區域中的核酸(例如，只留下“S”區域和非活性的“X”區域)，以致使“X”區域無需從基板去除。例如，所分解的“X”區域並不包含將進一步影響分析之保留在“X”區域中之任何可量化的DNA／RNA。從而，在“X”區域中將不存在DNA或RNA之可分析的量。
進一步態樣包括在基板上直接裂解取樣做為直通方法。此方法可部分地分解細胞的磷脂雙層及／或完全地分解蛋白質，用以將取樣處理成為適用於下游分析過程的液體裂解物。例如，可將取樣暴露於裂解緩衝劑或緩衝溶液。裂解液的實例包括高滲性、低滲性、pH調節的溶液，或諸如蛋白酶之含酶的溶液。
所敘述的過程可應用到自動化及手動工作流程二者。例如，它們可以與當前手動刮削技術結合而實施，因為“S”區域比“X”區域多很多，所以去除或分解“X”區域比僅僅收集“S”區域更容易。 取樣解剖過程
第4圖描繪各種取樣解剖方法。依據本發明之態樣，“X”區域的去除可在載玻片上只留下“S”區域以供收集之用。例如，可去除基板上之所有不需要的取樣，而僅在載玻片上留下所需的取樣做為直通提取。為去除該等“X”區域，存在有用以自基板取出非所需之取樣的機械性和非機械性工具。
機械性(例如，接觸)工具可包括實體材料的使用，諸如剃刀刀片、機器研磨器(標準或訂製的銑具)、刮匙、打孔器、刮刀、微珠粒噴砂器、及真空抽吸器，用以自基板直接去除不需要的取樣。機械性工具可進一步包括粒子噴砂器，用以去除該等“X”區域。
非機械性工具可包括間接接觸技術的使用，諸如雷射及水刀，用以自基板直接去除不需要的取樣。種種雷射系統包括飛秒雷射系統、皮秒雷射系統、奈秒雷射系統、微秒雷射系統、二氧化碳雷射系統、鎖模雷射系統、脈衝雷射系統、Q開關雷射系統、Nd：YAG雷射系統、連續雷射系統、染料雷射系統、可調雷射系統、鈦藍寶石雷射系統、高功率二極體雷射系統、連續波雷射或高功率光纖雷射系統。例如，飛秒雷射系統可使用具有中塔式個人電腦(PC)之尺寸的20W(瓦)平均功率。雷射的進一步實例包括，但不受限於二極體雷射、固態雷射、氣體雷射、及染料雷射。應瞭解的是，可將所使用的雷射組構為與傳統的雷射相比不那麼強大，用以留下更少的占地面積。
可將“X”區域中的核酸(例如，DNA)分解(例如，變性)，而在載玻片上只留下“S”區域和非活性的“X”區域以供收集之用。例如，分解“X”區域中的核酸將使該等區域變為對後續過程非活性(例如，核酸含量不會在其中它將影響到基因表達之位準)。因此，並不需要實體地去除／分割該等區域，並且可使用直通取樣收集方法。
諸如雷射、熱、射頻(RF)、超音波、低溫、電漿、等等之非機械性方法可被使用以從基板(例如，玻璃載玻片)分解所不想要的“X”區域。
化學方法可包括施加化學品(例如，漂白劑、酸、鹼、及酶)到“X”區域以分解核酸(例如，DNA／RNA)。NaOH或鹽亦可使用以使核酸變性。額外的變性劑可包括蛋白質變性劑及核酸變性劑。漂白劑之例示性濃度可係至少10%的漂白劑。可組合化學品的組合，包括含核酸內切酶及／或蛋白酶的pH調節溶液，或0.05%至10.0%(重量／體積)的次氯酸鈉。
依據態樣，在基板上使用裂解緩衝劑以直接執行裂解過程可繞過取樣解剖過程。例如，可將具有取樣的基板直接浸沒到具有裂解緩衝劑的溫控容器內，以使整個取樣與基板分離。隨後的蛋白質激酶(Pro K)蛋白質消化可在同一容器及一單獨的過程／容器中執行。
依據本發明之態樣，取樣解剖可包括機械性及非機械性方法，用以自基板取出不需要的取樣(例如，非所需的“X”區域)。如上述，機械性(接觸)方法可包括實體材料的使用，用以自基板分割出不需要的取樣。系統可使用諸如粒子微噴砂器、噴砂器、剃刀刀片、刮匙、打孔器、或刮刀之實體刮削工具，結合刮削動作旁邊的真空抽吸管，使用抽吸方法以同時地收集不需要的取樣。
抽吸裝置包括低成本之一次性消耗品(例如，具有過濾器的塑料管)，用以收集所有取樣，且將在每個案例上被更換以避免交叉污染。選擇性地，可在取樣之間清潔抽吸裝置以消除交叉污染。該過濾器具有阻止取樣流動但允許空氣通過的功能。此外，取樣不能完全堵塞過濾器而阻礙到空氣通道。
然後，可將去除的取樣收集在廢物箱中，而導致僅在基板上留下“S”區域用於直通方法。例如，直通收集可藉由以下來達成：(a)直接單通剃刀刀片直通，可輕鬆地自動化；(b)使用溫控的超音波水浴以自基板分離出取樣到容器／試管內；及／或(c)在取樣與基板分離之後，在收集容器／試管的底部施加靜電荷。
非機械性方法可包括間接技術的使用(例如，諸如雷射及水刀切除)，用以自基板分離地切割出非所需的取樣。例如，雷射及水刀方法可包括使用高壓水刀或雷射磨損技術在目標玻璃表面上施力，用以將取樣與基板分離。此導致僅在基板上留下“S”區域用於直通方法。
直通收集可藉由以下來達成：(a)直接單通剃刀刀片直通，可輕鬆地自動化；(b)使用溫控的超音波水浴以自基板分離出取樣到容器／試管內；及／或(c)在取樣與基板分離之後，在收集容器／試管的底部施加靜電荷。
可使用以下方法來分解“X”區域，用以自基板取出不需要的取樣。例如，非機械性方法可從基板分解非所需之“X”區域中的DNA。依據一實施例，系統將使用諸如雷射、熱、射頻(RF)、超音波、低溫、或電漿之非接觸的切除技術，用以從基板分解非所需的取樣。此導致僅在基板上留下“S”區域以供上述直通方法之用。
化學方法可包括施加化學品到“X”區域以分解DNA。例如，系統可在玻璃表面上之目標“X”區域上施加諸如，漂白劑、酸、鹼、或酶、等等的化學試劑，用以從基板分解取樣。此導致僅在基板上留下“S”區域以供上述直通方法之用。
應瞭解的是，本發明並不限於病理空間。它也可以用於預富集或隔離目標及非目標。所確定的技術亦可被單獨地使用或與其他整合的系統結合而使用。應進一步瞭解的是，用於直通的方法亦可包括氣動的使用或上述方法的組合。
標本類型包括，但未受限於細胞培養物、冷凍切片、新鮮取樣、液體活檢、及細胞學取樣(例如，痰、胸膜液、等等)。標本類型也可以包括非人類目標。
目標標本亦不限於基板。可使用被提供做為系統入口而允許系統對標本成像之任何形式因子的器皿。其他實例包括蓋玻片(亦即，血液塗片產生)、生物反應器、具有成像衝孔的細胞培養皿、取樣收集紙、或液體流／液滴。
本發明之態樣提供諸如清潔、便宜、及與高通量實驗室相容的優點，用以手動地(例如，使用筆)從基板直接提取感興趣的區域，或提供易於使用的數位註解工具和基於對象的演算法，用以匹配基板上的數位標記且同時保持標本的型態，而無需產生多組未染色基板(USS)以供手動顯微解剖之用。它還可以使得為了要完成所需任務之所需要的操作者干預的風險最小化。
在一些實施例中，解剖系統可使用許多手段，諸如雷射、水刀、及超音波，用以解剖基板以使ROI與不需要的取樣分離。
一些實施例可包括使用研磨技術之低成本的機械系統。小的桌上型CNC研磨機器使用立式立銑刀／刮刀以收集用於ROI(要保存的取樣)或RONI(要丟棄的取樣)標本之預定義的數位標記。此桌上型系統將允許使用者在研磨外殼內處理一組載玻片，立式銑具(例如，具有抽吸特徵之低成本的旋轉刮削夾具)將能夠跟蹤及收集標本預定義的最終使用者數位註解。在一些實施例中，可將保存的取樣轉移到試管以供後續過程之用。在其他實施例中，在基板上所留下的係S取樣，其可以以剃刀刀片予以輕鬆且乾淨地刮削。
做為實例，來自某些癌症之諸如超過40%的大部分活檢取樣可係所有的S和沒有X，而許多其他地區具有相對小的X區域。以小的立銑刀設置，該立銑刀可具有用於抽吸的管腔(該銑刀可係具有或不具有尖端的海波管以易於促進取樣的加工)。如果X區域很小，可將該等X區域移除。如果S區域很小，可加工及收集該等S區域。為簡易起見，也可以只一致地去除所有的X區域或收集所有的S區域。在一些實施例中，可選擇地使用水刀方法以去除載玻片上的X取樣，而留下S取樣。
在其他實施例中，X材料在載玻片上被有效地切除或破壞，而S材料保持完整。此可以以各種機械手段來完成，例如：使X取樣經受各種能源，諸如粒子微噴砂(例如，微珠粒噴砂)、雷射、電解、超音波、射頻、或熱能源或藉由選擇性地冷凍乾燥X取樣。在一些實施例中，切除X取樣所需的手段包含能源，例如，雷射、射頻、電流、聲音、或是能夠裂解細胞及／或分解諸如核酸及蛋白質之巨分子的熱能源。例如，其中一些方法可有效地燃燒及蒸發該X取樣。在一些實施例中，設備可將適當的能源精確地引導至筆外部的區域或基板上的數位化標記，諸如精確地聚焦雷射或射頻波或超音波以致使其僅影響到X取樣區域。例如，在一些實施例中，脈波雷射、電解、或超音波裝置可用作用以從載玻片切除及／或分解X區域中之核酸的手段，使得只有包含ROI的S區域留在該載玻片上。例如，一旦執行了S及X區域的跟蹤，系統可以被組構為僅將脈波雷射、電解、或超音波裝置引導至X區域。例如，可以以來自只與載玻片接觸之雷射、電解裝置、或超音波裝置的能量從一端到另一端地掃描該載玻片，且因此，僅切除該等X區域中的細胞。結果，載玻片的S區域保持完整且在載玻片上保留了唯一完整的細胞材料。在一些實施例中，該能量可以有效地蒸發X區域中的取樣並且可以破壞該等區域中之諸如DNA及RNA的感興趣分子，以致使來自X區域之材料不會在稍後的分析中污染到由此所生成之孤立的S區域。
在其他實施例中，X區域可藉由化學處理來有效地去除，包括水空蝕法(例如，超音波水空蝕法)，諸如以可分解來自要分析的取樣之諸如DNA及／或RNA及／或蛋白質的分子之一或多種試劑。用以選擇性地分解X取樣的化學手段包括例如，漂白劑、強酸、強鹼、或諸如DNA酶、RNA酶、及蛋白酶之瞄準並分解巨分子之酶的添加。例如，以RNA酶或蛋白酶之化學處理可根據載玻片上之數位化的筆標記而僅針對該載玻片的X區域。例如，RNA酶或蛋白酶可以將RNA或蛋白質分解成為小的片段或單體。由於化學處理的緣故，例如，載玻片的X區域將不包含顯著位準的完整分子用於分析，使得來自所處理之取樣之例如，蛋白質或RNA表達位準的分析將僅反映取樣之S部分中的表達位準，因為只有來自該S部分的蛋白質及／或RNA將保持完整。
該等方法中的任何一種方法-切除X部分的細胞以有效移除X組織或化學變性X部分或其中感興趣的分子-可藉由將S組織從包含X及S組織二者的載玻片雕刻出來以消除收集S組織的需要。相反地，可在“直通”組織收集方法中收集或使用載玻片上的整個組織以供稍後分析之用。例如，在“直通”收集中，將載玻片上的所有組織移除並且在S與X區域之間沒有組織解剖。從而，本文之方法係與直通組織收集相容，其中當收集組織用於稍後分析時並不需要在載玻片上將S與X組織分離。替代地，可簡單地將來自載玻片的組織從該載玻片移除，諸如藉由以類似於研磨過程的旋轉切削工具將它從載玻片刮削下來並藉由毛細管作用、抽吸、等等來進入收集器皿內。在該等實施例中，即使手動地執行組織收集，也不需要目前所使用並且可造成傷害或導致低準確度的高技術性剃刀刀片技術。選擇性地，組織收集可藉由儀器來自動地執行。此自動化係更容易實施，因為目標在於收集所有的組織，並不需將X區域與S區域分離。例如，可將組織收集到諸如井孔結構、小玻璃瓶、或試管之合適的容器內，以供例如，細胞裂解及諸如DNA、RNA、或蛋白質之感興趣分子之提取的處理之用。用以從所處理的載玻片來機械性地收集組織到容器內之手段包括例如，噴砂、使用剃刀刀片或類似刀片以刮下組織、或刮匙、刮刀、打孔器、或真空抽吸器以吸出組織、溶液或另一物質的添加用以在與載玻片表面相較之下提供諸如帶電荷表面或介質等等的競爭介質或表面。
在一些實施例中，例如，可在載玻片上直接進行諸如細胞裂解的某些步驟，而不是將用於分析之組織收集到諸如井孔結構、小玻璃瓶、或試管的容器內。而且，當將X區域切除或變性以移除或去活化不感興趣之任何顯著濃度的分子用於稍後分析時，此可係可能的。在一些該等實施例中，諸如具有合適試劑盒的細胞裂解且選擇地，諸如DNA、RNA、或蛋白質之感興趣分子的提取也可以在組織載玻片上直接地進行。在一些實施例中，該等過程可藉由設備來自動地控制。例如，在一些實施例中，可將載玻片浸沒於諸如包含在井孔結構或試管或小玻璃瓶中的裂解緩衝劑內，使得細胞裂解可在載玻片上發生。在一些實施例中，可接著在所浸沒的載玻片上執行諸如蛋白酶消化或DNA酶消化及／或RNA提取之隨後的步驟。
第5圖係在遮罩508上的入射輻射502之例示性的透射照射506及反射照射504之圖式500。此係因為該輻射502係部分地由遮罩508所阻隔且透射照射506僅可到達取樣512的某些區域(例如，只有一定比例的能量可被透射做為波長的函數)。基板510可係1毫米(mm)厚，其對透射照射506提供一些折射。例如，遮罩508可在載玻片510的頂部，使得輻射502被遮罩508所部分地阻隔且該輻射僅可到達“X”區域。依據本發明之態樣，遮罩508可包括光學的、熱的、機械性的結構、及／或化學遮罩，用以阻隔所施加之相關的熱量、雷射、化學品(例如，微珠粒噴砂)、等等。應瞭解的是，所暴露之部分可根據所使用的過程來加以去除或變性。
第6圖顯示具有標記的不需要之“X”區域602及在“X”區域602之間的感興趣之區域(ROI)604(例如，“S”區域)的例示性載玻片600。例如，該等“X”區域602及ROI 604可藉由上文所敘述之過程來決定。
第7圖描繪其中不需要的“X”區域712及714係藉由使遮罩700疊加在載玻片720上而從載玻片720被去除的過程。例如，可製備具有不需要的“X”區域702、704及需要的“S”區域706劃定的遮罩載玻片710。例如，“X”區域702、704及“S”區域706可藉由上文所敘述之過程來決定。使遮罩700疊加在載玻片720上允許依據所劃定之部分從載玻片720移除不需要的“X”區域712及714。所產生的載玻片720僅包括需要的部分716。應瞭解的是，“X”區域712及714可根據所使用的過程來加以去除或變性。
自動組織解剖(ATD)系統的例示性實施例使用具有如第10及11圖中所示之一次性訂製設計銑具的微型研磨系統(第12圖)，該銑具描繪了與組織載玻片相接之銑具的遠端切削部分。在此部分的前面，可以有一個或複數個切削刃，其將在該銑具的旋轉期間從載玻片分割組織。在該工具中可以有一或多個管腔(亦即，通道)，使得可以以真空抽吸迫使所分割出的組織進入至管腔內。該切削部分可以與該工具的主體接合。此主體的功能在於容納所收集的組織、與機器夾頭接合、容納過濾器元件、及與切削部分接合。加壓空氣或其他的惰性氣體可用以迫使所分割出的組織進入至收集試管內。替代實施例包括用攪拌來重力轉移至收集試管內、通過沖洗緩衝劑、或將具有所收集之組織的銑具直接放入至試管內。一個一次性銑具可用於由一或多個組織載玻片所組成的每個情況。
為了要縮短處理時間，此訂製銑具係設計用於在高轉速之下直接驅動或氣動式地操作。轉速可達到或超過100,000 rpm。此允許提高進料速度；因此，該工具係設計用以承受當高轉速操作時所招致的操作應力和溫度。
遠端切削區域可具有用以收集組織ROI的內腔且具有徑向設置在前面的一或複數個切削刃。材料可係鋼或比組織更硬且以低成本適用於高容量處理的任何材料。工程塑料可能是不錯的選擇，因為它們可被經濟地注塑成型。由於對於某些組織類型，ROI可接近750微米或更小，所以此前面的直徑可以非常小。小的管腔可嚴重地增加切削部分的壓差及限制空氣流動。較佳的是，快速地逐漸變細並逐漸增加緊鄰切削介面的管腔尺寸。
該主體的遠端與切削部分接合。該切削部分可係帶螺紋的、插入模製的、黏合的、壓合的、或任何其他合適的組裝技術。主體之內部由足夠的容積所組成，用以容納來自事例中的所有載玻片之所收集的組織。近端係設置有與標準機器夾頭接合的特徵。材料可係鋼，或可維持強度以承受操作應力且係以低成本適用於高容量處理的任何材料。工程塑料可能是不錯的選擇，因為它們可被經濟地注塑成型。主體的近端亦具有用於與過濾器接合的內部特徵。它還具有與真空附件接合的合適特徵，該真空附件可係由直接真空或經由文氏管(Venturi)裝置所驅動的直線式或離軸式組態。
過濾器元計係用以阻止所收集的組織，但允許空氣或惰性氣體通過。過濾器開口尺寸可係50微米或更大。該等開口尺寸及過濾器整體尺寸係設計使得所收集的組織將不會在過程的結束時完全堵塞該過濾器。過濾器必須承受操作壓力及力量。減壓特徵亦可被結合以防止堵塞。過濾器可黏合或機械地連接到主體。選擇性的夾緊部件也可以被使用。
銑具的遠端切削部分係連接到主體。該遠端切削部分包含與組織載玻片相接的一或複數個切削刃。遠端切削部分的設計將所分割的組織引導朝向該切削部分的中心。在遠端部分處的一或多個切削刃係徑向地定向。每個切削刃可係直的或彎曲的。在操作期間，刃與ROI的接觸角係使得將產生淨向量力以迫使組織朝向處理元件的中心，從而允許收集該ROI。例如，切削刃#1可被設定為垂直的，切削刃#2可形成銳角，以及切削刃#3可被設定成鈍角，該等位置的每一個係設定用以驅動所分割的組織。較佳實施例在於設立由一或複數個刃所構成的遠端切削部分，最少限度的刃係設立成切削刃#1，且較佳的取向係設立成具有銳角的切削刃#2。遠端切削部分可被設計以提高切削能力，包括鋸齒邊緣及鋸齒位置中的變化(包括長度、寬度、及深度)。
第10及11圖描繪依據各種實施例之例示性的取樣研磨裝置。如本文所示地，該裝置1000包含第一組件1014及第二組件1010。第一組件1014在相對的兩端上具有開口以及第二組件1010係固定到該第一組件1014的一端。該第二組件1010進一步包含取樣收集開口1018，該取樣收集開口1018背離該第二組件1010被固定到該第一組件1014的位置，該取樣收集開口1018具有沿著該取樣收集開口1018的周邊突出的一或多個取樣刮削元件1020。真空通道1012延伸穿過該第一組件1014及第二組件1010，用以連接該取樣收集開口1018與該第一組件1014的另一端上之真空連接開口1022。當操作裝置1000從基板收集取樣時，該裝置1000係旋轉使得取樣刮削元件1020從基板表面機械地去除部分取樣，且同時藉由使用真空泵以施加真空至第一組件1014的真空連接開口1022，而透過取樣收集開口1018及真空通道1012來同時地收集所去除的取樣部分。在各種實施例中，所去除的取樣部分係透過附接到真空連接開口1022的過濾器元件1016來收集。在各種實施例中，所去除的取樣部分係收集在與真空通道1012流體連通的容器中。
在各種實施例中，第一組件1014及第二組件1010係由不同的材料所組成。在各種實施例中，第一組件1014及第二組件1010係由相同的材料所組成。可以使用之材料的實例包括，但不受限於：金屬、聚合物、玻璃纖維、等等。
在各種實施例中，取樣刮削元件1020係沿著取樣收集開口1018的周邊而被等距地間隔開。在各種實施例中，取樣刮削元件1104係沿著取樣收集開口1018的周邊而被差距地間隔開。
第12圖描繪依據各種實施例之例示性的取樣收集系統。如本文所述地，系統1200包括取樣研磨裝置1000，其係定位在保持取樣1204的基板(亦即，載玻片) 1202上。該取樣研磨裝置1000包含第一組件1014及第二組件1010。當操作取樣研磨裝置1000時，其係旋轉及定位(在X、Y、及Z軸中)使得該裝置1000的尖端接觸取樣1204，用以從基板1202的表面機械地去除部分取樣1204，且同時透過使用施加真空到該研磨裝置1000的一端上之開口1208的真空泵1206來同時地收集所去除的部分取樣。
在各種實施例中，取樣研磨裝置1000可以以X、Y、及Z軸方向移動，以致使其僅與所需的取樣1204部分接觸。在各種實施例中，保持取樣1204的載玻片1202可以以X、Y、及Z軸方向移動，使得取樣研磨裝置1000僅與所需的取樣1204部分接觸。
在各種實施例中，第一組件1014及第二組件1010係由不同的材料所組成。在各種實施例中，第一組件1014及第二組件1010係由相同的材料所組成。可以使用之材料的實例包括，但不受限於：金屬、聚合物、玻璃纖維、等等。 例示性的後續取樣分析程序
可收集ROI組織(或S組織)以便可以以各種方式進行分析或操控。例如，在一些實施例中，所收集的ROI組織係如上述地經受細胞裂解，然後進行一或多個其他的過程。在一些實施例中，DNA及／或RNA及／或蛋白質、輔因子、膜脂質、及其類似物可直接地或在細胞裂解後從ROI組織提取，或可在原位予以評估。
在一些實施例中，本文的系統及方法涉及ROI組織中之DNA的分析。例如，本文的系統及方法可以與用於拷貝數變異(CNV)、單核苷酸多態性(SNP)、特定基因中的點突變、基因中之缺失或插入突變的偵測、轉位的偵測、易位、諸如病毒或細菌DNA之外來DNA的存在、DNA的甲基化、及其類似者之ROI組織的分析結合使用。在一些實施例中，本文的系統及方法可以與ROI組織中之RNA種類的分析結合使用，諸如基因的特定RNA轉錄物之位準的決定或特定的可變剪接RNA轉錄物的偵測及其相對位準或干擾RNA的存在。例如，RNA分析可藉由包括諸如定量RT-PCR之逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法，或藉由全轉錄組排序方法來執行。在一些實施例中，在ROI組織中之特定蛋白質的存在或位準可藉由諸如免疫沉澱法、ELISA、免疫印漬術、核酸、及其類似方法的方法來評估，諸如在原位或在細胞裂解程序後。在一些實施例中，可評估ROI組織，用以偵測諸如生物輔因子、細胞膜脂質、或其他組分之其他分子及其類似物的存在或位準。
用以分析例如，安裝在玻璃載玻片上之FFPE組織的生物取樣之例示性的系統及方法係顯示於第8A圖及第8B圖中。
第8A圖顯示依據上述方法之用以處理及／或分析例如，腫瘤活檢取樣之病患取樣的例示性方法。生物取樣係用包含粒子及空氣的接觸介質來微噴砂。在一些實施例中，該接觸介質包含粒子，其係非常適用以隔離存在於病患取樣中之感興趣的特定分析物。例如，二氧化矽粒子或諸如二氧化矽塗層鐵磁珠粒的二氧化矽塗層粒子係非常適用以隔離諸如包含誤義突變或功能缺失突變之mRNA的核酸標記。粒子微噴砂器係裝載有該等粒子且該微噴砂器的噴嘴被引導至所需的組織區域。例如，在病理學標本的情況中，所需的區域可係包含核酸的區域，例如，已以適當的污斑染色的細胞核。替代地，萬一病患標本包含不同的組織類型，則該所需的區域可係包含感興趣之細胞的組織類型或組織層，例如，在胰臟癌的情況中之內襯胰管的上皮細胞。以接觸介質(包含加壓空氣及粒子)微噴砂感興趣的區域將移除感興趣的細胞，其接著被收集並且與組織裂解緩衝劑結合以打破細胞。此產生細胞裂解物溶液，其中感興趣的分析物(例如，在胰臟癌的情況中，編碼KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、BRCA1、及／或BRCA2的突變核酸；請參閱Cicenas et al., Cancers (Basel), 28, 9(5), 2017)被吸附到粒子上。為提高吸附速率，可將緩衝劑溶液的pH值調整到等於或低於二氧化矽粒子中之表面矽烷醇基團的pKa，並且增加該緩衝劑的鹽含量。然後，以溶液洗滌該等粒子而留下吸附在其表面上的分析物，且同時洗去該裂解物溶液的其他組分，例如，諸如蛋白質及脂質的非分析物。該等分析物可使用諸如PCR之下游分析的技術予以直接地分析。或者，在以諸如PCR之核酸偵測技術進行下游分析之前，用合適的洗滌溶液來洗脫吸附在二氧化矽粒子之表面上的核酸。洗脫係藉由使用低離子強度及pH值的緩衝劑來促進。若需要的話，在微噴砂之前，取樣可使用諸如雷射微解剖的微解剖技術予以預處理，用以進一步細化及／或瞄準感興趣的區域(ROI)。
第8B圖顯示依據上述方法之用以處理及／或分析例如，用於博物館檔案的固定昆蟲學取樣或包含土壤微生物的接觸載玻片之生物取樣的例示性方法。生物取樣係用包含粒子及空氣的接觸介質來微噴砂。在一些實施例中，該接觸介質包含粒子，其係非常適用以隔離存在於病患取樣中之感興趣的特定分析物。例如，已以氨基、羧基、磺酸鹽、及磷酸鹽基團功能化的鋁粒子可用以隔離特定的多肽標記。粒子微噴砂器係裝載有該等粒子且該微噴砂器的噴嘴被引導至所需的組織區域。例如，在固定昆蟲標本的情況中，所需的區域可係包含例如，腹部之感興趣的標記。以接觸介質(包含加壓空氣及粒子)微噴砂感興趣的區域將移除感興趣的細胞，其接著被收集並且與組織裂解緩衝劑結合以打破細胞。此產生細胞裂解物溶液，其中感興趣的分析物被吸附到該等粒子上(例如，肽係吸附到功能化的鋁粒子上)。為提高吸附速率，根據目標的生理化學性質(例如，在可溶蛋白質的情況中之親水性；在膜蛋白質的情況中之疏水性)，該等粒子可被衍生化。然後，以溶液洗滌該等粒子而留下吸附在其表面上的分析物，且同時洗去該裂解物溶液的其他組分，例如，諸如脂質的非分析物。該等分析物可使用諸如質譜測定法之下游分析的技術以予以直接地分析。或者，在以諸如免疫印漬術或質譜測定法之肽偵測技術進行下游分析之前，用合適的洗滌溶液來洗脫吸附在鋁粒子之表面上的多肽。若需要的話，在微噴砂之前，取樣可使用諸如雷射微解剖的微解剖技術予以預處理，用以進一步細化及／或瞄準ROI。 電腦實施的系統
第9圖係方塊圖，其描繪可實施本教示之實施例的電腦系統400。在本教示的各種實施例中，電腦系統400可包括用以傳達資訊的匯流排402或其他通訊機制，以及與匯流排402耦接用以處理資訊的處理器404。在各種實施例中，電腦系統400亦可包括記憶體，其可係隨機存取記憶體(RAM)406或其他的動態儲存裝置，其係耦接至用以決定將由處理器404所執行之指令的匯流排402。記憶體亦可在將由處理器404所執行之指令的執行期間用以儲存臨時變數或其他的中間資訊。在各種實施例中，電腦系統400可進一步包括僅讀記憶體(ROM)408或其他的靜態儲存裝置，其係耦接至用以儲存用於處理器404之靜態資訊及指令的匯流排402。諸如磁碟或光碟的儲存裝置410可被提供並耦接到匯流排402以供儲存資訊和指令之用。
在各種實施例中，電腦系統400可經由匯流排402來耦接到諸如陰極射線管(CRT)或液晶顯示器(LCD)的顯示器412，用以對電腦使用者顯示資訊。包括字母數字及其他鍵的輸入裝置414可被耦接到匯流排402，用以傳達資訊及命令選擇至處理器404。另一類型的使用者輸入裝置係諸如滑鼠、軌跡球、或游標方向鍵的游標控制416，用以傳達方向資訊及命令選擇至處理器404及用以控制顯示器412上的游標移動。此輸入裝置414通常在第一軸(亦即，x)及第二軸(亦即，y)的兩個軸中具有兩個自由度，其允許裝置指明平面中的位置。惟，應瞭解的是，本文亦考慮到允許三維(x、y及z)游標移動的輸入裝置414。
與本教示的某些實施一致地，回應於執行記憶體406中所包含的一或多個指令之一或多個序列的處理器404，結果可由電腦系統400所提供。該等指令可從諸如儲存裝置410的電腦可讀取媒體或電腦可讀取儲存媒體來讀取到記憶體406內。記憶體406中所包含之指令序列的執行可致使處理器404執行本文所敘述的該等過程。選擇性地，可使用硬佈線電路來代替軟體指令或與軟體指令結合以實施本教示。因此，本教示的實施並未受限於硬體電路及軟體之任何特定的組合。
如本文所使用之“電腦可讀取媒體”(例如，資料儲存、資料貯存、等等)或“電腦可讀取儲存媒體”的術語意指參與提供指令至處理器404以供執行之用的任何媒體。該媒體可採取許多形式，包括但不限於非揮發性媒體、揮發性媒體、及傳輸媒體。非揮發性媒體的實例可包括，但未受限於諸如儲存裝置410的光學、固態、磁性碟片。揮發性媒體的實例可包括，但未受限於諸如記憶體406的動態記憶體。傳輸媒體的實例可包括，但未受限於同軸電纜、銅佈線、及光纖，包括包含匯流排402的佈線。
電腦可讀取媒體的常見形式包括例如，磁盤、磁片、硬碟、磁帶、或任何其他的磁性媒體、CD-ROM、任何其他的光學媒體、打孔卡片、紙帶、具有孔的圖案之任何其他的實體媒體、RAM、PROM、及EPROM、FLASH-EPROM、任何其他的記憶體晶片或匣、或電腦可讀取之任何其他的有形媒體。
除了電腦可讀取媒體之外，可將指令或資料提供做為包括在通訊設備或系統中之傳輸媒體上的信號，用以提供一或多個指令的序列到電腦系統400的處理器404以供執行之用。例如，通訊設備可包括具有指示指令及資料之信號的收發器。該等指令及資料係組構以致使一或多個處理器實施本發明中所概述的功能。資料通訊傳輸連接的代表性實例可包括，但未受限於電話數據機連接、廣域網路(WAN)、區域網路(LAN)、紅外線數據連接、NFC連接、等等。
應理解的是，本文所描述之方法流程圖、圖式、及伴隨的揭示內容可使用作為獨立裝置的電腦系統400，或在諸如雲端計算網路之共享電腦處理資源的分佈式網路上實施。
本文所描述的方法論可取決於應用而藉由各種手段來實施。例如，該等方法可以以硬體、韌體、軟體、或其任何的組合實施。對於硬體實施而言，處理單元可在一或多個應用特定積體電路(ASIC)、數位信號處理器(DSP)、數位信號處理裝置(DSPD)、可編程邏輯裝置(PLD)、可場編程閘陣列(FPGA)、處理器、控制器、微控制器、微處理器、電子裝置、設計以執行本文所敘述之功能的其他電子單元、或其組合內實施。
在各種實施例中，可將本教示的該等方法實施為以諸如C、C++、Python、等等之習知編程語言所編寫的韌體及／或軟體程式和應用程式。若實施為韌體及／或軟體時，本文所敘述的實施例可在非暫態之電腦可讀取媒體上實施，其中程式係儲存用以致使電腦執行上述的方法。應瞭解的是，可將本文所描述的各種引擎設置在諸如第9圖之電腦系統400的電腦系統上，從而處理器404將根據記憶體組件406／408／410及經由輸入裝置414所提供之使用者輸入的任一者或其組合來執行該等引擎所提供的分析和決定。
雖然結合各種實施例來敘述本教示，但並不打算將本教示限制於該等實施例。相反地，本教示包含各種替代例、修正例、和等效例，如本項技藝之該等技術人員所理解地。
進一步地，在描述各種實施例中，說明書可能已經將方法及／或過程呈現為特定的步驟序列。惟，倘若方法或過程並不依賴於本文所闡述的特定步驟順序時，則該方法或過程不應受限於所描述的特定步驟序列。如本項技藝之一般技術人員所理解地，其他的步驟序列可係可能的。因此，不應該將說明書中所闡述之特定的步驟順序解讀為在申請專利範圍上的限制。此外，針對方法及／或過程的申請專利範圍不應受限於所書寫的順序中之其步驟的性能，且熟習於本項技藝之人士可易於理解的是，該等序列可予以變化並且仍然保持在該等各式各樣實施例的精神和範疇內。
本文所敘述的實施例可以以其他的電腦系統組態實踐，包括手持式裝置、微處理器系統、微處理器為基礎或可編程的消費者電子裝置、小型電腦、大型電腦、及其類似物。該等實施例亦可在分佈式計算環境中實踐，其中任務係藉由透過網路所鏈接的遠程處理裝置來執行。
還應該瞭解的是，本文所敘述的實施例可使用涉及儲存在電腦系統中之資料的各種電腦實施運算。該等運算係需要實體量的實體操控。通常，但不一定的是，該等量採取能被儲存、轉移、組合、比較、及以其他方式操控的電性或磁性信號。進一步地，所執行的該等操控經常係以諸如生產、識別、決定、或比較的術語稱謂。
形成本文所敘述之實施例的一部分之任何運算皆係有用的機器運算。本文所敘述的實施例亦有關用以執行該等運算的裝置或設備。本文所敘述的系統及方法可被專門地建構以供所需目的之用，或其可係藉由電腦中所儲存之電腦程式予以選擇性地啟動或組構的通用型電腦。特別地，各種通用型機器可以與依據本文之教示所編寫的電腦程式一起使用，或者建構用以執行所需運算之更專業的設備可能會更方便。
還可以將某些實施例實施為電腦可讀取媒體上的電腦可讀取代碼。電腦可讀取媒體係可儲存資料的任何資料儲存裝置，其可在此之後由電腦系統所讀取。電腦可讀取媒體的實例包括硬碟、網路附加儲存(NAS)、唯讀記憶體、隨機存取記憶體、CD-ROM、CD-R、CD-RW、磁帶、及其他光學的、FLASH記憶體、和非光學的資料儲存裝置。電腦可讀取媒體亦可在網路耦接的電腦系統上分佈，以致使電腦可讀取代碼被以分佈式方式儲存和執行。 實例
本文所描述之該等結構、材料、組成、及方法係打算成為本發明的代表性實例，且將瞭解的是，本發明的範疇並未受限於該等實例的範圍。熟習於本項技藝之該等人士將認可的是，本發明可以以所揭示之結構、材料、組成、及方法上的變化例實踐，並且該等變化被視為在本發明的範疇內。
實例1：處理生物取樣以獲得核酸分析物
包含感興趣之核酸的組織學取樣係依據上述方法處理。在此，接觸介質包含粒子，其係非常適合於核酸隔離中使用。該等粒子包括二氧化矽粒子或諸如二氧化矽塗層鐵磁珠粒的二氧化矽塗層粒子。粒子微噴砂器係裝載有二氧化矽粒子，用以提供隔離核酸與組織標本的高效率方式。首先，所需的組織區域係藉由具有二氧化矽粒子的微噴砂從載玻片被移除，其接著被收集並且與組織裂解緩衝劑結合以打破細胞。此產生細胞裂解物溶液，其中核酸被吸附到二氧化矽粒子上。然後，以溶液洗滌該等二氧化矽粒子而留下吸附在其表面上的核酸，且同時洗去該裂解物溶液的其他組分，諸如蛋白質及脂質。該等核酸可使用諸如PCR之下游分析的技術予以直接地分析。或者，在以諸如PCR之核酸偵測技術進行下游分析之前，用合適的洗滌溶液來洗脫吸附在二氧化矽粒子之表面上的核酸。若需要的話，取樣可使用諸如雷射微解剖的微解剖技術予以預處理。
實例2：處理生物取樣以獲得核酸及肽分析物
選擇性地，使用於上文實例1中之微噴砂的該等粒子被收集在容器中並與最適用以選擇性地結合各種潛在之分析物(例如，核酸或蛋白質)的其他粒子結合，且所產生的粒子混合物係用以隔離感興趣的分析物。如在實例1中，在此備用設置中，先選擇將結合感興趣之分析物的微噴砂粒子(例如，根據電荷或疏水性或親和力)。使微噴砂後所產生之組織和粒子的混合物與裂解緩衝劑結合以打破細胞，且接著使生成的裂解物溶液和具有寡核苷酸或抗體與其表面結合的粒子結合，其中寡核苷酸或抗體與感興趣的分析物具有特定性結合。然後，使該等粒子對經受直接分析(例如，色層分析法或光譜測定法)。或者，使該等粒子對經受一系列的步驟，以結合、洗滌、及洗脫步驟洗脫感興趣的分析物，然後使用習知之技術進行分析。最後，其中感興趣的分析物係蛋白質，也可以使該裂解物溶液經受其他的分析步驟，諸如酶測定、結合測定、功能測定、等等。
上述方法可與任何隔離及／或純化步驟結合，該等步驟可在工作流程的任何階段實施，較佳地在最終的分析步驟之前，例如，PCR(在核酸分析物的情況中)或ELISA(在蛋白質分析物的情況中)。例如，感興趣的核酸經常藉由包含以下的一系列步驟來與組織隔離：(a)組織裂解，其中組織的細胞係藉由各種方法來打破以使細胞裂開並釋出其含量到溶液內；(b)核酸吸附到固相的表面上；(c)以溶液洗滌此固相而留下核酸吸附至該固相並去除其他的生物分子；以及(d)以溶液洗滌該固相而從該固相洗脫核酸，使得所收集的洗脫液包含隔離的核酸。二氧化矽膜及二氧化矽粒子通常被使用做為此類型之過程中的固相。其他類型的粒子亦經常被使用，包括二氧化矽塗層的或聚合物塗層的鐵磁珠粒。
從前文說明中，熟習於本項技藝之人士可容易地確定該等方法的基本特徵，並可進行各種變化和修正以使其適應於各種用途和條件，而不會背離其精神及範疇。
除非另有界定，否則本文所使用之所有技術性及科學性術語具有與熟習於本發明所屬技藝的一般技術人士所通常瞭解之意義相同的意義。雖然可在本發明的實踐或測試中使用與本文所描述之該等者類似或等效的方法和材料，但合適的方法和材料係敘述於前文的段落中。此外，該等材料、方法、及實例僅係描繪性且不意圖成為限制的。如果有衝突的話，將對包括定義的本說明書進行控制。
本文所引用之所有美國專利以及公開或未公開的美國專利申請案係結合於本文以供參考。本文所引用之所有公開的外國專利以及專利申請案係結合於本文以供參考。本文所引用之所有公開的參考資料、文件、手稿、科學文獻係結合於本文以供參考。與本文所引用之科學資料庫有關的所有識別符號及登錄編號(例如，PUBMED、NCBI)係結合於本文以供參考。
400:電腦系統 402:匯流排 404:處理器 406:隨機存取記憶體(RAM) 408:唯讀記憶體(ROM) 410:儲存裝置 412:顯示器 414:輸入裝置 416:游標控制 500:圖式 502:入射輻射 504:反射照射 506:透射照射 508、700:遮罩 510、600、720:載玻片 512、1204:取樣 602、702、704、712、714:“X”區域 604:感興趣的區域(ROI) 706:“S”區域 710:遮罩載玻片 716:需要的部分 1000:取樣研磨裝置 1010:第二組件 1012:真空通道 1014:第一組件 1016:過濾器元件 1018:取樣收集開口 1020、1104:取樣刮削元件 1022:真空連接開口 1200:取樣收集系統 1202:基板 1206:真空泵 1208:開口
第1圖顯示依據各種實施例之所使用的種種刮削方法之示意圖。
第2圖提供流程圖，顯示依據各種實施例之用以數位處理基板提交的例示性過程。
第3圖提供流程圖，顯示依據各種實施例之用以收集“S”區域或去除“X”區域的改進方法。
第4圖顯示依據各種實施例之用於取樣解剖的例示性方法。
第5圖描繪依據各種實施例之在遮罩上之例示性的發射及反射之入射輻射的照射。此係因為該輻射係部分地由該遮罩所阻隔且該輻射僅可到達某些區域(例如，只有一定比例的能量可被透射做為波長的函數)。
第6圖顯示依據各種實施例之具有標記的不需要之“X”區域及感興趣之區域(ROI)的例示性載玻片。例如，該等“X”區域及ROI可藉由下文所敘述之過程來決定。
第7圖描繪依據各種實施例之其中不需要的“X”區域係藉由使遮罩疊加在基板上而從基板被去除的過程。例如，可如下文所敘述地製備遮罩。該遮罩可以覆蓋在基板上且該等“X”區域可透過各種方法來去除，如下文所敘述地。
第8A及8B圖顯示依據各種實施例之粒子微噴砂器的代表性圖式。第8A圖顯示用以處理病患取樣之本發明的PMB之代表性實施；以及8B圖顯示用以處理病患取樣之本發明的PMB之代表性實施。
第9圖顯示用於所述系統及方法的實施之電腦系統的例示性系統架構。
第10圖描繪依據各種實施例之例示性的取樣處理裝置。
第11圖描繪依據各種實施例之例示性的取樣處理裝置。
第12圖描繪依據各種實施例之例示性的取樣處理系統。

Claims (50)

  1. 一種用於生物測定之生物取樣的處理方法，包含：(a)在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；以及(b)從該生物取樣去除該接觸介質。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生物取樣被處理用於診斷感興趣之一或多個分析物的分析。
  3. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之方法，其中該生物取樣包含穿刺活檢標本、針活檢標本、新鮮組織、組織培養、冷凍組織標本、中性福馬林處理組織、器官、胞器、福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織、乙醇固定石蠟包埋(EFPE)組織、蘇木精和伊紅(H&E)染色組織、或戊二醛固定組織。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，包含使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)、不感興趣區域(RONI)、或所有區域與該接觸介質接觸；較佳地，使感興趣區域(ROI)與該接觸介質接觸。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該生物取樣包含選自基因組DNA(gDNA)、甲基化DNA、特定甲基化DNA、信使RNA(mRNA)、碎片DNA、碎片RNA、碎片mRNA、線粒體DNA(mtDNA)、葉綠體DNA(ctDNA)、病毒RNA或病毒DNA、微RNA、核醣體RNA、原位PCR產物、多腺苷酸化(polyA)mRNA、RNA／DNA雜合體、脂質、醣、蛋白質、醣蛋白、脂蛋白、磷蛋白、蛋白質的特定磷酸化或乙醯化變種、或病毒外殼蛋白之診斷感興趣的至少一分析物；較佳地，選自mRNA、gDNA、病毒DNA、或病毒RNA的核酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中在該噴砂介質中的該顆粒物質包含氧化鋁；二氧化矽；金屬基粒子；磁性或鐵磁性粒子或其組合。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其中該顆粒物質能結合到該生物取樣中的分析物或非分析物；較佳地，該顆粒物質能經由選自離子相互作用、極性–非極性相互作用、疏水相互作用、凡得瓦相互作用、化學耦合、電介質或兩性離子相互作用或其組合的相互作用來結合到該分析物。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該接觸介質包含選自加壓之氦、氬、氙、氮、二氧化碳、或其組合的加壓空氣。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中該生物取樣被安裝在基板上，例如，該基板係選自玻璃、矽、多聚賴氨酸塗層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環烯烴共聚物(COCs)、環烯烴聚合物(COPs)、聚丙烯、聚乙烯、及／或聚碳酸酯。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其中該生物取樣包含核酸分析物以及該接觸介質包含包括二氧化矽的顆粒物質。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，進一步包含微解剖，例如，雷射微解剖。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之方法，其中該接觸介質係經由真空抽吸、壓力差動或梯度、重力、輸送介質(例如，液體或氣溶膠或氣體)、或選自磁場或電場的轉移介質，而從該生物取樣被去除。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，包含(a)使該生物取樣中之不感興趣區域(RONI)與該接觸介質選擇性接觸，其中該選擇性接觸較佳地包含使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)保持不變；(b)使該生物取樣中之感興趣區域(ROI)與該接觸介質選擇性接觸，其中該選擇性接觸較佳地包含使該生物取樣中之不感興趣區域(RONI)保持不變；或(c)使該生物取樣中之ROI及RONI二者與該接觸介質接觸。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之方法，包含收集該接觸介質中之該顆粒物質；(c)選擇地製備該顆粒物質以供分析之用；以及(d)進一步選擇地分析該顆粒物質。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該製備該顆粒物質以供分析之用包含以緩衝劑(例如，裂解緩衝劑)處理該顆粒物質以及洗滌該顆粒物質以去除非分析物。
  16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中顆粒物質的該分析包含聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR(qPCR)、逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、基於核酸序列擴增(NASBA)、環介導等溫擴增(LAMP)、滾環擴增(RCA)、免疫測定、免疫PCR(iPCR)、酶活性測定、染色、成像、全基因組擴增(WGA)、原位PCR、原位WGA、聚合酶群落形成、排序、單分子排序、奈米孔分析、奈米孔排序、單分子成像、DNA球形成、電泳、微機電系統(MEMS)電泳、質譜術、色層分析法(例如，HPLC)、鄰近連接測定、電化學偵測、電漿共振(SPR)、雜合測定(例如，諸如螢光原位雜合(FISH)的原位雜合測定)FRET、細胞分類(例如，FACS)、電化學發光ELISA、及化學發光ELISA。
  17. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之方法，進一步包含使該接觸介質與富集介質混合。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該富集介質包含特定結合到該生物取樣中之感興趣分析物的物質，例如，特定結合到感興趣之蛋白抗原的抗體或特定雜合到感興趣之核酸的核酸。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之方法，其中該生物取樣包含二維組織(例如，組織剖面或切片)或三維組織(例如，組織塊)，其包含感興趣區域(ROI)及／或不感興趣區域(RONI)之明確界定的空間位置；較佳地，感興趣區域(ROI)及不感興趣區域(RONI)二者。
  20. 一種用於生物取樣中之分析物的測定方法，包含藉由以下來處理該生物取樣：(a)在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；以及(b)從該生物取樣去除該接觸介質以獲得處理的生物取樣；並測定該處理的生物取樣或該去除的接觸介質中之該分析物。
  21. 一種生物分析系統，包含：(a)第一組件，用以在足以實現該生物取樣中之組分至少部分轉移到接觸介質的條件下，使該生物取樣或其中之區域與包含顆粒物質及加壓空氣的該接觸介質接觸；(b)第二組件，用以從該生物取樣去除該接觸介質；以及(c)選擇地，第三組件，用以分析該接觸介質或該處理的生物取樣或該接觸介質及該處理的生物取樣二者中之該組分。
  22. 如申請專利範圍第21項之生物分析系統，其中該第一組件包含加壓粒子微噴砂器(PMB)，該加壓粒子微噴砂器(PMB)包含該接觸介質。
  23. 如申請專利範圍第21項之生物分析系統，其中該第二組件包含真空抽吸器、壓力差動或梯度、用以輸送該顆粒物質的介質(例如，液體或氣溶膠)、或選自磁場或電場的轉移介質。
  24. 如申請專利範圍第21項之生物分析系統，其中該選擇的第三組件包含選自聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR(qPCR)、逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、基於核酸序列擴增(NASBA)、環介導等溫擴增(LAMP)、滾環擴增(RCA)、免疫測定、免疫PCR(iPCR)、酶活性測定、染色、成像、全基因組擴增(WGA)、原位PCR、原位WGA、聚合酶群落形成、排序、單分子排序、奈米孔分析、奈米孔排序、單分子成像、DNA球形成、電泳、微機電系統(MEMS)電泳、質譜術、色層分析法(例如，HPLC)、鄰近連接測定、電化學偵測、電漿共振(SPR)、雜合測定(例如，諸如螢光原位雜合(FISH)的原位雜合測定)FRET、細胞分類(例如，FACS)、電化學發光ELISA、及化學發光ELISA的儀器。
  25. 一種用以處理附加至基板上之取樣的系統，包含： 夾持器單元，用以固定該基板； 相機，定位於該夾持器單元附近； 處理元件，組構用以去除附加至該基板上之該取樣的一部分；以及 計算裝置，通訊地連接到該夾持器單元、該相機、及該處理元件，包含： 影像捕獲引擎，組構用以使用該相機來獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像及具有第二附加取樣之第二基板的第二影像， 數位標記引擎，組構用以允許使用者產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓， 影像疊加引擎，組構用以使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊，以及 取樣去除引擎，組構用以控制該夾持器單元及該處理元件的定位，使得僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分被去除。
  26. 如申請專利範圍第25項之系統，其中該處理元件係組構用以利用機械工具來去除該取樣的該部分。
  27. 如申請專利範圍第26項之系統，其中該機械工具包含噴砂、剃刀刀片、銑具、刮匙、打孔器、刮刀、真空抽吸器、或上述組合中的至少一者。
  28. 如申請專利範圍第25項之系統，其中該處理元件係組構用以利用非機械工具來去除該取樣的該部分。
  29. 如申請專利範圍第28項之系統，其中該非機械工具包含雷射或水刀中的至少一者。
  30. 一種用以處理附加至基板上之取樣的方法，包含： 獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像； 獲得具有第二附加取樣之第二基板的第二影像； 產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓； 使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊；以及 使用處理元件以僅去除該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該去除包含以機械工具去除該第二附加取樣的該部分。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，進一步包含以噴砂、剃刀刀片、刮匙、打孔器、刮刀、真空抽吸器、或上述組合中的至少一者去除該第二附加取樣的該部分。
  33. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該去除包含以非機械工具去除該第二附加取樣的該部分。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，進一步包含以雷射或水刀中的至少一者去除該第二附加取樣的該部分。
  35. 一種用以處理附加至基板上之取樣的系統，包含： 夾持器單元，用以固定該基板； 相機，定位於該夾持器單元附近； 處理元件，組構用以供應核酸變性劑以使附加至該基板上之該取樣的一部分上之核酸變性；以及 計算裝置，通訊地連接到該夾持器單元、該相機、及該處理元件，包含： 影像捕獲引擎，組構用以使用該相機來獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像及具有第二附加取樣之第二基板的第二影像， 數位標記引擎，組構用以允許使用者產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓， 影像疊加引擎，組構用以使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊，以及 核酸變性引擎，組構用以控制該夾持器單元及該處理元件的定位，使得僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分中之核酸被變性，該核酸變性引擎包含用以執行化學分析的化學分析儀、質譜儀、及／或用以執行細胞分析的細胞分析儀。
  36. 如申請專利範圍第35項之系統，其中該核酸變性劑包含化學品。
  37. 如申請專利範圍第36項之系統，其中該化學品包含漂白劑、酸、鹼、或酶中的至少一者。
  38. 如申請專利範圍第35項之系統，其中該處理元件係組構用以利用非化學工具來去除該取樣的該部分。
  39. 如申請專利範圍第38項之系統，其中該非化學工具包含雷射、熱加熱器、射頻(RF)波、超音波、低溫、或電漿中的至少一者。
  40. 一種用以處理附加至基板上之取樣的方法，包含： 獲得具有第一附加取樣之第一基板的第一影像； 獲得具有第二附加取樣之第二基板的第二影像； 產生標記影像，其包含該第一影像及該第一附加取樣之一部分的數位輪廓； 使該標記影像疊加到該第二影像上，以致使該第一附加取樣及該第二附加取樣的影像輪廓對齊；以及 使用處理元件以使僅在該第一附加取樣的該數位輪廓內之該第二附加取樣的一部分中之核酸變性。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該變性包含以化學品暴露該第二附加取樣的該部分。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，進一步包含將該第二附加取樣的該部分暴露至漂白劑、酸、鹼、或酶中的至少一者。
  43. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該變性包含以非化學工具暴露該第二附加取樣的該部分。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，進一步包含將該第二附加取樣的該部分暴露至雷射、熱加熱器、射頻(RF)波、超音波、低溫、或電漿中的至少一者。
  45. 一種取樣研磨裝置，包含： 第一組件，在相對的兩端上具有開口； 第二組件，其係固定到該第一組件的一端，其中該第二組件進一步包含取樣收集開口，該取樣收集開口背離該第二組件被固定到該第一組件的位置，該取樣收集開口具有沿著該取樣收集開口的周邊突出的一或多個取樣刮削元件；以及 真空通道，延伸穿過該第一及第二組件，用以連接該取樣收集開口與該第一組件的另一端上之真空連接開口。
  46. 如申請專利範圍第41項之取樣研磨裝置，其中該第一及第二組件係由不同的材料所組成。
  47. 如申請專利範圍第41項之取樣研磨裝置，其中該第一及第二組件係由相同的材料所組成。
  48. 如申請專利範圍第41項之取樣研磨裝置，其中該等取樣刮削元件沿著該取樣收集開口的該周邊而被等距地間隔開。
  49. 如申請專利範圍第41項之取樣研磨裝置，其中該等取樣刮削元件沿著該取樣收集開口的該周邊而被差距地間隔開。
  50. 如申請專利範圍第41項之取樣研磨裝置，進一步包含過濾器，其係附接到該第一組件的一端上之開口。
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