CN102869975B - 用于激光切割的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于去除组织区域的系统、装置和方法。当组织保持充分冷冻时，可编程激光器可去除精确的组织区域。激光器通部分地分析代表性组织切片的参考图像而被编程。软件程序可接收试验切片的数字图像。图像中的所关注区域可由用户选择。软件程序然后可产生切割指令并且将切割指令传送至可编程激光器。激光器可被构造为形成穿孔切口，以去除所关注区域，而无需熔化已去除的部分。

Description

用于激光切割的系统和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2010年2月9日提交的题目为“灵活激光微切割”的美国临时申请第61/302,816号的优先权，并且还要求于2010年11月17日提交的题目为“分析组织的系统和方法”的美国临时申请第61/414,783号的优先权，上述提及的每个申请的全部内容结合于此作为参考。
技术领域
本文中公开的实施方式大体涉及用于切割和分析组织的系统、装置和方法。更具体地，这些实施方式涉及冷冻组织样本的高通量成像和激光切割。
背景技术
疾病（诸如癌症）通常通过检查或者分析组织活检（tissue biopsy）来识别。该组织活检可含有需要被识别以确定适合病人的治疗的多个细胞类型。组织切割是从组织样本辅助分离并去除特定细胞族群的方法。通常情况下，从病人去除组织活检，并且在显微镜下去除和分析薄组织切片。在一些情况下，组织切片被着色，或者利用特定结合剂（诸如抗体）来处理，以有助于技术人员识别癌变或者异常的活检区。在一些情况下，为了分析细胞成分（诸如核酸或者蛋白质）的表达，对组织进行分类。
不幸的是，用于识别待进一步分析的合适的活检部分的许多实验或者着色也可能实质上改变活检组织。例如，技术人员可能需要对样本着色，以识别癌变区。然而，着色本身可能使该区域中的蛋白质和核酸恶化。因此，在执行DNA、RNA或者其它分子的分析之前，技术人员不能容易地识别或者浓缩组织活检中的癌变族群。
癌症基因组图谱（“TCGA”）为记载癌症基因组的项目。TCGA需要待用于遗传分析的具有高肿瘤核酸比例和低细胞坏死水平的组织样本。因此，在分析提取之前，期望从不需要的区域中分离含肿瘤的组织区域。能够物理地分离所需要的组织区域。组织区域可由技术人员手动去除。然而，该过程可能不精确，并且高分辨率去除可能不可行。
以物理方式分离所需要的组织区域的另一项技术为激光捕获显微切割（“LCM”）。使用该技术，技术人员可通过显微镜观看载在切片上的着色组织样本。转印膜可放置在样本上。在识别所关注的细胞区域之后，技术人员可启用激光器。激光器可使转印膜局部加热，从而激活膜。活性膜可具有粘结性质，导致靶细胞或细胞区域粘到以上膜。这些细胞由此可被去除并且被进一步分析。然而，该处理通常需要组织处于室温并且对于组织样本需要固定、着色和/或脱水。因此，使用LCM可使DNA、RNA和其它分子恶化。
发明内容
本文中公开的系统、装置和方法各自具有几个方面，没有一个方面单独负责它们的期望属性。在不限制本发明的范围的情况下，现将简要讨论一些突出的特征。也设想许多其它实施方式，包括具有较少、附加以及/或者不同组件、步骤、特征、目标、利益和优点的实施方式。组件、方面和步骤也可不同地排列和排序。在考虑所述讨论之后，尤其在阅读完标题“具体实施方式”章节之后，人们应当理解，本文中所公开装置和方法的特征如何提供超过其它已知装置和方法的优点。
在一个实施方式中，组织切割方法可包括以下步骤：从组织样本获得至少一个试验切片；将试验切片成像，以获得试验切片图像；获取识别试验切片图像中所关注的目标区域的数据；以及使用获取的数据从组织样本去除所关注的目标区域。在一个方面中，组织样本可被充分冷冻。在一些方面中，在将试验切片成像之前，可将试验切片着色。获得至少一个试验切片可包括：从组织样本获得顶部切片和底部切片。可利用可编程切割装置来去除所关注的目标区域。在一些方面中，可利用激光来去除所关注目标区域。激光可包括具有大约介于9μm和12μm之间波长的红外激光。一些方面还可包括：在将试验切片成像之前，切割组织样本中的对准标记（alignment mark）。
在一些实施方式中，一种组织切割容器可包括：外壳，具有组织容纳区域；衍射表面，设置在组织容纳区域的底部处；以及组织支架，设置在组织容纳区域的上方并且包括被构造为保持组织样本的开槽。在一些方面中，衍射表面可被构造为散热。组织支架还可包括至少一个约束元件。约束元件还可包括磁铁。所述组织容器可被构造为散热。
在一个实施方式中，一种用于浓缩组织样本中所关注的细胞族群的系统可包括：激光器，被构造为切割组织样本中的对准标记；数字成像器，被构造为将具有对准标记的组织样本切片进行成像；组织分析模块，被构造为从切片图像接收指示所关注细胞区域的数据；以及激光器，被构造为数据并且从组织样本切割所关注的细胞区域，以浓缩组织样本中所关注的细胞族群。在一些方面中，组织分析模块可为基于浏览器的软件模块。激光器可被构造为切割组织样本中“L”形对准标记。激光器可被构造为通过沿所关注细胞区边界切割穿孔切口从组织样本切割所关注的细胞区域。在一些方面中，数字成像器可被构造为将切片图像存储在连接至组织分析模块的服务器中。组织分析模块可被构造为读取鼠标移动，以接收指示所关注细胞区的数据。在激光读取数据并且切割所关注区域之前，数据可针对激光器被配置。在一些方面中，组织分析模块可通过组织切片图像分析来自动识别所关注区域。
附图说明
从结合附图的以下描述和所附权利要求中，本发明的前述和其它特征将变得更加充分显而易见。附图公开了说明性实施方式。它们不阐述所有实施方式。可另外或者替代性使用其它实施方式。应当理解，这些附图仅仅描述根据本发明的几个实施方式，并不被视为限制本发明范围；将通过使用附图更具体和更详细地描述本发明。
图1是示出了组织切割系统的一个实施方式的框图；
图2是示出了用于对组织样本划线以提供对准基准的方法的实施方式的框图；
图3是示出了用于对组织样本的试验切片着色并成像的方法的实施方式的框图；
图4是在软件环境中显示的组织切片图像（tissue section image）的屏幕截图；
图5A至图5B是示出了已由用户定义的所关注区域高亮化的组织切片图像的屏幕截图；
图6是根据一个实施方式的图像分析软件程序的屏幕截图；
图7A至图7E是组织切片的屏幕截图并且示出了用于确定要从组织样本去除的区域的处理的一个实施方式；
图8A是示出了计算机控制的组织激光切割系统的一个实施方式的框图；
图8B是根据一个实施方式的具有基座和盖体（lip）的组织固定件（tissue mount）的分解透视图；
图8C是根据一个实施方式的组织固定件的俯视图；
图9是在由激光切割装置部分切割之后的组织样本的俯视图；
图10A是可选实施方式组织固定件的透视图；
图10B是沿图10A中所示的线10B-10B截取的组织固定件的侧视图。
具体实施方式
在以下详细的说明中，参考形成该说明的附图。在附图中，除非另有明确指出，相似的符号通常表示相似的组件。在详细说明、附图和权利要求中描述的说明性实施方式并不意味着限制。可利用其它实施方式，并且在不脱离本文中所提出的主题的精神或范围的情况下，可做出其它改变。应当容易理解，如本文中大体上描述并且附图中所示的，本发明的各方面可以以多种不同的构造配置、取代、组合和设计，所有这些都明确地被考虑并成为本发明的一部分。
一个实施方式为一种系统，该系统使冷冻组织活检（frozen tissuebiopsy）利用激光产生的对准标记被标记，使得组织切片的原始位置随后可与剩余的活检样本相匹配。在本实施方式中，冷冻组织活检被放置到组织支架（tissue holder，组织架）中，激光切割样本中的多个对准孔（alignmenthole）。然后取得冷冻组织的切片，并且剩余活检可被放回冷藏箱储存。如下文中将更完整解释的，由于组织切片和剩余活检具有对准标记，所以组织切片的任何分析随后可与剩余活检相匹配。
在一个实施方式中，一旦已经去除经标记的组织切片，为了直观展现任何所关注区域，对切片进行处理。例如，肿瘤特定着色或者荧光肿瘤特定单克隆抗体可与组织切片接触，以直观对比切片的任何肿瘤部分与非肿瘤部分。然后，在一个实施方式中，使用切片成像装置来取得经处理的切片的高分辨率图像。
一旦拍摄到组织图像，图像就可显示在计算机屏幕上，并且被用户（诸如医生或者病理学家）观看到。用户可使用屏幕上工具来高亮化或者识别所关注区域。例如，所关注区域可由受过培训的用户根据着色、细胞结构和细胞特性来选择。例如，用户可使用计算机鼠标或者触控板在该区域或者与被认为癌变的活检区域相对应的图像区域周围绘制线。在计算机或者服务器上运行的界面模块可提供屏幕上绘制工具，并且接收表示用户所选区域的数据。界面模块可捕获组织切片图像与由用户绘制的线的相对位置。
一旦用户已经完成对图像中所关注区域高亮化，可存储与由用户高亮化的所关注区域有关的数据。然后，该数据可被用于从剩余冷冻组织活检中去除浓缩部分。在一个实施方式中，剩余的冷冻组织活检然后被放置在激光切割系统内的组织支架中。来自用户的数据与对准数据一起被加载到激光切割系统中，该对准数据使由用户分析的组织切片图像与冷冻组织活检对准。然后，激光切割系统使用对准信息以及来自用户的输入数据可从冷冻组织活检精确地切割所关注区域。该处理针对精确的所关注区域浓缩活检。在浓缩程序之前和之后，活检组织可保持冷冻并且未处理。
在一个实施方式中，使用通过互联网连接的计算机，提供用户组织切片图像。在用户计算机或者服务器上运行的软件可以是基于浏览器的，从而可在各种计算机、平板计算机和其它电子装置上可用。
本发明中所描述的主题的特定实施可被实施为实现以下潜在优点中的一个或多个。在一些实施方式中，在整个去除过程中，所切割的组织区未经化学处理，和/或保持充分冷冻。因此，复原核酸的质量和数量可得到改良。使用一个试验组织切片（即，显微镜载玻片）作为基准来切割未直接观看到的另一个冷冻组织切片也可能够高效利用病理学家的时间。本文中公开的主题可提供可同时自动切割高达多个的冷冻肿瘤标本的高通量装置，从而提高效率。所公开的主题也可导致针对TCGA的合格案例的数目增加，并且能够收集针对TCGA以前未考虑的许多案例。
图1示出了根据一个实施方式的组织切割系统。实验室100包括耦接至服务器142的成像系统110。服务器142可耦接至激光切割装置140。用于存储组织切片数据的数据库120以及被构造为在界面模块150和151中显示的组织分析网络模块144在服务器142内。实验室100还可包括样本存储单元160。实验室100连接至可由界面模块150、151访问的网络130。如图所示，界面模块150、151包括浏览器152a和152b以及组织分析显示模块153a和153b，浏览器152a和152b以及被下载用于由组织分析网络模块144显示的组织分析显示模块153a和153b。
在一个实施方式中，组织分析网络模块144通过用于显示组织图像的Adobe技术用PHP写入。关于PHP语言的另外的信息可在php.net网站上找到。在其它实施方式中，组织分析显示模块用写入，用于在用户计算机上的浏览器152a和152b中高效下载和运行。
在一个实施方式中，成像系统110被构造为拍摄组织切片的高分辨率数字图像。可利用各种技术并且以各种分辨率来拍摄图像。该成像系统包括可从Vista、CA的Aperio Technologies公司购得的ScanScope数字扫描仪或者本领域众所周知的任何其它系统。成像系统110可创建装有如下文讨论的组织样本的载玻片的数字图像。图像可为彩色并且具有足够高分辨率，以可视化单个细胞或者细胞族群。在一个实施方式中，成像系统110包括用于观看图像的显示器、用于暂时或者永久存储图像的存储器、处理器以及用于控制成像器的操作系统。成像系统110可连接至网络130，以允许用户访问和操纵图像。在一个实施方式中，网络130为互联网的一部分。
在一个实施方式中，数据库120耦接至成像系统110，并且被构造为存储代表数字图像的数据。数据库120可从成像系统110接收和存储数字图像数据，并且经由网络130将数字图像数据发送至界面模块150和151。如图所示，数据库120耦接至激光切割装置140，使得存储在数据库120中的数据可被用于控制激光切割装置140。数据库120可存储代表激光切割成形的数据，诸如笛卡尔坐标数据或者CNC指令。数据库120可经由网络130接收切割指令，存储切割指令，并且将切割指令发送至激光切割装置140。
在一个实施方式中，激光切割装置140被构造为切割组织。激光切割装置140可以是可编程的，并且可从数据库120以及/或者网络130接收切割指令。激光切割装置140可包括安装至机械组件的激光器，该机械组件被构造为在切割表面上纵向和横向地移动激光器。在一个实施方式中，移动是CNC控制的。激光切割装置140可被编程为移动至特定位置并且在特定位置处激活激光器。这些位置在本文中可被称为“切割位置”。
在一个实施方式中，样本存储单元160是被构造为保存组织样本的冷藏箱。冷藏箱可为例如-10°C、-20°C、-80°C或者其它任何合适的冷藏箱。在一个实施方式中，样本存储单元160为液氮存储单元。
在一个实施中，图1所描绘的系统可如下工作。组织样本可被提供给实验室100。组织样本可充分冷冻。可去除组织样本的试验切片。组织样本可被存储在样本存储单元160中。试验切片可被着色，以有助于识别细胞级结构。可利用成像系统110来可视化试验切片并对其成像。图像可被保存在数据库120中。图像可被上传到网络130，并且由用户利用界面模块150和151（例如，基于网络的软件程序）来分析。在图像中可识别所关注区域，并且与所关注区域相对应的信息可被发送至数据库120。这种信息可被处理以产生可被发送至激光切割装置140的切割指令。组织样本可从样本存储单元160中去除，并且被放置在激光切割装置140中。然后，可通过利用切割指令编程的激光切割装置140来去除所关注区域。
图2示出了用于对组织样本划线以提供参考轴的方法。参考轴可被用于使组织样本中的区域的相对定位相关。参考轴可被用于利用成像分析软件来对准图像。例如，参考点或者参考轴可被用于建立坐标系。图像分析软件可根据参考轴计算相对距离。这些信息可被变换为可编程激光切割装置的切割指令。
在图2所示的实施方式中，该处理通过提供组织样本200开始。组织样本200可被充分冷冻。在一些实施方式中，组织样本200保持低于大约–10°C。该处理通过将组织样本200放置在激光切割装置中而继续。激光切割装置可被编程为移动至多个切割位置。激光器220可被构造为穿透小于组织样本在切割位置下的总厚度。
在一个实施方式中，激光器220被构造为在不损坏核酸的情况下切割组织。在一个实施方式中，激光器220发射红外光谱的波长，例如，大约9μm至12μm范围内的波长。在一个实施方式中，激光器220为发射大约10.6μm波长的二氧化碳（CO2）激光器。激光器220的功率和速度设定可以为可调整和可编程的。合适的激光切割装置140可为VLS6.60，其具有可从Scottsdale AZ的通用激光系统获得的60瓦特CO2自由空间气体条形激光和2”对焦镜头。激光器可被构造为通过快速蒸发冷冻组织中的水来切割冷冻组织。未实施激光器的其它合适装置和方法也可被用于切割组织。例如，具有附加路由器或者刀片的CNC机器可被用作替代品。
在一个实施方式中，在组织样本200中沿两条大致垂直的线做出对准标记210。如图所示，在组织样本200的顶部表面250上做出对准标记。然而，可在任何表面和/或多个表面上做出对准标记。该处理通过从激光切割装置中移除组织样本200来继续。
该处理通过从组织样本200中去除试验切片200a而继续。试验切片200a可利用冷冻切片机装置或者利用本领域中众所周知的任何合适的装置或者方法来切割和去除。组织样本200的其余部分可被存储在样本存储器中，同时试验切片200a被进一步处理并成像。尽管图2描绘了从组织样本200的顶部表面250去除的一个试验切片200a，但可从组织样本200的任一表面去除多个试验切片。例如，可去除顶部切片、底部切片、以及/或者侧面切片的任何组合。也可以相对于顶部表面或侧表面的任何角度或者从任何深度去除试验切片。如下文将详细描述的，在一个实施方式中，从样本200的顶部和底部切割试验切片，并且使用这两个试验切片来确定切割区域。在一个实施方式中，从顶部和侧部切割试验切片，以更好地理解组织样本200的三维结构。
如图2所示，试验切片200a包括“L”形构造的对准标记210。对准标记210可用作对准基准，因为它们在试验切片200a和样本200的图像中可见。切片和样本的轴可利用对准标记210对准，以提供可确定激光器的切割指令的已知基准。
图3示出了对组织样本200的试验切片200a着色和成像的方法。试验切片200a载于载玻片300上。试验切片200a可利用本领域中众所周知的任何着色剂被着色，以提高对比度或者突出所关注的结构。在一个实施方式中，试验切片200a通过苏木精和伊红（H&E）着色剂被着色。诸如如特殊着色、免疫组织化学着色、荧光原位杂交、福斯特共振能量转移（“FRET”）或者显色原位杂交的其它识别技术也可被用于确定所关注区域。该处理通过利用成像系统310对着色载玻片成像以在组织切片200a的显示器320上获得图像而继续。成像系统可基于各种微观方法，包括明视场、暗视场、相衬、荧光、共焦激光扫描和电子显微。成像系统可为Aperio的ScanScope XT。该图像可使用诸如Aperio的ImageScope或者Webscope的软件来分析。该图像可被存储，随后传播给用户，诸如病理学家。
图4示出了在本发明一个实施方式的软件环境下操纵的试验切片图像的屏幕截图。在所示实施方式中，通过从在实验室100中的服务器142上运行的组织分析模块144下载数据来访问组织分析显示模块153。如图所示，试验切片图像400包括对准标记210。运行在浏览器152a中的指令允许图像旋转，以将“L”形对准标记210和原点轴410对准。原点轴410可为激光切割指令提供参考点。组织分析显示模块153a可利用对准提示（alignment prompt）450来提示用户。在所示的实施方式中，对准提示450提示用户选择三个点来形成原点。例如，用户可选择三个对准标记上的三个点，以通过在所选点上移动鼠标并且点击来建立原点。分析显示模块可以在反馈提示460中向用户提供反馈。例如，软件可验证三个点形成以大约90度相交的两条线。用户可清除所选的访问，或者如果对准令人满意，则选择完成。
图5A至图5B示出了具有用户定义的所关注区域510a和510b的试验切片图像500a和500b的图像。图像分析软件允许用户使用鼠标或者触控板利用例如光标550在试验切片500a和500b中选择所关注区域510a和510b。可通过在相应的所选区域的周围形成线条520a和520b来识别所关注区域510a和510b，由此包围所关注区域。在一个实施方式中，所关注区域510a和510b可能已经被发现具有高比例癌细胞。在一个实施方式中，所关注区域可能不包括坏死区域。在一个实施方式中，所关注区域可能不包括基质细胞。应当认识到，使用所述系统，病理学家可使用他们计算机根据病人以及用于分析的组织样本来包围和限定任何预选的所关注区域。例如，针对癌变组织将分析怀疑具有肺癌的病人的肺组织样本。
也可通过图像分析软件在图像中识别所关注区域。该软件可采用可基于细胞大小、形状、颜色、密度以及/或者其它特性来识别所关注区域的细胞识别算法。在一个实施方式中，软件推荐所关注区域给用户。然后，用户可接受所推荐的区域或者修改所关注区域。在一个实施方式中，软件可被培训为识别所关注区域。例如，软件可存储由用户选择的所关注区域的图像信息。然后，该存储的图像信息可由软件使用以与新图像相比较，并且基于与先前所选的所关注区域的比较来进行推荐。在一个实施方式中，软件是全自动的。例如，软件可分析图像，选择所关注区域、制定切割指令以及将切割指令发送至切割装置。
图6示出了根据一个实施方式的图像分析软件程序的屏幕截图。该屏幕截图包括选择窗口601和观看窗口602，观看窗口602显示试验切片图像。选择窗口601被用于选择试验切片图像中的所关注区域。例如，用户可通过点击并拖动鼠标光标以形成包围所关注区域605a和607a的线602a和608a，而在选择窗口601中选择该区域。相对应的区域可以作为线602b和608b以及所关注区域605b和607b出现在观看窗口602中。如果所选区域不能够通过切割装置来切割，则软件程序可例如通过警报620来警告用户。例如，如果切割装置待切割的所选区域形状太小或者太大或者太复杂，则所述区域可能无法切割。所选区域的大小还可通过程序来计算，并且通过区域显示器625来显示。
继续参考图6，可为注解和/或为待输入的数据结果提供注释区域630。标度615可被提供为显示试验切片的相对大小。激光厚度显示器610也可提供激光切割线的相对厚度。用户输入635可清除或者完成所选区域。在所示的实施方式中，软件程序在诸如微软Internet或者苹果的浏览器上运行。可提供针对各种研究相关数据元素的用户数据输入600。显示或者输入到用户数据输入600中的数据可含有基于其它输入以所选区域的形式和/或形状自动计算的分量。
图7A至图7E示出了根据一个实施方式的确定待从组织样本中去除的一个或多个区域的方法。图7A示出了从组织样本的顶部侧700去除的试验切片，而图7B示出了从同一组织样本的底部侧702去除的试验切片。所示的试验切片是被着色并成像的。图7C示出了在从组织样本的顶部侧710和712去除的试验切片中的用户选择的所关注区域，而图7D示出了在从组织样本的底部侧711和713去除的试验切片中的用户选择的所关注区域。坏死区域可被可视化并被避免。然后，如图7E所示，可组合顶部图像和底部图像。图像分析软件可确定重叠的用户选择的所关注区域720和722。然后，这些重叠的所关注区域720和722可被用于产生切割指令。切割指令可被发送至切割装置，并且从组织样本可仅去除重叠区域。因此，可更有可能去除同质细胞族群。
图8A示出了根据一个实施方式的激光切割系统的示意图。激光切割系统包括激光切割装置800，激光切割装置800耦接至诸如个人计算机的控制器810。控制器810也可耦接至网络130和数字成像系统110。激光切割装置800可包括激光器220和样本固定件（sample mount）850。激光器220可在下面的样本固定件850上方在至少两个方向上移动。激光器的移动和切割特性可由控制器810编程和/或控制。
图8B示出了根据一个实施方式的组织支架或固定件的透视图。在所示的实施方式中，样本固定件850包括组织容器860和组织支架880。组织支架880可包括开槽882，以容纳组织样本。组织样本可被冷冻。组织样本可利用组织胶合剂（诸如Tissue-Tek O.C.T.）或者本领域中众所周知的任何其它合适的化合物而被固定在开槽882内。组织样本的一部分可在开槽882之上以及/或者之下突出。突出部分可利用冷冻切片机装置被切片并且被去除。组织支架880可被存储在冷藏箱中。
组织支架880可包括至少一个约束元件884，约束元件884被构造为将组织支架880固定至组织容器860。约束元件884可包括磁铁。组织支架880还可包括被构造为将组织支架880与组织容器860对准的定位元件888，诸如柱或者孔。在一个实施方式中，定位元件888包括被构造为被组织容器上的柱容纳的孔。组织支架880可被构造为散热。组织支架880可利用任何合适金属来形成。在一个实施方式中，组织支架880由铝制成。
在一个实施方式中，组织容器860包括容纳区域862。当组织支架880固定到组织容器860时，容纳区域862可位于组织支架880中的开槽882下方。容纳区域862可包括被构造为衍射光的表面863。例如，表面863可被划线或者包括凹槽，或者利用光吸收材料涂覆。组织容器860可包括至少一个约束元件864以及/或者定位元件868，以将组织支架对准以及/或者将组织支架880固定在容纳区域862上的位置中。组织容器860可被构造为散热。例如，组织容器860基本上可为中空和/或由冷却系统包围。在一个实施方式中，组织容器860内部和侧面与干冰接触。组织容器860可由任何合适的金属形成。在一个实施方式中，组织容器860由铝制成。
图8C示出了根据一个实施方式的组织固定件的俯视图。组织样本801可固定在组织支架880中的开槽内，并且利用组织胶合剂890固定在开槽内。组织支架880可以以先前做出对准标记的相同定向放置在组织容器860的上方。多个样本固定件可被设置在激光切割装置中，使得一次可切割多个组织样本。
图9示出了在由激光切割装置部分切割之后的组织样本的俯视图。组织样本900可利用组织胶合剂890固定在组织支架的开槽内。如图所示，激光切割装置可被构造为沿所关注区域910的边界制作穿孔920。例如，激光可通过组织样本900，并且激光器可被激励以在形成包围或者围绕所关注区域910的线的位置处切割各个穿孔920。例如，可沿包围所关注区域910的线大约每100微米、200微米、300微米或者500微米制成激光形成的穿孔920。此外，激光器可被构造为穿透小于组织样本900的总深度，使得在每个穿孔上多次激励激光器以切割通过组织样本900的总深度。激光器可在组织样本900上进行多次穿过，并且激光器可在相同的切割位置处被激励。在一些实施中，激光器可在组织样本900上进行20至200次穿过，例如，大约60次。通过在组织900中的各穿孔920处进行多次切割，系统可允许组织样本900和所关注区域910保持充分冷冻。相反，在一些实施方式中，当激光器被用于以单次穿过完全切割通过组织样本900时，由于激光高温，当它切割各穿孔时，组织可能开始熔化。在切割之后，所关注区域910可掉落或者被轻拍到下面的组织容器中。各穿孔的间距可被调整为适应在激光切割之后需要采用多大压力从剩余组织样本去除所关注区域。
图10A示出了根据另一实施方式的组织固定件的透视图。在所示的实施方式中，组织固定件990包括包围组织容器960的绝缘外壳910。腔体985形成在组织容器960和绝缘外壳910之间，并且可填充有干冰以及/或者异丙醇，以使组织样本保持在充分冷冻状态。风扇（未示出）可被设置为使组织固定件990上的冷空气循环。组织容器960可包括用于将组织支架对准并固定至组织容器960的定位元件988。组织支架880的一个实例可在图8B中找到。组织容器960包括可引导至组织容纳区域的开槽982。
图10B示出了沿图10A中所示的线10B-10B截取的组织固定件990的截面侧视图。组织容器960和绝缘外壳910之间的腔体985被示出为充满冷却液950。组织支架980可定位和固定在组织容器960上。绝缘罩970可设置在绝缘外壳910的上方，以进一步绝缘组织容器960。绝缘罩970可具有激光可从中通过并切割保持在组织支架980中的组织样本的开槽975。切割的组织部分可掉落到组织容纳区域962中，并且保持充分冷冻，直至被取回。
使用该系统
在本发明一个实施方式中，可如下使用组织切割系统。技术人员以冷冻组织块作为开始。组织块利用O.C.T.固定至组织支架880，同时其在干冰上。然后，将组织支架固定至组织容器860，并且将其放置在激光切割装置中。组织容器被放置在干冰上，以使组织块保持冷冻。磁铁被用于将组织支架固定至组织容器。组织支架被锁住或被构造为使得其只可在一个唯一取向上固定至组织容器，以确保组织块可与系统容易重新对准。然后，激光切割装置被编程为切割组织块中的对准标记。对准标记为“L”形状，使得后续的组织切片可与其剩余的组织块重新对准。
然后，从激光切割装置移除组织支架，并且从组织样本的顶部表面去除组织切片，同时组织样本保留在组织支架中。试验切片利用冷冻切片机来去除，并且仍胶合在架中的剩余组织块被存储在-80°C冷藏箱中。试验切片然后被着色，并且被固定至载玻片。载玻片然后被放置在数字载玻片成像系统中，并且着色的组织切片的高分辨率图像被捕获到所述系统中。
图像被输入至组织分析软件程序中，之后被操纵为在屏幕上更加可回看。技术人员将组织切片图像带到屏幕上，并且对准标记被可视化。相对于在组织切片图像中清晰示出的对准标记，可做出图像原点。然后可分析或者存储图像，用于以后传送给病理学家。病理学家然后可在组织分析显示模块中访问组织图像，该组织分析显示模块被编程为在病理学家的计算机的网络浏览器中运行。组织分析显示模块允许病理学家基于可视化着色剂在图像中选择所关注区域。这些区域由病理学家左击计算机鼠标并且在所关注区域周围拖动线条来选择。一旦病理学家在组织分析显示模块中已经识别出所关注区域，与包围所关注区域的线条的坐标相对应的数据被存储在由技术人员可访问的服务器上。
技术人员将冷冻的剩余组织样本回传到激光系统中，并且使用由病理学家产生的数据来切割所关注区域周围的穿孔图案。根据冷冻组织样本的厚度，来自病理学家或者技术人员的激光切割指令还可包括激光功率设定以及激光在样本上所进行的次数。
然后，可通过按压所关注区域或者多个所关注区域来机械地去除所关注区域，直至它们挣脱从冷冻组织样本带来的塞子。然后，当所关注区域针对病理学家所需的细胞类型已经被浓缩时，所关注区域由技术人员进一步分析。例如，可使用本领域众所周知的适用于冷冻试样的任何试剂盒来分析所关注的组织区域。可收集组织分子（包括DNA、RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物和代谢物）并且使用例如Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、DNA/RNA/蛋白质序列分析、DNA/RNA/蛋白质微阵列、功能蛋白质测定、酶联免疫吸附试验（“ELISA”）以及/或者PCR试验来分析，以识别所关注区域内的细胞特征。
尽管本方法已经通过处理冷冻组织来描述，但预处理要求和灵活切割环境的缺乏使其适合于任何类型的组织，无论冷冻或者室温。例如，使用相邻切割的冷冻部分作为模板，可在37°C并且高湿度下切割新鲜切除的组织片。在该情况下，可收集活细胞的纯族群用于细胞培养。
除了切割，本文中公开的装置可利用其它方法。例如，激光器或者某个其它装置可被用于在不去除细胞的情况下杀死它们，或者被用于引入随后可检测到的标记。
实例1
预筛选组织，并且含有70%以上的肿瘤细胞核的组织被提交给TCGA。使用上述的激光切割方法和装置来切割没有完整BCR病理过程的十二例肾细胞癌和肺腺癌。十个先前不合格的实例针对分子提取而变得合格。
观察到对组织学中涉及的时间或劳动没有影响，并且观察到病理回顾所需的努力减少。切割步骤所需的附加时间最小（每次研究大约15分钟至20分钟）。一般情况下，激光切割方法和装置能够几乎消除坏死，并且能够消除足够正常的细胞核以使病例合格。这归因于在大区中出现的坏死趋向以及正常细胞核的扩散分布（尤其是血管内皮细胞）。
微观评估表明，在目标的50μm内始终如一地完成切割。对切割区域中的组织的可见损害是最小的（损害从切割线延伸大约10μm至15μm）。
实例2
使用上述激光切割方法和装置来切割肾细胞癌变部分。从去除的所关注区域中提取并分析RNA。结果与在相同协议下收集并且在TCGA协议下提取的肾细胞癌变情况队列相比较。RNA和DNA经由当前TCGA SOP（Allprep+mirVana）来提取。RNA质量经由如由生物分析仪（Agilent）评定的RNA完整性数目（RIN）来评定。两个组织集具有从同一分布绘制的RIN，并且经由Welch的T-Test（p>0.05）观察到RIN没有明显差异。因此，上述激光切割方法和装置可浓缩肿瘤细胞核的冷冻标本，而不会引起由Agilent生物分析仪可测量的RNA下降。
以上描述详细地描述本文中公开的系统、装置和方法的某些实施方式。应当理解，然而，不管以上描述如何详细地出现在文本中，装置和方法也可以以许多方式实践。也如上所述，应当注意，当描述本发明的某些特征或者方面时，特定术语的使用不应被视为暗示所述术语在本文中重新定义为限于包括与所述术语相关联的技术的特征或方面的任何特定特性。因此，本发明的范围应当根据所附权利要求及其任何等价物来解释。
本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可做出各种修改和改变。所述修改和改变意为包括在由所附权利要求限定的实施方式范围内。本领域技术人员还应当理解，一个实施方式中包括的部分可以与其它实施方式互换；可以以与其它所示实施方式的任何组合包括来自所示实施方式的一个或多个部分。例如，本文中所述以及/或者图中所示的各种组件中的任一个可被组合、互换或者从其它实施方式排除。
就本文中任何复数以及/或者单数术语的使用而言，本领域技术人员可从复数转化为单数以及/或者从单数转化为复数，这适用于上下文以及/或者应用。为了清楚起见，各种单数/复数排列组合可在本文中明确阐述。
本领域技术人员应当理解，一般情况下，本文中，尤其是所附权利要求（例如，所附权利要求的前序部分）中使用的术语，一般是指“开放式”术语（例如，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当解释为“具有至少一个”，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”等）。本领域技术人员还应当理解，如果特定数目的引入权利要求详述是有意的，则这种有意将在权利要求中明确详述，并且在没有所述详述的情况下，这种有意不存在。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可包括介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，以引入权利要求详述。然而，这些短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一个（a）”或者“一个（an）”的权利要求详述引入限制包括对只含有一个所述详述的实施方式的所述引入权利要求详述的任何特定权利要求，即使相同权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或者“至少一个”以及诸如“一个（a）”或者“一个（an）”不定冠词（例如，“一个（a）”以及/或者“一个（an）”通常应被解释为意味着“至少一个”或者“一个或多个”）；针对用于介绍权利要求详述的定冠词使用同样适用。此外，即使明确详述特定数目的引入权利要求详述，本领域技术人员应当认识到，所述详述通常应当解释为意味着至少详述数目（例如，在没有其它修改的情况下，“两个详述”裸述通常意味着至少两个详述或者两个或则两个以上详述）。此外，在使用类似于“A、B和C中至少一个等”惯例的情况下，一般情况下，所述结构在这个意义上意味着本领域技术人员应该理解所述惯例（例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C以及/或者具有A、B和C等的系统）。在使用类似于“A、B或者C中至少一个等”惯例的情况下，一般情况下，所述结构在这个意义上意味着本领域技术人员应该理解所述惯例（例如，“具有A、B或者C中至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C以及/或者具有A、B和C等的系统）。本领域技术人员还应当理解，不论在描述、权利要求或者附图中，提出两个或者两个以上不同术语的几乎所有析取词以及/或者短语应当理解为考虑包括术语其中之一、术语任何一个或者两个术语的可能性。例如，短语“A或者B”应当理解为包括“A”或者“B”或者“A和B”的可能性。
以上描述和权利要求可能是指“连接”或者“耦接”在一起的元件或者特征。如本文中使用，除非另有明确说明，“连接”意味着一个元件/特征直接或者间接连接至另一个元件/特征，并且不一定以机械方式。同样，除非另有明确说明，“耦接”意味着一个元件/特征直接或者间接耦接至另一个元件/特征，并且不一定以机械方式。因此，尽管图中所示各种示意图图示元件和组件的实例配置，但是在实际实施方式中，另外中间元件、装置、特征或者组件可能存在（假设所示电路的功能不会受到不利影响）。
本领域技术人员应当理解，可使用各种不同技术来表示信息和信号。例如，在整个以上描述中可能引用的数据、指令、命令、信息、信号、比特、符号和芯片可由电压、电流、电磁波、磁场或者粒子、光场或者粒子或者它们的任何组合来表示。
本领域技术人员还应该理解，结合本文中公开的方面描述的各种说明性逻辑方块、模块、内核、处理器、构件、电路和逻辑步骤中任何一个可实施为电子硬件（例如，数字实施、模拟实施或者两个组合，它们可使用源编码或者某个其它技术来设计），包括指令的程序或者设计代码的各种形式（为了方便起见，在本文中可能是指“软件”或者“软件模块”或者两者组合）。为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，各种说明性组件、方块、模块、电路和步骤在上文在它们功能方面已经大体上描述。所述功能实施为硬件或者软件取决于特定应用以及施加于整个系统上的设计约束。本领域技术人员可针对各特定应用以不同方式实施所述功能，但是所述实施决定不应解释为导致偏离本发明范围。
结合本文中公开的方面描述的各种说明性逻辑方块、模块、内核和电路可在集成电路（IC）、接入终端或者接入点内实施或者由集成电路（IC）、接入终端或者接入点执行。IC可包括通用处理器、数字信号处理器（DSP）、应用特定集成电路（ASIC）、现场可编程门阵列（FPGA）或者设计为执行本文中所述功能的其它可编程逻辑装置、离散门或者电晶体逻辑装置、离散硬件组件、电气组件、光学组件、机械组件或者它们任何组合，并且可执行驻留在IC内、IC外部的代码或者指令或者两者。逻辑方块、模块、内核和电路可包括天线以及/或者收发器，以与网络内或者装置内各种组件通信。通用处理器可为微处理器，但是在替代性实施方式中，所述处理器可为任何处理器、控制器、微控制器或者状态机。处理器也可实施为计算装置的组合，例如，DSP和微处理器、多个微处理器、一个或者一个以上微处理器与DSP内核的组合或者任何其它所述构成。模块或者内核的功能可以本文中教导的某个其它方式实施。此外，本文中描述的功能（例如，与一个或者一个以上附图有关）在一些方面中可对应于所附权利要求中类似指定的功能的“构件”。
应当理解，任何公开方法中步骤的任何特定次序或者层次为示例方法实例。基于设计偏好，应当理解，当在本发明范围内保留时，方法中步骤的特定次序或者层次可重新排列。所附方法权利要求以示例次序呈现各种步骤元件，并且并不意味着限制于呈现的特定次序或者层次。
所述功能可以硬件、软件、固件或者它们任何组合来实施。如果以软件实施，功能可存储于有形非临时性计算机可读介质上，或者作为一个或者一个以上指令或者代码被传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，包括有利于计算机程序从一个地方转移到另一个地方的任何介质。存储介质可为可由计算机存取的任何可用介质。通过举例方式，并且并不限制，所述计算机可读介质可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或者其它光盘存储器、磁盘存储器或者其它磁性存储装置或者可用于以指令或者数据结构形式携带或者存储所需程序码并且可由计算机存取的任何其它介质。计算机可读介质可为以非临时性或者暂时性计算机可读介质形式。此外，任何连接可适当地称为计算机可读介质。例如，如果使用同轴电缆、光纤电缆、双绞线、数字用户线（DSL）或者诸如红外、无线电和微波的无线技术从网站、服务器或者其它远程源传送软件，那么同轴电缆、光纤电缆、双绞线、DSL或者诸如红外、无线电和微波的无线技术被包括在介质定义中。如本文中使用，磁盘和光盘包括紧凑型光盘（CD）、激光光盘、光学光盘、数字多功能光盘（DVD）、软盘和蓝光光盘，其中，磁盘通常以磁力再现数据，而光盘利用激光再现数据。以上组合也应当包括在计算机可读介质范围内。总之，应当理解，计算机可读介质可在任何合适计算机程序产品中实施。
尽管本文已经公开了各个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文中公开的各种方面和实施方式是为了说明的目的，并且并不旨在限制由所附权利要求指示的真正范围和精神。

Claims (15)

1.一种组织切割方法，包括以下步骤：
提供组织样本；
切割组织样本中的对准标记；
从组织样本获得至少一个试验切片，其中所述试验切片和所述组织样本具有对准标记，以及其中所述对准标记定义对准基准，所述对准基准使得所述试验切片能在初始定位上与所述组织样本对准；
对所述试验切片进行成像，以获得试验切片图像；
获取识别所述试验切片图像中所关注的目标区域的数据；以及
利用所述获取的数据从所述组织样本中去除所述关注的目标区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织样本被充分冷冻。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在对所述试验切片成像之前，将所述试验切片着色。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，获得至少一个试验切片包括从所述组织样本中获得顶部切片和底部切片。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，利用可编程切割装置来去除所述关注的目标区域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，利用激光来去除所述关注的目标区域。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述激光包括具有在9μm和12μm之间的波长的红外激光。
8.一种用于浓缩组织样本中所关注的细胞族群的系统，包括：
激光器，被构造为切割所述组织样本中的对准标记，以便当从所述组织样本移除试验切片时，所述试验切片和所述组织样本具有对准标记，而且其中所述对准标记定义对准基准，所述对准基准使得所述试验切片能在初始定位上与所述组织样本对准；
数字成像器，被构造为对具有对准标记的组织样本切片进行成像；
组织分析模块，被构造为从切片图像接收指示所关注的细胞区域的数据；以及
所述激光器被构造为读取所述数据并且切割来自所述组织样本的所关注的细胞区域，以浓缩所述组织样本中的所关注的细胞族群。
9.根据权利要求8所述的系统，其中，所述组织分析模块为基于浏览器的软件模块。
10.根据权利要求8所述的系统，其中，所述激光器被构造为切割所述组织样本中的“L”形对准标记。
11.根据权利要求8所述的系统，其中，所述激光器被构造为通过沿所述所关注的细胞区域的边界切割穿孔切口，以切割来自所述组织样本的所述关注的细胞区域。
12.根据权利要求8所述的系统，其中，所述数字成像器被构造为将所述切片的所述图像存储在连接至所述组织分析模块的服务器中。
13.根据权利要求8所述的系统，其中，所述组织分析模块被构造为读取鼠标移动，以接收指示所述所关注的细胞区域的所述数据。
14.根据权利要求8所述的系统，其中，在所述激光器读取所述数据并且切割所述关注区域之前，所述数据针对所述激光器被配置。
15.根据权利要求8所述的系统，其中，所述组织分析模块可通过所述组织切片的图像分析来自动识别所述关注区域。
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