KR20210003288A - 사전-분석 기판 프로세싱을 위한 시스템들 및 방법들 - Google Patents

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Abstract

본 개시에 제시된 일부 실시형태들은 자동화된 조직 해부 (ATD) 시스템에 관한 것이다. ATD 시스템은, (a) 저장될 영역으로서의 ROI 또는 ROI 들만으로 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플을 추출하고; 그리고 (b) 비관심 영역 (RONI) 에서 핵산 함량을 제거 또는 분해하고 표준 현미경 기판으로부터 모든 조직 샘플을 특정 용기에 수집하기 위해, 비-접촉 및/또는 기계적 방법을 사용하여 기판 상에 병리학자 디지털 마크 또는 펜 마크로부터 기판에 대한 해부를 수행하는 원 스톱이고, 잠재적으로 저-비용 시스템이다.

Description

사전-분석 기판 프로세싱을 위한 시스템들 및 방법들
관련 출원들에 대한 상호 참조
분야
본 개시는 일반적으로 조직학 및/또는 병리생물학의 분야들에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 일부 실시형태들에서, 기판, 예를 들어 조직학 검체과 같은 생물학적 기판에서 관심 영역들 (ROI) 및 비관심 영역들 (RONI) 을 분리 및 단리하는데 유용할 수도 있는, 사전-분석 기판 프로세싱 시스템들 및 관련된 방법들에 관한 것이다.
다운스트림 분석을 위한 조직학적 샘플들의 준비 및/또는 프로세싱을 위한 스크래핑 (scraping) 절차들의 번거로운 성질을 해결하기 위해 다양한 방법들이 제안되었다. 예를 들어, 진공 블라스팅 기법이 권장되었다; 그러나, 이들은 산업 환경에서만 배포가능하고 따라서 값비싼 도구 및 기구를 필요로 한다. 또한, 현재 현미경 유리 슬라이드에 장착된 기판과 호환가능한 진공 블라스팅 기술이 없다. 유사하게, 예를 들어 실리카 입자, 실리카-코팅된 입자, 또는 폴리머-코팅된 강자성 비드에 의한, 샌드블라스팅과 같은 입자-기반 블라스팅 방법은, 다운스트림 분석 단계들의 구현 전에 관심 영역들 (ROI) 로부터 입자들의 분리를 필요로 한다.
현재 조직 해부 프로세스는 면도날을 사용하여 기판으로부터 "S"(즉, ROI) 영역들을 직접 수집하는, 완전히 수동이다. 예를 들어, 기판 서브미션 (submission) 을 위한 종래의 워크플로우는, 사용자가 표준 규격품 마킹 펜을 사용하여 착색된 슬라이드 상의 병리학적 관심 영역 마킹을 착색되지 않은 슬라이드로 전달하는 전부 수동 프로세스를 포함한다. 그 후 사용자는 면도날 또는 이에 상응하는 것을 사용하여 마킹된 착색되지 않은 기판 상의 관심 영역을 스크래핑한다.
이러한 설명된 수동 프로세스는 조직 스크래핑의 일관성 및 정확성에 영향을 미치는, 조작자의 손/눈 조정에 전적으로 의존하여 조작자 정확성을 제한한다. 이 프로세스는 또한 유리 표면에 가해지는 일정한 힘이 조작자에 의한 열상 및 인체공학적 쟁점들 (예를 들어, 심피 터널) 을 야기할 수도 있기 때문에 인체공학/안전성 쟁점들을 도입한다.
디지털 병리학의 현재 구현은 조직학/병리학 워크플로우의 많은 영역들을 개선했다. 그러나, 여전히 일부 중요한 영역의 충족되지 않은 요구들이 있다. 하나의 충족되지 않은 요구는 일부 기판 서브미션들은 상업적 디지털 병리학 시스템을 사용하여 디지털로 프로세싱될 수 없다는 것이다. 상당수의 경우들이 여전히 수동 유리 워크플로우 프로세싱을 필요로 한다. 따라서, 완전한 디지털 워크플로우를 달성하기 위해 이 프로세스를 변환하는 방식에 대한 요구가 존재한다.
본 개시에 제시된 일부 실시형태들은 자동화된 조직 해부 (ATD) 시스템에 관한 것이다. ATD 시스템은, (a) 저장될 영역으로서의 ROI 또는 ROI 들만으로 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플을 추출하고; 그리고 (b) 비관심 영역 (RONI) 에서 핵산 함량을 제거 또는 분해하고 표준 현미경 기판으로부터 모든 조직 샘플을 특정 용기에 수집하기 위해, 비-접촉 및/또는 기계적 방법을 사용하여 기판 상에 병리학자 디지털 마크 또는 펜 마크로부터 기판에 대한 해부를 수행하는 원 스톱이고, 잠재적으로 저-비용 시스템이다.
본 개시의 소정의 양태들에 따라, ATD 는 기판 상의 ROI 를 스크래핑하기 위해 디지털 병리학 프로세스와 병합된다. 또한 바람직한 "S" (즉, ROI) 영역들을 수집하거나 실현가능한 방식으로 원하지 않는 "X" 영역들을 제거하기 위한 시스템들 및 방법들이 개시된다. 설명된 시스템들 및 방법들은 슬라이드 이미지들을 디지털화하고 다운스트림 스크래핑 프로세스들을 단순화하기 위한 저 비용 플렉서블 시스템을 제공한다.
일부 실시형태들에서, 시스템들은 다음을 수행할 수도 있다: (a) 적절한 배율로 착색된 및 착색되지 않은 슬라이드 이미지들을 캡처, (b) 펜 마킹을 디지털 마킹으로 디지털화, (c) 오브젝트 기반 또는 다른 알고리즘을 수행하여 기판 상의 마킹 좌표들을 연관된 기판들에 매칭, (d) 마킹된 샘플 ROI 를 용기로 추출, (e) RONI 에서의 샘플을 제거 또는 RONI 에서 핵산을 분해하고 모든 샘플들 (예를 들어, 조직) 을 용기에 수집, 및 (f) 샘플을 용해하고 용해물을 출력.
이 기술은 현재 수동 프로세스들이 다음과 같은 소정의 단점들 또는 제한들을 갖기 때문에 유용할 수도 있다: (a) 열악한 품질, (b) 조작자 제한, (c) 작업 위험, (d) 인체공학, 및/또는 (e) 안전성. 예를 들어, 수동 해부 방법들은 결과의 일관성 및 정확성에 영향을 미칠 수도 있는 개별 조작자 손/눈 조정에 전적으로 의존한다. 이들은 또한 일관된 정확성을 달성하기 위해 전용 훈련 계획을 필요로 할 수도 있다. 유리 표면에 가해진 일정한 힘으로 수동 해부를 수행하는 것은 또한 일정 기간에 걸쳐 조작자에 의한 인체공학적 쟁점들을 야기할 수 있다: 예를 들어, 손목뼈 터널 증후군과 같은 손목 부상. 따라서, 많은 실험실에서, 조작자들은 또한 부상 방지를 돕도록 수동 해부를 수행하는데 소요되는 시간을 제한해야 한다. 안전성의 측면에서, 이들은 또한 예를 들어, 열상을 야기할 수 있는 부러진 날로부터 면도날 부상의 위험이 있다. 그럼에도 불구하고, 완전 수동 방법은 예를 들어, 표준 규격품 마킹 펜을 사용하여 병리학자로부터의 관심 영역을 핸드 마킹하는 현재 랩 프로세스에서 보통 사용되며, 엔드 사용자는 기판 상의 관심 영역을 스크래핑하기 위해 면도날 또는 이에 상당하는 것 (즉, 메스) 을 사용할 수도 있다.
샘플 해부를 위한 자동화된 시스템이 이용가능하지만; 이러한 시스템은 비용이 높고 및/또는 스루풋이 낮을 수 있다. 예를 들어, AVENIO® MILLISECT™ 시스템 (Roche GmbH) 은 기판 상의 관심 영역의 자동화된 수집을 수행하며 따라서 상기 수동 수집에 의한 쟁점들을 회피한다. 그러나, 이 시스템은 비용이 높고, 느리게 동작하며, 고 용적 실험실을 위해 많은 시스템들 및 조작자들을 필요로 할 수도 있다. 따라서, 이 시스템은 고-스루풋 샘플 분석에 적합하지 않을 수도 있다. 레이저 캡처 해부 시스템은 또한 여러 제조자들로부터 이용가능하다 (예를 들어, Leica LMD6-7 시스템들). 이들 시스템들에서, UV 레이저가 사용되어 ROI 를 컷 스루 (예를 들어, 경계를 프로파일링 또는 스코어링) 하고 IR 레이저가 사용되어 접착 캡을 팽창시켜 기판으로부터 ROI 를 제거하며 (예를 들어, 기판으로부터 검체 방출을 개선하기 위해); 시스템은 또한 후속 분석을 위해 수집될 수 있는 맞춤형 기판을 필요로 한다.
본 개시는 어려움을 야기할 수도 있는 샘플 해부의 여러 영역들을 언급하며, 실시형태들은 상이한 레벨의 시스템 복잡성을 포함할 수도 있다. 본 시스템들 및 방법들은 수동 분리를 회피하고 표준 슬라이드 장비를 사용하면서, 더 높은 스루풋 및 이에 따른 더 빠른 샘플 해부를 제공할 수도 있는, 기판 상의 관심 영역 (ROI) 을 분리하는 방식들을 제공한다.
본 개시는 예를 들어, 다음을 포함하는 기판 상으로 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 시스템들을 포함한다: (a) 기판을 고정하기 위한 홀더 유닛; (b) 홀더 유닛에 근접하여 포지셔닝된 카메라; (c) 기판 상으로 부착된 샘플의 일부를 제거하도록 구성된 프로세싱 엘리먼트; 및 (d) 홀더 유닛에 통신가능하게 연결된 컴퓨팅 디바이스.
양태들에 따라, 카메라 및 프로세싱 엘리먼트는: (a) 카메라를 사용하여 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지 및 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 캡처 엔진, (b) 사용자가 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성할 수 있게 하도록 구성된 디지털 마커 엔진, (c) 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 회전 및 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이 매핑하도록 구성된 이미지 오버레이 엔진, 및 (d) 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부만이 제거되도록 프로세싱 엘리먼트 및 홀더 유닛의 포지셔닝을 제어하도록 구성된 샘플 제거 엔진을 포함한다.
따라서, 본 명세서의 일부 시스템 실시형태들은 샘플 상의 하나 이상의 ROI들 (본 명세서에서는 또한 "S" 샘플로 지칭됨) 과 슬라이드 상의 다른 샘플들 (본 명세서에서는 "X" 샘플로 표기됨) 사이의 인터페이스를 묘사하는 마크를 디지털화하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 인터페이스들은 예를 들어, 샘플 상의 가상 마크의 생성을, 동일한 샘플 상에 또는 그 샘플과 수동으로 정렬된 병렬 샘플 상에 이전에 배치된 수동 마크를 가상으로 추적하는 것에 의해, 또는 병렬의, 이전에 수동으로 마킹된 샘플의 타겟 샘플로의 자동화된 정렬 뿐만 아니라 하나의 샘플에서 다른 샘플로 마크를 가상으로 추적하는 것에 의해, 허용하는 알고리즘을 포함한다. 이러한 수단은 또한 이들 액션들을 수행하는데 필요한 기계적 컴포넌트들을 포함한다.
본 명세서의 일부 시스템 실시형태들은 슬라이드 상의 임의의 X 샘플로부터 하나 이상의 ROI들을, ROI(들)에 영향을 주지 않으면서 이 X 샘플을 절제하거나 기계적 프로세스들을 통해 선택적으로 제거함으로써 분리하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 수단은 예를 들어, 펄스 레이저, 워터 제트, 또는 무선 주파수의 소스, 밀링, 전류, 초음파, 마이크로-블라스팅, 마이크로비드 블라스팅, 입자-블라스팅, 샌드 블라스팅, 절제 (ablating), 또는 동물 세포들을 용해 또는 절제할 수 있는 열 에너지를 포함한다. 이러한 수단은 또한 레이저 또는 워터 제트와 같은 메커니즘을, 예를 들어 특히 ROI(들)를 회피하면서 X 샘플로 지향시킬 수도 있는 이들 방법들 및 알고리즘들을 채용하는데 필요한 기계적 컴포넌트들을 포함한다.
본 명세서의 일부 시스템 실시형태들은 X 샘플 또는 그 내의 거대분자들 또는 세포들을 선택적으로 화학적 분해함으로써 X 샘플들로부터 하나 이상의 ROI들을 분리하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 수단은 화학물질들을 ROI(들) 을 회피하면서 특히 X 샘플에 지향시킬 수도 있는 그러한 방법들 및 알고리즘들을 채용하는데 필요한 기계적 컴포넌트들 뿐만 아니라 선택적으로 X 샘플에는 지향되고 슬라이드 상의 ROI(들) 에는 지향되지 않는 표백제, 강산, 강염기 또는 하나 이상의 효소들을 포함한다.
일부 시스템 실시형태들에서, 시스템은 또한 기판 상의 하나 이상의 ROI들의 직선 패스 수집을 위한 수단을 포함한다. 예를 들어, 직선 패스는 모든 샘플들이 수집될 때 마킹들을 포함하지 않을 수도 있다. 일단 X 가 없어지거나 제거되면, 모든 나머지 샘플들 (예를 들어, S 영역들만) 이 수집될 때 직선 패스 방법이 활용될 수도 있다. 예시적인 수단은 예를 들어, 유리 슬라이드로부터 ROI 를 추출하기 위해 접착 매질을 사용하거나, ROI 샘플에 대해 경쟁 표면 또는 매질 또는 용액 (예를 들어, 입자 마이크로-블라스팅) 을 제공하기 위해 하전된 표면 또는 매질, 진공으로 샘플을 제거할 수 있게 하는 진공 소스, 펀치, 스쿠프, 큐렛, 면도날과 같은 블레이드, 입자 블라스팅을 포함한다. 이러한 수단은 또한 상기 엘리먼트들의 사용을 자동으로 제어하는데 필요한 다른 기계적 엘리먼트들을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 시스템은 ROI 샘플을 용기에 배치하기 위한 수단을 포함한다. 예시적인 수단은 예를 들어, 슬라이드로부터 제거된 ROI 샘플을 취하고 이를 웰 구조, 튜브 또는 바이알과 같은 용기 내에 또는 용기 상으로 놓는 프로세스를 자동으로 제어할 수도 있는 기계적 컴포넌트들을 포함한다.
본 개시의 양태들은 다음을 포함하는 기판 상에 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 방법을 기재한다: (a) 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지를 획득하는 단계; (b) 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하는 단계; (c) 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성하는 단계; (d) 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하는 단계; 및 (e) 프로세싱 엘리먼트를 사용하여 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부만을 제거하는 단계.
본 개시의 추가 양태들은 다음을 포함하는 기판 상으로 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 시스템을 기재한다: (a) 기판을 고정하기 위한 홀더 유닛; (b) 홀더 유닛에 근접하여 포지셔닝된 카메라; (c) 기판 상으로 부착된 샘플의 일부 상의 핵산들을 변성시키기 위해 핵산 변성제를 공급하도록 구성된 프로세싱 엘리먼트; 및 (d) 홀더 유닛에 통신가능하게 연결된 컴퓨팅 디바이스.
양태들에 따라, 카메라 및 프로세싱 엘리먼트는: (a) 카메라를 사용하여 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지 및 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 캡처 엔진, (b) 사용자가 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성할 수 있게 하도록 구성된 디지털 마커 엔진, (c) 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하도록 구성된 이미지 오버레이 엔진, 및 (d) 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 X 또는 (RONI) 부분에서의 핵산만이 변성되도록 프로세싱 엘리먼트들 및 홀더 유닛의 포지셔닝을 제어하도록 구성된 핵산 변성 엔진을 포함하고, 핵산 변성 엔진은 화학적 분석을 수행하기 위한 화학적 분석기, 질량 분석기 및/또는 세포 분석을 수행하기 위한 세포 분석기를 포함한다.
부가 양태들은 다음을 포함하는 기판 상으로 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 방법을 기재한다: (a) 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지를 획득하는 단계; (b) 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하는 단계; (c) 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성하는 단계; (d) 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하는 단계; 및 (e) 프로세싱 엘리먼트를 사용하여 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부에서 핵산만을 변성시키는 단계.
또 다른 양태에서, 조직학적 샘플들, 예를 들어 FFPF 슬라이드들 또는 고정된 조직들을 프로세싱하기 위한 시스템들, 방법들 및 장치들이 개시된다. 이러한 시스템들, 방법들, 및 장치들은 기존의 입자 마이크로블라스터 (PMB) 및 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 밀링 기술의 한계들을 극복하고 사용의 용이성 그리고 또한 분석 워크플로우의 감도 및/또는 특이성을 크게 개선한다. 특히, 본 개시는 PMB 및 CNC 밀링 기술의 변형들에 관한 것이며, 이는 비-관심 영역 (RONI) 의 효율적인 제거 또는 조직학적 샘플들로부터의 관심 영역 (ROI) 의 수집을 허용하면서, 동시에 분석물 (예를 들어, 핵산, 단백질, 및 다른 거대분자) 의 손실을 최소화한다. 기재된 방법들은 간단하고 다운스트림 분석 절차들과 원활하게 통합될 수 있다.
본 개시에 따라, 조합 블라스팅 기법은 기판, 예를 들어 유리 슬라이드 상에 장착된 생물학적 검체을 프로세싱하는데 사용된다. 블라스팅 재료 (즉, 입자들) 의 조합 및 가압된 공기는 시스템으로 강제-공급되고 환자 조직 ROI 를 향해 지향된다. PMB 는 PMB 의 벽들 내에 블라스팅된 환자 조직을 포함하는 방식으로 구조화된다. 다음으로, 진공이 그 후 사용되어 영역으로부터 블라스팅된 조직을 취하고 이를 용기 내에 축적한다. 필터가 사용되어 용기를 파티셔닝하여 진공 축적은 허용하지만 그 부분들이 진공 펌프에 도달하지 못하도록 할 수도 있다. 이 방법은 폐기물 영역 ("X") 또는 관심 영역 ("S"), 또는 모든 관심 내용물들을 블라스팅하는데 사용될 수 있다. 블라스팅 매질들은, 예를 들어 알루미늄 산화물; 실리콘 이산화물; 금속성-기반 입자들; 자성 또는 강자성 입자들, 염, 이온성 입자들, 동결건조된 시약 입자들을 포함하는, 상이한 재료들로 이루어질 수 있다.
(예를 들어, 다운스트림 프로세싱 전에) 최종 관심 타겟으로부터 입자들의 분리를 필요로 하는 기존 PMB 기술과 대조적으로, 본 개시의 시스템들 및 방법들은 입자들 자체가 다운스트림 프로세스에서 사용되기 때문에 프로세싱된 샘플로부터 입자들의 분리를 필요로 하지 않는다.
인스턴트 방법들이 또한 다중 프로세싱 단계들의 단일 단계로의 통합을 허용하기 때문에 기존 방법들보다 유리한데, 이 단일 단계는 교차-오염 감소를 돕고 또한 크게 감소화되고, 효율적이며, 저렴한 방식으로 조직 검체로부터 핵산과 같은 분석물의 수집을 허용한다. 조작자 고려사항들을 감소시킴으로써, 현재 개시된 시스템들 및 방법들은 면역조직화학, 뉴클레아제 보호 분석 등과 같은 조직학적 분석의 가변성 감소 및/또는 재현성 증가를 돕는다.
본 기술의 또 다른 이점은 본 개시의 시스템들 및/또는 방법들이 기존 분석 워크플로우, 예를 들어 다운스트림 분석 절차들, 예컨대 현미경, 혼성화 분석, 시퀀싱, 크로마토그래피, 분광법, ELISA 등에 모듈식으로 적용될 수 있다는 것이다. 이는 현재 개시된 시스템들 및/또는 방법들이 다양한 사전- 및 사후-프로세싱 단계들에 원활하게 통합될 수 있는 것을 의미한다. 원하는 경우, 시스템들 및 방법들은 다양한 다운스트림 분석 단계들에서, 스캐폴드로서 또한 적용될 수도 있다.
인스턴트 방법들은 다양한 절제 입자들을 활용하기 위해 용이하게 수정 또는 적응될 수 있으며, 예를 들어 상이한 사이즈, 형상 또는 재료의 입자들이 타겟 조직 메이크 및/또는 조성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 관심 타겟에 의존하여, 소수성, 극성, 무극성, 이온 교환 가능 입자들, 친화성 특정 입자들, 유전체 입자, 동결건조된 입자들 등과 같은 대안의 유형의 재료들이 사용될 수도 있다. 또한, 본 명세서에 채용된 시약들 및 시스템들은 상대적으로 저렴하기 때문에, 본 기술은 분석 워크플로우에 쉽게 통합되어 분석 비용을 과도하게 높이지 않으면서 성능을 현저하게 개선할 수 있다.
따라서 본 개시는 부분적으로 다음의 비제한적인 실시형태들에 관련된다:
일부 실시형태들에서, 본 개시는 생물학적 분석을 위해 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 방법은 (a) 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는 접촉 매질과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 생물학적 샘플로부터 접촉 매질을 제거하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위해 프로세싱된다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물의 분석을 위한 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 생물학적 샘플은 펀치 생검 검체, 바늘 생검 검체, 신선한 조직, 조직 배양물, 냉동 조직 검체, 중성 포르말린-처리된 조직, 기관, 세포기관, 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직, 왁스-고정 포매 조직, 에탄올-고정 파라핀-포매 (EFPE) 조직, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 착색 조직, 또는 글루타르알데히드 고정 조직을 포함한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 FFPF 또는 EFPE 조직을 포함한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 종양 조직, 퇴행성 조직, 염증 조직 (예를 들어, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, 크론 병 (Crohn’s disease) 등과 같은 염증성 질환을 겪고 있는 환자의 조직) 의 세포를 포함한다.
본 개시는 제 1 및 제 2 컴포넌트를 포함하는 샘플 밀링 디바이스에 관련된다. 제 1 컴포넌트는 양쪽 단부들 상에 개구들을 포함한다. 제 2 컴포넌트는 제 1 컴포넌트의 일 단부에 고정되고 제 2 컴포넌트가 제 1 컴포넌트에 고정되는 곳으로부터 떨어져 대향하는 샘플 수집 개구를 갖는다. 샘플 수집 개구는 샘플 수집 개구의 둘레를 따라 돌출하는 하나 이상의 샘플 스크래핑 엘리먼트들을 갖는다. 진공 채널은 제 1 및 제 2 컴포넌트들을 통해 연장하여 제 1 컴포넌트의 다른 단부 상의 진공 연결 개구와 샘플 수집 개구를 연결한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 관심 영역 (ROI), 비-관심 영역 (RONI), 또는 생물학적 샘플에서의 모든 영역들을 접촉 매질과 접촉시키는 것; 바람직하게는 접촉 매질과 관심 영역 (ROI) 을 접촉시키는 것을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 생물학적 샘플은 게놈 DNA (gDNA), 메틸화된 DNA, 특정 메틸화된 DNA, 메신저 RNA (mRNA), 단편화된 DNA, 단편화된 RNA, 단편화된 mRNA, 미토콘드리아 DNA (mtDNA), 엽록체 DNA (ctDNA), 바이러스성 RNA 또는 바이러스성 DNA, microRNA, 리보솜 RNA, 인 시튜 PCR 제품, polyA mRNA, RNA/DNA 하이브리드, 지질, 탄수화물, 단백질, 당단백질, 지질단백질, 인단백질, 특정 인산화된 또는 아세틸화된 단백질의 변이체 또는 바이러스성 외피 단백질로부터 선택된 적어도 하나의 관심 진단 분석물; 바람직하게는 mRNA, gDNA, 바이러스성 DNA 또는 바이러스성 RNA 로부터 선택된 핵산을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 블라스트 매질에서의 미립자 물질은 알루미늄 산화물; 실리콘 이산화물; 금속성-기반 입자들; 자성 또는 강자성 입자들 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 미립자 물질은 생물학적 샘플에서의 분석물 또는 비-분석물에 결합할 수 있고; 바람직하게, 미립자 물질은 이온성 상호작용, 극성-무극성 상호작용, 소수성 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 화학적 커플링, 유전체 또는 쌍성이온 상호작용 또는 이들의 조합으로부터 선택된 상호작용을 통해 분석물에 결합할 수 있다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 접촉 매질은 가압된 헬륨, 아르곤, 제논, 질소, 이산화탄소, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 가압된 공기를 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 생물학적 샘플은 기판 상에 장착되며, 예를 들어 기판은 유리, 실리콘, 폴리-L-리신 코팅된 재료, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 사이클릭 올레핀 공중합체 (COC), 사이클릭 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 종이 및/또는 폴리카보네이트로부터 선택된다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 생물학적 샘플은 핵산 분석물을 포함하고 접촉 매질은 실리카를 포함하는 미립자 물질을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 마이크로-해부, 예를 들어 레이저 마이크로-해부를 더 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 접촉 매질은 진공화 (vacuuming), 압력 차 또는 구배, 중력, 수송 매질 (예를 들어, 액체 또는 에어로졸 또는 기체), 또는 자기장 또는 전기장으로부터 선택된 전달 매질을 통해 생물학적 샘플로부터 제거된다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, (a) 생물학적 샘플에서의 비-관심 영역 (RONI) 을 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계로서, 선택적 접촉은 바람직하게는 생물학적 샘플에서의 관심 영역 (ROI) 을 터치되지 않은 채로 두는 것을 포함하는, 상기 비-관심 영역 (RONI) 을 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계; (b) 생물학적 샘플에서의 관심 영역 (ROI) 을 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계로서, 선택적 접촉은 바람직하게는 생물학적 샘플에서의 비-관심 영역 (RONI) 을 터치되지 않은 채로 두는 것을 포함하는, 상기 관심 영역 (ROI) 을 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계; 또는 (c) 생물학적 샘플에서의 ROI 및 RONI 양자 모두를 접촉 매질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 접촉 매질에서 미립자 물질을 수집하는 단계를 포함하고; (c) 옵션으로, 분석을 위해 미립자 물질을 준비하는 단계를 포함하며, 그리고 (d) 추가 옵션으로, 미립자 물질을 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 분석을 위해 미립자 물질을 준비하는 단계는, 버퍼 (예를 들어, 용해 버퍼) 로 미립자 물질을 처리하는 단계 및 미립자 물질을 세척하여 비-분석물을 제거하는 단계를 포함한다. 바람직하게 이러한 실시형태 하에서, 미립자 물질의 분석은, 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR), 정량적 PCR (qPCR), 역 전사효소 PCR (RT-PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 롤링 서클 증폭 (RCA), 면역분석, 면역PCR (iPCR), 효소 활성도 분석, 착색, 이미징, 전체 게놈 증폭 (WGA), 인 시튜 PCR, 인 시튜 WGA, 폴로니 형성, 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱, 나노포어 분석, 나노포어 시퀀싱, 단일-분자 이미징, DNA 볼 형성, 전기영동, MEMS (microelectromechanical systems) 전기영동, 질량 분석, 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC), 근접 결찰 분석, 전기화학적 검출, 플라스몬 공명 (SPR), 혼성화 분석 (예를 들어, 형광 인 시튜 혼성화 (fluorescence in situ hybridization ; FISH) 와 같은 인 시튜 혼성화 분석) FRET, 세포 분류 (예를 들어, FACS), 전기화학발광 (electrochemiluminescence) ELISA, 및 화학발광 ELISA 를 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 방법은 접촉 매질을 농축 매질과 혼합하는 단계를 더 포함한다. 바람직하게, 이러한 실시형태 하에서, 농축 매질은 생물학적 샘플에서의 관심 분석물에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 관심 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 관심 핵산에 특이적으로 혼성화하는 핵산을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들에 따른 생물학적 분석, 예를 들어 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위한, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법에 관련되며, 생물학적 샘플은 관심 영역 (ROI) 및/또는 비-관심 영역 (RONI); 바람직하게는 ROI 및 RONI 양자 모두의 잘 정의된 공간적 위치를 포함하는 2 차원 조직 (예를 들어, 조직 절편 또는 슬라이스) 또는 3 차원 조직 (예를 들어, 조직 블록) 을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 본 개시는 (a) 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는 접촉 매질과 생물학적 샘플을 접촉시키는 것; 및 (b) 생물학적 샘플로부터 접촉 매질을 제거하는 것에 의해 생물학적 샘플을 프로세싱하여 프로세싱된 생물학적 샘플을 획득하는 단계; 및 제거된 접촉 매질 또는 프로세싱된 생물학적 샘플에서의 분석물에 대해 분석하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서의 분석물을 분석하는 방법에 관련된다.
일부 실시형태들에서, 본 개시는 (a) 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는 접촉 매질과 생물학적 샘플 또는 그 내의 영역을 접촉시키기 위한 제 1 컴포넌트; (b) 생물학적 샘플로부터 접촉 매질을 제거하기 위한 제 2 컴포넌트; 및 (c) 옵션으로, 프로세싱된 생물학적 샘플 또는 접촉 매질 또는 접촉 매질 및 프로세싱된 샘플 양자 모두에서 컴포넌트을 분석하기 위한 제 3 컴포넌트를 포함하는, 생분석 시스템에 관련된다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들의 생분석 시스템에 관련되며, 제 1 컴포넌트는 접촉 매질을 함유하는 가압된 입자 마이크로-블라스터 (PMB) 를 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들의 생분석 시스템에 관련되며, 제 2 컴포넌트는 진공, 압력 차 또는 구배, 미립자 물질 (예를 들어, 액체 또는 에어로졸) 을 수송하기 위한 매질, 또는 자기장 또는 전기장으로부터 선택된 전달 매질을 포함한다.
본 개시는 전술한 또는 다음의 실시형태들의 생분석 시스템에 관련되며, 옵션의 제 3 컴포넌트는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR), 정량적 PCR (qPCR), 역 전사효소 PCR (RT-PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 롤링 서클 증폭 (RCA), 면역분석, 면역PCR (iPCR), 효소 활성도 분석, 착색, 이미징, 전체 게놈 증폭 (WGA), 인 시튜 PCR, 인 시튜 WGA, 폴로니 형성, 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱, 나노포어 분석, 나노포어 시퀀싱, 단일-분자 이미징, DNA 볼 형성, 전기영동, MEMS (microelectromechanical systems) 전기영동, 질량 분석, 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC), 근접 결찰 분석, 전기화학적 검출, 플라스몬 공명 (SPR), 혼성화 분석 (예를 들어, 형광 인 시튜 혼성화 (fluorescence in situ hybridization ; FISH) 와 같은 인 시튜 혼성화 분석) FRET, 세포 분류 (예를 들어, FACS), 전기화학발광 (electrochemiluminescence) ELISA, 및 화학발광 ELISA 로부터 선택된 기구를 포함한다.
본 개시에 제시된 일부 실시형태들은 자동화된 조직 해부 (ATD) 시스템에 관한 것이다. ATD 시스템은, (a) 저장될 영역으로서의 ROI 또는 ROI 만으로 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플을 추출하고; 그리고 (b) 비관심 영역 (RONI) 에서 DNA 를 제거 또는 분해하고 표준 현미경 기판으로부터의 모든 조직 샘플을 특정 용기에 수집하기 위해 비-접촉 및/또는 기계적 방법을 사용하여 기판 상에 병리학자 디지털 마크 또는 펜 마크로부터 기판에 대한 해부를 수행하는 원 스톱이고, 잠재적으로 저-비용 시스템이다.
도 1 은 다양한 실시형태들에 따라 활용되는 다양한 스크래핑 방법들의 개략적인 표현들을 나타낸다.
도 2 는 다양한 실시형태들에 따른, 기판 서브미션들을 디지털로 프로세싱하기 위한 예시적인 프로세스를 나타내는 플로우챠트를 제공한다.
도 3 은 다양한 실시형태들에 따른, "S" 영역들을 수집 또는 "X" 영역들을 제거하기 위한 개선된 방법들을 나타내는 플로우챠트를 제공한다.
도 4 는 다양한 실시형태들에 따른, 샘플 해부를 위한 예시적인 방법들을 나타낸다.
도 5 는 다양한 실시형태들에 따른, 마스크 상의 입사 방사선의 예시적인 투과 및 반사 조사를 도시한다. 이는 방사선이 마스크에 의해 부분적으로 차단되고 방사선이 소정의 영역들에만 도달할 수 있기 때문이다 (예를 들어, 에너지의 소정의 퍼센티지만이 파장의 함수로서 송신될 수도 있다).
도 6 은 다양한 실시형태들에 따른, 관심 영역 (ROI) 및 원하지 않는 "X" 영역들이 마킹된 예시적인 슬라이드를 나타낸다. 예를 들어, "X" 영역들 및 ROI 는 하기에 설명된 프로세스에 의해 결정될 수도 있다.
도 7 은 다양한 실시형태들에 따른, 기판 상부에 마스크를 오버레이함으로써 원하지 않는 "X" 영역들이 기판으로부터 제거되는 프로세스를 도시한다. 예를 들어, 마스크는 하기에 기재된 바와 같이 준비될 수도 있다. 마스크는 기판 상으로 오버레이될 수도 있고, "X" 영역들은 하기에 설명되는 바와 같이, 다양한 방법들을 통해 제거될 수도 있다.
도 8a 및 도 8b 는 다양한 실시형태들에 따른, 입자 마이크로-블라스터들의 대표적인 예시들을 나타낸다. 도 8a 는 환자 샘플들을 프로세싱하기 위한 개시의 PMB 의 대표적인 구현을 나타내고; 도 8b 는 환자 샘플들을 프로세싱하기 위한 개시의 PMB 의 대표적인 구현을 나타낸다.
도 9 는 기재된 시스템들 및 방법들의 구현을 위한 컴퓨터 시스템의 예시적인 시스템 아키텍처를 나타낸다.
도 10 은 다양한 실시형태들에 따른, 예시적인 샘플 프로세싱 디바이스를 도시한다.
도 11 은 다양한 실시형태들에 따른, 예시적인 샘플 프로세싱 디바이스를 도시한다.
도 12 는 다양한 실시형태들에 따른, 예시적인 샘플 프로세싱 시스템을 도시한다.
정의들
본 명세서에 사용된 용어들의 일부는 이 섹션에 기재된 바와 같이 정의된다. 다른 용어들은 본 개시의 다른 곳에서 정의되거나 예시된다. 다르게 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 출원에서, "또는" 의 사용은 달리 언급되지 않으면 "및/또는" 을 의미한다. 다중 종속 청구항의 맥락에서, "또는" 의 사용은 대안으로만 하나보다 많은 선행 종속 또는 독립 청구항을 다시 지칭한다.
단어 "약"은 본 개시의 맥락이 달리 표시하지 않거나, 또는 이러한 해석과 일치하지 않으면, 그 값에 10% 를 더하거나 또는 뺀 범위를 의미하고, 예를 들어 "약 5" 는 4.5 내지 5.5 를 의미하고, "약 100" 은 90 내지 100 을 의미하는 등이다. 예를 들어, "약 49, 약 50, 약 55" 과 같은 수치 값의 목록에서, "약 50" 은 선행 값과 후속 값 사이 간격(들)의 절반 미만까지 연장된 범위, 예를 들어 49.5 초과 내지 52.5 미만을 의미한다. 뿐만 아니라, 구절 "약 값 미만" 또는 "약 값 초과"는 본 명세서에서 제공되는 용어 "약" 의 정의 관점에서 이해되어야 한다.
본 개시에서 값의 범위가 제공되는 경우에, 그 범위의 상한 값과 하한 값 사이의 각 개재 값 및 그 명시된 범위의 임의의 다른 명시되거나 또는 개재된 값은 본 개시 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 1 μm 내지 8 μm 의 범위가 명시되면, 이것은 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 및 7 μm 가 또한 개시되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출하는 것" 은 샘플에서 하나 이상의 파라미터들의 측정에 의해 샘플과 연관된 값 또는 값들의 세트를 결정하는 프로세스를 지칭하고, 참조 샘플에 대해 테스트 샘플을 비교하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 개시에 따라, 종양의 검출은 하나 이상의 마커들을 식별, 분석, 측정 및/또는 정량하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "가능도" 는 일반적으로 확률, 상대적 확률, 존재 또는 부재, 또는 정도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "포함하다(comprise)" (또는 그 변형들)", "함유하다" (또는 그 변형들), "가지다" (또는 그 변형들), 또는 "포함하다 (include)" (또는 그 변형들) 는, 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 포괄적이거나 또는 개방적이며 부가의, 열거되지 않은 첨가제, 컴포넌트, 정수, 엘리먼트 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 예를 들어, 피처들의 목록을 포함하는 프로세서, 방법, 시스템, 조성물, 키트 또는 장치는 반드시 오직 그들 피처들에만 제한되는 것이 아니고 이러한 프로세스, 방법, 시스템, 조성물, 키트 또는 장치에 고유하거나 또는 명백히 열거되지 않은 다른 피처들을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플" 은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리적 특징을 기반으로, 특징화 및/또는 식별될 세포 및/또는 다른 분자적 엔티티를 함유하는 관심 대상으로부터 획득되거나 또는 유도되는 조성물을 지칭한다. 바람직하게, 샘플은 살아있는 엔티티, 예를 들어, 세포, 조직, 장기 등으로부터 유도되는 샘플을 의미하는 "생물학적 샘플"이다. 일부 실시형태들에서, 조직 샘플의 소스는 혈액 또는 임의의 혈액 컴포넌트; 체액; 신선, 냉동 및/또는 보관 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물 유래의 고형 조직; 및 대상의 임신 또는 발생 중 임의 시점의 세포 또는 혈장일 수 있다. 샘플은 1 차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 체액 (예를 들어, 림프, 양수, 우유, 전혈, 소변, CSF, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물 및 세포 배양 배지), 균질화된 조직, 종양 조직 및 세포 추출물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 샘플은 예를 들어, 시약에 의한 처리를 통해 조작되거나, 단백질 또는 핵산과 같은 소정 컴포넌트에 대해 용해 또는 농축되거나, 절편화 목적, 예를 들어 조직학적 샘플에서의 세포 또는 조직의 얇은 슬라이스를 위해 반고체 또는 고체 매트릭스에 포매된 생물학적 샘플을 더 포함한다. 샘플은 환경 컴포넌트, 이를테면 예를 들어, 물, 토양, 머드, 공기, 수지, 미네랄 등을 함유할 수도 있다. 바람직하게, 샘플은 대상 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물 대상) 으로부터 획득된, DNA (예를 들어, gDNA, mtDNA), RNA (예를 들어, mRNA, tRNA), 단백질, 또는 이들의 조합을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포" 는 용어 "생물학적 세포" 와 상호교환가능하게 사용된다. 생물학적 세포의 비제한적인 예는 진핵생물 세포, 식물 세포, 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 파충류 세포, 조류 세포, 어류 세포 등, 원핵생물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 원충 세포 등, 조직, 예컨대 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직 등에서 해리된 세포, 면역 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 매크로파지 등, 배아 (예를 들어, 접합자), 난모세포, 난자, 정자 세포, 하이브리도마, 배양 세포, 세포주 유래 세포, 암 세포, 감염된 세포, 형질감염 및/또는 형질전환 세포, 리포터 세포 등을 포함한다. 포유류 세포는, 예를 들어, 인간, 생쥐, 쥐, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등으로부터의 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양" 은 정상 또는 야생형 세포와 비교하여 유전자, 세포 또는 생리적 레벨에서 형질전환을 겪을 수 있는 임의의 세포 또는 조직을 포함한다. 이 용어는 일반적으로 양성 (예를 들어, 전이를 형성하지 않고 인접 정상 조직을 파괴하지 않는 종양) 또는 악성/암 (예를 들어, 주변 조직을 침입하고, 일반적으로 전이를 생성시킬 수 있으며, 시도된 제거 이후에 재발될 수 있고, 적절하게 치료되지 않으면 숙주의 죽음을 야기시킬 가능성이 있는 종양) 일 수 있는 신생물성 성장을 의미한다. 예를 들어, Steadman's Medical Dictionary, 28th Ed Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005) 를 참조한다.
용어 "암" 은 비정상적인 세포 성장, 특히 암 및 암종, 육종, 선암종, 림프종, 백혈병, 고형 및 림프성 암 등을 지칭하며, 이는 본질적으로 악성이다. 상이한 암 유형의 예는, 폐암, 췌장암, 유방암, 위암, 방광암, 경구암, 난소암, 갑상선암, 전립선암, 자궁암, 고환암, 신경아세포종, 머리, 목, 자궁경부 및 질의 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 연조직 및 골원성 육종, 직결장암, 간암, 신세포 암 (예를 들어, RCC), 흉막암, 자궁경부암, 항문암, 담관암, 위장 카시노이드 종양, 식도암, 담낭암, 소장암, 중추신경계의 암, 피부암, 융모막암종; 골원성 육종, 섬유육종, 신경교종, 흑색종 등을 포함한다.
"정상 세포"의 맥락에서 사용된 바와 같이 용어 "정상"은 조사되는 조직 유형 (예를 들어, PBMC) 의 비형질전환된 세포의 형태를 나타내거나 또는 비형질전환된 표현형의 세포를 지칭하는 것으로 의미된다. 일부 실시형태들에서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "정상 샘플" 은 비종양 샘플, 예를 들어, 타액 샘플, 피부 샘플, 모발 샘플 등을 포함한다. 본 개시의 방법은 정상 샘플의 사용없이 구현될 수도 있음을 유의해야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "비정상" 은 일반적으로 정상 (예를 들어, 야생형) 으로부터 어느 정도 벗어나는 생물학적 시스템의 상태를 지칭한다. 비정상 상태는 생리적 또는 분자적 레벨에서 발생될 수 있다. 대표적인 예는 예를 들어, 생리적 상태 (질환, 병상) 또는 유전자 이상 (돌연변이, 단일 뉴클레오티드 변이체, 카피수 변이체, 유전자 융합, 인델 (indel) 등) 을 포함한다. 질환 상태는 암 또는 전암일 수 있다. 비정상 생물학적 상태는 비정상성 정도 (예를 들어, 정상 상태와 멀어진 거리를 표시하는 정량적 측정) 과 연관될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "마커" 는 치료적 중재술, 예를 들어 항암제 처리에 대한 정상 생물학적 프로세스, 병원성 프로세스 또는 약리학적 반응의 표시자로서 객관적으로 측정될 수 있는 특징을 지칭한다. 대표적인 유형의 마커는 예를 들어, 유전자 돌연변이, 유전자 중복, 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실, 또는 복수의 차이들, 예컨대 DNA 의 체세포 변경, 복제 수 변이 (copy number variation), 순차 반복, 전위 (translocation) 또는 이들의 조합을 포함하는, 예를 들어 마커의 수 또는 구조 (예를 들어, 서열) 에서의 분자 변화를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전적 마커 (genetic marker)" 는 게놈 상의 특정 위치를 갖거나 게놈에서의 특정 위치에 대응하는 폴리뉴클레오티드의 서열 (예를 들어, 게놈 위치의 서열에 상보적인 전사체) 을 지칭한다. 따라서, 용어 "유전적 마커" 는 또한 예를 들어 게놈 서열에 의해 인코딩된 cDNA 및/또는 mRNA 뿐만 아니라, 게놈 서열 그 자체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 유전적 마커는 2 이상의 대립유전자 또는 변이체를 포함할 수도 있다. 유전적 마커는 유전자 산물 (예를 들어, 단백질) 을 위해 코딩하거나 또는 코딩하지 않는 핵산 서열을 포함한다. 특히, 유전적 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성/변이 또는 복제 수 변이 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게, 유전적 마커는 참조 샘플과 비교하여 DNA 에 체세포 변이, 예를 들어 sSNV 또는 sCNV, indel, SV 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 마커" 또는 "단백체 마커" 는 폴리펩티드의 서열 또는 이의 단편, 예를 들어 게놈 서열에 대응할 수도 있는 전사체 (예를 들어, DNA 서열에 의해 전사되는 전사체) 에 대응하는 (예를 들어, 전사체에 의해 인코딩되는) 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 "포르말린-고정, 왁스-포매" 또는 "포르말린-고정, 파라핀-포매" 또는 "FFPE" 조직 샘플은 포르말린 또는 등가 물질로 고정되고 왁스, 예컨대 파라핀 왁스 또는 등가 물질에 포매된 샘플을 지칭하도록 광범위하게 해석된다. 본 명세서에서 FFPE 조직은 임의의 인간, 동물 또는 식물 소스로부터일 수도 있다.
본 명세서에서 "슬라이드" 는 분석을 위해 FFPE 조직을 유지할 수 있는 임의의 유형의 표면일 수도 있고 임의의 적합한 재료들로 만들어질 수도 있다.
본 명세서에서 "관심 영역" 또는 "ROI" 는 유전자의 서열, 구조 또는 발현 레벨의 변경을 평가하는 것과 같은, 사용자가 분석하기를 원할 수도 있는 기판 상의 샘플의 일부를 지칭하다. 기판 상의 샘플은 모든 ROI, ROI 없음, 하나의 ROI 또는 하나 보다 많은 ROI 로 구성될 수도 있다. ROI 는 또한 본 명세서에서 "S" 샘플로서 지칭된다. 기판 상의 RONI 샘플은 본 명세서에서 "X" 샘플로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "미립자" 물질은 실질적으로 구형 입자 또는 덜 불규칙한 형상의 입자와 같은 입자로 구성된 물질을 의미한다. 통상적으로, 미립자 물질은 직경이 약 10 nm 내지 약 100 μm 이고; 바람직하게는 약 50 내지 약 400 nm 이며; 특히 약 100 내지 약 200 nm 이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "분석" 은 물질의 양, 존재 또는 부재에 대한 테스트 또는 테스팅이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "가압된" 공기는 예를 들어 대기압보다 큰 압력으로 압축된 공기를 의미한다. 이러한 가압된 "공기" 컴포넌트는 통상적으로 헬륨, 아르곤, 크세논, 질소, 이산화탄소, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 불활성 기체이다. 가압 시스템에서 통상적인 바와 같이, "공기" 컴포넌트은 액체, 반-액체 또는 기체 형태일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "접촉하는 것" 은 제제 (예를 들어, 접촉 매질) 를 포함하는 조성물이 시험관, 플라스크, 조직 배양, 칩, 어레이, 플레이트, 마이크로플레이트, 모세관 등에서, 타겟, 예를 들어 셀 타겟을 함유하는 샘플로 도입되고, 타겟과 제제 사이의 상호작용을 허용하기에 충분한 온도 및 시간에서 배양되는 것을 의미한다.
생체 내 진단 또는 치료적 맥락에서, "접촉하는 것" 은 활성 소재 (예를 들어, 화학적 화합물 또는 약물) 이 대상으로 도입되고, 활성 소재가 대상의 타겟 조직, 예를 들어 생체 내, 상피 조직과 접촉을 이루도록 허용되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상" 은 보통 임상 연구를 위해 사용된 동물을 포함하여, 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간, 수의과 또는 농장 동물, 가축 또는 반려동물을 의미한다. 특히, 대상은 인간 대상, 예를 들어 암과 같은 질병으로 진단된 인간 환자이다. 대상은 질병과 연관된 하나 이상의 특징들, 질병과 연관된 증상(들), 질병과 관련하여 무증상 또는 진단되지 않는 것을 갖거나, 잠재적으로 갖거나, 또는 갖는 것으로 의심될 수도 있다. 특히, 대상은 암을 가질 수도 있거나, 대상이 암과 연관된 증상(들)을 보일 수도 있거나, 대상이 암과 연관된 증상이 없을 수도 있거나, 또는 대상이 암으로 진단되지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 최광의 의미로 용어 "노이즈" 는 그럼에도 불구하고, 참 이벤트로서 수신되거나 또는 프로세싱될 수도 있는 임의의 원하지 않는 방해 (예를 들어, 참 이벤트와 직접 연관되지 않은 신호) 를 지칭한다. 노이즈는 인공 및 자연 소스로부터 시스템으로 도입된 원치않거나 방해하는 에너지의 합산이다. 노이즈는 신호에 의해 반송된 정보가 저하되거나 덜 신뢰성있게 되도록 신호를 왜곡시킬 수도 있다. 이 용어는 일부 현상의 거동 또는 속성에 관한 정보, 예를 들어 마커 (SNV, CNV, indel, SV) 와 암과 같은 질병 사이의 확률적 연관성을 운반하는 기능인, "신호" 와 대조된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 마커 레벨의 맥락에서 용어 "추정" 은 광범위한 의미로 사용된다. 이와 같이, 용어 "추정" 은 실제 값 (예를 들어, mbp DNA 당 1 변동), 값의 범위, 통계값 (예를 들어, 평균, 중간값 등) 또는 다른 의미의 추정 (예를 들어, 확률적으로) 을 지칭할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로" 는 의도된 목적을 위하여 작업하기에 충분하다는 것을 의미한다. 따라서 용어 "실질적으로" 는 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체적인 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완벽한 상태, 치수, 측정, 결과 등으로부터의 작은 중요하지 않은 변형들을 허용한다. 수치 값들 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특징들에 대하여 이용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "컴포넌트" 는 시스템의 구성을 지칭한다. 예를 들어, 세포 시스템에서, 컴포넌트들은 폴리펩티드 (예를 들어, 작은 펩티드 뿐만 아니라 큰 단백질), 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 탄수화물 (예를 들어, 단당류 뿐만 아니라 전분과 같은 거대분자), 지질, 및 다른 구성, 예컨대 비타민 및 콜레스테롤을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전달" 은 결합, 접합, 흡착 등과 같은 프로세스를 통해 자연 환경으로부터 (예를 들어, 미토콘드리아 DNA 의 경우 미토콘드리아) 비자연 환경 (예를 들어, 실리카 입자의 표면) 으로의 시스템의 컴포넌트의 움직임을 지칭하도록 최광의 의미로 사용된다. 용어는 컴포넌트와 비자연 시스템 사이의 공유 (covalent) 또는 비공유 (non-covalent) 상호작용들과 같은 프로세스들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "공유" 상호작용은 접합된 원자들 사이의 전자들을 공유하는 것을 수반한다. 대조적으로, "비공유" 상호작용은 예를 들어, 이온성 상호작용, 정전기 상호작용, 수소 접합 상호 작용, 물리화학적 상호작용, 반 데르 발 힘, 루이스-산/루이스-염기 상호 작용 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "분석물" 은 일반적으로 본 명세서에 개시된 방법 또는 시스템을 사용하여 검출되는 타겟 분자(들) 을 지칭한다. 분석물은 당업계에서 사용되는 용어들과 같은 DNA 분석물, RNA 분석물, 핵산 분석물, 거대분자 또는 소분자일 수 있다. 특히, 거대분자는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함할 수도 있다. 일반적인 규칙으로서, 거대분자의 분자량은 적어도 약 300 달톤이고 수백만 달톤일 수 있다. 소분자는 약 300 달톤까지의 분자 중량을 갖는 유기 화합물이다. 소정의 경우들에서, 분석물은 핵산 분석물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프로브" 는 물질, 예를 들어, 분자이며, 이는 특히 특정 타겟에 의해 인식될 수 있다. 잠재적 프로브/타겟 또는 타겟/프로브 결합 파트너들의 유형은 수용체/리간드; 리간드/항리간드; DNA/DNA, DNA/RNA, PNA (펩티드 핵산)/핵산을 포함하는 핵산 (폴리뉴클레오티드) 상호작용; 기판, 소분자 또는 이펙터 분자 등을 갖는 효소, 기타 촉매 또는 기타 물질; 등을 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 프로브의 예는 펩티드, 효소 (예컨데, 프로테아제 또는 키나아제), 효소 기판, 보조인자, 약물, 렉틴, 당류, 핵산 (올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, PNA, 또는 변형되거나 수정된 핵산을 포함), 올리고당, 단백질, 효소, 폴리클론 및 모노클론 항체, 단일 사슬 항체 또는 이들의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 프로브 중합체는 선형 또는 환형일 수 있다. 프로브는 차등 활성도, 차등 결합에 의해 또는 구조적 마커로부터의 식별을 통해 상이한 타겟들을 구별할 수 있다. 발명의 프로브는 바람직하게는 핵산 분자, 특히 바람직하게는 DNA 이다. 소정의 경우들에서, "프로브" 는 "타겟" 으로서 기능할 수도 있고 "타겟" 은 프로브로서 기능할 수도 있으며, 예를 들어 상보적 DNA (cDNA) 는 타겟 유전자 서열의 일부에 혼성화하는 프로브로서 작용할 수도 있다; 그러나, cDNA 자체는 유전자 서열의 mRNA 산물과 매칭하기 때문에 타겟 서열에 대응한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "분석" 뿐만 아니라 "검출" 은 분석물에 관한 관심 파라미터의 정성적 또는 정량적 결정, 예를 들어 분석물의 양, 레벨, 농도, 또는 활성도 (절대 또는 상대) 를 지칭할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "진단" 은 대상이 주어진 질환 또는 컨디션을 겪을 가능성이 있는지 여부에 관하여 결정이 행해질 수 있는 방법들을 지칭한다. 당업자는 종종 하나 이상의 진단 표시자들, 예를 들어 컨디션 또는 질환의 존재, 중증도 또는 부재를 표시하는 양의 마커, 존재, 부재, 또는 변화에 기초하여 진단을 행한다. 다른 진단 표시자는 환자 이력; 신체 증상, 예를 들어 불명확한 체중 감량, 발열, 피로감, 통증, 또는 피부 이상; 표현형; 유전자형; 또는 환경 또는 유전 인자를 포함할 수 있다. 당업자는 용어 "진단"은 소정의 과정 또는 결과가 발생하게 될 증가된 확률을 지칭하고, 즉 과정 또는 결과가 주어진 특징, 예를 들어 그 특징을 별현하지 않는 개체와 비교할 때, 진단 표시자의 존재 또는 레벨을 발현하는 환자에서 더 발생할 가능성이 있는 것음을 이해할 것이다. 개시의 진단 방법은 주어진 특징을 발현하는 환자에서 과정 또는 결과가 더 잘 발생할지 여부를 결정하기 위해, 독립적으로, 또는 다른 진단 방법들과 조합하여 사용될 수 있다.
용어 "핵산" 은 일반적으로 증폭의 산물이든, 합성적으로 생성된 산물이든, RNA 의 역 전사의 산물이든, 자연적으로 발생하는 산물이든, DNA 또는 RNA 를 지칭한다. 통상적으로, 핵산은 단일- 또는 이중-가닥 분자이며 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이중-가닥 핵산 분자는 3' 또는 5' 오버행들을 가질 수 있으며, 이로써 그들의 전체 길이에 걸쳐 완전히 이중- 가닥인 것으로 요구되거나 가정되지 않는다. 더욱이, 용어 핵산은 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및/또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드에 대한 변형으로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 예들이 열거되지만 이에 재한되지 않는다: 각각 엑소뉴클레아제 분해 (degradation)/중합효소 확장의 결찰 또는 방지를 허용하기 위한 5' 또는 3' 뉴클레오티드의 인산화; 공유 및 근방 공유 부착들을 위한 아미노, 티올, 알킨 또는 비오티닐 변형; 형광단 및 소광제; 분해를 방지하기 위한 뉴클레오티드들 사이의 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로아미데이트 및 포스포로티에스터 결합; 메틸화; 및 변형 염기.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용되고 주어진 길이의 아미노산 사슬을 포괄하는 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 본드에 의해 결합된다. 용어 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 변형을 지칭하고 이를 배제하지 않는다. 변형은, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 인산화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헤미 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디설파이드 접합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포뮬레이션, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된" 또는 "추출된" 은 분자의 맥락에서 실질적으로 불순물이 없는 분자를 지칭한다. 분자 (예컨대, DNA 또는 RNA) 는 샘플에서의 다른 컴포넌트들로부터 떨러져서 정제될 때 "단리" 되거나 "추출" 되었다. 정제는 샘플에서 또한 발견된 하나 이상의 외부 컴포넌트들로부터 타겟을 분리하는 것을 지칭한다. 혼합된 검체 또는 샘플로부터 단리, 추출 또는 정제되는 컴포넌트들은 통상적으로 정제되지 않은 또는 추출되지 않은 샘플과 비교하여 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 75 %, 적어도 90 % 또는 적어도 98 %, 또는 심지어 적어도 99 % 만큼 정제되거나 농축된다.
용어 "합성물질" 은 당업계에 알려진 기법을 사용하여, 예를 들어 포스포라미디트 화학 또는 합성 화학을 사용하여 화학적으로 합성된 분자를 지칭한다.
핵산의 맥락에서 용어 "혼성" 또는 "혼성화" 는 듀플렉스 뿐만 아니라 이러한 듀플렉스를 형성할 수 있는 분자들을 포함하도록 광범위하게 의미된다. 이러한 맥락에서, 다수의 염기들에 걸쳐 염기 쌍을 이루는 단일-가닥 핵산이 "혼성화" 로 언급된다. 혼성화는 통상적으로 생리적 또는 생물학적 조건들 (예를 들어, 세포내 : pH 7.2, 140mM 칼륨 이온; 세포 외 : pH 7.4, 145mM 나트륨 이온) 하에서 결정된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사체" 는 DNA 서열 내의 리보핵산 잔기, 글리세롤 유도체와 같은 분지 연결제 또는 아미노알킬 연결기 (linker) 와 같은, 합성적으로 도입된 잔기 또는 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "부가물" 은 예를 들어 O6-알킬-dG 및 O6-Me-dG 를 포함한다. 마찬가지로, 일 실시형태에서 용어 "접합체(conjugate)" 는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 공유로 또는 비공유로 결합된 타겟 인식제를 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "접합체" 는 하나 이상의 형광 염료 분자들에 공유로 또는 비공유로 선형, 분지형 또는 수지상 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "타겟" 은 존재, 활성도 및/또는 양이 결정되기를 원하고 주어진 프로브에 대해 친화성을 갖는 물질을 지칭한다. 타겟은 인공 또는 자연-발생 물질일 수 있다. 또한, 이들은 변경되지 않은 상태에서 또는 다른 종들과의 집성체로서 채용될 수 있다. 타겟은 직접 또는 특정 결합 물질을 통해, 결합 멤버에 공유로 또는 비공유로 접합될 수 있다. 본 발명에서 채용될 수 있는 타겟의 예는, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 (mRNA, tRNA, rRNA, 올리고뉴클레오티드, DNA, 바이러스성 RNA 또는 DNA, EST, cDNA, RNA 또는 DNA 로부터 유도된 PCR-증폭 산물, 및 이들의 돌연변이, 변성체 또는 변형을 포함); 단백질 (효소, 예컨대 신경전달물질, 프로테아제, 키나아제 등의 절단을 담당하는 것들을 포함); 효소용 기판; 펩티드; 보조인자; 렉틴; 당류; 다당류; 세포 (세포 표면 항원을 포함할 수 있음); 세포막; 세포기관; 등 뿐만 아니라 복합, 공유 접합 가교 등의 형태로 존재할 수 있는 다른 분자 또는 다른 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 타겟은 또한 안티-프로브로서 지칭될 수 있다.
프로브가 타겟 서열에 결합하는 경우, 결합은 "특이적" 또는 "선택적"일 수도 있다. 일반적으로, 프로브가 하나 또는 단 하나의 결합 파트너 (예를 들어, 타겟) 를 갖는 경우, 이는 "특이성" 의 특성을 소유한다. 실제로, 대부분의 프로브는 특히 고농도에서 다수의 타겟들에 결합할 것이기 때문에 프로브의 대부분이 "특이적" 이기 보다는 오히려 "선택적" 이다. 따라서, 용어들은 상호교환가능하게 사용된다. 결합의 특이성 및 선택성은 루틴한 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 타겟은 특정 mRNA 이고, 프로브는 선택된 혼성화 조건들 하에서, 타겟에는 특이적으로 결합하지만 간섭하는 RNA 또는 DNA 에는 결합하지 않는, 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 당업자는 당업계에서 인식된 방법을 사용하여, 비특이적인 간섭 DNA 또는 RNA 에 대한 최소 혼성화로, 타겟에 선택적으로 혼성화할 올리고뉴클레오티드의 피처들을 실험적으로 결정할 수 있다 (예를 들어, 상기 참조). 일반적으로, 과량의 비타겟 RNA들의 배경에 존재하는 타겟 mRNA 를 구별하는데 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 약 8 내지 약 50 의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 18, 20, 22 또는 25 의 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. 경쟁 타겟의 큰 배경이 없는 생화학 분석에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브는 8 뉴클레오티드보다 더 짧을 수 있다. 당업계에 인식된 절차들 (예를 들어, 컴퓨터 프로그램 BLAST) 를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 서로 관련되지 않고 알려진 유전학 데이터베이스에서 잠재적으로 간섭하는 서열과 유사하지 않도록 선택될 수 있다. RNA 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브의 특이적 혼성화를 허용할 혼성화 조건의 선택은 당업계에 인식된 절차를 사용하여, 루틴하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 9 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드와 같은 짧은 핵산 분자를 지칭하며, 이는 일부 예들에서 더 긴 핵산 서열의 합성을 개시하는데 사용된다. 더 긴 프라이머는 길이가 약 10, 12, 15, 20, 25, 30 또는 50 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 프라이머는 또한 검출에서 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 기판으로부터 소정의 샘플을 "기계적으로 제거 또는 절제하는 것" 은 기판으로부터 샘플을 분리하거나 기화시키거나 또는 그렇지 않으면 기판 상에 샘플이 더 이상 존재하지 않도록 기계적 수단에 의해 샘플을 분해하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 거대분자를 화학적으로 "분해한다" 는 것은, RNA, DNA 및/또는 단백질과 같은 거대분자를 변성 또는 부수거나 이들이 ROI 조직에서 RNA, DNA 및/또는 단백질의 이후 분석을 오염시키지 않을만큼 충분히 화학적으로 변형하는 것을 의미한다.
병리학자, 실험실 사용자 또는 다른 개인에 의해 슬라이드 상에 만들어진 "마크" 는 본 명세서에서 "수동 마크" 로 지칭된다. 이러한 마크는 예컨대 펜 또는 에칭 장비로 임의의 이용가능한 수단에 의해 만들어질 수도 있다. 대조적으로, 본 명세서에서 시스템에 의해 자동으로 만들어진 마크는, "가상 마크" 또는 "디지털 마크" 로 명명되어 수동으로가 아니라 하나 이상의 알고리즘들의 사용에 의해 만들어지는 것을 표시한다.
용어 "디지털", "디지털화", "자동화" 및 "자동으로" 등은, 사용자에 의해 수동으로 수행되는 액션들과는 반대로, 본 명세서에서의 시스템에 의해 수행되는, 예를 들어 알고리즘에 의해 및/또는 사용자와 컴퓨터 사용자 인터페이스 사이의 상호작용에 의해 제어되는 액션들을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표면" 은 분석물 또는 관심 프로브 사이의 상호작용을 허용하는 부위를 제공하는 임의의 물건을 지칭한다. 바람직하게, 표면은 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 반응 트레이의 웰의 벽, 멀티-웰 플레이트, 시험관, 폴리스티렌 비드, 자성 비드, 막 (membrane) 및 마이크로 입자 (예컨대, 라텍스 입자) 의 표면이다. 검출기 시약에 의한 접근을 허용하기에 충분한 다공성 및 포획 시약을 고정하기에 적절한 표면 친화성을 갖는 임의의 적합한 다공성 재료 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 가 이 용어에 의해 고려된다. 예를 들어, 니트로셀룰로오스의 다공성 구조는 포획 시약과 같은 다양한 시약에 대해 우수한 흡수 및 흡착 특성을 갖는다. 나일론은 유사한 특징을 가지며 또한 적합하다. 수화 상태의 겔 구조를 가진 재료처럼, 마이크로다공성 구조가 유용하다. 유용한 고체 지지체의 추가 예는, 천연 중합체 탄수화물 및 이들의 합성 변형, 가교 또는 치환 유도체, 예컨대 한천, 아가로스, 가교 알긴산, 치환 및 가교 구아 검, 셀룰로오스 에스테르 (특히 질산 및 카르복실산을 가짐), 혼합 셀룰로오스 에스테르, 및 셀룰로오스 에테르; 질소를 함유하는 천연 중합체, 예컨대 가교 또는 변형된 젤라틴을 포함하는, 단백질 및 유도체; 천연 탄화수소 중합체, 예컨대 라텍스 및 고무; 적절하게 다공성인 구조로 조제될 수도 있는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐아세테이트 및 부분적으로 가수분해된 유도체를 포함하는 비닐 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 위의 폴리축합물의 테포폴리머 및 공중합체, 예컨대 폴리에스테르, 폴리아미드, 및 다른 중합체, 예컨대 폴리우레탄 또는 폴리에폭시드; 다공성 무기 재료, 예컨대 황산 바륨, 황산 칼슘, 탄산 칼슘을 포함하는 알칼리성 토금속의 황산염 또는 탄산염, 알칼리 및 알칼리성 토금속의 규산염, 알루미늄 및 마그네슘; 및 알루미늄 또는 실리콘 산화물 또는 수화물, 예컨대 점토, 알루미나, 탈크, 카올린, 제올라이트, 실리카 겔 또는 유리 (이들 재료들은 위의 중합체 재료들로 필터들로서 사용될 수도 있음); 및 위의 클래스들의 혼합물 또는 공중합체, 예컨대 이미 존재하는 천연 중합체 상의 합성 중합체의 중합화를 개시함으로써 획득된 그래프트 공중합체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "시그니처" 는 관심 표현형을 표시하는 마커들의 집합을 지칭하며, 예를 들어 암 시그니처는 돌연변이를 품고 있는 세포 또는 조직이 종양 세포임을 표시하는 ≥3 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 시그니처는 마커들, 예를 들어 종양 마커들의 조합의 존재, 부재 및/또는 풍부를 포함한다. 다양한 프로브 세트들을 조합함으로써, 관심 표현형의 검출을 위한 신뢰성있는 방법이 설계될 수 있다. 단일 분석으로 수행되는 이러한 시그니처 테스트는 다양한 마커들 사이의 상호작용을 평가하고 이해하는데 큰 이점을 제공할 수 있다.
용어 "증폭" 은 일반적으로 타겟 핵산으로부터 복수의 핵산 분자들의 생성을 지칭하며, 여기에서는 프라이머가 중합효소에 의한 확장을 위해 개시 부위를 제공하기 위해 타겟 핵산 분자 상의 특정 부위를 혼성화한다. 증폭은 제한되지는 않지만 표준 PCR, 긴 PCR, 핫 스타트 PCR, qPCR, RT-PCR 및 실시간 PCR 과 같은 종래 알려진 임의의 일반적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 과 같은 완전한 면역글로불린 또는 Fab, Fv 또는 Fc 와 같은 항체의 단편 (특히 항원-결합 단편), 또는 융합된 항체, 융합된 항체 단편 또는 임의의 다른 항체의 유도체를 지칭한다. 용어 "라벨링된 항체" 는 효소, 형광 염료, 화학발광 물질, 비오틴, 아비딘 또는 방사성동위원소로 라벨링된 항체를 지칭한다.
용어 "에피토프" 는 단백질, 탄수화물 또는 지질과 같은 화합물의 항원성 영역을 지칭한다. 항원성 영역은 통상적으로 5 내지 8 아미노 산으로 구성된다. 에피토프는 특히 개개의 항체의 항원 결합 부위에 의해 인식된다.
본 명세서에서 용어 "고정된 조직 또는 세포" 는 당업자에게 알려진 바와 같이 사용되며 화학적 고정 방법에 의해 부패로부터 보존되는 생물학적 조직 또는 세포를 지칭한다. 이러한 방법은 그러한 생물학적 조직 또는 세포 내에서 자가분해 또는 부패를 방지한다. 고정화는 생화학 반응을 종료하고 처리된 조직의 기계적 안정성을 증가시킨다.
용어 "면역-조직화학" 또는 "IHC" 는 조직학적 샘플에서 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로 항원의 존재를 검출하기 위한 기법을 지칭한다. 항체-항원 복합체의 검출은 보통 형광 라벨링된 항체에 의해 또는 효소-라벨링된 항체로 발색 반응에 의해 발생한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "매크로해부" 는 메스 또는 주걱과 같은 도구를 사용하여, 현미경 슬라이드와 같은 고체 지지체 상에 장착된 조직 절편으로부터 관심 영역을 스크래칭하는 프로세스를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "마이크로해부" 는 조직 샘플로부터 하나 이상의 특정 세포 또는 관심 영역을 절단 및 분리하는 프로세스를 지칭한다. 마이크로해부는 예를 들어 레이저로 관련 영역을 절단함으로써 레이저 캡처 마이크로해부 (LCM) 를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "막 슬라이드" 는 레이저 캡처 마이크로해부 (LCM) 에서 사용하기 위한 현미경 슬라이드 또는 고체 지지체를 지칭한다. 마이크로해부를 위해 다양한 막들로 커버될 수 있는 금속 프레임으로 구성된 막 또는 프레임 슬라이드로 커버된 유리 슬라이드들이 사용될 수 있다.
용어 "폴리-리신" 은 최대 수백의 반복 단위를 포함하고 조직 절편과 같은 샘플과 샘플이 장착되는 막 측 사이의 친화성을 증가시키기에 적합한 분자를 지칭한다. 설명에 따른 폴리-리신은 폴리-L-리신이다. 설명에 따른 폴리-L-리신은 70 내지 300 kDa 의 분자 중량을 갖는다. 폴리-L-리신은 프로테아제에 의해 소화될 수 있다. 설명에 따른 다른 폴리-리신은 예를 들어 폴리-D-리신이다. 설명에 따른 폴리-D-리신은 70 내지 300 kDa 의 분자 중량을 갖는다. 폴리-D-리신은 프로테아제 소화에 내성이 있다.
용어 "qPCR" 은 일반적으로 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응, 정량 중합효소 연쇄 반응 또는 운동 중합효소 연쇄 반응으로 알려진 PCR 기법을 지칭한다. 이 기법은 PCR 을 사용하여 타겟 핵산을 동시에 증폭하고 정량화하며, 여기서 정량화는 타겟 핵산에 일단 혼성화되면 단지 검출가능한 형광 리포터 분자를 포함하는 삽입 형광 염료 또는 서열-특정 프로브에 의해서이다.
본 명세서에서 용어 "RNA" 는 당업자에게 알려진 바와 같이 사용되며 프리-mRNA, 프리-mRNA 전사체, mRNA, 전사체 프로세싱 중간체, 유전자 또는 유전자들로부터의 전사체 및 번역을 위해 사용된 성숙 mRNA, 또는 이로부터 유도된 핵산을 지칭한다. 전사 프로세싱은 스플라이싱, 편집, 수정 및 분해와 같은 프로세스를 포함한다. 샘플을 포함하는 mRNA 는 예를 들어, mRNA, 유전자 또는 유전자들의 mRNA 전사체, 역 전사를 사용하여 mRNA 로부터 유래하는 cDNA, 증폭된 DNA 로부터 전사된 RNA, cDNA 로부터 전사된 cRNA, 유전자로부터 증폭된 DNA 등을 포함한다.
본 명세서에서 샘플을 포함할 수도 있는 "용기" 는 표면, 웰, 튜브 또는 바이알을 포함하는 용기의 임의의 유형, 형상 또는 사이즈를 의미하도록 넓게 해석된다. 용기는 임의의 특정 재료로 만들어지기 위해 특정 형상 또는 사이즈를 가질 필요는 없고, 단지 그 상에 또는 그 내에 위치된 조직의 분석 또는 조작을 가능하게 하는 물리적 구조들로서만 작용하는 것이 필요하다.
본 명세서에서 "착색된" 슬라이드/기판은 병리학자 또는 다른 훈련된 개인이 기판 상에 임의의 ROI 의 윤곽을 표기하도록 기판을 마킹할 수도 있도록 ROI 샘플들과 다른 샘플들 사이의 차이를 드러내는 것을 보조하도록 처리된 기판을 지칭한다. "착색되지 않은" 슬라이드/기판은 그렇게 처리되지 않았지만 다른 유형으로 처리될 수도 또는 처리되지 않았을 수도 있는 기판이다.
본 명세서에서 기판 상의 X 샘플로부터 하나 이상의 ROI들을 "분리하는" 용어는, 이후 ROI 샘플에서 분자들의 분석을 오염시키지 않도록 기판으로부터 물리적으로 제거되거나, 절제 (예를 들어, 기화 또는 연소 또는 물리적 분해) 되거나, 또는 화학적으로 처리되는 방식으로 X 샘플들을 처리하는 수단을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "기판" 은 FFPE 슬라이드, 조직 슬라이드, 표준 슬라이드, 용기, 착색된 슬라이드, 착색되지 않은 슬라이드, 살아있는 조직 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 슬라이드를 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "샘플" 은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 부착된 세포 조직, 검체, 조직 샘플, FFPE 조직 또는 기타 생물학적 재료를 지칭한다.
"컴퓨터 프로세서" 또는 "컴퓨팅 수단" 또는 "컴퓨터" 는 본 명세서에서 그의 필요한 기능들을 수행할 임의의 하드웨어 및/또는 소프트웨어 조합을 지칭하는 것으로 넓게 해석된다. 예를 들어, 프로세서는 예컨대 전자 제어기, 메인프레임, 서버 또는 개인용 컴퓨터 (데스크탑 또는 휴대용) 의 형태로 이용가능한 프로그램가능 디지털 마이크로프로세서일 수도 있다. 프로세서가 프로그램가능한 경우, 적절한 프로그래밍은 컴퓨터 본체에 통합되거나 원격 위치에서 사용자 인터페이스로부터 프로세서에 통신될 수 있거나, 컴퓨터 프로그램 제품 (예컨대 자기, 광학, 또는 고체 상태 디바이스 기반이든, 휴대용 또는 고정 컴퓨터 판독가능 저장 매체) 에 미리 저장될 수 있다. 예를 들어, 자기 매체 또는 광학 디스크는 프로그래밍을 반송할 수도 있고 그의 대응하는 사용자 인터페이스에서 각각의 프로세서와 통신하는 적절한 판독기에 의해 판독될 수 있다. 본 명세서에서 "사용자 인터페이스" 는 사용자가 컴퓨터를 프로그램하고 따라서 이 컴퓨터를 통해 시스템의 소정의 동작들을 제어할 수 있게 하는 물리적 구조를 의미하도록 넓게 해석된다. 예들은 메인프레임 또는 랩탑 컴퓨터 키보드 및 모니터, 다른 유형의 시각적 모니터 및 키보드 시스템, 예컨대 패드-유형 또는 스마트-폰 유형 디바이스 또는 다른 원격 디바이스를 포함한다. 사용자 인터페이스는 물리적으로 컴퓨터 본체의 일부일 수도 있거나, 시스템의 다른 곳에 위치되거나, 컴퓨터로부터 원격으로 위치될 수도 있으며, 유선 또는 무선 접속을 통해 컴퓨터 프로세서와 통신할 수 있다.
착색되지 않은 기판들 상에 ROI들을 디지털로 마킹하기 위한 방법들
샘플 분석 및 해부는 통상적으로 샘플들의 병렬 슬라이스들을 포함하는 일련의 슬라이드들을 수반한다. 세트에서의 하나 이상의 슬라이드들은 예를 들어, 개별 세포 핵을 드러내기 위해 및/또는 종양학 애플리케이션, 암성 및 비암성 세포와 같은 상이한 유형의 세포를 구별하는 것을 돕기 위해 착색될 수도 있다. 병리학자는 기판을 검사하고 펜 또는 다른 적절한 마킹 디바이스로 슬라이드 상의 관심 영역 (ROI) 을 마킹할 수도 있다. 이러한 ROI들 또는 연관된 펜 마킹들은 그 후 샘플의 인접한 슬라이스(들) 로부터 기판과 매핑 (회전 및 정렬) 될 수도 있으며, 이는 궁국적으로, 예컨대 게놈 서열화를 위한 DNA, RNA 발현 분석을 위한 RNA 를 추출하기 위해 또는 세포들의 인 시튜 분석을 수행하는 것 등을 위해 분석될 것이다. 수동 샘플 해부 방법들에서는, 병리학자의 펜 마크가 기판에 손으로 전달되고 슬라이드 상의 주변 샘플들로부터 ROI 를 절단하기 위해 면도날이 사용된다.
관심 영역뿐만 아니라 조사 중인 장기의 주변 조직에 대한 조직학적 절편화를 수반하는 매크로해부 기법들은, 종양 타이핑, 염증성 질환의 진단 및 퇴행성 질환의 결정과 같은, 많은 병리학적 조사에서 점점 더 전개되고 있다. 매크로해부에서, 관심 환자 조직 ("S" 영역) 은 다운스트림 분석을 위한 입력 재료로서 "S" 영역만이 사용되도록, 필요하지 않은 영역 ("X" 영역) 을 제외하면서, 조직학적 표면, 예를 들어 유리 슬라이드로부터 수집된다. 소정의 경우들에서, 병리학자로부터의 복잡한 "S" 형상 정의는 조직-기술자로부터 어려운 스크래핑 동작들을 초래할 수 있다. 종종, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 복잡한 스크래핑 기법들이 필요하다. 본 개시는 생물학적 샘플들을 그 내부의 분석물이 바람직하게는 비-분석물로부터의 간섭없이, 더 정확하게 검출될 수 있도록 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들에 관련된다. 따라서, 신호 품질을 개선하고 및/또는 노이즈를 감소시킴으로써, 본 시스템들 및 방법들은 특히 FFPE 와 같은 이종 샘플들에서 분석물을 분석하는 맥락에서, 생물학적 분석의 결과를 크게 개선한다.
신호 품질 및 노이즈 감소와 같은 분석 파라미터들을 개선함으로써, 본 개시된 시스템들 및 방법들은 또한 예를 들어, 관심 특성, 예를 들어 인종 특성 (법의학용) 또는 질병 특성과 바이오마커의 활성도 또는 레벨 또는 존재/부재를 상관시키는, 분석 목표를 개선한다.
본 개시의 시스템들 및 방법들은 생물학적 검체 (예를 들어, 조직학 슬라이드) 에서 조직의 특정된 영역에 타겟팅하고 이를 제거하며 신호-포함 ("S") 조직 영역을 선택적으로 수집하기 위해 입자 마이크로-블라스터들의 사용에 부분적으로 기초한다. 이 방법은 입자들을 ROI 로 지향하기 위해 가압된 가스 또는 다른 가스의 제어된 스트림 및 입자들의 사용을 포함한다. 이 방법은 바람직하게는 샘플의 오염 및/또는 샘플에서의 분석물의 희석 기회들을 감소시키는 건식 방법이다.
현재 개시된 방법들은 다양한 설정들로 사용될 수 있다. 예를 들어, 매크로해부가 요망되는 제 1 구현에서, 기판의 "X" 영역 (예를 들어, 조직학적 슬라이드) 은 기판 상에 "S" 영역만을 터치되지 않은 채로 두면서 선택적으로 마이크로-블라스팅될 수 있다. 그 후, 다운스트림 프로세싱 방법들이 사용되어 기판으로부터 "S" 영역을 제거할 수 있다. 예를 들어, 매크로해부가 또한 요망되는 제 2 구현에서, 기판의 "S" 영역 (예를 들어, 조직학적 슬라이드) 은 기판 상에 "X" 영역만을 터치되지 않은 채로 두면서 선택적으로 마이크로-블라스팅될 수도 있다. "S" 영역으로부터의 조직은 기판으로부터 제거될 수 있고, 그 후 입자들은 용기에 모아져서 다운스트림 프로세싱을 사용하여 프로세싱된다. 또 다른 구현에서, 매크로해부는 필요하지 않으며, 기판의 모든 영역들 ( "X"및 "S"영역) 이 마이크로-블라스팅되고, 양자의 영역들의 내용물이 다운스트림 프로세싱을 위해 용기에 수집된다.
도 2 는 품질 및 조직 두께가 균일하게 제어될 수 없는 착색되지 않은 슬라이드 서브미션들 (USS) 을 디지털로 프로세싱하기 위한 예시적인 프로세스를 도시한다. 이 프로세스는 병렬 프로세스가 병합되게 할 수도 있는 3 개의 경로들을 갖는 2 개의 병렬 프로세스들을 포함할 수도 있다.
일 양태에 따라, 제 1 병렬 경로를 따라, USS 가 홀더 상으로 장착될 수도 있다. 장착된 USS 는 경로 검토를 대기하기 위해 저장 유닛에 저장될 수도 있다. USS 의 스캔 이미지가 생성된다. USS 는 저장 유닛으로부터 취출된다. 그 후 자동화된 샘플 해부 루틴이 수행될 수도 있다.
일 양태에 따라, 제 2 병렬 경로를 따라, USS 가 착색되어 참조 슬라이드를 생성한다. 참조 슬라이드가 스캔되어 이미지를 생성한다. 참조 슬라이드 상의 관심 영역 (ROI) 을 포함하는 디지털화된 마킹이 생성된다. 그 후 마킹이 이미지 관리 시스템 (IMS) 에 업로드될 수 있는지가 결정된다. 업로드될 수 있으면, 제 2 병렬 경로가 경로 1 을 통해 제 1 병렬 경로와 병합한다.
경로 1 에서 서브미션 기판(들) 은 현재 디지털 병리학 솔루션을 통해 그들의 마킹들을 성공적으로 전송한다. USS 는 경로 1 을 통해 현재 디지털 워크플로우에서 가장 일찍 프로세싱될 수 있다.
업로드될 수 없으면, 외부 마킹 전송 알고리즘이 적용된다. 마킹이 전달될 수 있으면, 경로 2 는 제 2 병렬 경로를 제 1 병렬 경로에 연결한다. 예를 들어, 경로 2 에서 서브미션 기판(들)은 현재 디지털 병리 솔루션 외부의 마킹 전달 알고리즘의 개발을 필요로 한다. 이 경로는 외부 마킹 전송 알고리즘이 필요하다고 가정하는 것이다 (예를 들어, 현재 디지털 병리 솔루션 내의 가능성).
마지막으로, 마킹은 경로 3 을 통해 수동으로 전달될 수도 있다. 예를 들어, 경로 3 에서는 서브미션 기판(들)로부터의 직접 마킹 전송이 이용가능하지 않으며, 병리학자가 각각의 연관된 기판 상에 개별적으로 디지털 마킹을 수동으로 수행하는 것을 필요로 한다. 이 경로는 경로 1 및 경로 2 양자 모두가 진행되지 못하는 경우의 대비 솔루션이다. 이 프로세스는 여전히 자동화된 샘플 스크래핑 시스템에서 최소로 프로세싱할 수 있다.
도 3 은 "S" 영역을 수집하거나 "X" 영역을 제거하는 방법들을 도시한다. 일 양태에 따라, "X" 영역이 제거되고 "S" 영역만 남게 되어 샘플 수집에 대해 직선 패스 (슬라이드로부터 모든 샘플을 수집) 방법을 허용한다. 이는 일반적으로"X"의 작은 영역들만이 있기 때문에 효율적인 방법이다. 예를 들어, ~ 50 % 의 경우는 직선 패스이다 (예를 들어, "S" 영역 없음). 대부분의 경우, "X" 영역은 "S" 영역보다 훨씬 적다 (예를 들어, 제거할 "X" 영역이 적음).
추가 양태들은 "X" 영역이 기판으로부터 제거될 필요가 없도록 "X "영역 (예를 들어, "S" 영역 및 비활성 "X" 영역만 남음) 에서 핵산을 분해하는 것을 포함한다. 예를 들어, 분해된 "X" 영역은 분석에 추가 영향을 미치게 될 "X" 영역에 남아있는 임의의 정량화가능한 DNA/RNA 를 포함하지 않는다. 따라서 "X" 영역에는 분석가능한 양의 DNA 또는 RNA 가 없을 것이다.
추가 양태들은 직선 패스 방법으로서 기판 상의 직접 용해 샘플을 포함한다. 이 방법은 세포의 인지질 이중층을 부분적으로 부수고 및/또는 단백질을 완전히 부숴서 샘플을 다운스트림 분석 프로세스에 적합한 액체 용해물로 프로세싱할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 용해 버퍼 또는 버퍼 용액에 노출될 수도 있다. 용해 유체의 예들은 고혈압, 저장성, pH 조정 용액, 또는 효소를 포함하는 용액, 예컨대 프로테아제를 포함한다.
기재된 프로세스는 자동화된 및 수동 워크플로우들 양자 모두에 적용가능할 수도 있다. 예를 들어, 이들은 "X" 영역보다 "S" 영역이 훨씬 더 많기 때문에, "S" 영역만을 수집하는 것보다 "X" 영역을 제거 또는 분해하는 것이 더 용이하므로 현재 수동 스크래핑 기법들과 조합하여 구현될 수도 있다.
샘플 해부 프로세스
도 4 는 다양한 샘플 해부 방법들을 도시한다. 본 개시의 양태들에 따라, "X" 영역의 제거는 수집을 위해 슬라이드 상에 "S" 영역만을 남길 수도 있다. 예를 들어, 기판 상의 모든 원하지 않는 샘플들이 제거되어, 슬라이드 상에 원하는 샘플만을 직선 패스 추출로서 남길 수도 있다. "X" 영역을 제거하기 위해, 기판들로부터 원하지 않는 샘플들을 추출하기 위한 기계적 및 비-기계적 도구들이 있다.
기계적 (예를 들어, 접촉) 도구들은 면도날, 기계 밀링 (표준 또는 맞춤형 밀링 도구), 큐렛, 펀치, 스쿠프, 마이크로비드 블라스팅 및 진공 흡입과 같은 물리적 재료의 사용을 포함하여 기판으로부터 직접 원하지 않는 샘플을 제거할 수도 있다. 기계적 도구들은 "X" 영역들을 제거하기 위한 입자 블라스팅을 더 포함할 수도 있다.
비-기계적 도구들은 원하지 않는 샘플을 기판으로부터 직접 제거하기 위해, 레이저 및 워터 제트와 같은 간접 접촉 기술의 사용을 포함할 수도 있다. 다양한 레이저 시스템들은 펨토초 레이저 시스템, 피코초 레이저 시스템, 나노초 레이저 시스템, 마이크로초 레이저 시스템, 이산화탄소 레이저 시스템, 모드 잠금식 레이저 시스템, 펄스형 레이저 시스템, Q 스위치형 레이저 시스템, Nd:YAG 레이저 시스템, 연속 레이저 시스템, 색소 레이저 시스템, 튜너블 레이저 시스템, Ti-사파이어 레이저 시스템, 고전력 다이오드 레이저 시스템, 연속파 레이저 또는 고전력 파이버 레이저 시스템 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 펨토 초 레이저 시스템은 미드-타워 개인용 컴퓨터 (PC) 의 사이즈를 갖는 20W 평균 전력을 활용할 수도 있다. 레이저의 추가 예들은 다이오드 레이저, 고체-상태 레이저, 가스 레이저 및 염료 레이저를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활용된 레이저는 종래 레이저보다 풋 프린트를 덜 남기기 위해 덜 강력하도록 구성될 수도 있음이 이해된다.
핵산 (예를 들어, DNA) 은 "X" 영역들에서 분해 (예를 들어, 변성) 되어, 수집을 위해 슬라이드 상에 비활성 "X" 영역 및 "S" 영역만을 남긴다. 예를 들어, "X" 영역에서 핵산을 분해하면, 그 영역이 후속 프로세스에 비활성으로 될 것이다 (예를 들어, 핵산 함량이 유전자 발현에 영향을 미치게 될 레벨은 아님). 따라서, 이러한 영역을 물리적으로 제거/해부할 필요가 없으며 직선 패스 샘플 수집 방법이 사용될 수 있다.
레이저, 열, RF, 초음파, 극저온, 플라즈마 등과 같은 비-기계적 방법은 기판 (예를 들어, 유리 슬라이드) 으로부터 원하지 않는 "X" 영역을 분해하는데 활용될 수도 있다.
화학적 방법들은 핵산 (예를 들어, DNA/RNA) 을 분해하기 위해 화학물질 (예를 들어, 표백제, 산, 알칼리 및 효소 등) 을 "X" 영역들에 적용하는 것을 포함할 수도 있다. NaOH 또는 염이 또한 핵산을 변성시키는데 활용될 수도 있다. 부가 변성제는 단백질 변성제 및 핵산 변성제를 포함할 수도 있다. 표백제의 예시적인 농도는 적어도 10 % 표백제일 수도 있다. 화학물질의 조합은 엔도뉴클레아제 및/또는 프로테아제를 함유하는 pH 조정 용액 또는 차아염소산 나트륨 0.05 % - 10.0 % (중량/체적) 을 포함하여 조합될 수 있다.
양태들에 따라, 용해 버퍼를 사용하여, 기판 상에서 용해 프로세스를 직접 수행하면 샘플 해부 프로세스를 우회할 수도 있다. 예를 들어, 샘플을 갖는 기판은 기판으로부터 전체 샘플을 분리하기 위해 용해 버퍼를 갖는 온도-제어된 용기에 직접 담가질 수도 있다. 후속 단백질 키나아제 (Pro K) 단백질 소화는 동일한 용기 및 별도의 프로세서/용기에서 수행될 수 있다.
본 개시의 양태들에 따라, 샘플 해부는 기판들로부터 원하지 않는 샘플 (예를 들어, 바람직하지 않은 "X" 영역) 을 추출하기 위한 기계적 및 비-기계적 방법들을 포함할 수도 있다. 상술한 바와 같이, 기계적 (접촉) 방법은 기판으로부터 직접 원하지 않는 샘플을 해부하기 위해 물리적 재료들의 사용을 포함할 수도 있다. 시스템은 흡입 방법을 사용하여 동시에 원하지 않는 샘플을 수집하기 위해 스크래핑 액션 다음에 진공 흡입관과 조합된 스쿠프, 펀치, 큐렛, 면도날, 샌드 블라스팅, 입자 마이크로-블라스팅과 같은 물리적 스크래핑 도구을 활용할 수도 있다.
흡입 디바이스는 모든 샘플을 수집하기 위해 저렴한 일회용 소모품 (예를 들어, 필터를 갖는 플라스틱 튜브) 으로 구성되며 교차-오염을 회피하기 위해 각각의 경우에 대체될 것이다. 대안으로, 교차-오염을 제거하기 위해 샘플들 사이에서 흡입 디바이스가 세정될 수도 있다. 필터는 샘플의 흐름을 정지시키지만 공기가 통과될 수 있게 하는 기능을 갖는다. 부가적으로, 샘플들은 공기 통로를 방해하도록 필터를 완전히 막을 수 없다.
그 후 제거된 샘플은 쓰레기통에 수집되어, 결국 직선 패스 방법들을 위해 기판 상에 "S" 영역만을 남긴다. 예를 들어, 직선 패스 수집은 다음에 의해 달성될 수 있다: (a) 용이하게 자동화될 수 있는 직접 단일 패스 면도날 직선 패스; (b) 기판으로부터의 샘플을 용기/튜브로 분리하도록 온도 제어된 초음파 수조를 활용하는 것; 및/또는 (c) 샘플이 기판으로부터 분리된 후 수집 용기/튜브의 하단에 정전하를 인가하는 것.
비-기계적 방법들은 기판으로부터 분리된 원하지 않는 샘플을 해부하기 위해 간접 기술 (예를 들어, 이를테면 레이저 및 워터 제트 절제) 의 사용을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 레이저 및 워터 제트 방법들은 고압 워터제트 또는 레이저 마모 기술을 사용하여 타겟 유리 표면에 힘을 가하여 기판에서 샘플을 분리하는 것을 포함할 수도 있다. 이는 결국 직선 패스 방법을 위해 기판 상에 "S" 영역들만을 남긴다.
직선 패스 수집은 다음에 의해 달성될 수 있다: (a) 용이하게 자동화될 수 있는 직접 단일 패스 면도날 직선 패스; (b) 기판으로부터의 샘플을 용기/튜브로 분리하도록 온도 제어된 초음파 수조를 활용하는 것; 및/또는 (c) 샘플이 기판으로부터 분리된 후 수집 용기/튜브의 하단에 정전하를 인가하는 것.
"X" 영역을 분해하기 위해, 기판들로부터 원하지 않는 샘플을 추출하는데 다음의 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-기계적 방법들은 기판으로부터 원하지 않는 "X" 영역에서 DNA 를 분해할 수도 있다. 구현에 따라, 시스템은 레이저, 열, RF, 초음파, 극저온 또는 플라즈마와 같은 비접촉 절제 기술을 사용하여 기판으로부터 원하지 않는 샘플을 분해할 것이다. 이는 결국 위에 개요된 직선 패스 방법을 위해 기판 상에 "S" 영역들만을 남긴다.
화학적 방법들은 DNA 를 분해하기 위해 "X" 영역에 화학 물질들을 적용하는 것을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 시스템은 표백제, 산, 알칼리 또는 효소 등과 같은 화학물질 시약을 유리 표면 상의 타겟팅된 "X" 영역들 상에 적용하여 기판으로부터 샘플을 분해할 수도 있다. 이는 결국 위에 개요된 직선 패스 방법을 위해 기판 상에 "S" 영역들만을 남긴다.
개시는 병리학 공간에 제한되지 않음이 이해된다. 이는 사전 농축 또는 단리 및 또한 비-타겟을 위해 사용될 수 있다. 식별된 기술은 또한 별도로 또는 다른 통합 시스템과 조합으로 사용될 수 있다. 직선 패스를 위한 방법은 또한 공압의 사용 또는 상기 방법들의 조합을 포함할 수도 있음이 또한 이해된다.
검체 유형은 세포 배양, 동결 절편, 신선한 샘플, 액체 생검 및 세포검사 샘플 (즉, 가래, 흉막액 등) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검체 유형은 또한 비-인간 타겟들을 포함할 수 있다.
타겟 검체는 또한 기판에 제한되지 않는다. 시스템이 검체를 이미지화할 수 있게 하는 시스템에 흡입구로서 임의의 폼 팩터 도관 (vessel) 이 사용될 수 있다. 다른 예는 커버슬립 (즉, 혈액 도말 생성), 생물반응기, 이미징 펀치가 있는 세포 배양 접시, 샘플 수집 종이, 또는 액체 스트림/액적을 포함한다.
본 개시의 양태들은 예컨대 수동 마이크로해부를 위해 착색되지 않은 기판 (USS) 의 세트들을 생성할 필요성을 제거하는 검체의 모폴로지를 유지하면서 기판에 걸쳐 디지털 마킹을 매칭시키는 오브젝트-기반 알고리즘 및 사용하기에 용이한 디지털 주석 도구을 제공하거나 수동으로 (예를 들어, 펜을 사용하여) 기판으로부터 직접 관심 영역을 추출하기 위해 높은 스루풋의 실험실과 호환가능하고, 깨끗하며 저렴한 이점들을 제공한다. 또한 원하는 태스크들을 완료하는데 필요한 조작자 개입의 리스크를 최소화한다.
일부 실시형태들에서, 해부 시스템은 원하지 않는 샘플로부터 ROI(들)를 분리하도록 기판을 해부하기 위해 레이저, 워터 제트 및 초음파와 같은 많은 수단을 사용할 수도 있다.
일부 실시형태들은 밀링 기술을 활용하는 저-비용 기계 시스템을 포함할 수도 있다. 소형 테이블-탑 CNC 밀링 머신은 수직 엔드 밀/스쿠퍼를 사용하여 ROI (저장될 샘플) 또는 RONI (폐기될 샘플) 검체에 대해 미리정의된 디지털 마킹을 수집한다. 이 테이블-탑 시스템은 사용자가 밀링 인클로저 내의 슬라이드들의 일 세트를 프로세싱할 수 있게 할 것이고, 수직 밀링 도구 (예를 들어, 흡입 피처를 갖는 저 비용 회전 스크래핑 고정구) 가 미리정의된 엔드 사용자 디지털 주석을 추적하고 검체를 수집할 수 있을 것이다. 일부 실시형태들에서, 저장된 샘플은 후속 프로세스를 위해 튜브에 전달될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 기판 상에 남는 것은 면도날로 용이하게 그리고 깨끗하게 스크래핑될 수 있는 S 샘플이다.
예로서, 소정의 암으로부터 샘검 샘플의 40 % 이상과 같은 큰 부분은 모두 S 일 수 있고 X 는 아닐 수도 있는 한편, 많은 다른 것들은 상대적으로 작은 X 영역을 갖는다. 작은 엔드 밀 설정으로, 엔드 밀은 흡입을 위한 루멘을 가질 수도 있다 (즉, 밀은 샘플의 머시닝을 용이하게 하기 위해 그라인드 팁이 있거나 없는 하이포튜브일 수 있다). X 영역이 작으면, X 영역을 제거할 수 있다. S 영역이 작으면, S 영역을 머시닝하고 이를 수집할 수 있다. 단순화를 위해, 일관되게 모든 X 영역을 제거하거나 모든 S 영역을 수집할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 워트 제트 방법이 대안으로 사용되어 슬라이드 상에서 X 샘플을 제거하여, 뒤에 S 샘플을 남길 수도 있다.
다른 실시형태들에서, X 재료는 S 재료가 손상되지 않은 채로 슬라이드 상에서 효과적으로 절제되거나 파괴된다. 이는 X 샘플을 선택적으로 동결-건조하는 것에 의해 또는 X 샘플을 입자 마이크로-블라스팅 (예를 들어, 마이크로비드 블라스팅), 레이저, 전기분해, 초음파, 무선 주파수, 또는 열 에너지 소스와 같은 다양한 에너지 소스에 적용하는 것과 같은 다양한 기계적 수단으로 행해질 수 있다. 일부 실시형태들에서, X 샘플을 절제하는데 필요한 수단은 세포를 용해하고 및/또는 단백질 및 핵산과 같은 생물학적 거대분자를 분해할 수 있는 에너지 소스, 예를 들어 레이저, 무선 주파수, 전류, 사운드 또는 열 에너지 소스를 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법들 중 일부는 X 샘플을 효과적으로 버닝하고 기화시킬 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 장치는 X 샘플 영역들에만 영향을 미치도록 레이저 또는 무선주파수파 또는 초음파를 정밀하게 포커싱하는 것과 같은, 기판 상의 디지털화된 마킹 또는 펜 외부의 영역들에 적절한 에너지 소스를 정밀하게 지향시킬 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 펄스 레이저, 전기분해 또는 초음파 디바이스는 ROI(들)를 포함하는 S 영역만이 슬라이드 상에 남도록 슬라이드로부터 X 영역에서 핵산을 절제 및/또는 분해하는 수단으로서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 시스템은 S 및 X 영역의 추적이 수행되면, 펄스 레이저, 전기분해 또는 초음파 디바이스를 X 영역에만 지향시키도록 구성될 수도 있다. 예를 들어, 슬라이드는 슬라이드의 X 영역과만 접촉하여 X 영역의 세포만을 절재하는 레이저, 전기분해 디바이스 또는 초음파 디바이스로부터의 에너지로 일 단부에서 다른 단부까지 스캐닝될 수도 있다. 결과적으로 슬라이드의 S 영역은 온전히 유지되고 슬라이드 상에는 단지 온전한 세포 재료만이 유지된다. 일부 실시형태들에서, 에너지는 X 영역에서 샘플을 효과적으로 기화시킬 수도 있고 DNA 및 RNA 와 같은 그러한 영역들에서 관심 분자를 파괴하여 X 영역으로부터의 재료가 이후 분석에서 결과적으로 단리된 S 영역을 오염시키지 않도록 할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, X 영역은 예컨대 DNA 및/또는 RNA 및/또는 단백질과 같은, 분석될 샘플로부터의 분자들을 분해하는 하나 이상의 시약으로, 워터 캐비테이션 방법 (예를 들어, 초음파 워트 캐비테이션 방법) 을 포함하는, 화학적 처리에 의해 효과적으로 제거될 수도 있다. X 샘플을 선택적으로 분해하기 위한 화학적 수단은 예를 들어, DNase, RNase 및 프로테아제와 같은 거대분자를 타겟팅하고 부수는 효소, 강염기, 강산, 또는 표백제의 첨가를 포함한다. 예를 들어, RNase 또는 프로테아제 효소에 의한 화학적 처리는 슬라이드 상의 디지털화된 펜 마킹에 기초하여 슬라이드의 X 영역으로만 지향될 수도 있다. 예를 들어 RNase 또는 프로테아제는 RNA 또는 단백질을 작은 단편 또는 단량체로 분해할 수도 있다. 예를 들어, 화학적 처리의 결과로서, 슬라이드의 X 영역은 분석을 위해 유의 레벨의 온전한 분자를 포함하지 않으므로, 예를 들어 처리된 샘플로부터의 단백질 또는 RNA 발현 레벨의 분석은 S 부분으로부터의 단백질 및/또는 RNA 만이 온전한 채로 유지될 것이기 때문에 샘플의 S 부분에서는 이 발현 레벨만을 반영한다.
이러한 방법들 중 어느 하나- X 부분의 세포를 절제하여 X 조직을 효과적으로 제거하거나 X 부분 또는 관심 분자를 화학적으로 변성시키는 것- 은 S 조직을 X 및 S 조직 양자 모두를 함유하는 슬라이드로부터 조각함으로써 수집할 필요성을 제거할 수도 있다. 대신, 슬라이드 상의 전체 조직은 "직선 패스" 조직 수집 접근법에서 이후 분석을 위해 수집되거나 사용될 수도 있다. "직선 패스" 수집에 있어서, 슬라이드 상의 모든 조직이 제거되며 예를 들어 S 영역과 X 영역 사이에 조직 해부가 없다. 따라서, 본 명세서의 방법은 이후 분석을 위해 조직을 수집할 때 슬라이드 상의 S 및 X 조직을 분리할 필요가 없는 직선 통과 조직 수집과 호환가능하다. 대신, 슬라이드로부터의 조직은 예컨대 슬라이드로부터 수집 도관으로 스크래핑하거나, 밀링 프로세스와 유사한 회전식 절단 도구로 모세관 작용, 흡입 등에 의해, 슬라이드로부터 간단히 제거될 수도 있다. 이러한 실시형태들에서, 조직 수집이 수동으로 수행되더라도, 현재 사용중이며 부상을 야기하거나 낮은 정확도로 이어질 수 있는 고도로 숙련된 면도날 기법은 필요하지 않다. 대안으로, 조직 수집은 기구에 의해 자동으로 수행될 수도 있다. 이 자동화는 S 영역으로부터 X 영역을 분리할 필요없이 모든 조직을 수집하는 것이 목적이므로 구현하는데 더 용이하다. 예를 들어, 조직은 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 관심 분자의 추출 및 세포 용해와 같은 프로세싱을 위해 웰, 바이알 또는 튜브와 같은 적합한 용기에 수집될 수도 있다. 처리된 슬라이드로부터 용기로 조직을 기계적으로 수집하기 위한 수단은, 예를 들어 샌드 블라스팅, 조직을 스크래프 오프하는 면도날 또는 유사한 블레이드, 또는 큐렛, 스쿠프, 펀치 또는 진공, 하전된 표면 또는 매질 등과 같은 슬라이드 표면과 비교하여 경쟁 매질 또는 표면을 제공하기 위한 용액 또는 다른 물질을 첨가를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 분석을 위해 조직을 웰, 바이알 또는 튜브와 같은 용기에 수집하기 보다는, 예를 들어 세포 용해와 같은 소정의 단계들이 슬라이드 상에서 직접 수행될 수도 있다. 다시, 이것은 X 영역이 절제되거나 변성되어 이후 분석을 위해 비관심 분자들의 임의의 현저한 농도를 제거 또는 비활성화할 때 가능할 수도 있다. 일부 이러한 실시형태들에서, 예컨대 적절한 키트에 의한 세포 용해, 및 옵션으로 또한 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 관심 분자의 추출은 조직 슬라이드 상에서 직접 수행될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 이러한 프로세스는 장치에 의해 자동으로 제어될 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 슬라이드는 세포 용해가 슬라이드 상에서 발생할 수 있도록 예컨대 웰 또는 튜브 또는 바이알에 포함된, 용해 버퍼에 담가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 그 후 프로테아제 소화 또는 DNase 소화 및/또는 RNA 추출과 같은 후속 단계가 담가진 슬라이드 상에서 수행될 수도 있다.
도 5 는 마스크 (508) 상의 입사 방사선 (502) 의 예시적인 투과 조사 (506) 및 반사 조사 (504) 의 다이어그램 (500) 이다. 이는 방사선 (502) 이 마스크 (508) 에 의해 부분적으로 차단되고 투과 조사 (506) 가 샘플 (512) 의 소정의 영역들에만 도달할 수 있기 때문이다 (예를 들어, 에너지의 소정의 퍼센티지만이 파장의 함수로서 투과될 수도 있다). 기판 (510) 은 1mm 두께일 수도 있으며, 이는 투과 조사 (506) 에 일부 굴절을 제공한다. 예를 들어, 마스크 (508) 는 방사선 (502) 이 마스크 (508) 에 의해 부분적으로 차단되고 방사선이 "X" 영역에만 도달할 수 있도록 슬라이드 (510) 의 상단 측 상에만 있을 수도 있다. 본 개시의 양태들에 따라, 마스크 (508) 는 관련 열, 레이저, 화학물질 (예를 들어, 마이크로비드 블라스팅) 등이 적용되는 것을 차단하기 위해 광학적, 열적, 기계적 구조 및/또는 화학적 마스크를 포함할 수도 있다. 노출된 부분은 활용된 프로세스에 의존하여, 제거되거나 변성될 수도 있음이 이해된다.
도 6 은 원하지 않는 "X" 영역들 (602) 사이의 관심 영역 (ROI)(604)(예를 들어, "S" 영역) 및 마킹된 원하지 않는 "X" 영역 (602) 을 갖는 예시적인 슬라이드 (600) 를 나타낸다. 예를 들어, "X" 영역들 (602) 및 ROI (604) 는 상술한 프로세스에 의해 결정될 수도 있다.
도 7 은 슬라이드 (720) 상부에 마스크 (700) 를 오버레이함으로써 슬라이드 (720) 로부터 원하지 않는 "X" 영역들 (712 및 714) 이 제거되는 프로세스를 도시한다. 예를 들어, 마스크 슬라이드 (710) 는 바람직하지 않은 "X" 영역들 (702, 704) 및 바람직한 "S" 영역 (706) 이 묘사된 것으로 준비될 수도 있다. 예를 들어, "X" 영역들 (704) 및 "S" 영역 (706) 은 상술한 프로세스에 의해 결정될 수도 있다. 슬라이드 (720) 상부에 마스크 (700) 를 오버레이하는 것은 묘사된 부분에 따라 슬라이드 (720) 로부터 바람직하지 않은 "X" 영역 (712 및 714) 의 제거를 허용한다. 결과의 슬라이드 (720) 는 원하는 부분 (716) 만을 포함한다. "X" 영역들 (712 및 714) 은 활용된 프로세스에 의존하여, 제거되거나 변성될 수도 있음이 이해된다.
자동화된 조직 해부 (ATD) 시스템의 예시적인 실시형태는, 조직 슬라이드와 인터페이스하는 밀링 도구의 원위 절단 부분을 도시하는 도 10 및 도 11 에 나타낸 바와 같이 일회용 맞춤형 설계 밀링 도구를 갖는 소형 밀링 시스템 (도 12) 을 활용한다. 이 부분의 전방 면에는, 밀링 도구의 회전 동안 슬라이드로부터 조직을 해부할 하나 또는 복수의 절단 에지들이 있을 수 있다. 도구에서의 하나 이상의 루멘들 (즉, 채널들) 이 있을 수도 있으므로 해부된 조직이 진공 흡입에 의해 루멘(들) 내로 강제될 수 있다. 절단 부분은 도구의 본체와 인터페이스될 수 있다. 이 본체의 기능은 수집된 조직을 하우징하고, 기계 척과 인터페이스하고, 필터 엘리먼트를 하우징하며, 그리고 절단 부분과 인터페이스하는 것이다. 가압된 공기 또는 기타 불활성 가스가 사용되어 해부된 조직을 수집 튜브 내로 강제할 수 있다. 대안의 실시형태들은 교반에 의한 수집 튜브로의 중력 전달, 플러시 버퍼 스루, 또는 수집된 조직을 갖는 밀링 도구를 시험관에 직접 배치하는 것을 포함한다. 하나 또는 많은 조직 슬라이드들로 구성된 각각의 경우에 대해 하나의 일회용 밀링 도구가 사용될 수 있다.
프로세싱 시간을 감소시키기 위해, 이러한 맞춤형 밀링 도구는 직접 구동 또는 공기-구동식으로 높은 회전 속도에서 동작하도록 설계된다. 회전 속도는 100,000 rpm 까지 또는 이를 너머 도달할 수 있다. 이것은 개선된 피드 속도를 허용하며; 따라서 이 도구는 높은 회전 속도로 동작할 때 발생된 동작 응력 및 온도를 견디도록 설계된다.
원위 절단 영역은 조직 ROI 를 수집하는데 사용된 내부 루멘을 가질 수 있으며 전방 면에 방사상으로 배치된 하나 또는 복수의 절단 에지들을 갖는다. 재료는 강철 또는 조직보다 단단하고 저 비용으로 대량 프로세싱에 도움이 되는 임의의 재료일 수 있다. 엔지니어링 플라스틱은 경제적으로 사출 성형될 수 있기 때문에 양호한 선정일 수도 있다. ROI 는 일부 조직 유형에 대해 750 마이크론 이하만큼 가까울 수 있기 때문에, 이 전방 면의 직경은 매우 작을 수도 있다. 작은 루멘은 절단 부분에 걸쳐 차압을 심하게 증가시키고 공기 흐름을 제한할 수 있다. 절단 인터페이스에 바로 근접한 루멘 사이즈를 빠르게 테이퍼링하고 높이는 것이 바람직하다.
본체의 원위 단부는 절단 부분과 인터페이스한다. 절단 부분은 나사산, 삽입 성형, 접합, 압입되거나 임의의 다른 적절한 조립 기법일 수도 있다. 본체 내부는 모든 슬라이드들로부터 수집된 조직을 케이스에 하우징하기에 충분한 체적으로 구성된다. 근위 단부에는 표준 머신 척킹과 인터페이스하는 피처들이 제공된다. 재료는 강철 또는 조직보다 단단하고 저 비용으로 대량 프로세싱에 도움이 되는 임의의 재료일 수 있다. 엔지니어링 플라스틱은 경제적으로 사출 성형될 수 있기 때문에 양호한 선정일 수도 있다. 본체의 근위 단부에는 필터와 인터페이스하는 내부 피처들을 갖는다. 또한 이것은 직접 진공 또는 벤투리 (Venturi) 디바이스에 의해 구동되는 인-라인 또는 오프-축 구성일 수도 있는 진공 부착물과 인터페이스하기에 적합한 피처들을 가질 것이다.
필터 엘리먼트는 수집된 조직을 정지하기 위한 것이지만 공기 또는 불활성 가스가 통과할 수 있게 한다. 필터 개구 사이즈는 50 마이크론 이상일 수도 있다. 개구 사이즈 및 필터 전체 사이즈는 수집된 조직이 프로세스의 종료 시 필터를 완전히 막지 않게 되도록 설계된다. 필터는 동작 압력 및 힘을 견뎌야 한다. 압력 완화 피처가 또한 막힘을 방지하기 위해 통합될 수도 있다. 필터는 본체에 접합되거나 기계적으로 부착될 수도 있다. 대안의 클램핑 부분이 또한 사용될 수도 있다.
밀링 도구의 원위 절단 부분이 본체에 연결된다. 원위 절단 부분은 조직 슬라이드와 인터페이스하는 하나 이상의 복수의 절단 에지들을 포함할 수 있다. 원위 절단 부분 설계는 해부된 조직을 절단 부분의 중앙을 향해 지향한다. 원위 포지션에서 하나 이상의 절단 에지들은 방사상으로 배향된다. 각각의 절단 에지는 직선 또는 곡선일 수도 있다. 동작 동안 에지 및 ROI 의 접촉 각도는 네트 벡터 힘이 프로세싱 엘리먼트의 중앙을 향해 조직을 강제하도록 생성될 것이어서 ROI 가 수집될 수 있도록 하는 것이다. 예를 들어, 절단 에지 #1 은 수직으로 설정될 수 있고, 절단 에지 # 2 는 예각을 형성할 수 있고, 절단 에지 # 3 는 둔각으로 설정될 수 있으며, 이들 포지션들의 각각은 해부된 조직을 드라이브하도록 설정된다. 바람직한 실시형태는 절단 에지 #1 처럼 최소로 설정된 하나 이상의 복수의 에지들로 구성된 원위 절단 부분을 설정하는 것이며, 바람직한 배향은 예각을 갖는 절단 에지 #2 처럼 설정된다. 원위 절단 부분은 톱니 에지 및 톱니 포지션 (길이, 폭 및 깊이를 포함) 에서의 변동들을 포함하는 절단 파워를 개선하도록 설계될 수 있다.
도 10 및 도 11 은 다양한 실시형태들에 따른, 예시적인 샘플 밀링 디바이스를 도시한다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 디바이스 (1000) 는 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트로 구성된다. 제 1 컴포넌트 (1014) 는 대향 단부들에 개구들을 갖고 제 2 컴포넌트 (1010) 는 제 1 컴포넌트 (1014) 의 일 단부에 고정된다. 제 2 컴포넌트 (1010) 는 제 2 컴포넌트 (1010) 가 제 1 컴포넌트 (1014) 에 고정되는 곳으로부터 떨어져 대향하는 샘플 수집 수집 개구 (1018) 를 더 포함하고, 샘플 수집 개구 (1018) 는 샘플 수집 개구 (1018) 의 둘레를 따라 돌출하는 하나 이상의 샘플 스크래핑 엘리먼트들 (1020) 을 갖는다. 진공 채널은 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트들을 통해 연장하여 제 1 컴포넌트 (1014) 의 다른 단부 상의 진공 연결 개구 (1022) 와 샘플 수집 개구 (1018) 를 연결한다. 디바이스 (1000) 가 기판으로부터 샘플을 수집하도록 동작될 때, 이는 샘플 스크래핑 엘리먼트 (1020) 가 기판 표면으로부터 샘플의 일부를 기계적으로 제거하면서 동시에 제거된 샘플 부분을 제 1 컴포넌트 (1014) 의 진공 연결 개구 (1022) 에 진공을 적용하도록 진공 펌프를 사용함으로써 샘플 수집 개구 (1018) 및 진공 채널 (1012) 을 통해 수집하도록 회전된다. 다양한 실시형태들에서, 제거된 샘플 부분은 진공 연결 개구 (1022) 에 부착되는 필터 엘리먼트 (1016) 를 통해 수집될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 제거된 샘플 부분은 진공 채널 (1012) 과 유체 연통하는 용기에 수집된다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트들은 상이한 재료로 구성된다. 다양한 실시형태들에서, 제 1 (1014) 및 제 2 (101) 컴포넌트들은 동일한 재료로 구성된다. 사용될 수 있는 재료의 예는 금속, 중합체, 섬유유리 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트들은 2 개의 별도의 개별 부품들로서가 아닌 단일 통합 부품으로서 제조된다.
다양한 실시형태들에서, 샘플 스크래핑 엘리먼트들 (1020) 은 샘플 수집 개구 (1018) 의 둘레를 따라 균등하게 이격된다. 다양한 실시형태들에서, 샘플 스크래핑 엘리먼트들 (1104) 은 샘플 수집 개구 (1018) 의 둘레를 따라 상이하게 이격된다.
도 12 는 다양한 실시형태들에 따른, 예시적인 샘플 수집 시스템을 도시한다. 본 명세서에 도시된 바와 같이, 시스템 (1200) 은 샘플 (1204) 을 유지하는 기판 (즉, 슬라이드) (1202) 상부에 포지셔닝되는 샘플 밀링 디바이스 (1000) 를 포함한다. 샘플 밀링 디바이스 (1000) 는 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트들로 구성된다. 샘플 밀링 디바이스 (1000) 가 동작 중일 때, 이는 디바이스 (1000) 의 팁이 샘플 (1204) 과 접촉하여 기판 (1202) 의 표면으로부터 샘플 (1204) 의 일부를 기계적으로 제거하면서 동시에 밀링 디바이스 (1000) 의 일 단부 상의 개구 (1208) 에 진공을 적용하는 진공 펌프 (1206) 의 사용을 통해 샘플의 제거된 부분들을 수집하도록 회전되고 포지셔닝된다 (X, Y 및 Z 축에서).
다양한 실시형태들에서, 샘플 밀링 디바이스 (100) 는 샘플 (1204) 의 원하는 부분과만 접촉을 이루도록 X, Y 및 Z 축 방향으로 이동될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 샘플 (1204) 을 유지하는 슬라이드 (1202) 는 샘플 밀링 디바이스 (1000) 이도록 X, Y 및 Z 축 방향으로 이동될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 (1014) 및 제 2 (1010) 컴포넌트들은 상이한 재료로 구성된다. 다양한 실시형태들에서, 제 1 (1014) 및 제 2 (101) 컴포넌트들은 동일한 재료로 구성된다. 사용될 수 있는 재료의 예는 금속, 중합체, 섬유유리 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 후속 샘플 분석 절차들
ROI 조직 (또는 S 조직) 은 다양한 방식들로 분석되거나 조작될 수 있도록 수집될 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서 수집된 ROI 조직은 상술한 바와 같이, 세포 용해 다음 하나 이상의 다른 프로세스들을 거친다. 일부 실시형태들에서, DNA 및/또는 RNA 및/또는 단백질, 보조인자, 막 지질 등은 ROI 조직으로부터 직접 또는 세포 용해에 후속하여 추출될 수도 있거나 인 시튜로 평가될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 본 명세서의 시스템 및 방법은 ROI 조직에서 DNA 의 분석에 수반된다. 예를 들어, 본 명세서의 시스템 및 방법은 복제 수 변동 (CNV), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 특정 유전자의 점 돌연변이, 유전자의 결실 또는 삽입 돌연변이의 검출, 전치의 검출, 전위, 바이러스성 또는 박테리아 DNA 와 같은 외부 DNA 의 존재, DNA의 메틸화 등에 대한 ROI 조직의 분석과 함께 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 본 명세서의 시스템 및 방법은 유전자의 특정 RNA 전사체의 레벨의 결정 또는 특정 대안으로-붙여진 RNA 전사체 및 그의 상대적 레벨의 검출 또는 간섭 RNA 의 존재와 같은, ROI 조직에서 RNA 종의 분석과 함께 사용될 수도 있다. RNA 분석은, 예를 들어 정량적 RT-PCR 과 같은 역 전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 을 포함하는 방법에 의해 또는 전체 전사체 시퀀싱 방법에 의해 수행될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, ROI 조직에서 특정 단백질의 존재 또는 레벨은, 예컨대 인 시튜로 또는 다음의 세포 용해 절차들에서, 면역침전, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 핵산 등과 같은 방법에 의해 평가될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, ROI 조직은 생물학적 보조인자, 세포막 지질, 또는 다른 컴포넌트 등과 같은 다른 분자의 존재 또는 레벨을 검출하기 위해 평가될 수도 있다.
도 8a 및 도 8b 에는 유리 슬라이드 상에 장착된 생물학적 샘플, 예를 들어 FFPE 조직을 분석하기 위한 예시적인 시스템 및 방법이 나타나 있다.
도 8a 는 상술한 방법들에 따른, 환자 샘플, 예를 들어 종양 생검 샘플의 프로세싱 및/또는 분석을 위한 예시적인 방법을 나타낸다. 생물학적 샘플은 입자 및 공기를 함유하는 접촉 매질로 마이크로-블라스팅된다. 일부 실시형태들에서, 접촉 매질은 환자 샘플에 존재하는 특정 분석물의 단리에 사용하기에 매우 적합한 입자를 함유할 수도 있다. 예를 들어, 실리카 코팅된 강자성 비드와 같은 실리카 입자 또는 실리카 코팅된 입자는 미스센스 돌연변이 또는 기능 돌연변의 손실을 품고 있는 mRNA 와 같은 핵산 마커를 단리하는데 매우 적합하다. 입자 마이크로-블라스터는 이러한 입자로 로딩되고 마이크로 블라스터의 노즐은 원하는 조직 영역으로 지향된다. 예를 들어, 병리 검체의 경우, 원하는 영역은 핵산, 예를 들어 적절한 착색으로 착색된 세포의 핵을 포함하는 영역일 수도 있다. 대안으로, 환자 검체가 상이한 조직 유형을 포함하는 경우 원하는 영역은 관심 영역을 함유하는 조직 유형 또는 조직 층, 예를 들어 췌장암의 경우 췌장 관을 감싸는 상피 세포일 수도 있다. 접촉 매질 (가압 공기 및 입자를 포함) 로 관심 영역을 마이크로-블라스팅하면 관심 세포를 제거하며, 이는 그 후 수집되고 조직 용해 버퍼와 결합되어 세포를 파괴한다. 이는 관심 분석물 (예를 들어, 췌장암의 경우, KRAS, TP53, CDKN2A, SMAD4, BRCA1 및/또는 BRCA2 를 인코딩하는 돌연변이 핵산; Cicenas 등의 Cancers (Basel), 28, 9(5), 2017 참조) 이 입자 상으로 흡착되는 세포 용해물 용액을 생성한다. 흡착 속도를 개선하기 위해, 버퍼 용액의 pH 가 실리카 입자의 표면 실라놀기의 pKa 이하로 조절될 수도 있고 버퍼의 염 함량이 증가된다. 그 후 입자는 용해물 용액의 다른 컴포넌트, 예를 들어 단백질 및 지질과 같은 비-분석물을 세척해 내면서 표면에 흡착된 분석물을 남기는 용액으로 세척된다. 분석물은 PCR 과 같은 다운스트림 분석 기법들을 사용하여 직접 분석될 수도 있다. 대안으로, 실리카 입자의 표면 상에 흡착된 핵산은 PCR 과 같은 핵산 검출 기법으로 다운스트림 분석 전에 적합한 용리액으로 용리된다. 낮은 이온 강도 및 pH 의 버퍼를 사용하는 것에 의해 용리가 촉진된다. 원하는 경우, 마이크로 블라스팅 전에 샘플은 레이저 마이크로-해부와 같은 미세-해부 기법을 사용하여 사전 프로세싱되어, 관심 영역 (ROI) 을 추가로 정제 및/또는 타겟팅할 수도 있다.
도 8b 는 상술한 방법에 따른, 생물학적 샘플, 예를 들어 박물관 아카이브 용 고정 곤충학적 샘플 또는 토양 미생물을 포함하는 접촉 슬라이드의 프로세싱 및/또는 분석을 위한 예시적인 방법을 나타낸다. 생물학적 샘플은 입자 및 공기를 함유하는 접촉 매질로 마이크로-블라스팅된다. 일부 실시형태들에서, 접촉 매질은 환자 샘플에 존재하는 특정 분석물의 단리에 사용하기에 매우 적합한 입자를 함유할 수도 있다. 예를 들어, 아미노, 카르복실, 설포네이트 및 포스페이트 기로 기능화된 알루미늄 입자는 특정 폴리펩티드 마커를 분리하는데 유용할 수도 있다. 입자 마이크로-블라스터는 이러한 입자로 로딩되고 마이크로 블라스터의 노즐은 원하는 조직 영역으로 지향된다. 예를 들어, 고정 곤충 검체의 경우, 원하는 영역은 관심 마커를 함유하는 영역, 예를 들어 복부일 수도 있다. 접촉 매질 (가압 공기 및 입자를 포함) 로 관심 영역을 마이크로-블라스팅하면 관심 세포를 제거하며, 이는 그 후 수집되고 조직 용해 버퍼와 결합되어 세포를 파괴한다. 이는 관심 분석물이 입자에 흡착되는 세포 용해 용액을 생성한다 (예를 들어, 펩티드는 기능화된 알루미늄 입자 상으로 흡착된다). 흡착 속도를 개선하기 위해, 타겟의 물리화학적 특성 (예를 들어, 가용성 단백질의 경우 친수성, 막 단백질의 경우 소수성) 에 의존하여, 입자가 유도체화될 수도 있다. 그 후 입자는 용해물 용액의 다른 컴포넌트, 예를 들어 지질과 같은 비-분석물을 세척해 내면서 표면에 흡착된 분석물을 남기는 용액으로 세척된다. 분석물은 질량 분석법과 같은 다운스트림 분석 기법들을 사용하여 직접 분석될 수도 있다. 대안으로, 알루미늄 입자의 표면 상에 흡착된 폴리펩티드는 면역블로팅법 또는 질량 분석법과 같은 펩티드 검출 기법으로 다운스트림 분석 전에 적합한 용리 용액으로 용리된다. 원하는 경우, 마이크로-블라스팅 전에 샘플은 레이저 마이크로-해부와 같은 미세-해부 기법을 사용하여 사전 프로세싱되어, ROI 를 추가로 정제 및/또는 타겟팅할 수도 있다.
컴퓨터-구현 시스템
도 9 는 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (400) 을 도시하는 블록 다이어그램이다. 본 교시들의 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (400) 은 정보를 통신하기 위한 버스 (402) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 정보를 프로세싱하기 위해 버스 (402) 와 커플링된 프로세서 (404) 를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 컴퓨터 시스템 (400) 은 또한 프로세서 (404) 에 의해 실행될 명령들을 결정하기 위해 버스 (402) 에 커플링된, 랜덤 액세스 메모리 (RAM)(406) 또는 다른 동적 저장 디바이스일 수 있는 메모리를 포함할 수 있다. 메모리는 또한 프로세서 (404) 에 의해 실행될 명령들의 실행 동안 임시 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (400) 은 프로세서 (404) 에 대한 정적 정보 및 명령들을 저장하기 위해 버스 (402) 에 커플링된 판독 전용 메모리 (ROM)(408) 또는 다른 정적 저장 디바이스를 더 포함할 수 있다. 정보 및 명령들을 저장하기 위해 자기 디스크 또는 광 디스크와 같은, 저장 디바이스 (410) 가 제공되고 버스 (402) 에 커플링될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (400) 은 컴퓨터 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위해, 버스 (402) 를 통해서 음극선관 (CRT) 또는 액정 디스플레이 (LCD) 와 같은 디스플레이 (412) 에 커플링될 수 있다. 정보 및 커맨드 선택들을 프로세서 (404) 에 통신하기 위해, 영숫자 및 다른 키들을 포함한, 입력 디바이스 (414) 가, 버스 (402) 에 커플링될 수 있다. 사용자 입력 디바이스의 다른 유형은 방향 정보 및 커맨드 선택들을 프로세서 (404) 에 통신하고 디스플레이 (412) 상의 커서 이동을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향 키들과 같은 커서 제어기 (416) 이다. 이 입력 디바이스 (414) 는 통상적으로 디바이스가 평면에서의 포지션들을 특정할 수 있게 하는 2 개의 축들, 즉, 제 1 축 (즉, x) 및 제 2 축 (즉, y) 에서 2 의 자유도들을 갖는다. 그러나, 3 차원 (x, y 및 z) 커서 이동을 허용하는 입력 디바이스들 (414) 이 또한 본 명세서에서 고려될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 교시들의 소정의 구현들에 따르면, 프로세서 (404) 가 메모리 (406) 에 포함된 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스들을 실행하는 것에 응답하여 컴퓨터 시스템 (400) 에 의해 결과들이 제공될 수 있다. 이러한 명령들은 다른 컴퓨터-판독가능 매체 또는 컴퓨터-판독가능 저장 매체, 예컨대 저장 디바이스 (410) 로부터 메모리 (406) 로 판독될 수 있다. 메모리 (406) 에 포함된 명령들의 시퀀스들의 실행은 프로세서 (404) 로 하여금 본 명세서에서 설명되는 프로세스들을 수행하게 할 수 있다. 대안으로, 하드-와이어드 (hard-wired) 회로부가 본 교시들을 구현하기 위해 소프트웨어 명령들 대신 또는 이와 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 교시들의 구현들은 하드웨어 회로부와 소프트웨어의 임의의 특정의 조합에 한정되지 않는다.
용어 "컴퓨터-판독가능 매체" (예컨대, 데이터 스토어, 데이터 스토리지, 등) 또는 "컴퓨터-판독가능 저장 매체" 는, 본 명세서에서 사용될 때, 실행을 위해 프로세서 (404) 에 명령들을 제공하는데 참여하는 임의의 매체들을 지칭한다. 이러한 매체는 비-휘발성 매체들, 휘발성 매체들, 및 송신 매체들을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다수의 형태들을 취할 수 있다. 비-휘발성 매체들의 예들은 저장 디바이스 (410) 와 같은, 광학, 고체 상태, 자기 디스크들을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 휘발성 매체들의 예들은 메모리 (406) 와 같은, 동적 메모리를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 송신 매체들의 예들은 버스 (402) 를 포함하는 와이어들을 포함한, 동축 케이블들, 구리 와이어, 및 광섬유를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
컴퓨터-판독가능 매체들의 일반적인 형태들은 예를 들어, 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드들, 종이 테이프, 홀들의 패턴들을 가진 임의의 다른 물리적인 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 유형의 매체를 포함한다.
컴퓨터 판독가능 매체에 부가하여, 명령들 또는 데이터가 하나 이상의 명령들의 시퀀스들을 실행을 위해 컴퓨터 시스템 (400) 의 프로세서 (404) 에 제공하기 위해 통신 장치 또는 시스템에 포함된 송신 매체들 상에 신호들로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 통신 장치는 명령들 및 데이터를 나타내는 신호들을 가지는 트랜시버를 포함할 수도 있다. 명령들 및 데이터는 하나 이상의 프로세서들로 하여금, 본 명세서의 개시물에 개요된 기능들을 구현가능하게 하도록 구성된다. 데이터 통신 송신 접속들의 대표적인 예들은 전화기 모뎀 접속들, 광역 네트워크들 (WAN), 근거리 네트워크들 (LAN), 적외선 데이터 접속들, NFC 접속들, 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 설명한 방법론들, 플로우 차트들, 다이어그램들 및 첨부된 개시물이 컴퓨터 시스템 (400) 을 독립 디바이스로서 이용하여 또는 클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은, 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 설명된 방법론들은 애플리케이션에 의존하여 다양한 수단에 의해 구현될 수도 있다. 예를 들어, 이들 방법론들은 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로 구현될 수도 있다. 하드웨어 구현을 위해, 프로세싱 유닛은 하나 이상의 주문형 집적회로들 (ASICs), 디지털 신호 프로세서들 (DSPs), 디지털 신호 프로세싱 디바이스들 (DSPDs), 프로그래밍가능 로직 디바이스들 (PLDs), 필드 프로그래밍가능 게이트 어레이들 (FPGAs), 프로세서들, 제어기들, 마이크로-제어기들, 마이크로프로세서들, 전자 디바이스들, 본 명세서에서 설명되는 기능들을 수행하도록 설계된 다른 전자 유닛들, 또는 이들의 조합 내에서 구현될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 교시의 방법은 펌웨어 및/또는 소프트웨어 프로그램 및 C, C ++ 등과 같은 종래의 프로그래밍 언어로 작성된 애플리케이션으로 구현 될 수도 있다. 펌웨어 및/또는 소프트웨어로서 구현되는 경우, 여기에 기술된 실시형태들은 컴퓨터로 하여금 전술한 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체 상에서 구현될 수 있다. 본 명세서에 설명된 다양한 엔진은 도 9 의 컴퓨터 시스템 (400) 과 같은 컴퓨터 시스템 상에 제공될 수 있음이 이해되어야 하며, 이에 의해 프로세서 (404) 가 입력 디바이스 (414) 를 통해 사용자 입력 및 메모리 컴포넌트 (406/408/410) 중 중 어느 하나 또는 이의 조합에 의해 제공된 명령들에 종속하는, 이들 엔진들에 의해 제공된 결정들 및 분석들을 실행하게 된다.
본 교시들은 다양한 실시형태들과 함께 설명되지만, 본 교시들은 이러한 실시형태들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시들은 당업자들이 주지하고 있는 바와 같이, 다양한 대안들, 변경들, 및 등가물들을 포괄한다.
또한, 다양한 실시형태들을 설명하는데 있어서, 명세서는 방법 및/또는 프로세스를 단계들의 특정 시퀀스로서 제시하였을 수도 있다. 그러나, 그 방법 또는 프로세스가 본 명세서에서 개시된 단계들의 특정 순서에 의존하지 않는 한, 본 방법 또는 프로세스는 설명된 단계들의 특정 시퀀스에 제한되지 않아야 한다. 당업자가 주지하고 있는 바와 같이, 다른 단계들의 시퀀스들이 가능할 수도 있다. 따라서, 명세서에서 개시된 단계들의 특정 순서는 청구항들에 대한 제한들로서 간주되지 않아야 한다. 게다가, 본 방법 및/또는 프로세스에 관한 청구항은 서술된 순서로 이들의 단계들의 수행에 한정되어서는 안되며, 당업자는 시퀀스들이 다양할 수도 있으며 여전히 다양한 실시형태들의 사상 및 범위 내에 있음을 쉽게 알 수 있다.
본 명세서에서 설명하는 실시형태들은, 핸드-헬드 디바이스들, 마이크로프로세서 시스템들, 마이크로프로세서-기반 또는 프로그램가능 가전제품, 미니 컴퓨터들, 메인프레임 컴퓨터들 등을 포함한, 다른 컴퓨터 시스템 구성들로 실시될 수 있다. 실시형태들은 또한 태스크들이 네트워크를 통해서 링크된 원격 프로세싱 디바이스들에 의해 수행되는 분산 컴퓨팅 환경들에서 실시될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 설명하는 실시형태들이 컴퓨터 시스템들에 저장된 데이터를 포함하는 다양한 컴퓨터-구현 동작들을 채용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 동작들은 물리량들의 물리적인 조작을 필요로 하는 동작들이다. 대개, 반드시는 아니지만, 이들 양들은 저장, 전달, 결합, 비교, 및 기타 조작이 가능한 전기 또는 자기 신호들의 형태를 취한다. 또, 수행되는 조작들은 발생, 식별, 결정, 또는 비교와 같은, 용어들로 종종 지칭된다.
본 명세서에서 설명하는 실시형태들의 부분을 형성하는 동작들 중 임의의 동작은 유용한 머신 동작들이다. 본 명세서에서 설명되는, 실시형태들은, 또한 이들 동작들을 수행하는 디바이스 또는 장치에 관한 것이다. 본 명세서에서 설명되는 시스템들 및 방법들은, 요구된 목적들을 위해 특별히 구성될 수 있거나 또는 컴퓨터에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 선택적으로 활성화되거나 또는 구성되는 범용 컴퓨터일 수도 있다. 특히, 다양한 범용 머신들이 본 명세서에서의 교시들에 따라서 작성된 컴퓨터 프로그램들과 함께 사용될 수도 있거나, 또는 요구된 동작들을 수행하기 위해 보다 특수화된 장치를 구성하는 것이 더욱 편리할 수도 있다.
소정의 실시형태들은 또한 컴퓨터 판독가능 매체 상에 컴퓨터 판독가능 코드로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 데이터를 저장할 수 있는 임의의 데이터 저장 디바이스이며, 이후 컴퓨터 시스템에 의해 판독될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체의 예들은 하드 드라이브들, NAS (network attached storage), 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, CD-ROM들, CD-R들, CD-RW들, 자기 테이프들, 및 다른 광학적, 플래시 메모리 및 비-광학적 데이터 저장 디바이스들을 포함한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한 컴퓨터 판독가능 코드가 분산된 방식으로 저장 및 실행되도록 네트워크 커플링된 컴퓨터 시스템들 상에 걸쳐서 분산될 수 있다.
실시예들
본 명세서에 기술된 구조, 재료, 조성물 및 방법은 본 개시의 대표적인 실시예들인 것으로 의도되며, 본 개시의 범위가 실시예들의 범위로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 본 개시가 개시된 구조, 재료, 조성물 및 방법에 대한 변형들로 실시될 수 있고, 그러한 변형이 본 개시의 범주 내인 것으로 간주된다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1: 핵산 분석물을 획득하기 위한 생물학적 샘플 프로세싱
관심 핵산을 함유하는 조직학 샘플이 상술한 방법에 따라 프로세싱된다. 여기서, 접촉 매질은 핵산 단리에 사용하기에 아주 적합한 입자를 함유한다. 이들은 실리카 코팅된 강자성 비드와 같은 실리카 입자 또는 실리카 코팅된 입자를 포함한다. 입자 마이크로 블라스터는 조직 검체에서 핵산을 분리하는 효율적인 방법을 제공하기 위해 실리카 입자로 로딩된다. 먼저, 원하는 조직 영역은 그 후 수집되고 조직 용해 버퍼와 조합되어 세포를 파괴하는 실리카 입자로 마이크로-블라스팅에 의해 슬라이드로부터 제거된다. 이는 핵산이 실리카 입자 상으로 흡착되는 세포 용해 용액을 생성한다. 그 후 입자는 단백질 및 지질과 같은 용해물 용액의 다른 컴포넌트를 세척해 내면서 표면 상에 흡착된 핵산을 남기는 용액으로 세척된다. 핵산은 PCR과 같은 다운스트림 분석 기법들을 사용하여 직접 분석될 수도 있다. 대안으로, 실리카 입자의 표면 상에 흡착된 핵산은 PCR 과 같은 핵산 검출 기법으로 다운스트림 분석 전에 적합한 용리액으로 용리된다. 원하는 경우, 샘플은 레이저 미세-해부와 같은 미세 해부 기술을 사용하여 사전-프로세싱될 수도 있다.
실시예 2: 핵산 및 펩티드 분석물을 획득하기 위한 생물학적 샘플 프로세싱
대안으로, 실시예 1 에서 마이크로-블라스팅을 위해 사용된 입자는 용기에 수집되고 다양한 잠재적 분석물 (예를 들어, 핵산 또는 단백질) 의 선택적 결합에 최적으로 적합한 다른 입자와 조합되고, 결과의 입자들의 혼합은 관심 분석물을 단리하는데 사용된다. 실시예 1 에서와 같이, 이 대안의 설정에서는, 이들이 관심 분석물을 결합하는 마이크로-블라스팅 입자가 (예를 들어, 전하 또는 소수성 또는 친화성에 기초하여) 먼저 선택된다. 마이크로 블라스팅 후 생성되는 입자 및 조직의 혼합물은 세포를 파괴하기 위해 용해 버퍼와 조합되며, 결과의 용해 용액은 그 후 올리고뉴클레오티드 또는 항체가 관심 분석물에 대한 특이성으로 결합하는, 그 표면에 결합된 올리고뉴클레오티드 또는 항체를 갖는 입자와 조합된다. 그 후 입자 쌍은 직접 분석된다 (예를 들어, 크로마토그래피 또는 분광법). 대안으로, 입자 쌍은 관심 분석물을 용리하기 위해 결합, 세척 및 용리 단계의 일련의 단계를 거친 다음, 종래 기법을 사용하여 분석된다. 마지막으로, 관심 분석물은 단백질이고, 용해물 용액은 또한 효소 분석, 결합 분석, 기능 분석 등과 같은 다른 분석 단계를 거칠 수 있다.
상술한 방법은 임의의 단리 및/또는 정제 단계와 조합될 수 있으며, 이 단계는 워크플로우의 임의의 단계에서, 바람직하게는 최종 분석 단계 이전, 예를 들어 PCR (핵산 분석물의 경우) 또는 ELISA (단백질 분석물의 경우) 에 구현될 수도 있다. 예를 들어, 관심 핵산은 종종 다음의 일련의 단계들에 의해 조직으로부터 단리된다: (a) 조직의 세포가 다양한 방법에 의해 파괴되어 세포를 열고 그 내용물을 용액으로 방출하는, 조직 용해; (b) 고체 상의 표면 상으로의 핵산의 흡착; (c) 고체 상에 흡착된 핵산은 남기지만 다른 생체분자를 제거하는 용액으로의 이 고체 상의 세척 : 및 (d) 수집된 용리가 단리된 핵산을 포함하도록, 고체 상으로부터 핵산을 용리하는 용액으로의 고체 상의 세척. 실리카막 및 실리카 입자는 일반적으로 이러한 유형의 프로세스에서 고체 상으로서 사용된다. 실리카 코팅된 또는 중합체-코팅된 강자성 비드를 포함하여 다른 유형의 입자가 또한 일반적으로 사용된다.
전술한 설명으로부터, 당업자는 방법의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 조건에 발명을 적응하도록 다양한 변경 및 수정들을 행할 수 있다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 또는 등가의 다른 방법들 및 재료들이 본 개시의 실시 또는 테스팅에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들은 전술한 단락에 설명된다. 부가적으로, 자료들, 방법들, 및 예들은 오직 예시적일 뿐 한정하도록 의도되지 않는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 공개되지 않은 미국 특허 출원은 참조로 통합된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 참조로 여기에 통합된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개된 참고문헌, 문서, 원고, 과학 문헌은 여기에 참조로 통합된다. 본 명세서에 언급된 과학 데이터베이스와 관련된 모든 식별자 및 등록 번호 (예를 들어, PUBMED, NCBI) 는 여기에 참조로 통합된다.
선택된 실시형태들의 설명
실시형태 1. 기판 상으로 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 시스템으로서, 기판을 고정하기 위한 홀더 유닛; 홀더 유닛에 근접하여 포지셔닝된 카메라; 기판 상으로 부착된 샘플의 일부를 제거하도록 구성된 프로세싱 엘리먼트; 및 홀더 유닛에 통신가능하게 연결된 컴퓨팅 디바이스를 포함하고, 카메라 및 프로세싱 엘리먼트는, 카메라를 사용하여 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지 및 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 캡처 엔진, 사용자가 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성하는 것을 허용하도록 구성된 디지털 마커 엔진, 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하도록 구성된 이미지 오버레이 엔진, 및 제 1 고정 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 고정 샘플의 일부만이 제거되도록 프로세싱 엘리먼트 및 홀더 유닛의 포지셔닝을 제어하도록 구성된 샘플 제거 엔진을 포함한다.
실시형태 2. 실시형태 1 의 시스템에서, 프로세싱 엘리먼트가 기계적 도구를 활용하여 샘플의 일부를 제거하도록 구성된다.
실시형태 3. 실시형태 2 의 시스템에서, 기계적 도구는 샌드 블라스팅, 면도날, 밀링 도구, 큐렛, 홀 펀처, 스쿠퍼, 진공 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 시스템에서, 프로세싱 엘리먼트가 비-기계적 도구를 활용하여 샘플의 일부를 제거하도록 구성된다.
실시형태 5. 실시형태 4 의 시스템에서, 비-기계적 도구는 레이저 또는 워터제트 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태 6. 기판 상으로 부착된 샘플을 프로세싱하기 위한 방법으로서, 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지를 획득하는 단계; 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하는 단계; 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성하는 단계; 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하는 단계; 및 프로세싱 엘리먼트를 사용하여 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부만을 제거하는 단계를 포함한다.
실시형태 7. 실시형태 6 의 방법에서, 제거하는 단계는 기계적 도구로 제 2 부착된 샘플의 일부를 제거하는 것을 포함한다.
실시형태 8. 실시형태 6 또는 실시형태 7 의 방법에서, 샌드 블라스팅, 면도날, 큐렛, 홀 펀처, 스쿠퍼, 진공 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 제 2 부착된 샘플의 일부를 제거하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 9. 실시형태 6 의 방법에서, 제거하는 단계는 비-기계적 도구로 제 2 부착된 샘플의 일부를 제거하는 것을 포함한다.
실시형태 10. 실시형태 6 또는 실시형태 9 의 방법에서, 레이저 또는 워터제트 중 적어도 하나로 제 2 부착된 샘플의 일부를 제거하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 11. 기판 상으로 부착된 샘플들을 프로세싱하기 위한 시스템으로서, 기판을 고정하기 위한 홀더 유닛; 홀더 유닛에 근접하여 포지셔닝된 카메라; 기판 상으로 부착된 샘플의 일부 상에 핵산을 변성하기 위해 핵산 변성제를 공급하도록 구성된 프로세싱 엘리먼트; 및 홀더 유닛에 통신가능하게 연결된 컴퓨팅 디바이스를 포함하고, 카메라 및 프로세싱 엘리먼트는, 카메라를 사용하여 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지 및 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 캡처 엔진, 사용자가 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성할 수 있게 하도록 구성된 디지털 마커 엔진, 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하도록 구성된 이미지 오버레이 엔진, 및 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부에서 핵산만이 변성되도록 프로세싱 엘리먼트 및 홀더 유닛의 포지셔닝을 제어하도록 구성된 변성 엔진을 포함하고, 핵산 변성 엔진은 화학적 분석을 수행하기 위한 화학적 분석기, 질량 분석기, 및/또는 세포 분석을 수행하기 위한 세포 분석기를 포함한다.
실시형태 12. 실시형태 11 의 시스템에서, 핵산 변성제는 화학물질을 포함한다.
실시형태 13. 실시형태 12 의 시스템에서, 화학물질은 표백제, 산, 알칼리 또는 효소 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태 14. 실시형태 11 내지 13 중 어느 하나의 시스템에서, 프로세싱 엘리먼트가 비-화학적 도구를 활용하여 샘플의 일부를 제거하도록 구성된다.
실시형태 15. 실시형태 14 의 시스템에서, 비-화학적 도구는 레이저, 열 히터, 무선 주파수 (RF) 파, 초음파, 극저온 또는 플라즈마 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태 16. 기판 상으로 부착된 샘플을 프로세싱하기 위한 방법으로서, 제 1 부착된 샘플을 갖는 제 1 기판의 제 1 이미지를 획득하는 단계; 제 2 부착된 샘플을 갖는 제 2 기판의 제 2 이미지를 획득하는 단계; 제 1 부착된 샘플의 일부의 디지털 윤곽 및 제 1 이미지를 포함하는 마커 이미지를 생성하는 단계; 제 1 부착된 샘플의 이미지 윤곽들 및 제 2 부착된 샘플이 정렬되도록 제 2 이미지 상으로 마커 이미지를 오버레이하는 단계; 및 프로세싱 엘리먼트를 사용하여 제 1 부착된 샘플의 디지털 윤곽 내에 있는 제 2 부착된 샘플의 일부에서만 핵산을 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 17. 실시형태 16 의 방법에서, 변성시키는 단계는 화학물질로 제 2 부착된 샘플의 일부를 노출시키는 것을 포함한다.
실시형태 18. 실시형태 16 또는 실시형태 17 의 방법에서, 표백제, 산, 알칼리 또는 효소 중 적어도 하나로 제 2 부착된 샘플의 일부를 노출시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 19. 실시형태 16 의 방법에서, 변성시키는 단계는 비-화학적 도구로 제 2 부착된 샘플의 일부를 노출시키는 것을 포함한다.
실시형태 20. 실시형태 16 또는 실시형태 19 의 방법에서, 레이저, 열 히터, 무선 주파수 (RF) 파, 초음파, 극저온, 또는 플라즈마 중 적어도 하나로 제 2 부착된 샘플의 일부를 노출시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 21. 샘플 프로세싱 디바이스로서, 대향 단부들 상에 개구들을 갖는 제 1 컴포넌트; 제 1 컴포넌트의 일 단부 상에 고정되는 제 2 컴포넌트로서, 제 2 컴포넌트는 제 2 컴포넌트가 제 1 컴포넌트에 고정되는 곳으로부터 떨어져 대향하는 샘플 수집 개구를 포함하고, 샘플 수집 개구는 샘플 수집 개구의 둘레를 따라 돌출하는 하나 이상의 샘플 스크래핑 엘리먼트들을 갖는, 상기 제 2 컴포넌트; 및 제 1 컴포넌트의 다른 단부 상에 진공 연결 개구와 샘플 수집 개구를 연결시키도록 제 1 및 제 2 컴포넌트들을 통해 연장하는 진공 채널을 포함한다
실시형태 22. 실시형태 21 의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 제 1 및 제 2 컴포넌트들은 상이한 재료들로 구성된다.
실시형태 23. 실시형태 22 의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 제 1 및 제 2 컴포넌트들은 동일한 재료로 구성된다.
실시형태 24. 실시형태들 21 내지 23 중 어느 하나의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 샘플 스크래핑 엘리먼트들은 샘플 수집 개구의 둘레를 따라 균등하게 이격된다.
실시형태 25. 실시형태들 21 내지 23 중 어느 하나의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 샘플 스크래핑 엘리먼트들은 샘플 수집 개구의 둘레를 따라 상이하게 이격된다.
실시형태 26. 실시형태들 21 내지 25 중 어느 하나의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 제 1 컴포넌트의 일 단부 상의 개구에 부착되는 필터를 더 포함한다.
실시형태 27. 실시형태 21 의 샘플 프로세싱 디바이스에서, 제 1 및 제 2 컴포넌트들은 단일 통합된 디바이스로서 제조된다.

Claims (24)

  1. 생물학적 분석을 위해 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법으로서,
    (a) 접촉 매질과 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉 매질은 상기 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 상기 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는, 상기 접촉 매질과 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 접촉 매질을 제거하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플이 관심 진단의 하나 이상의 분석물들의 분석을 위해 프로세싱되는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 펀치 생검 검체, 바늘 생검 검체, 신선한 조직, 조직 배양물, 냉동 조직 검체, 중성 포르말린-처리된 조직, 기관, 세포기관, 포르말린 고정 파라핀 포매 (formalin fixed paraffin embedded; FFPE) 조직, 에탄올-고정 파라핀-포매 (EFPE) 조직, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 착색 조직 또는 글루타르알데히드 고정 조직을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플에서의 관심 영역 (ROI), 비관심 영역 (RONI), 또는 모든 영역들을 상기 접촉 매질과 접촉시키는 단계; 바람직하게는 상기 접촉 매질과 관심 영역 (ROI) 을 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 게놈 DNA (gDNA), 메틸화된 DNA, 특정 메틸화된 DNA, 메신저 RNA (mRNA), 단편화된 DNA, 단편화된 RNA, 단편화된 mRNA, 미토콘드리아 DNA (mtDNA), 엽록체 DNA (ctDNA), 바이러스성 RNA 또는 바이러스성 DNA, microRNA, 리보솜 RNA, 인 시튜 PCR 제품, polyA mRNA, RNA/DNA 하이브리드, 지질, 탄수화물, 단백질, 당단백질, 지질단백질, 인단백질, 특정 인산화된 또는 아세틸화된 단백질의 변이체 또는 바이러스성 외피 단백질로부터 선택된 적어도 하나의 관심 진단 분석물; 바람직하게는 mRNA, gDNA, 바이러스성 DNA 또는 바이러스성 RNA 로부터 선택된 핵산을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    블라스트 매질에서의 상기 미립자 물질은 알루미늄 산화물; 실리콘 이산화물; 금속성-기반 입자들; 자성 또는 강자성 입자들 또는 이들의 조합을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 미립자 물질은 상기 생물학적 샘플에서의 분석물 또는 비-분석물에 결합할 수 있고; 바람직하게, 상기 미립자 물질은 이온성 상호작용, 극성-무극성 상호작용, 소수성 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 화학적 커플링, 유전체 또는 쌍성이온 상호작용 또는 이들의 조합으로부터 선택된 상호작용을 통해 상기 분석물에 결합할 수 있는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 접촉 매질은 가압된 헬륨, 아르곤, 크세논, 질소, 이산화탄소, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 가압된 공기를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 기판 상에 장착되고, 예를 들어, 기판은 유리, 실리콘, 폴리-L-리신 코팅된 재료, 니트로셀룰로스, 폴리스티렌, 사이클릭 올레핀 공중합체 (COC), 사이클릭 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및/또는 폴리카보네이트로부터 선택되는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 핵산 분석물을 포함하고 상기 접촉 매질은 실리카를 포함하는 미립자 물질을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    마이크로-해부, 예를 들어 레이저 마이크로-해부를 더 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 접촉 매질은 진공화, 압력 차 또는 구배, 중력, 수송 매질 (예를 들어, 액체 또는 에어로졸 또는 기체), 또는 자기장 또는 전기장으로부터 선택된 전달 매질을 통해 상기 생물학적 샘플로부터 제거되는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    (a) 상기 생물학적 샘플에서의 비-관심 영역 (RONI) 을 상기 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계로서, 선택적 접촉은 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에서의 관심 영역 (ROI) 을 터치되지 않은 채로 두는 것을 포함하는, 상기 비-관심 영역 (RONI) 을 상기 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 생물학적 샘플에서의 관심 영역 (ROI) 을 상기 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계로서, 선택적 접촉은 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에서 비-관심 영역 (RONI) 을 터치되지 않은 채로 두는 것을 포함하는, 상기 관심 영역 (ROI) 을 상기 접촉 매질과 선택적으로 접촉시키는 단계; 또는
    (c) 상기 생물학적 샘플의 ROI 및 RONI 양자 모두를 상기 접촉 매질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 접촉 매질에서 상기 미립자 물질을 수집하는 단계; (c) 옵션으로, 분석을 위해 상기 미립자 물질을 준비하는 단계; 및 (d) 추가 옵션으로, 상기 미립자 물질을 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 분석을 위해 상기 미립자 물질을 준비하는 단계는 버퍼 (예를 들어, 용해 버퍼) 로 상기 미립자 물질을 처리하고 상기 미립자 물질을 세척하여 비-분석물을 제거하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 미립자 물질의 분석은, 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR), 정량적 PCR (qPCR), 역 전사효소 PCR (RT-PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 롤링 서클 증폭 (RCA), 면역분석, 면역PCR (iPCR), 효소 활성도 분석, 착색, 이미징, 전체 게놈 증폭 (WGA), 인 시튜 PCR, 인 시튜 WGA, 폴로니 형성, 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱, 나노포어 분석, 나노포어 시퀀싱, 단일-분자 이미징, DNA 볼 형성, 전기영동, MEMS (microelectromechanical systems) 전기영동, 질량 분석, 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC), 근접 결찰 분석, 전기화학적 검출, 플라스몬 공명 (SPR), 혼성화 분석 (예를 들어, 형광 인 시튜 혼성화 (fluorescence in situ hybridization ; FISH) 와 같은 인 시튜 혼성화 분석) FRET, 세포 분류 (예를 들어, FACS), 전기화학발광 (electrochemiluminescence) ELISA, 및 화학발광 ELISA 를 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 접촉 매질을 농축 매질과 혼합하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 농축 매질은 상기 생물학적 샘플에서의 관심 분석물에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 관심 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 관심 핵산에 특이적으로 혼성화하는 핵산을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 관심 영역 (ROI) 및/또는 비-관심 영역 (RONI); 바람직하게는 ROI 및 RONI 양자 모두의 잘 정의된 공간 위치를 포함하는 2 차원 조직 (예를 들어, 조직 절편 또는 슬라이스) 또는 3 차원 조직 (예를 들어, 조직 블록) 을 포함하는, 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법.
  20. 생물학적 샘플에서의 분석물에 대해 분석하는 방법으로서,
    (a) 접촉 매질과 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 것으로서, 상기 접촉 매질은 상기 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 상기 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는, 상기 접촉 매질과 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 것; 및
    (b) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 접촉 매질을 제거하는 것
    에 의해 상기 생물학적 샘플을 프로세싱하여 프로세싱된 생물학적 샘플을 획득하는 단계; 및
    제거된 상기 접촉 매질 또는 상기 프로세싱된 생물학적 샘플에서의 상기 분석물에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 분석물에 대해 분석하는 방법.
  21. (a) 생물학적 샘플에서의 컴포넌트의 접촉 매질로의 적어도 부분적 전달을 실시하기에 충분한 조건들 하에서 가압된 공기 및 미립자 물질을 포함하는 상기 접촉 매질과 상기 생물학적 샘플 또는 그 내의 영역을 접촉시키기 위한 제 1 컴포넌트;
    (b) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 접촉 매질을 제거하기 위한 제 2 컴포넌트; 및
    (c) 옵션으로, 상기 접촉 매질 또는 프로세싱된 상기 생물학적 샘플 또는 상기 접촉 매질 및 상기 프로세싱된 생물학적 샘플 양자 모두에서 상기 컴포넌트를 분석하기 위한 제 3 컴포넌트를 포함하는, 생분석 시스템.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 1 컴포넌트는 상기 접촉 매질을 함유하는 가압된 입자 마이크로-블라스터 (PMB) 를 포함하는, 생분석 시스템.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 2 컴포넌트는 진공, 압력 차 또는 구배, 미립자 물질 (예를 들어, 액체 또는 에어로졸) 을 수송하기 위한 매질, 또는 자기장 또는 전기장으로부터 선택된 전달 매질을 포함하는, 생분석 시스템.
  24. 제 21 항에 있어서,
    옵션의 상기 제 3 컴포넌트는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR), 정량적 PCR (qPCR), 역 전사효소 PCR (RT-PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 롤링 서클 증폭 (RCA), 면역분석, 면역PCR (iPCR), 효소 활성도 분석, 착색, 이미징, 전체 게놈 증폭 (WGA), 인 시튜 PCR, 인 시튜 WGA, 폴로니 형성, 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱, 나노포어 분석, 나노포어 시퀀싱, 단일-분자 이미징, DNA 볼 형성, 전기영동, MEMS (microelectromechanical systems) 전기영동, 질량 분석, 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC), 근접 결찰 분석, 전기화학적 검출, 플라스몬 공명 (SPR), 혼성화 분석 (예를 들어, 형광 인 시튜 혼성화 (fluorescence in situ hybridization ; FISH) 와 같은 인 시튜 혼성화 분석) FRET, 세포 분류 (예를 들어, FACS), 전기화학발광 (electrochemiluminescence) ELISA, 및 화학발광 ELISA 로부터 선택된 기구를 포함하는, 생분석 시스템.
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