BR112020026088A2 - sistemas e métodos para processamento de substrato pré-analítico - Google Patents

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Abstract

Algumas modalidades apresentadas nessa revelação referem-se a um Sistema de Dissecção Automatizada de Tecido (ATD). Um sistema de ATD é um sistema de parada única e potencialmente de baixo custo para realizar dissecações em um substrato de marca digital de patologista ou marca de caneta no substrato usando método sem contato e/ou mecânico para extrair uma amostra de tecido embebida em parafina e fixada em formalina (FFPE) com: (a) apenas a(s) ROI ou ROIs como área a ser salva; e (b) remover ou decompor o conteúdo de ácido nucleico na região sem interesse (RONI) e coletar toda a amostra de tecido de um substrato de microscópio padrão em um recipiente específico.

Description

SISTEMAS E MÉTODOS PARA PROCESSAMENTO DE SUBSTRATO PRÉ- ANALÍTICO REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS CAMPO
[001] A presente revelação geralmente se refere a campos da histologia e/ou patobiologia. Mais especificamente, a presente revelação se refere a sistemas de processamento de substrato pré-analítico e métodos relacionados que, em algumas modalidades, podem ser úteis para separar e isolar regiões de interesse (ROI) e regiões sem interesse (RONI) no substrato, por exemplo, substratos biológicos, tal como espécime histológico.
ANTECEDENTES
[002] Uma variedade de métodos foi sugerida para resolver a natureza incômoda dos procedimentos de raspagem para a preparação e/ou processamento de amostras histológicas para análise a jusante. Por exemplo, técnicas de jateamento a vácuo têm sido recomendadas; no entanto, eles só podem ser implantados em um ambiente industrial e, portanto, requerem ferramentas e instrumentos caros. Além disso, atualmente não há tecnologia de jateamento a vácuo compatível com substratos montados em lâminas de vidro microscópicas. De forma similar, os métodos de jateamento com base em partículas, tal como o jateamento de areia, por exemplo, com partículas de sílica, partículas revestidas com sílica ou grânulos ferromagnéticos revestidos com polímero, requerem a separação das partículas das regiões de interesse (ROI) antes da implementação das etapas analíticas a jusante.
[003] Os processos de dissecção de tecido atuais são completamente manuais, usando lâminas de raspagem para coletar diretamente áreas “S” (isto é, ROI) dos substratos. Por exemplo, fluxos de trabalho convencionais para envios de substrato incluem um processo inteiramente manual em que um usuário transfere manualmente as marcações da área de interesse do patologista em uma lâmina corada para lâminas não coradas usando uma caneta de marcação padrão disponível no mercado. O usuário então usa uma lâmina de raspagem ou equivalente para raspar a área de interesse no substrato não corado marcado e coletar em um recipiente.
[004] Esse processo manual descrito limita a precisão do operador por confiar completamente na coordenação mão/olho do operador, o que afeta a consistência e a precisão da raspagem do tecido. Esse processo também introduz problemas de ergonomia/segurança porque a força constante aplicada à superfície do vidro pode causar laceração e problemas ergonômicos (por exemplo, túnel de carpo) com o operador.
[005] As implementações atuais da patologia digital melhoraram muitas áreas dos fluxos de trabalho de histologia/patologia. No entanto, ainda existem algumas áreas importantes de necessidades não atendidas. Uma necessidade não atendida é que alguns envios de substrato não podem ser processados digitalmente usando os Sistemas de Patologia Digital comerciais. Um número substancial de casos ainda requer processamento manual do fluxo de trabalho do vidro. Portanto, existe uma necessidade de uma maneira de converter esse processo para atingir o fluxo de trabalho digital completo.
SUMÁRIO
[006] Algumas modalidades apresentadas nessa revelação se referem a um Sistema de Dissecção Automatizada de Tecido
(ATD). Um sistema de ATD é um sistema de parada única e potencialmente de baixo custo para realizar dissecações em um substrato de marca digital ou marca de caneta de patologista no substrato usando método sem contato e/ou mecânico para extrair uma amostra de tecido embebida em parafina e fixada em formalina (FFPE) com: (a) apenas a(s) ROI ou ROIs como área a ser salva; e (b) remover ou decompor o conteúdo de ácido nucleico na região sem interesse (RONI) e coletar toda a amostra de tecido de um substrato de microscópio padrão em um recipiente específico.
[007] De acordo com certos aspectos da presente revelação, o ATD é associado a um processo de patologia digital para raspar ROI em substratos. Também são revelados sistemas e métodos para coletar regiões “S” desejáveis (isto é, ROI) ou remover regiões “X” indesejadas de maneiras viáveis. Os sistemas e métodos descritos fornecem um sistema flexível de baixo custo para digitalizar imagens de lâminas e simplificar os processos de raspagem a jusante.
[008] Os sistemas, em algumas modalidades, podem ser capazes de realizar o seguinte: (a) capturar imagens de lâminas coradas e não coradas com ampliação adequada, (b) digitalizar uma marcação de caneta em uma marcação digital, (c) executar um objeto baseado ou outro algoritmo para combinar as coordenadas de marcação em um substrato com os substratos associados, (d) extrair ROI de amostra de marcada para um recipiente, (e) remover amostras em RONI ou decompor o ácido nucleico em RONI e coletar todas as amostras (por exemplo, tecido) em um recipiente, e (f) lisar a amostra e lisado de saída.
[009] Essa tecnologia pode ser útil porque os processos manuais atuais podem ter certas desvantagens ou limitações, tais como: (a) qualidade inferior, (b) limitações do operador, (c) riscos do trabalho, (d) ergonomia e/ou (e) segurança. Por exemplo, os métodos de dissecção manual dependem completamente da coordenação individual da mão/olho do operador, o que pode afetar a consistência e a precisão do resultado. Eles também podem exigir um plano de treinamento dedicado para atingir uma precisão consistente. A realização da dissecção manual com força constante aplicada à superfície do vidro também pode causar problemas ergonômicos para o operador ao longo do tempo; por exemplo, lesões no punho, tal como a síndrome do túnel do carpo. Assim, em muitos laboratórios, os operadores também devem limitar o número de horas que passam realizando dissecções manuais para ajudar a prevenir lesões. Em termos de segurança, também existe o risco de lesões pela lâmina de raspagem devido a lâminas quebradas que podem causar lacerações, por exemplo. No entanto, um método totalmente manual é comumente usado nos processos de laboratório atuais que, por exemplo, usam uma caneta marcadora padrão disponível no mercado para marcar à mão a área de interesse de um patologista, em que um usuário final pode usar uma lâmina de raspagem ou equivalente (isto é, bisturi) para raspar a área de interesse no substrato.
[0010] Sistemas automatizados para dissecção de amostras estão disponíveis; no entanto, tais sistemas podem ser caros e/ou de baixo rendimento. Por exemplo, o sistema AVENIO MILLISECT (Roche GmbH) é uma fresadora que realiza coleta automatizada de regiões de interesse em substratos e, assim, evita os problemas acima com coleta manual. No entanto, o sistema é caro, opera lentamente e pode exigir muitos sistemas e operadores para um laboratório de alto volume. Portanto, esse sistema pode não ser adequado para análises de amostras de alto rendimento. Os sistemas de dissecção de captura a laser também estão disponíveis em vários fabricantes (por exemplo, sistemas Leica LMD6-7). Nesses sistemas, um laser UV é usado para cortar (por exemplo, perfilar ou marcar um limite) uma ROI e um laser IV para dilatar uma capa adesiva para remover a ROI do substrato (por exemplo, para melhorar a liberação de espécime de um substrato); o sistema também requer substratos personalizados que podem ser coletados para análise subsequente.
[0011] Essa revelação aborda várias áreas de dissecção de amostra que podem causar dificuldades e modalidades podem compreender diferentes níveis de complexidade do sistema. Os presentes sistemas e métodos fornecem maneiras de separar uma região de interesse (ROI) em um substrato que pode fornecer maior rendimento e, portanto, dissecção de amostra mais rápida, evitando a separação manual e usando equipamento de lâmina padrão.
[0012] A presente revelação inclui, por exemplo, sistemas para processar amostras afixadas em um substrato, incluindo: (a) uma unidade de suporte para prender um substrato; (b) uma câmera posicionada próxima à unidade de suporte; (c) um elemento de processamento configurado para remover uma porção de uma amostra afixada no substrato; e (d) um dispositivo de computação conectado comunicativamente à unidade de suporte.
[0013] De acordo com os aspectos, a câmera e o elemento de processamento podem incluir: (a) um dispositivo de captura de imagem configurado para obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada e uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada usando a câmera, (b) um dispositivo de marcador digital configurado para permitir que um usuário gere uma imagem de marcador que contém a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada, (c) um dispositivo de sobreposição de imagem configurado para mapear a sobreposição da imagem do marcador na segunda imagem de modo que os contornos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam girados e alinhados, e (d) um dispositivo de remoção de amostra configurado para controlar o posicionamento da unidade de suporte e do elemento de processamento de modo que apenas uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada é removida.
[0014] Por conseguinte, algumas modalidades de sistema nesse documento compreendem um meio para digitalizar uma marca delineando a interface entre uma ou mais ROI(s) em uma amostra (também chamada de amostra “S” nesse documento) e outras amostras na lâmina (indicada como amostra “X” nesse documento). Essas interfaces incluem, por exemplo, algoritmos que permitem a criação de uma marca virtual em uma amostra, seja virtualmente traçando uma marca manual previamente colocada na mesma amostra, ou em uma amostra paralela que foi alinhada manualmente com a amostra, ou por alinhamento automatizado de uma amostra paralela previamente marcada manualmente para uma amostra alvo, bem como virtualmente traçando a marca de uma amostra para a outra.
Esses meios também incluem componentes mecânicos necessários para executar essas ações.
[0015] Algumas modalidades de sistema nesse documento compreendem meios para separar uma ou mais ROI(s) de qualquer amostra X na lâmina removendo seletivamente por meio de processos mecânicos ou ablação da amostra X sem impactar a(s) ROI(s). Tais meios incluem, por exemplo, um laser, tal como um laser de pulso, um jato de água ou uma fonte de radiofrequência, moagem, corrente elétrica, ultrassom, microjateamento, jateamento de microesferas, jateamento de partículas, jateamento de areia, ablação, ou energia térmica que é capaz de lise ou ablação de células animais. Esses meios também incluem os componentes mecânicos necessários para empregar esses métodos e algoritmos que podem direcionar o dispositivo, tal como um laser ou jato de água, por exemplo, especificamente para a amostra X, evitando a(s) ROI(s).
[0016] Algumas modalidades de sistema nesse documento compreendem meios para separar uma ou mais ROI(s) de X amostras por decomposição química seletiva da amostra X ou células ou macromoléculas nas mesmas. Tais meios incluem, por exemplo, lixívia, ácido forte, base forte ou uma ou mais de enzimas direcionadas seletivamente para a amostra X e não para ROI(s) na lâmina, bem como os componentes mecânicos necessários para empregar esses métodos e algoritmos que pode direcionar os produtos químicos especificamente para a amostra X, evitando ROI(s).
[0017] Em algumas modalidades de sistema, o sistema também compreende um meio para coleta de passagem direta de uma ou mais ROI(s) em um substrato. Por exemplo, a passagem direta pode não incluir marcações quando todas as amostras são coletadas. Uma vez que os Xs são mortos ou removidos, o método de passagem direta pode ser utilizado como todas as amostras restantes (por exemplo, apenas regiões S) são coletadas. Os meios exemplificativos incluem, por exemplo, jato de partículas, lâminas, como lâminas de raspagem, bisturis, curetas, colheres, punções, uma fonte de vácuo para permitir que um vácuo remova a amostra, ou uma superfície carregada ou meio para fornecer uma superfície ou meio ou solução competitiva(o) (por exemplo, microjateamento de partículas) para a amostra de ROI, ou usando meio adesivo para extrair a ROI da lâmina de vidro. Esses meios também incluem outros elementos mecânicos conforme necessário para controlar automaticamente o uso dos elementos acima.
[0018] Em algumas modalidades, o sistema inclui meios para colocar a amostra de ROI em um recipiente. Os meios exemplificativos incluem, por exemplo, componentes mecânicos que podem controlar automaticamente o processo de retirar a amostra ROI de uma lâmina e colocá-la dentro ou sobre um recipiente, tal como uma estrutura de poço, um tubo ou um frasco.
[0019] Aspectos da presente revelação descrevem um método para processar amostras afixadas em um substrato que compreende: (a) obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada; (b) obter uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada; (c) gerar uma imagem de marcador contendo a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada; (d) sobrepor a imagem do marcador à segunda imagem de modo que os contornos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados; e (e) remover apenas uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada usando um elemento de processamento.
[0020] Outros aspectos da presente revelação descrevem um sistema para processar amostras afixadas em um substrato, que compreende: (a) uma unidade de suporte para prender um substrato; (b) uma câmera posicionada próxima à unidade de suporte; (c) um elemento de processamento configurado para fornecer um agente desnaturante de ácido nucleico para desnaturar os ácidos nucleicos em uma porção de uma amostra afixada ao substrato; e (d) um dispositivo de computação conectado comunicativamente à unidade de suporte.
[0021] De acordo com os aspectos, a câmera e o elemento de processamento podem incluir: (a) um dispositivo de captura de imagem configurado para obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada e uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada usando a câmera, (b) um dispositivo de marcador digital configurado para permitir que um usuário gere uma imagem de marcador que contém a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada, (c) um dispositivo de sobreposição de imagem configurado para sobrepor a imagem do marcador na segunda imagem, de modo que os contornos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados, e (d) um dispositivo de desnaturação de ácido nucleico configurado para controlar o posicionamento da unidade de suporte e do elemento de processamento de modo que apenas o ácido nucleico na porção X ou (RONI) da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada é desnaturada, o dispositivo de desnaturação de ácido nucleico que compreende um analisador químico para realizar análise química, um espectrômetro de massa e/ou um analisador de células para realizar a análise de células.
[0022] Aspectos adicionais descrevem um método para processar amostras afixadas em um substrato que compreende: (a) obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada; (b) obter uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada; (c) gerar uma imagem de marcador contendo a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada; (d) sobrepor a imagem do marcador à segunda imagem de modo que os contornos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados; e (e) desnaturar apenas o ácido nucleico em uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada usando um elemento de processamento.
[0023] Em outro(s) aspecto, sistemas, métodos e aparelhos para processamento de amostras histológicas, por exemplo, lâminas FFPE ou tecidos fixos são revelados. Esses sistemas, métodos e aparelhos superam as limitações do microjateador de partículas existente (PMB) e da tecnologia de fresagem de controle numérico computadorizado (CNC) melhora muito a facilidade de uso e também a sensibilidade e/ou especificidade do fluxo de trabalho analítico. Em particular, a revelação se refere a variações na tecnologia de fresagem com PMB e CNC, que permite a remoção eficiente de regiões sem interesse (RONI) ou coleta da região de interesse (ROI) de amostras histológicas, enquanto, ao mesmo tempo, minimiza a perda de analitos (por exemplo, ácidos nucléicos, proteínas e outras macromoléculas) da ROI. Os métodos descritos são simples e podem ser perfeitamente integrados com os procedimentos analíticos a jusante.
[0024] De acordo com a presente revelação, uma técnica de explosão de combinação é usada para processar espécime biológico montado em substratos, por exemplo, lâminas de vidro. Uma combinação de material de jateamento (isto é, partículas) e ar pressurizado é alimentada à força no sistema e direcionada para a ROI do tecido do paciente. O PMB é estruturado de forma a conter o tecido do paciente jateado dentro das paredes do PMB. Em seguida, um vácuo é usado para retirar o tecido jateado da área e acumulá-lo em um recipiente. Um filtro pode ser usado para dividir o recipiente para permitir o acúmulo de vácuo, mas impede que as partes cheguem à bomba de vácuo. Esse método pode ser usado tanto para jatear a região de descarte (“X”) ou região de interesse (“S”), ou todos os conteúdos de interesse. Os meios de jateamento podem ser feitos de diferentes materiais, incluindo, por exemplo, óxido de alumínio; dióxido de silício; partículas de base metálica; partículas magnéticas ou ferromagnéticas; sal, partículas iônicas, partículas de reagente liofilizado.
[0025] Em contraste com a tecnologia de PMB existente, que requer a separação das partículas do alvo final de interesse (por exemplo, antes do processamento a jusante), os sistemas e métodos da presente revelação não requerem a separação das partículas da amostra processada como as próprias partículas são usadas no processo a jusante.
[0026] Os presentes métodos também são vantajosos sobre os métodos existentes, pois permitem a integração de várias etapas de processamento em uma única etapa, o que ajuda a reduzir a contaminação cruzada e também permite a coleta de analitos, tais como ácidos nucleicos de espécimes de tecido de uma maneira altamente simplificada e eficiente, e de barata. Ao reduzir as considerações do operador, os sistemas e métodos presentemente revelados ajudam a reduzir a variabilidade e/ou aumentar a reprodutibilidade de ensaios histológicos, tais como, imuno-histoquímica, ensaios de proteção de nuclease, etc.
[0027] Outra vantagem da presente tecnologia é que os sistemas e/ou métodos da presente revelação podem ser aplicados modularmente em um fluxo de trabalho analítico existente, por exemplo, procedimentos analíticos a jusante, tal como microscopia, ensaios de hibridização, sequenciamento, cromatografia, espectrometria, ELISA, etc. Isso significa que os sistemas e/ou métodos presentemente revelados podem ser integrados perfeitamente em várias etapas de pré e pós-processamento. Se desejado, os sistemas e métodos também podem ser aplicados, como um andaime, em várias etapas analíticas a jusante.
[0028] Os presentes métodos podem ser facilmente modificados ou adaptados para utilizar uma variedade de partículas de ablação, por exemplo, partículas de diferentes tamanhos, formas ou materiais podem ser selecionadas com base na preparação e/ou composição do tecido alvo. Por exemplo, dependendo do alvo de interesse, podem ser usados tipos alternativos de materiais, tais como, partículas hidrofóbicas, polares, apolares, com capacidade de troca iônica, partículas específicas de afinidade, partícula dielétrica, partículas liofilizadas, etc. Além disso, uma vez que os reagentes e sistemas empregados nesse documento são relativamente baratos, a presente tecnologia pode ser facilmente integrada em um fluxo de trabalho analítico para melhorar significativamente o desempenho sem aumentar abertamente o custo do ensaio.
[0029] A presente revelação, portanto, se refere, em parte, às seguintes modalidades não limitativas.
[0030] Em algumas modalidades, a revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico, que compreende (a) contactar a amostra biológica com um meio de contato que compreende uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos transferência parcial de um componente da amostra biológica para o meio de contato; e (b) remover o meio de contato da amostra biológica. De preferência, a amostra biológica é processada para análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico.
[0031] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a amostra biológica compreende espécimes de biópsia por punção, espécimes de biópsia por agulha, tecidos frescos, culturas de tecidos, espécimes de tecidos congelados, tecidos neutros tratados com formalina, órgãos, organelas, tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (FFPE), tecidos embebidos e fixados em cera, tecidos embebidos em parafina e fixados em etanol (EFPE), tecidos corados com hematoxilina e eosina (H&E), ou tecidos fixados com glutaraldeído. De preferência, a amostra biológica compreende tecidos FFPE ou EFPE. De preferência, a amostra biológica contém células de tecido tumoral, tecidos degenerativos, tecidos inflamados (por exemplo, tecido de um paciente que sofre de uma doença inflamatória, tais como, artrite reumatoide, colite ulcerativa, doença de Crohn, etc.
[0032] A revelação se refere a um dispositivo de moagem de amostra que inclui um primeiro e um segundo componentes. O primeiro componente tem aberturas em ambas as extremidades. O segundo componente é preso a uma extremidade do primeiro componente e tem uma abertura de coleta de amostra voltada para longe de onde o segundo componente é preso ao primeiro componente. A abertura de coleta de amostra tem um ou mais elemento(s) de raspagem de amostra que se projetam ao longo de um perímetro da abertura de coleta de amostra. Um canal de vácuo se estende através do primeiro e do segundo componentes para conectar a abertura de coleta de amostra com uma abertura de conexão de vácuo na outra extremidade do primeiro componente.
[0033] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, que compreende o contato de uma região de interesse (ROI), uma região sem interesse (RONI), ou todas as regiões na amostra biológica com o meio de contato; de preferência contactando uma região de interesse (ROI) com o meio de contato.
[0034] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a amostra biológica compreende pelo menos um analito de interesse diagnóstico selecionado de DNA genômico (gDNA), DNA metilado, DNA metilado específico, RNA mensageiro (mRNA), DNA fragmentado, RNA fragmentado, mRNA fragmentado, DNA mitocondrial (mtDNA), DNA de cloroplasto (ctDNA), RNA viral ou DNA viral, microRNA, RNA ribossomal, produto de PCR in situ, mRNA poliA, híbrido de RNA/DNA, lipídeo, carboidrato, proteína, glicoproteína, lipoproteína, fosfoproteína, variante fosforilada ou acetilada específica de uma proteína ou proteínas do revestimento viral; de preferência ácidos nucleicos selecionados de mRNA, gDNA, DNA viral ou RNA viral.
[0035] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a substância particulada no meio de jateamento compreende óxido de alumínio; dióxido de silício; partículas de base metálica; partículas magnéticas ou ferromagnéticas ou uma combinação das mesmas.
[0036] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a substância particulada é capaz de se ligar a um analito ou não analito na amostra biológica; de preferência, a substância particulada é capaz de se ligar ao analito por meio de uma interação selecionada de interação iônica, interação polar-apolar, interação hidrofóbica, interação de van der waal, acoplamento químico, interação dielétrica ou zwitteriônica ou uma combinação dos mesmos.
[0037] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que o meio de contato compreende ar pressurizado selecionado de pressurizado hélio, argônio, xenônio, nitrogênio, dióxido de carbono ou uma combinação dos mesmos.
[0038] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a amostra biológica é montada em um substrato, por exemplo, um substrato é selecionado de vidro, silício, material revestido com poli-L-lisina, nitrocelulose, poliestireno, copolímeros de olefina cíclica (COCs), polímeros de olefina cíclicos (COPs), polipropileno, polietileno, papel e/ou policarbonato.
[0039] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a amostra biológica compreende um analito de ácido nucleico e o meio de contato compreende uma substância particulada que compreende sílica.
[0040] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, que compreende adicionalmente microdissecção, por exemplo, microdissecção à laser.
[0041] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que o meio de contato é removido da amostra biológica via vácuo, diferencial ou gradiente de pressão, gravidade, um meio de transporte (por exemplo, líquido ou aerossol ou gás), ou um meio de transferência selecionado de campo magnético ou campo elétrico.
[0042] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, que compreende (a) contactar seletivamente uma região sem interesse (RONI) na amostra biológica com o meio de contato, em que o contato seletivo compreende, de preferência, deixar uma região de interesse (ROI) na amostra biológica intacta; (b) contatar seletivamente uma região de interesse (ROI) na amostra biológica com o meio de contato, em que o contato seletivo compreende, de preferência, deixar uma região sem interesse (RONI) na amostra biológica intocada; ou (c) contatar ROI e RONI na amostra biológica com o meio de contato.
[0043] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo,
para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, que compreende a coleta da substância particulada no meio de contato; (c) preparar opcionalmente a substância particulada para análise; e (d) adicionalmente opcionalmente analisar a substância particulada.
[0044] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a preparação da substância particulada para análise compreende o tratamento a substância particulada com um tampão (por exemplo, tampão de lise) e lavando a substância particulada para remover não analitos. De preferência, nessa modalidade, a análise da substância particulada compreende reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo (qPCR), PCR de transcriptase reversa (RT- PCR), amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação por círculo rolante (RCA), imunoensaio, imunoPCR (iPCR), ensaio de atividade enzimática, coloração, formação de imagem, amplificação do genoma completo (WGA), PCR in situ, WGA in situ, formação de polony, sequenciamento, sequenciamento de uma única molécula, análise de nanopore, sequenciamento nanopore, formação de imagem de uma única molécula, formação de esferas de DNA, eletroforese, eletroforese de sistemas microeletromecânicos (MEMS), espectrometria de massa, cromatografia (por exemplo, HPLC), ensaio de ligação de proximidade, detecção eletroquímica, ressonância de plasmon (SPR), ensaio de hibridização (por exemplo, em ensaio de hibridização situ, tal como hibridização in situ por fluorescência (FISH)) FRET, classificação de células (por exemplo, FACS), ELISA de eletroquimioluminescência e ELISA de quimioluminescência.
[0045] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que o método compreende adicionalmente misturar o meio de contato com um meio enriquecedor. De preferência, nessa modalidade, o meio de enriquecimento compreende uma substância que se liga especificamente a um analito de interesse na amostra biológica, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de proteína de interesse ou um ácido nucleico que se hibridiza especificamente com um ácido nucleico de interesse.
[0046] A revelação se refere a um método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico de acordo com as modalidades anteriores ou seguintes, por exemplo, para a análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico, em que a amostra biológica compreende um tecido bidimensional (por exemplo, seção ou fatia de tecido) ou um tecido tridimensional (por exemplo, bloco de tecido) que compreende uma localização espacial bem definida de uma região de interesse (ROI) e/ou uma região sem interesse (RONI); de preferência ROI e RONI.
[0047] Em algumas modalidades, a revelação se refere a um método de ensaio para um analito em uma amostra biológica que compreende o processamento da amostra biológica por (a) contactar a amostra biológica com um meio de contato que compreende uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos a transferência parcial de um componente da amostra biológica para o meio de contato; e (b) remover o meio de contato da amostra biológica para obter uma amostra biológica processada; e ensaio do analito na amostra biológica processada ou no meio de contato removido.
[0048] Em algumas modalidades, a revelação se refere a um sistema bioanalítico que compreende (a) um primeiro componente para contactar uma amostra biológica ou uma região na mesma com um meio de contato que compreende uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos uma transferência parcial de um componente da amostra biológica para o meio de contato; (b) um segundo componente para remover o meio de contato da amostra biológica; e (c) opcionalmente, um terceiro componente para analisar o componente no meio de contato ou a amostra biológica processada ou o meio de contato e a amostra biológica processada.
[0049] A revelação se refere a um sistema bioanalítico das modalidades anteriores ou seguintes, em que o primeiro componente compreende um microjateador de partículas pressurizadas (PMB) contendo o meio de contato.
[0050] A revelação se refere a um sistema bioanalítico dos anteriores ou das modalidades seguintes, em que o segundo componente compreende um vácuo, diferencial ou gradiente de pressão, um meio para transportar a substância particulada (por exemplo, líquido ou aerossol) ou um meio de transferência selecionado do campo magnético ou campo elétrico.
[0051] A revelação se refere a um sistema bioanalítico das modalidades anteriores ou seguintes, em que o terceiro componente opcional compreende um instrumento selecionado de reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo (qPCR), PCR via transcriptase reversa (RT-PCR), amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação por círculo rolante (RCA), imunoensaio, imunoPCR (iPCR), ensaio de atividade enzimática, coloração, formação de imagem, amplificação do genoma completo (WGA), PCR in situ, WGA in situ, formação de polony, sequenciamento, sequenciamento de uma única molécula, análise de nanopore, sequenciamento de nanopore, formação de imagem de uma única molécula, formação de esferas de DNA, eletroforese, eletroforese de sistemas microeletromecânicos (MEMS), espectrometria de massa, cromatografia (por exemplo, HPLC), ensaio de ligação de proximidade, detecção eletroquímica, ressonância plasmônica (SPR), ensaio de hibridização (por exemplo, ensaio de hibridização in situ, tal como hibridização in situ por fluorescência (FISH)) FRET, classificação de células (por exemplo, FACS), eletroquimioluminescência ELISA e quimioluminescência ELISA.
[0052] Algumas modalidades apresentadas nessa revelação referem-se a um Sistema de Dissecção Automatizada de Tecido (ATD). Um sistema de ATD é um sistema de parada única e potencialmente de baixo custo para realizar dissecações em um substrato de marca digital ou marca de caneta de patologista no substrato usando método sem contato e/ou mecânico para extrair uma amostra de tecido embebida em parafina e fixada em formalina (FFPE) com: (a) apenas a ROI ou ROIs como área a ser salva; e (b) remover ou decompor o
DNA na região sem interesse (RONI) e coletar toda a amostra de tecido de um substrato de microscópio padrão em um recipiente específico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0053] A Fig. 1 mostra representações esquemáticas de vários métodos de raspagem que são utilizados de acordo com várias modalidades.
[0054] A FIG. 2 fornece um fluxograma que mostra um processo exemplificativo para o processamento digital de envios de substrato, de acordo com várias modalidades.
[0055] A Fig. 3 fornece um fluxograma mostrando métodos melhorados para coletar regiões “S” ou remover regiões “X”, de acordo com várias modalidades.
[0056] A Fig. 4 mostra métodos exemplificativos para dissecção de amostra, de acordo com várias modalidades.
[0057] A Fig. 5 ilustra a irradiação transmitida e refletida exemplificativa de uma radiação incidente em uma máscara, de acordo com várias modalidades. Isso ocorre porque a radiação é parcialmente bloqueada pela máscara e a radiação só pode atingir certas áreas (por exemplo, apenas uma certa porcentagem da energia pode ser transmitida em função do comprimento de onda).
[0058] A Fig. 6 mostra uma lâmina exemplificativa com regiões “X” indesejadas marcadas e uma região de interesse (ROI), de acordo com várias modalidades. Por exemplo, as regiões “X” e a ROI podem ser determinadas pelos processos descritos abaixo.
[0059] A Fig. 7 ilustra um processo onde regiões “X” indesejadas são removidas de um substrato sobrepondo uma máscara sobre o substrato, de acordo com várias modalidades.
Por exemplo, uma máscara pode ser preparada como descrito abaixo. A máscara pode ser sobreposta em um substrato e as regiões “X” podem ser removidas por meio de vários métodos, como descrito abaixo.
[0060] As Figs. 8A e 8B mostram ilustrações representativas dos microjateadores de partículas, de acordo com várias modalidades. A Fig. 8A mostra a implementação representativa de PMB da revelação para processar amostras de pacientes; e a Fig. 8B mostra a implementação representativa de PMB da revelação para processar amostras de pacientes.
[0061] A Fig. 9 mostra uma arquitetura de sistema exemplificativa de um sistema de computador para implementação dos sistemas e métodos descritos.
[0062] A Fig. 10 ilustra um dispositivo de processamento de amostra exemplificativo, de acordo com várias modalidades.
[0063] A Fig. 11 ilustra um dispositivo de processamento de amostra exemplificativo, de acordo com várias modalidades.
[0064] A Fig. 12 ilustra um sistema de processamento de amostra exemplificativo, de acordo com várias modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0065] Alguns dos termos usados nesse documento são definidos como descrito nessa seção. Outros termos são definidos ou exemplificados em outra parte da revelação. A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto à qual essa invenção pertence.
[0066] Nesse pedido, o uso de “ou” significa “e/ou", a menos que indicado de outra forma. No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, o uso de “ou” refere-se a mais de uma reivindicação independente ou dependente anterior apenas como alternativa.
[0067] A palavra “cerca de” significa uma faixa de mais ou menos 10% desse valor, por exemplo, “cerca de 5” significa 4,5 a 5,5, “cerca de 100” significa 90 a 100, etc., a menos que o contexto da revelação indica o contrário, ou é inconsistente com tal interpretação. Por exemplo, em uma lista de valores numéricos, tal como “cerca de 49, cerca de 50, cerca de 55", “cerca de 50” significa uma faixa que se estende a menos da metade da(s) faixa(s) entre os valores anteriores e subsequentes, por exemplo, mais de 49,5 para menos de 52,5. Além disso, as expressões “menos do que cerca de” um valor ou “maior do que cerca de” um valor devem ser entendidas em vista da definição do termo “cerca de” fornecido nesse documento.
[0068] Quando uma faixa de valores é fornecida nessa revelação, pretende-se que cada valor intermediário entre os limites superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor determinado ou intermediário nessa faixa determinada seja abrangido pela revelação. Por exemplo, se uma faixa de 1 µm a 8 µm for determinado, pretende-se que 2 µm, 3 µm, 4 µm, 5 µm, 6 µm e 7 µm também sejam revelados.
[0069] Como usado nesse documento, o termo “pluralidade” pode ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais.
[0070] Como usado nesse documento, o termo “detecção” refere-se ao processo de determinação de um valor ou conjunto de valores associados a uma amostra pela medição de um ou mais parâmetro(s) em uma amostra e pode adicionalmente compreender a comparação de uma amostra de teste contra a referência amostra. De acordo com a presente revelação, a detecção de tumores inclui a(o) identificação, ensaio, medição e/ou quantificação de um ou mais marcador(es).
[0071] O termo “probabilidade", como usado nesse documento, geralmente se refere a uma probabilidade, uma probabilidade relativa, uma presença ou uma ausência ou um grau.
[0072] Como usado nesse documento, os termos “compreender” (ou variações do mesmo), “conter” (ou variações do mesmo), “ter” (ou variações do mesmo) ou “incluir” (ou variações do mesmo), não se destinam a ser limitantes, são inclusivos ou abertos e não excluem aditivos, componentes, números inteiros, elementos ou etapas de método adicionais não recitado(a)s. Por exemplo, um(a) processo, método, sistema, composição, kit ou aparelho que compreende uma lista de recursos não está necessariamente limitado apenas a esses recursos, mas pode incluir outros recursos não expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, sistema, composição, kit ou aparelho.
[0073] O termo “amostra”, como usado nesse documento, refere-se a uma composição que é obtida ou derivada de um indivíduo de interesse que contém uma entidade celular e/ou outra molecular que deve ser caracterizada e/ou identificada, por exemplo, com base nas características bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas. De preferência, a amostra é uma “amostra biológica", o que significa uma amostra que é derivada de uma entidade viva, por exemplo,
células, tecidos, órgãos e semelhantes. Em algumas modalidades, a fonte da amostra de tecido pode ser sangue ou quaisquer constituintes do sangue; fluidos corporais; tecido sólido a partir de um órgão fresco, congelado e/ou preservado ou amostra de tecido ou biópsia ou aspirado; e células de qualquer momento da gestação ou do desenvolvimento do objeto ou plasma. As amostras incluem, mas não se limitam a células primárias ou cultivadas ou linhas celulares, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, soro, plasma, fluidos (por exemplo, linfa, líquido amniótico, leite, sangue integral, urina, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva, expectoração, lágrimas, transpiração, muco, lisados de tumor e meio de cultura de células), tecido homogeneizado, tecido de tumor e extratos celulares. As amostras incluem adicionalmente amostras biológicas que foram manipuladas, por exemplo, por meio de tratamento com reagentes, solubilizadas ou enriquecidas com certos componentes, tais como proteínas ou ácidos nucleicos, ou incorporadas em uma matriz semissólida ou sólida para finalidades de corte, por exemplo, uma fina fatia de tecido ou células em uma amostra histológica. As amostras podem conter componentes ambientais, tais como, por exemplo, água, solo, lama, ar, resinas, minerais, etc. De preferência, a amostra biológica contém DNA (por exemplo, gDNA, mtDNA), RNA (por exemplo, mRNA, tRNA), proteína, ou combinações dos mesmos, obtidos de um indivíduo (por exemplo, indivíduo humano ou outro mamífero).
[0074] Como usado nesse documento, o termo “célula” é usado indistintamente com o termo “célula biológica". Exemplos não limitativos de células biológicas incluem células eucarióticas, células vegetais, células animais, tais como, células de mamíferos, células reptilianas, células aviárias, células de peixes ou semelhantes, células procarióticas, células bacterianas, células fúngicas, células de protozoários ou semelhantes, células dissociadas de um tecido, tais como, músculo, cartilagem, gordura, pele, fígado, pulmão, tecido neural e semelhantes, células imunológicas, tais como, células T, células B, células natural killer, macrófagos e semelhantes, embriões (por exemplo, zigotos), oócitos, óvulos, células de esperma, hibridomas, células em cultura, células de uma linha celular, células cancerígenas, células infectadas, células transfectadas e/ou transformadas, células repórter e semelhantes. Uma célula de mamífero pode ser, por exemplo, de um humano, um camundongo, um rato, um cavalo, uma cabra, uma ovelha, uma vaca, um primata ou semelhantes.
[0075] Como usado nesse documento, o termo “tumor” inclui qualquer célula ou tecido que pode ter sofrido transformação no nível genético, celular ou fisiológico em comparação com uma célula normal ou de tipo selvagem. O termo usualmente indica crescimento neoplásico que pode ser benigno (por exemplo, um tumor que não forma metástases e destrói o tecido normal adjacente) ou maligno/câncer (por exemplo, um tumor que invade os tecidos circundantes, e usualmente é capaz de produzir metástases, pode recorrer após a tentativa de remoção e é provável que cause a morte do hospedeiro, a menos que seja tratado adequadamente). Ver Steadman’s Medical Dictionary, 28a Ed Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005).
[0076] O termo “câncer” refere-se ao crescimento celular anormal, particularmente cânceres e carcinomas, sarcomas,
adenocarcinomas, linfomas, leucemia, cânceres sólidos e linfoides, etc. que são malignos por natureza. Exemplos de diferentes tipos de câncer incluem, mas não estão limitados a, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer gástrico, câncer de bexiga, câncer oral, câncer de ovário, câncer de tireoide, câncer de próstata, câncer uterino, câncer testicular, neuroblastoma, carcinoma de células escamosas da cabeça, pescoço, colo do útero e vagina, mieloma múltiplo, tecido mole e sarcoma osteogênico, câncer colorretal, câncer de fígado, câncer renal (por exemplo, RCC), câncer pleural, câncer cervical, câncer anal, câncer de duto biliar, tumores carcinoides gastrointestinais, câncer do esôfago, câncer da vesícula biliar, câncer do intestino delgado, câncer do sistema nervoso central, câncer da pele, coriocarcinoma; sarcoma osteogênico, fibrossarcoma, glioma, melanoma, etc.
[0077] O termo “normal", como usado no contexto de “célula normal”, pretende se referir a uma célula de um fenótipo não transformado ou exibindo uma morfologia de uma célula não transformada do tipo de tecido sendo examinado (por exemplo, PBMC). Em algumas modalidades, “amostra normal”, como usado nesse documento, inclui amostra não tumoral, por exemplo, amostra de saliva, amostra de pele, amostra de cabelo ou semelhantes. Deve ser notado que os métodos da revelação podem ser implementados sem o uso de amostras normais.
[0078] O termo “anormal”, como usado nesse documento, geralmente se refere a um estado de um sistema biológico que se desvia em algum grau do normal (por exemplo, tipo selvagem). Estados anormais podem ocorrer no nível fisiológico ou molecular. Os exemplos representativos incluem, por exemplo, estado fisiológico (doença, patologia) ou uma aberração genética (mutação, variante de nucleotídeo único, variante do número de cópias, fusão gênica, indel, etc.). Um estado de doença pode ser câncer ou pré-câncer. Um estado biológico anormal pode estar associado a um grau de anormalidade (por exemplo, uma medida quantitativa que indica uma distância do estado normal).
[0079] Como usado nesse documento, o termo “marcador” se refere a uma característica que pode ser medida objetivamente como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou uma resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica, por exemplo, tratamento com um agente anticâncer. Tipos representativos de marcadores incluem, por exemplo, alterações moleculares na estrutura (por exemplo, sequência) ou número do marcador, que compreende, por exemplo, mutações de genes, duplicações de genes, substituições adições ou eliminações de aminoácidos, ou uma pluralidade de diferenças, tais como alterações somáticas no DNA, variações do número de cópias, repetições em tandem, translocações ou uma combinação dos mesmos.
[0080] Como usado nesse documento, o termo “marcador genético” se refere a uma sequência de polinucleotídeo que tem uma localização específica em um genoma ou corresponde à localização específica no genoma (por exemplo, um transcrito que é complementar à sequência da localização genômica). Assim, o termo “marcador genético” também pode ser usado para se referir a, por exemplo, um cDNA e/ou um mRNA codificado por uma sequência genômica, bem como à própria sequência genômica. Os marcadores genéticos podem incluir dois ou mais alelos ou variantes. Os marcadores genéticos incluem sequências de ácido nucleico que codificam ou não codificam para um produto gênico (por exemplo, uma proteína). Particularmente, os marcadores genéticos incluem polimorfismos/variações de nucleotídeo único ou variações do número de cópias ou uma combinação dos mesmos. De preferência, o marcador genético inclui variações somáticas no DNA, por exemplo, sSNV ou sCNV, indels, SVs ou uma combinação dos mesmos em comparação com uma amostra de referência.
[0081] Como usado nesse documento, o termo “marcador de proteína” ou “marcador proteômico” refere-se a uma sequência de polipeptídeo ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo, que corresponde a um transcrito (por exemplo, é codificado por uma transcrição), que por sua vez pode corresponder a uma sequência genômica (por exemplo, uma transcrição que é transcrita por uma sequência de DNA).
[0082] Uma amostra de tecido “embebida em cera e fixada em formalina” ou “embebida em parafina e fixada em formalina” ou “FFPE” nesse documento é amplamente interpretada como se referindo a uma amostra que foi fixada com formalina ou uma substância equivalente e embebido em cera, tal como cera de parafina ou uma substância equivalente. O tecido FFPE nesse documento pode ser de qualquer fonte humana, animal ou vegetal.
[0083] Uma “lâmina” nesse documento pode ser qualquer tipo de superfície capaz de reter tecido FFPE para análise e pode ser feita de quaisquer materiais adequados.
[0084] Uma “região de interesse” ou “ROI” nesse documento se refere a uma porção de uma amostra em um substrato que um usuário pode desejar analisar, de modo a avaliar alterações na(o) sequência, estrutura ou nível de expressão de genes. As amostras em um substrato podem ser compreendidas de todos as ROI, nenhuma ROI, uma ROI ou mais de uma ROI. Uma ROI também é referida como amostra “S” nesse documento. Uma amostra de RONI em um substrato é referida nesse documento como amostra “X”.
[0085] Como usado nesse documento, o termo substância “particulada” significa uma substância compreendida de partículas, tais como, partículas substancialmente esféricas ou partículas de formato menos irregular. Tipicamente, as substâncias particuladas têm um diâmetro de cerca de 10 nm a cerca de 100 µm; de preferência de cerca de 50 a cerca de 400 nm; especialmente de cerca de 100 a cerca de 200 nm.
[0086] Como usado nesse documento, o termo “ensaio” é um teste ou teste para a quantidade, presença ou ausência de uma substância.
[0087] Como usado nesse documento, o termo ar “pressurizado” significa ar que foi comprimido, por exemplo, com pressão que é maior do que a pressão atmosférica. O componente de “ar” em tal pressurizado é tipicamente um gás inerte selecionado de hélio, argônio, xenônio, nitrogênio, dióxido de carbono ou uma mistura dos mesmos. Como é típico em sistemas pressurizados, o componente “ar” pode estar na forma líquida, semilíquida ou gasosa.
[0088] Como usado nesse documento, “contato” significa que a composição que compreende um agente (por exemplo, meio de contato) é introduzida em uma amostra contendo um alvo, por exemplo, alvo celular, em um tubo de ensaio, frasco,
cultura de tecido, chip, matriz, placa, microplaca, capilar ou semelhantes, e incubados a uma temperatura e tempo suficientes para permitir uma interação entre o alvo e o agente.
[0089] No diagnóstico in vivo ou contexto terapêutico, “contactar” significa que um ingrediente ativo (por exemplo, um composto químico ou um fármaco) é introduzido em um indivíduo, e o ingrediente ativo é permitido entrar em contato com o tecido alvo do indivíduo, por exemplo, tecido epitelial, in vivo.
[0090] Como usado nesse documento, o termo “indivíduo” significa qualquer animal, de preferência um mamífero, tal como um ser humano, um animal veterinário ou de fazenda, um animal doméstico ou de estimação, incluindo animais normalmente usados para pesquisa clínica. Particularmente, o indivíduo é um indivíduo humano, por exemplo, um paciente humano diagnosticado com uma doença tal como o câncer. Um indivíduo pode ter, potencialmente ter, ou ser suspeito de ter uma ou mais de características associadas a uma doença, um(s) sintoma(s) associado(s) à doença, assintomático em relação à doença ou não diagnosticado. Particularmente, o indivíduo pode ter câncer, o indivíduo pode mostrar um(s) sintoma(s) associado(s) ao câncer, o indivíduo pode estar livre de sintomas associados ao câncer ou o indivíduo pode não ter sido diagnosticado com câncer.
[0091] Como usado nesse documento, o termo “ruído” em seu sentido mais amplo se refere a quaisquer distúrbios indesejados (por exemplo, sinal não diretamente associado ao evento verdadeiro) que podem, no entanto, ser processados ou recebidos como eventos verdadeiros. O ruído é a soma de energia indesejada ou perturbadora introduzida em um sistema a partir de fontes naturais e artificiais. O ruído pode distorcer um sinal de forma que a informação transportada pelo sinal se torne degradada ou menos confiável. O termo é contrastado com “sinal”, que é uma função que transmite informações sobre o comportamento ou atributos de algum fenômeno, por exemplo, associação probabilística entre um marcador (SNV, CNV, indel, SV) e uma doença tal como câncer.
[0092] Como usado nesse documento, o termo “estimativa” no contexto de níveis de marcadores é usado em um sentido amplo. Como tal, o termo “estimativa” pode se referir a um valor real (por exemplo, 1 variação por DNA mbp), uma faixa de valores, um valor estatístico (por exemplo, média, mediana, etc.) ou outros meios de estimativa (por exemplo, probabilisticamente).
[0093] Como usado nesse documento, o termo “substancialmente” significa o suficiente para funcionar para a finalidade pretendida. O termo “substancialmente” permite, assim, variações menores e insignificantes de um(a) estado, dimensão, medição, resultado absoluto ou perfeito ou similares, como seria esperado por uma pessoa técnica no assunto, mas que não afetam de forma apreciável o desempenho geral. Quando usado em relação a valores numéricos ou parâmetros ou características que podem ser expressado(a)s como valores numéricos, “substancialmente” significa dentro de dez porcento.
[0094] Como usado nesse documento, o termo “componente” refere-se ao constituinte de um sistema. Por exemplo, em um sistema celular, os componentes podem incluir polipeptídeos (por exemplo, pequenos peptídeos, bem como proteínas grandes), ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), carboidratos (por exemplo, açúcares simples, bem como macromoléculas, tal como amido), lipídeos e outros constituintes, tais como vitaminas e colesterol.
[0095] Como usado nesse documento, o termo “transferência” é usado no sentido mais amplo para se referir a um movimento de um componente de um sistema de seu ambiente natural (por exemplo, mitocôndrias no caso de DNA mitocondrial) para um ambiente não natural (por exemplo, superfície da partícula de sílica) por meio de um processo, tal como, aglutinação, ligação, adsorção, etc. O termo inclui processos como interações covalentes ou não covalentes entre o componente e o sistema não natural.
[0096] Como usado nesse documento, o termo interação “covalente” envolve o compartilhamento de elétrons entre os átomos ligados. Em contraste, as interações “não covalentes” podem incluir, por exemplo, interações iônicas, interações eletrostáticas, interações de ligações de hidrogênio, interações físico-químicas, forças de van der Waal, interações de ácido de Lewis/base de Lewis ou combinações das mesmas.
[0097] Como usado nesse documento, o termo “analito” geralmente se refere a uma(s) molécula(s) alvo que é detectada usando os métodos ou sistemas revelados nesse documento. O analito pode ser um analito de DNA, um analito de RNA, um analito de ácido nucleico, uma macromolécula ou uma pequena molécula conforme esses termos são usados na técnica. Em particular, uma macromolécula pode incluir, por exemplo, um polinucleotídeo, um polipeptídeo, um carboidrato, um lipídeo ou uma combinação de um ou mais dos mesmos. Como regra geral, a massa molecular de uma macromolécula é de pelo menos cerca de 300 Daltons e pode ser milhões de Daltons. Uma pequena molécula é um composto orgânico com peso molecular de até cerca de 300 Daltons. Em certos casos, o analito é um analito de ácido nucleico.
[0098] Como usado nesse documento, uma “sonda” é uma substância, por exemplo, uma molécula, que pode reconhecer ou ser especificamente reconhecida por um alvo particular. Os tipos de potenciais parceiros de ligação sonda/alvo ou alvo/sonda incluem receptor/ligando; ligando/antiligando; interações de ácido nucleico (polinucleotídeo), incluindo DNA/DNA, DNA/RNA, PNA (ácido nucleico de peptídeo)/ácido nucleico; enzimas, outros catalisadores ou outras substâncias, com substratos, pequenas moléculas ou moléculas efetoras; etc. Exemplos de sondas que são contempladas por essa invenção incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, enzimas (tais como proteases ou quinases), substratos enzimáticos, cofatores, fármacos, lectinas, açúcares, ácidos nucleicos (incluindo oligonucleotídeos, DNA, RNA, PNA ou ácidos nucleicos modificados ou substituídos), oligossacarídeos, proteínas, enzimas, anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos de cadeia única ou fragmentos dos mesmos. Os polímeros de sonda podem ser lineares ou cíclicos. As sondas podem distinguir entre diferentes alvos, seja em virtude da atividade diferencial, ligação diferencial ou por meio da identificação de marcadores estruturais. As sondas da invenção são, de preferência, moléculas de ácido nucleico, particularmente de preferência DNA. Em certos casos, “sondas” podem funcionar como “alvos” e “alvos” podem funcionar como sondas, por exemplo, um DNA complementar
(cDNA) pode servir como uma sonda que se hibridiza com uma porção de uma sequência de gene alvo; no entanto, o próprio cDNA corresponde à sequência alvo, uma vez que corresponde ao produto de mRNA da sequência do gene.
[0099] Como usado nesse documento, o termo “análise” bem como o termo “detecção” podem se referir à determinação qualitativa ou quantitativa de um parâmetro de interesse relativo ao analito, por exemplo, quantidade, nível, concentração ou atividade do analito (absolutos e relativos).
[00100] Como usado nesse documento, o termo “diagnóstico” refere-se a métodos pelos quais uma determinação pode ser feita quanto a se um indivíduo tem probabilidade de sofrer de uma determinada doença ou condição. O técnico no assunto muitas vezes faz um diagnóstico com base em um ou mais de indicadores de diagnóstico, por exemplo, um marcador, cuja presença, ausência, quantidade ou mudança na quantidade é indicativa da presença, gravidade ou ausência da doença ou condição. Outros indicadores de diagnóstico podem incluir histórico do paciente; sintomas físicos, por exemplo, perda de peso inexplicada, febre, fadiga, dores ou anomalias da pele; fenótipo; genótipo; ou fatores ambientais ou hereditários. Um técnico no assunto entenderá que o termo “diagnóstico” se refere a uma probabilidade aumentada de que determinado curso ou resultado ocorrerá; isto é, que um curso ou resultado é mais provável de ocorrer em um paciente que exibe uma determinada característica, por exemplo, a presença ou o nível de um indicador de diagnóstico, quando comparado a indivíduos que não exibem a característica. Os métodos de diagnóstico da revelação podem ser usados independentemente, ou em combinação com outros métodos de diagnóstico, para determinar se um curso ou resultado é mais provável de ocorrer em um paciente que exibe uma determinada característica.
[00101] O termo “ácido nucleico” geralmente se refere a DNA ou RNA, seja um produto de amplificação, criado sinteticamente, produtos de transcrição reversa de RNA ou de ocorrência natural. Tipicamente, os ácidos nucleicos são moléculas de cadeia simples ou dupla e são compostos de nucleotídeos de ocorrência natural. As moléculas de ácido nucleico de fita dupla podem ter saliências de 3’ ou 5’ e, como tal, não são necessárias ou assumidas como completamente de fita dupla em todo o seu comprimento. Além disso, o termo ácido nucleico pode ser composto de nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou modificações em nucleotídeos de ocorrência natural. Exemplos são listados aqui, mas não estão limitados a: fosforilação de 5’ ou 3’ nucleotídeos para permitir a ligação ou prevenção da degradação da exonuclease/extensão da polimerase, respectivamente; modificações de amino, tiol, alquino ou biotinila para ligações covalentes e quase covalentes; fluoróforos e agentes de extinção; fosforotioato, metilfosfonatos, fosforamidatos e ligações fosforotiéster entre nucleotídeos para prevenir a degradação; metilação; e bases modificadas.
[00102] O termo “polipeptídeo", quando usado nesse documento, significa um peptídeo, uma proteína ou um polipeptídeo que são usados intercambiáveis e que abrangem cadeias de aminoácidos de um determinado comprimento, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. O termo polipeptídeo também se refere a, e não exclui, modificações do polipeptídeo. As modificações incluem glicosilação, acetilação, acilação, fosforilação, ADP-ribosilação, amidação, afixação covalente de flavina, afixação covalente de uma porção heme, afixação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, afixação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, afixação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formulação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação.
[00103] Como usado nesse documento, o termo “isolado” ou “extraído” no contexto de uma molécula se refere a uma molécula que está substancialmente livre de impurezas. Uma molécula (como DNA ou RNA) foi “isolada” ou “extraída” quando é purificada de outros componentes em uma amostra. A purificação refere-se à separação do alvo de um ou mais componentes estranhos também encontrados em uma amostra. Componentes que são isolados, extraídos ou purificados a partir de um(a) espécime ou amostra mista tipicamente são purificados ou enriquecidos em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 90%, ou pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% em comparação com a amostra não purificada ou não extraída.
[00104] O termo “sintético” refere-se a moléculas que foram quimicamente sintetizadas usando técnicas compreendidas na técnica, por exemplo, usando química de fosforamidita ou química sintética.
[00105] O termo “híbrido” ou “hibridizar” no contexto de um ácido nucleico é amplamente utilizado para incluir dúplexes, bem como moléculas que são capazes de formar dúplexes. Nesse contexto, os ácidos nucleicos de fita simples que pareiam em uma série de bases são chamados de “hibridizar”. A hibridação é tipicamente determinada sob condições fisiológicas ou biológicas (por exemplo, intracelular: pH 7,2, íon potássio 140 mM; extracelular: pH 7,4, íon sódio 145 mM).
[00106] Como usado nesse documento, o termo “análogo” inclui, mas não está limitado a, oligonucleotídeos tendo resíduos ou ligantes introduzidos sinteticamente nos mesmos, tal como um resíduo de ácido ribonucleico dentro de uma sequência de DNA, um agente de ligação em ramificação, tal como um derivado de glicerol, ou um ligante de aminoalquila, por exemplo. “Adutos” incluem, por exemplo, O6-alquil-dG e O6-Me-dG. Da mesma forma, o termo “conjugado” em uma modalidade, refere-se a um agente de reconhecimento de alvo covalentemente ou não covalentemente ligado a um ou mais polinucleotídeo(s). Em outra modalidade, o termo “conjugado” se refere a um polinucleotídeo linear, ramificado ou dendrítico covalentemente ou não covalentemente a uma ou mais de moléculas de corante fluorescente.
[00107] Como usado nesse documento, “alvo” refere-se a uma substância cuja presença, atividade e/ou quantidade é desejada a ser determinada e que tem uma afinidade para uma determinada sonda. Os alvos podem ser substâncias artificiais ou de ocorrência natural. Além disso, eles podem ser empregados em seu estado inalterado ou como agregados com outras espécies. Os alvos podem ser afixados, covalentemente ou não covalentemente, a um membro de ligação, seja diretamente ou por meio de uma substância de ligação específica. Exemplos de alvos que podem ser empregados nessa invenção incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos ou polinucleotídeos (incluindo mRNA, tRNA, rRNA, oligonucleotídeos, DNA, RNA viral ou DNA, ESTs, cDNA, produtos amplificados por PCR derivados de RNA ou DNA e mutações, variantes ou modificações dos mesmos); proteínas (incluindo enzimas, tais como as responsáveis pela clivagem de neurotransmissores, proteases, quinases e semelhantes); substratos para enzimas; peptídeos; cofatores; lectinas; açúcares; polissacarídeos; células (que podem incluir antígenos de superfície celular); membranas celulares; organelas; etc., bem como outras moléculas ou outras substâncias que podem existir em forma complexada, ligada covalentemente, reticulada, etc. Os alvos também podem ser chamados de anti-sondas.
[00108] Em que a sonda se liga a uma sequência alvo, a ligação pode ser “específica” ou “seletiva". Em geral, se uma sonda tem um e apenas um parceiro de ligação (por exemplo, alvo), ela possui a propriedade de “especificidade”. Na prática, a grande maioria das sondas é “seletiva” em vez de “específica”, porque a maioria das sondas se ligará a uma série de alvos, particularmente em altas concentrações. Assim, os termos são usados de forma intercambiável. A especificidade e a seletividade da ligação podem ser determinadas usando métodos de rotina. Por exemplo,
em que o alvo é um mRNA particular, a sonda pode ser, por exemplo, um oligonucleotídeo, que se liga especificamente ao alvo, mas não a RNAs ou DNAs interferentes, sob condições de hibridização selecionadas. Um técnico no assunto pode, usando métodos reconhecidos na técnica, determinar experimentalmente as características de um oligonucleotídeo que irá se hibridizar de forma otimizada com o alvo, com hibridização mínima para DNA ou RNA interferente não específico (por exemplo, ver acima). Em geral, o comprimento de uma sonda de oligonucleotídeo usada para distinguir um mRNA alvo presente em uma referência de um grande excesso de RNAs não direcionados pode variar de cerca de 8 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 18, 20, 22 ou 25 nucleotídeos. Uma sonda de oligonucleotídeo para uso em um ensaio bioquímico no qual não existe uma grande referência de alvos competidores pode ser menor do que 8 nucleotídeos. Usando procedimentos reconhecidos na técnica (por exemplo, o programa de computador BLAST), as sequências de sondas de oligonucleotídeos podem ser selecionadas de modo que sejam mutuamente não relacionadas e diferentes das sequências potencialmente interferentes em bases de dados genéticos conhecidos. A seleção de condições de hibridização que permitirão a hibridização específica de uma sonda de oligonucleotídeo com o RNA alvo pode ser determinada rotineiramente, usando procedimentos reconhecidos na técnica.
[00109] Como usado nesse documento, o termo “iniciador” refere-se a moléculas de ácido nucleico curtas, tais como oligonucleotídeos de DNA que compreende nove ou mais nucleotídeos, que em alguns exemplos são usados para iniciar a síntese de uma sequência de ácidos nucleicos mais longa. Os iniciadores mais longos podem ter cerca de 10, 12, 15, 20, 25, 30 ou 50 nucleotídeos ou mais de comprimento. Os iniciadores também podem ser usados na detecção.
[00110] “Remover ou fazer ablação mecanicamente (de)” certas amostras de um substrato nesse documento, significa separar essa amostra do substrato ou vaporizar ou de outra forma decompor a amostra por meios mecânicos de modo que não esteja mais presente no substrato.
[00111] “Decompor” macromoléculas quimicamente nesse documento significa desnaturar ou quebrar macromoléculas, tais como, RNA, DNA e/ou proteínas ou modificá-las quimicamente o suficiente para que não contaminem uma análise posterior de RNA, DNA e/ou proteínas em tecido de ROI.
[00112] Uma “marca” feita em uma lâmina por um patologista ou usuário de laboratório ou outro indivíduo é referida nesse documento como uma “marca manual”. Essa marca pode ser feita por qualquer meio disponível, tal como uma caneta ou equipamento de gravação. Uma marca que é feita automaticamente por um sistema nesse documento, em contraste, pode ser denominada uma “marca virtual” ou uma “marca digital” para indicar que não é feita manualmente, mas pelo uso de um ou mais algoritmo(s).
[00113] Os termos “digital”, “digitalizado”, “automatizado” e “automaticamente” e semelhantes indicam ações que são realizadas por um sistema nesse documento, por exemplo, controlado por algoritmos e/ou pela interação entre um usuário e uma interface do usuário do computador em oposição às ações que são realizadas manualmente por um usuário.
[00114] Como usado nesse documento, o termo “superfície” refere-se a qualquer matéria que fornece um sítio que permite a interação entre um analito ou uma sonda de interesse.
De preferência, a superfície é uma superfície de um suporte sólido, por exemplo, nitrocelulose, as paredes dos poços de uma bandeja de reação, placas de múltiplos poços, tubos de ensaio, grânulos de poliestireno, grânulos magnéticos, membranas e micropartículas (tais como partículas de látex). Qualquer material poroso adequado com porosidade suficiente para permitir o acesso por reagentes detectores e uma afinidade de superfície adequada para imobilizar reagentes de captura (por exemplo, oligonucleotídeos) é contemplado por esse termo.
Por exemplo, a estrutura porosa da nitrocelulose tem excelentes qualidades de absorção e adsorção para uma ampla variedade de reagentes, por exemplo, reagentes de captura.
O náilon possui características similares e também é adequado.
Estruturas microporosas são úteis, assim como materiais com estrutura de gel no estado hidratado.
Outros exemplos de suportes sólidos úteis incluem carboidratos poliméricos naturais e seus derivados sinteticamente modificados, reticulados ou substituídos, tais como ágar, agarose, ácido algínico reticulado, gomas de guar substituídas e reticuladas, ésteres de celulose, especialmente com ácido nítrico e ácidos carboxílicos, ésteres de celulose mistos e éteres de celulose; polímeros naturais contendo nitrogênio, tais como proteínas e derivados, incluindo gelatinas reticuladas ou modificadas; polímeros de hidrocarbonetos naturais, tal como látex e borracha; polímeros sintéticos que podem ser preparados com estruturas adequadamente porosas, tais como polímeros de vinila, incluindo polietileno, polipropileno, poliestireno, policloreto de vinila, acetato de polivinila e seus derivados parcialmente hidrolisados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros e terpolímeros dos policondensados acima, tais como e outros polímeros, tais como poliuretanos ou poliepóxidos; materiais inorgânicos porosos, tais como sulfatos ou carbonatos de metais alcalino- terrosos e magnésio, incluindo sulfato de bário, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio, silicatos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, alumínio e magnésio; e óxidos ou hidratos de alumínio ou silício, tais como, argilas, alumina, talco, caulim, zeólito, gel de sílica ou vidro (esses materiais podem ser usados como filtros com os materiais poliméricos anteriores); e misturas ou copolímeros das classes anteriores, tais como copolímeros de enxerto obtidos por polimerização inicial de polímeros sintéticos em um polímero natural pré-existente.
[00115] Como usado nesse documento, o termo “assinatura” refere-se a uma coleção de marcadores que indicam um fenótipo de interesse, por exemplo, uma assinatura de câncer que compreende ≥3 mutações que indica que a célula ou o tecido que abriga as mutações é uma célula tumoral. Em algumas modalidades, uma assinatura compreende a presença, ausência e/ou abundância de uma combinação dos marcadores, por exemplo, marcadores tumorais. Ao combinar os vários conjuntos de sondas, um método confiável para a detecção de um fenótipo de interesse pode ser projetado. Esse teste de assinatura que é conduzido como um único ensaio pode fornecer um grande benefício para avaliar e compreender a interação entre os vários marcadores.
[00116] O termo “amplificação” geralmente se refere à produção de uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico a partir de um ácido nucleico alvo, em que os iniciadores se hibridizam em localizações específicos com as moléculas de ácido nucleico alvo, a fim de fornecer um sítio de iniciação para extensão por uma polimerase. A amplificação pode ser realizada por qualquer método geralmente conhecido na técnica, tal como, mas não se limitando a, PCR padrão, PCR longa, PCR inicial a quente, qPCR, RT-PCR e PCR em tempo real.
[00117] O termo “anticorpo”, como usado nesse documento, refere-se a uma imunoglobulina completa, tal como uma IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM ou a um fragmento de um anticorpo (especialmente um fragmento de ligação de antígeno), tal como um Fab, Fv ou Fc ou um anticorpo fundido, um fragmento de anticorpo fundido ou qualquer outro derivado de um anticorpo. O termo “anticorpo rotulado” refere-se a um anticorpo que é rotulado com uma enzima, um corante fluorescente, uma substância quimioluminescente, biotina, avidina ou um radioisótopo.
[00118] O termo “epítopo” refere-se a uma região antigênica de um composto, tal como uma proteína, um carboidrato ou um lipídeo. A região antigênica tipicamente consiste em 5 a 8 aminoácidos. O epítopo é especificamente reconhecido pelos sítios de ligação de antígeno do respectivo anticorpo.
[00119] O termo “tecido ou célula fixo(a)” é usado nesse documento como conhecido pelo técnico no assunto e refere- se a tecido ou células biológico(as) que é(são) preservado(as) da decomposição por métodos de fixação química. Tais métodos evitam a autólise ou putrefação dentro de tais tecidos ou células biológico(a)s. A fixação termina as reações bioquímicas e aumenta a estabilidade mecânica do tecido tratado.
[00120] O termo “imuno-histoquímica” ou “IHC” refere-se a uma técnica para detectar a presença de um antígeno com um anticorpo capaz de se ligar especificamente ao referido antígeno em amostras histológicas. A detecção do complexo anticorpo-antígeno ocorre geralmente por uma reação cromogênica com um anticorpo rotulado com enzima ou por um anticorpo rotulado com fluorescência.
[00121] O termo “macrodissecção", como usado nesse documento, refere-se ao processo de arranhar uma área de interesse de uma seção de tecido montada em um suporte sólido, como uma lâmina de microscópio, usando uma ferramenta como um bisturi ou uma espátula. O termo “microdissecção", como usado nesse documento, refere-se ao processo de corte e separação de uma ou mais de células específicas ou uma área de interesse de uma amostra de tecido. A microdissecção pode, por exemplo, ser realizada usando microdissecção de captura de laser (LCM), cortando a área relevante com um laser.
[00122] O termo “lâmina de membrana”, como usado nesse documento, refere-se a suportes sólidos ou lâminas de microscópio para uso em Microdissecção de Captura a Laser (LCM). Para microdissecção, podem ser usadas lâminas de vidro de cobertas com uma membrana ou lâminas de moldura que consistem em uma moldura de metal que pode ser coberta com várias membranas.
[00123] O termo “polilisina” refere-se a uma molécula que contém até várias centenas de unidades de repetição e é adequada para aumentar a afinidade entre uma amostra, tal como uma seção de tecido, e o lado da membrana em que a amostra é montada. Uma polilisina de acordo com a descrição é poli-L-lisina. A poli-L-lisina de acordo com a descrição tem um peso molecular de 70 a 300 kDa. A poli-L-lisina pode ser digerida por proteases. Outra polilisina de acordo com a descrição é, por exemplo, poli-D-lisina. A poli-D-lisina de acordo com a descrição tem um peso molecular de 70 a 300 kDa. A poli-D-lisina é resistente à digestão por protease.
[00124] O termo “qPCR” geralmente se refere à técnica de PCR conhecida como reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real, reação em cadeia da polimerase quantitativa ou reação em cadeia da polimerase cinética. Essa técnica simultaneamente amplifica e quantifica ácidos nucleicos alvo usando PCR, em que a quantificação é em virtude de um corante fluorescente intercalante ou sondas específicas para sequência que contêm moléculas repórter fluorescentes que são detectáveis apenas uma vez hibridizado com um ácido nucleico alvo.
[00125] O termo “RNA” é usado nesse documento conforme conhecido pelo técnico no assunto e se refere a pré-mRNA, transcritos de pré-mRNA, mRNA, intermediários de processamento de transcrição, mRNA maduro usado para tradução e transcritos de um gene ou genes, ou ácidos nucleicos derivados dos mesmos. O processamento da transcrição inclui processos, tais como, emenda, edição, modificação e degradação. O mRNA incluindo amostras inclui, por exemplo, mRNA, transcritos de mRNA do(s) gene ou genes, cDNA originado de mRNA usando transcrição reversa, RNA transcrito de DNA amplificado, cRNA transcrito de cDNA, DNA amplificado a partir dos genes e semelhantes.
[00126] Um “recipiente” que pode compreender uma amostra nesse documento é amplamente interpretado para significar qualquer tipo, forma ou tamanho de recipiente, incluindo uma superfície, um poço, um tubo ou um frasco. Não é necessário que um recipiente tenha qualquer forma ou tamanho específica(o) para ser feito de qualquer material específico, mas apenas para atuar como estruturas físicas que permitem a análise ou manipulação de tecido localizado no mesmo ou sobre o mesmo.
[00127] Uma lâmina/substrato “corada(o)” nesse documento se refere a um substrato que foi tratado para ajudar a revelar diferenças entre as amostras de ROI e outras amostras, de modo que um patologista ou outro indivíduo treinado pode marcar o substrato para denotar o gráfico de quaisquer ROIs no substrato. Um(a) lâmina/substrato “não corada(o)” é um substrato que não foi tratado, mas que pode ou não ter sido submetido a outros tipos de tratamento.
[00128] O termo “separar” uma ou mais ROI(s) de X amostras em um substrato nesse documento inclui meios de tratar X amostras de modo que sejam fisicamente removidas do substrato, sejam submetidas à ablação (por exemplo, vaporizadas ou queimadas ou fisicamente decompostas), ou sejam tratadas quimicamente para não contaminar a análise posterior de moléculas na amostra de ROI.
[00129] O termo “substrato” nesse documento se refere a várias lâminas incluindo, mas não se limitando a, lâminas FFPE, lâminas de tecido, lâminas padrão, recipientes, lâminas coradas, lâminas não coradas, tecido vivo, etc.
[00130] O termo “amostra” nesse documento se refere a tecido celular, espécimes, amostras de tecido, tecido FFPE ou outros materiais biológicos afixados usando métodos de biologia molecular padrão.
[00131] Um “processador de computador” ou “meio de computação” ou “computador” é amplamente interpretado nesse documento para se referir a qualquer combinação de hardware e/ou software que executará as funções exigidas dos mesmos. Por exemplo, um processador pode ser um microprocessador digital programável, tal como disponível na forma de um controlador eletrônico, mainframe, servidor ou computador pessoal (de bancada ou portátil). Onde o processador é programável, a programação adequada pode ser comunicada a partir de uma interface de usuário incorporada ao corpo do computador ou em uma localização remota para o processador, ou previamente salva em um produto de programa de computador (tal como um meio de armazenamento legível por computador portátil ou fixo, seja baseado em dispositivos de estados magnéticos, ópticos ou sólidos). Por exemplo, um meio magnético ou disco óptico pode transportar programação e pode ser lido por um leitor adequado que se comunica com cada processador em sua interface de usuário correspondente. Uma “interface de usuário” nesse documento é amplamente interpretada como uma estrutura física que permite a um usuário programar um computador e, assim, controlar certas operações de um sistema através do computador. Os exemplos incluem um teclado e um monitor de mainframe ou laptop, outro tipo de monitor visual e sistema de teclado, tal como um dispositivo do tipo teclado ou smartphone ou outro dispositivo remoto. A interface do usuário pode ser fisicamente parte do corpo do computador, localizada em outro lugar no sistema ou localizada remotamente do computador e capaz de se comunicar com o processador do computador por meio de uma conexão com ou sem fio. Métodos para Marcação Digital de ROIs em Substratos não Corados
[00132] A análise e a dissecção de amostras tipicamente envolvem uma série de lâminas que compreende fatias paralelas de amostras. Uma ou mais de lâminas em um conjunto pode(m) ser corada(s), por exemplo, para revelar núcleos celulares individuais e/ou para ajudar a distinguir células de diferentes tipos, tais como em aplicações oncológicas, células cancerígenas e não cancerígenas. Um patologista pode examinar um substrato e marcar as regiões de interesse (ROIs) na lâmina com uma caneta ou outro dispositivo de marcação adequado. Essas ROIs ou as marcações de caneta associadas podem então ser mapeadas (giradas e alinhadas) com substrato de fatia(s) adjacente(s) da amostra, que serão finalmente analisadas, tal como para extrair DNA para sequenciamento genômico, RNA para análise de expressão de RNA ou para realizar análise in situ de células, etc. Nos métodos de dissecção manual da amostra, a marca da caneta do patologista é transferida à mão para um substrato e uma lâmina de raspagem é usada para cortar a ROI das amostras circundantes na lâmina.
[00133] As técnicas de macrodissecção, que envolvem o corte histológico não apenas das regiões de interesse, mas também dos tecidos circundantes do órgão sob investigação, têm sido cada vez mais implantadas em muitas investigações patológicas, tais como tipagem de tumor, diagnóstico de doenças inflamatórias e determinação de doenças degenerativas. Na macrodissecção, o tecido do paciente de interesse (área “S”) é coletado de espécime histológico, por exemplo, uma lâmina de vidro, enquanto exclui a área desnecessária (área “X”), de modo que apenas a área “S” é usada como o material de entrada para o ensaio a jusante. Em certos casos, a definição da forma de “S” complexa do patologista pode resultar em operações de raspagem difíceis de um histotécnico. Frequentemente, técnicas de raspagem complexas são necessárias, como mostrado na FIG. 1. A presente revelação se refere a sistemas e métodos para processar amostras biológicas de modo que os analitos nas mesmas possam ser detectados com mais precisão, de preferência livre de interferência de não analitos. Portanto, ao melhorar a qualidade do sinal e/ou reduzir o ruído, os presentes sistemas e métodos melhoram muito o resultado de ensaios biológicos, especialmente no contexto de análise de analitos em amostras heterogêneas, tal como FFPE.
[00134] Ao melhorar os parâmetros de ensaio, tais como qualidade de sinal e redução de ruído, os sistemas e métodos atualmente revelados também melhoram o objetivo do ensaio, por exemplo, correlacionando a presença/ausência ou níveis ou atividades de biomarcadores com uma característica de interesse, por exemplo, característica étnica (para forense) ou característica de doença.
[00135] Os sistemas e métodos da revelação são baseados, em parte, no uso de microjateadores de partículas para direcionar e remover áreas especificadas do tecido em um espécime biológico (por exemplo, lâminas de histologia) e coletar seletivamente área de tecido contendo sinal (“S”). O método compreende o uso de partículas e uma corrente controlada de ar pressurizado ou outro gás para direcionar as partículas para a ROI. O método é, de preferência, um método seco, o que reduz as chances de contaminação da amostra e/ou diluição dos analitos na amostra.
[00136] Os métodos presentemente revelados podem ser usados em uma variedade de configurações. Por exemplo, em uma primeira implementação, em que a macrodissecção é desejada, a área “X” no substrato (por exemplo, lâmina histológica) pode ser microjateada seletivamente, deixando apenas a área “S” no substrato intocada. Posteriormente, os métodos de processamento a jusante podem ser usados para remover a área “S” do substrato. Em uma segunda implementação, em que a macrodissecção também é desejada, a área “S” no substrato (por exemplo, lâmina de histologia) pode ser seletivamente microjateada, enquanto deixa apenas a área “X” no substrato intocada. O tecido da área “S” pode ser removido do substrato e as partículas são então reunidas em um recipiente para serem processadas usando o processamento posterior. Ainda em outra implementação, em que a macrodissecção não é necessária, todas as regiões do substrato (áreas “X” e “S") são microjateadas e os conteúdos de ambas as regiões são coletados em um recipiente para processamento a jusante.
[00137] A FIG. 2 ilustra um processo de exemplo para processamento digital de apresentações de lâminas não coradas (USS), onde a qualidade e a espessura do tecido não podem ser controladas uniformemente. O processo pode incluir dois processos paralelos com três trajetos que podem fazer com que os processos paralelos se fundam.
[00138] De acordo com um aspecto, ao longo de um primeiro trajeto paralelo, a USS pode ser montada em um suporte. A USS montada pode ser armazenada em uma unidade de armazenamento para aguardar uma revisão do trajeto. Uma imagem digitalizada da USS é criada. A USS é recuperada da unidade de armazenamento. Uma rotina de dissecção de amostra automatizada pode então ser realizada.
[00139] De acordo com um aspecto, ao longo de um segundo trajeto paralelo, a USS é corada para criar uma lâmina de referência. A lâmina de referência é digitalizada para criar uma imagem. É criada uma marcação digitalizada que inclui uma região de interesse (ROI) na lâmina de referência. É então determinado se a marcação pode ser carregada para um sistema de gerenciamento de imagem (IMS). Nesse caso, o segundo trajeto paralelo se funde com o primeiro trajeto paralelo através do trajeto 1.
[00140] No trajeto 1, o(s) substrato(s) de submissão transferem com sucesso suas marcações por meio da solução de patologia digital atual. A USS pode ser processada primeiro no fluxo de trabalho digital atual por meio do trajeto 1.
[00141] Caso contrário, um algoritmo de transferência de marcação externa é aplicado. Se a marcação puder ser transferida, o trajeto 2 conecta o segundo trajeto paralelo ao primeiro trajeto paralelo. Por exemplo, no trajeto 2, o(s) substrato(s) de submissão requerem o desenvolvimento de algoritmo de transferência de marcação externo à solução atual de patologia digital. Esse trajeto está assumindo o algoritmo de transferência de marcação externa necessário (por exemplo, capacidade dentro da solução de patologia digital atual).
[00142] Finalmente, a marcação pode ser transferida manualmente através do trajeto 3. Por exemplo, no trajeto 3, a transferência de marcação direta do(s) substrato(s) de apresentação não está disponível e exige que um patologista realize manualmente a marcação digital em cada substrato associado individualmente. Esse trajeto é uma solução de reserva no caso de o trajeto 1 e o trajeto 2 falharem em prosseguir. O processo ainda pode ser processado no sistema de raspagem de amostra automatizado, no mínimo.
[00143] A FIG. 3 ilustra métodos de coleta de regiões “S” ou remoção de regiões “X”. De acordo com um aspecto, as áreas “X” são removidas e apenas as áreas “S” são deixadas para permitir métodos de passagem direta (coleta de toda a amostra da lâmina) para coleta de amostra. Esse é um método eficiente, pois normalmente existem apenas pequenas áreas de “X”. Por exemplo, ~ 50% dos casos são de passagem direta (por exemplo, sem áreas “S”). Na maioria dos casos, as áreas “X” são muito menores do que as áreas “S” (por exemplo, menos áreas “X” para remover).
[00144] Aspectos adicionais incluem a decomposição de ácidos nucleicos em áreas “X” (por exemplo, apenas áreas “S” e áreas “X” inativas restantes), de modo que áreas “X” não precisem ser removidas do substrato. Por exemplo, as áreas decompostas “X” não contêm nenhum DNA/RNA quantificável restante na área “X” que impactaria a análise adicional. Assim, não haverá quantidade analisável de DNA ou RNA nas áreas “X”.
[00145] Outros aspectos incluem amostra de lise direta no substrato como um método de passagem direta. Esse método pode quebrar parcialmente a bicamada fosfolipídica da célula e/ou quebrar totalmente a proteína para processar a amostra em lisado líquido adequado para processos analíticos a jusante. Por exemplo, a amostra pode ser exposta a um tampão de lise ou solução tampão. Exemplos de fluidos de lise incluem: soluções hipertônicas, hipotônicas, com pH ajustado ou soluções contendo enzimas, tais como proteases.
[00146] Os processos descritos podem ser aplicáveis a fluxos de trabalho automatizados e manuais. Por exemplo, eles podem ser implementados em combinação com as técnicas atuais de raspagem manual, pois é mais fácil remover ou decompor áreas “X” do que apenas coletar áreas “S”, visto que há muito mais áreas “S” do que áreas “X”. Processos de dissecção da Amostra
[00147] A FIG. 4 ilustra vários métodos de dissecção de amostra. De acordo com aspectos da presente revelação, a remoção de áreas “X” pode deixar apenas áreas “S” na lâmina para coleta. Por exemplo, todas as amostras não desejadas no substrato podem ser removidas, deixando apenas as amostras desejadas na lâmina como uma extração de passagem direta. Para remover as áreas “X”, existem ferramentas mecânicas e não mecânicas para extrair as amostras não desejadas dos substratos.
[00148] Ferramentas mecânicas (por exemplo, contato) podem incluir o uso de materiais físicos, tais como lâmina de raspagem, máquina de fresagem (ferramentas de fresagem padrão ou personalizadas), cureta, punções, colheres, jateamento de microesferas e sucção a vácuo para remover a amostra não desejada diretamente do substrato. Ferramentas mecânicas podem incluir adicionalmente jateamento de partículas para remover as áreas “X”.
[00149] Ferramentas não mecânicas podem incluir o uso de tecnologia de contato indireto, tais como laser e jato de água, para remover a amostra não desejada diretamente do substrato. Vários sistemas de laser incluem sistema de laser de femtossegundo, sistema de laser de pico-segundo, sistema de laser de nanossegundo, sistema de laser de microssegundo, sistema de laser de dióxido de carbono, sistema de laser de modo bloqueado, sistema de laser pulsado, um sistema de laser Q-comutado, um sistema de laser Nd:YAG, um sistema de laser contínuo, um sistema de laser de corante, um sistema de laser ajustável, um sistema de laser de Ti-Safira, um sistema de laser de diodo de alta potência, laser de onda contínua ou um sistema de laser de fibra de alta potência. Por exemplo, um sistema de laser de femtossegundo pode utilizar uma potência média de 20 W que tem o tamanho de um computador pessoal (PC) de torre média. Outros exemplos de laseres incluem, mas não estão limitados a laseres de diodo, laseres de estado sólido, laseres de gás e laseres de corante. Entende-se que os laseres utilizados podem ser configurados para serem menos poderosos para deixar menos pegada do que os laseres convencionais.
[00150] O ácido nucleico (por exemplo, DNA) pode ser decomposto (por exemplo, desnaturado) nas áreas “X”, deixando apenas as áreas “S” e as áreas “X” inativas na lâmina para coleta. Por exemplo, decompor o ácido nucleico nas áreas “X” tornará essas áreas inativas para processos subsequentes (por exemplo, o conteúdo de ácido nucleico não está em um nível no qual afetará a expressão do gene). Portanto, não há necessidade de remover/dissecar fisicamente essas áreas e o método de coleta de amostra de passagem direta pode ser usado.
[00151] Métodos não mecânicos, tais como, a laser, térmico, por RF, por ultrassom, por criogenia, por plasma, etc., podem ser utilizados para decompor a área “X” não desejada do substrato (por exemplo, lâmina de vidro).
[00152] Os métodos químicos podem incluir a aplicação de produtos químicos (por exemplo, alvejante, ácido, álcali e enzima, etc.) às áreas “X” para decompor o ácido nucleico (por exemplo, DNA/RNA). NaOH ou sal também pode ser utilizados para desnaturar o ácido nucleico. Desnaturantes adicionais podem incluir desnaturantes de proteínas e desnaturantes de ácido nucleico. Concentrações exemplificativas de alvejante podem ser de pelo menos 10% de alvejante. Uma combinação de produtos químicos pode ser combinada, incluindo soluções de pH ajustado contendo endonucleases e/ou proteases, ou 0,05% -10,0% (peso/volume) de hipoclorito de sódio.
[00153] De acordo com os aspectos, o uso de um tampão de lise para realizar diretamente um processo de lise nos substratos pode contornar o processo de dissecção da amostra. Por exemplo, o substrato com a amostra pode ser diretamente submerso em um recipiente com temperatura controlada com um tampão de lise para separar a amostra inteira do substrato. A digestão subsequente da proteína quinase (Pro K) pode ser realizada no mesmo recipiente e em um processo/recipiente separado.
[00154] De acordo com aspectos da presente revelação, a dissecção da amostra pode incluir métodos mecânicos e não mecânicos para extrair a amostra não desejada (por exemplo,
a área “X” indesejável) dos substratos. Como descrito acima, um método mecânico (contato) pode incluir o uso de materiais físicos para dissecar a amostra não desejada diretamente do substrato. O sistema pode utilizar uma ferramenta de raspagem física, tais como, microjateamento de partículas, jato de areia, lâmina de raspagem, cureta, punções ou colheres combinadas com um tubo de sucção a vácuo próximo à ação de raspagem para coletar a amostra não desejada simultaneamente usando um método de sucção.
[00155] O dispositivo de sucção consiste em um consumível descartável de baixo custo (por exemplo, um tubo de plástico com um filtro) para coletar toda a amostra e será substituído em cada caso para evitar contaminação cruzada. Alternativamente, um dispositivo de sucção pode ser limpo entre as amostras para eliminar a contaminação cruzada. O filtro tem a função de interromper o fluxo da amostra, mas permitindo a passagem do ar. Adicionalmente, as amostras não podem obstruir totalmente o filtro para obstruir a passagem de ar.
[00156] A amostra removida, então, pode ser coletada em uma lata de lixo, resultando em deixar apenas as áreas “S” no substrato para métodos de passagem direta. Por exemplo, a coleta de passagem direta pode ser realizada por: (a) passagem direta de lâmina de navalha de passagem única direta que pode ser facilmente automatizada; (b) utilização de um banho de água ultrassônico com temperatura controlada para separar a amostra do substrato em um recipiente/tubos; e/ou (c) aplicação de uma carga estática no fundo do recipiente/tubo de coleta após a amostra ser separada do substrato.
[00157] Os métodos não mecânicos podem incluir o uso de tecnologia indireta (por exemplo, tais como ablação a laser e por jato de água) para dissecar a amostra não desejada separada do substrato. Por exemplo, os métodos a laser e por jato de água podem incluir o uso de uma tecnologia de jato de água de alta pressão ou de abrasão a laser para aplicar força na superfície de vidro alvo para separar a amostra do substrato. Isso resulta em deixar apenas as áreas “S” no substrato para métodos de passagem direta.
[00158] A coleta de passagem direta pode ser realizada por: (a) uma passagem direta de lâmina de navalha de passagem direta única que pode ser facilmente automatizada; (b) utilizar um banho de água ultrassônico com temperatura controlada para separar a amostra do substrato em um recipiente/tubos; e/ou (c) aplicar uma carga estática no fundo do recipiente/tubo de coleta após a amostra ser separada do substrato.
[00159] Para decompor a área “X”, os seguintes métodos podem ser usados para extrair a amostra não desejada dos substratos. Por exemplo, métodos não mecânicos podem decompor o DNA na área “X” não desejada do substrato. De acordo com uma implementação, o sistema usará uma tecnologia de ablação sem contato, como laser, térmico, RF, ultrassom, criogenia ou plasma para decompor a amostra não desejada do substrato. Isso resulta em deixar apenas as áreas “S” no substrato para o método de passagem direta descrito acima.
[00160] Os métodos químicos podem incluir a aplicação de produtos químicos na área “X” para decompor o DNA. Por exemplo, o sistema pode aplicar reagentes químicos, tais como, alvejante, ácido, álcali ou enzima, etc. em áreas “X”
direcionadas na superfície do vidro para decompor a amostra do substrato. Isso resulta em deixar apenas as áreas “S” no substrato para o método de passagem direta descrito acima.
[00161] Entende-se que a revelação não se limita ao espaço da patologia. Pode ser usado para pré-enriquecimento ou isolamento, alvo e não alvo também. As tecnologias identificadas também podem ser usadas separadamente ou em combinação com outros sistemas integrados. É ainda entendido que os métodos de passagem direta também podem incluir o uso de métodos pneumáticos ou uma combinação dos métodos acima.
[00162] Os tipos de espécimes incluem, mas não estão limitados a, culturas de células, seções congeladas, amostra fresca, biópsia líquida e amostras de citologia (isto é, escarro, fluido pleural, etc.). Os tipos de espécimes também podem incluir alvos não humanos.
[00163] A amostra alvo também não se limita a um substrato. Qualquer recipiente de fator de forma fornecido como entrada para o sistema que permite que o sistema faça a imagem do espécime pode ser usado. Outros exemplos incluem lamínulas (ou seja, geração de esfregaço de sangue), biorreatores, placas de cultura de células com punções para formação imagem, papel de coleta de amostra ou corrente/gotículas de líquido.
[00164] Aspectos da presente revelação fornecem vantagens, como ser limpo, barato e compatível com laboratórios de alto rendimento para extrair áreas de interesse diretamente de substratos manualmente (por exemplo, usando caneta) ou fornecer uma ferramenta de anotação digital fácil de usar e algoritmo baseado em objeto para combinar a marcação digital em substratos enquanto mantém a morfologia do espécime que elimina a necessidade de gerar conjuntos de substratos não corados (USS) para microdissecção manual. Também minimiza o risco de intervenção do operador necessária para completar as tarefas desejadas.
[00165] Em algumas modalidades, um sistema de dissecção pode usar muitos meios, tais como, laser, jato de água e ultrassom para dissecar substratos para separar ROI(s) de amostras indesejadas.
[00166] Algumas modalidades podem incluir um sistema mecânico de baixo custo utilizando tecnologia de fresagem. Uma pequena fresadora CNC de bancada usa fresa/colher de extremidade vertical para coletar a marcação digital predefinida para espécime de ROI (amostra a ser salva) ou RONI (amostra a ser descartada). Esse sistema de bancada permitirá que o usuário processe um conjunto de lâminas dentro de um compartimento de fresagem, uma ferramenta de fresagem vertical (por exemplo, dispositivo de raspagem rotativo de baixo custo com recurso de sucção) será capaz de rastrear e coletar espécime para anotação digital predefinida do usuário final. Em algumas modalidades, a amostra salva pode ser transferida para um tubo para processos subsequentes. Em outras modalidades, o que resta no substrato são as amostras S, que podem ser raspadas de maneira fácil e limpa com uma lâmina de raspagem.
[00167] A título de exemplo, uma grande fração, como mais de 40%, das amostras de biópsia de certos cânceres podem ser todas S e não X, enquanto muitos outros têm áreas relativamente pequenas de X. Com uma configuração de fresa de topo pequena, a fresa final pode ter um lúmen para sucção
(isto é, a fresa pode ser um hipotubo com ou sem uma ponta de fresagem para facilitar a fragmentação da amostra). Se as áreas X forem pequenas, pode-se remover as áreas X. Se as áreas S forem pequenas, pode-se fragmentar e coletar as áreas S. Para simplificar, pode-se também remover consistentemente todas as áreas X ou coletar todas as áreas S. Em algumas modalidades, um método de jato de água pode, alternativamente, ser usado para remover a amostra X em uma lâmina, deixando a amostra S.
[00168] Em outras modalidades, o material X é efetivamente submetido à ablação ou destruído na lâmina enquanto o material S permanece intacto. Isso pode ser feito com vários meios mecânicos, como submeter a amostra X a várias fontes de energia, tal como microjateamento de partículas (por exemplo, jato de microesferas), laser, eletrólise, ultrassom, radiofrequência ou fontes de energia térmica ou por liofilização seletiva a amostra X. Em algumas modalidades, os meios necessários para fazer ablação da amostra X compreendem uma fonte de energia, por exemplo, laser, radiofrequência, corrente elétrica, som ou fonte de energia térmica que é capaz de lisar células e/ou decompor macromoléculas biológicas, tais como ácidos nucléicos e proteínas. Alguns desses métodos, por exemplo, podem efetivamente queimar e vaporizar a amostra X. Em algumas modalidades, o aparelho pode direcionar a fonte de energia apropriada precisamente para as áreas fora da caneta ou marcação digitalizada em um substrato, tal como focalizar um laser ou onda de radiofrequência ou onda de ultrassom precisamente de modo que afete apenas as áreas de amostra X. Por exemplo, em algumas modalidades, um laser de pulso,
eletrólise ou dispositivo de ultrassom pode ser usado como um meio para fazer ablação do e/ou decompor o ácido nucleico nas áreas X da lâmina de modo que apenas as áreas S que compreendem a(s) ROI(s) permaneçam na lâmina. Por exemplo, o sistema pode ser configurado, uma vez que o rastreamento das áreas S e X é realizado, para direcionar um laser de pulso, eletrólise ou dispositivo de ultrassom apenas para as áreas X. Por exemplo, a lâmina pode ser digitalizada de uma extremidade a outra com a energia do laser, dispositivo de eletrólise ou dispositivo de ultrassom apenas fazendo contato com as áreas X da lâmina e, portanto, apenas fazendo ablação das células nas áreas X. Como resultado, as áreas S da lâmina permanecem intactas e permanecem o único material celular intacto na lâmina. Em algumas modalidades, a energia pode vaporizar efetivamente a amostra nas áreas X e pode destruir moléculas de interesse nessas áreas, tais como DNA e RNA, de modo que o material das áreas X não contamine as áreas S isoladas resultantes em análise posterior.
[00169] Em outras modalidades, as áreas X podem ser efetivamente removidas por tratamento químico, incluindo métodos de cavitação de água (por exemplo, métodos de cavitação de água ultrassônico), tal como com um ou mais de agentes que decompõem as moléculas da amostra a ser analisada, tais como como DNA e/ou RNA e/ou proteínas. Os meios químicos para decompor a amostra X seletivamente incluem, por exemplo, adição de alvejante, ácidos fortes, bases fortes ou enzimas que têm como alvo e quebram macromoléculas, tais como DNases, RNases e proteases. Por exemplo, um tratamento químico com uma RNase ou enzima protease pode ser direcionado apenas às áreas X da lâmina com base nas marcações de caneta digitalizadas na lâmina. Uma RNase ou protease pode, por exemplo, decompor o RNA ou proteínas em pequenos fragmentos ou monômeros. Como resultado de tratamentos químicos, por exemplo, as áreas X da lâmina não compreenderiam níveis significativos de moléculas intactas para análise, de modo que uma análise de, por exemplo, níveis de expressão de proteína ou RNA da amostra tratada refletiria apenas a níveis de expressão na porção S da amostra, uma vez que apenas a proteína e/ou RNA da porção S permaneceria intacta.
[00170] Qualquer um desses métodos - ablação das células da porção X para remover efetivamente o tecido X ou desnaturação química da porção X ou das moléculas de interesse no mesmo - pode eliminar a necessidade de coletar o tecido S, esculpindo-o em uma lâmina contendo tecidos X e S. Em vez disso, todo o tecido da lâmina pode ser coletado ou usado para análise posterior em uma abordagem de coleta de tecido de “passagem direta”. Em uma coleta de “passagem direta”, todo o tecido da lâmina é removido e não há dissecção de tecido entre as áreas S e X, por exemplo. Por conseguinte, os métodos nesse documento são compatíveis com uma coleta de tecido de passagem direta em que não há necessidade de separar os tecidos S e X em uma lâmina ao coletar o tecido para análise posterior. Em vez disso, o tecido da lâmina pode simplesmente ser removido da lâmina, tal como raspando-o para fora da lâmina e em um recipiente de coleta, por ação capilar, sucção ou similares com uma ferramenta de corte rotativa similar a um processo de fresagem. Em tais modalidades, mesmo se a coleta de tecido for realizada manualmente, não há necessidade de técnicas de lâmina de raspagem altamente qualificadas atualmente em uso e que podem causar lesões ou levar a uma baixa precisão. Alternativamente, a coleta de tecido pode ser realizada automaticamente pelo instrumento. Essa automação é mais fácil de implementar, pois o objetivo é coletar todo o tecido sem a necessidade de separar a região X da região S. Por exemplo, o tecido pode ser coletado em um recipiente adequado, tal como um poço, frasco ou tubo para processamento, tal como lise celular e extração de moléculas de interesse, tais como, DNA, RNA ou proteínas. Os meios para coletar mecanicamente o tecido de uma lâmina tratada para um recipiente incluem, por exemplo, jato de areia, usando uma lâmina de raspagem ou similares para raspar o tecido, ou curetas, colheres, punções ou vácuo para aspirar o tecido, adição de solução ou outra substância para fornecer um meio ou superfície competitivo(a) em comparação com a superfície de deslizamento, como uma superfície ou meio carregada(o) e semelhantes.
[00171] Em algumas modalidades, em vez de coletar tecido para análise em um recipiente, tal como um poço, frasco ou tubo, por exemplo, certas etapas, tal como a lise celular, podem ser conduzidas diretamente na lâmina. Novamente, isso pode ser possível quando as áreas X são removidas ou desnaturadas para remover ou desativar quaisquer concentrações significativas de moléculas sem interesse para a análise posterior. Em algumas dessas modalidades, a lise celular, como com um kit apropriado e, opcionalmente, também a extração de moléculas de interesse, tal como DNA, RNA ou proteínas, podem ser conduzidas diretamente na lâmina de tecido. Em algumas modalidades, tais processos podem ser controlados automaticamente pelo aparelho. Por exemplo, em algumas modalidades, as lâminas podem ser submersas em um tampão de lise, tal como contido em um poço ou tubo ou frasco para que a lise celular possa ocorrer na lâmina. Em algumas modalidades, as etapas subsequentes podem ser realizadas na lâmina submersa, tal como digestão por protease ou digestão por DNase e/ou extração de RNA.
[00172] A FIG. 5 é um diagrama 500 de irradiação transmitida de exemplo 506 e irradiação refletida 504 de uma radiação incidente 502 em uma máscara 508. Isso ocorre porque a radiação 502 é parcialmente bloqueada pela máscara 508 e a irradiação transmitida 506 só pode atingir certas áreas da amostra 512 (por exemplo, apenas uma certa porcentagem da energia pode ser transmitida em função do comprimento de onda). Um substrato 510 pode ter 1 mm de espessura, o que fornece alguma refração à irradiação transmitida 506. Por exemplo, a máscara 508 pode estar no lado superior da lâmina 510 de modo que a radiação 502 esteja sendo parcialmente bloqueada pela máscara 508 e pela radiação só pode alcançar áreas “X”. De acordo com aspectos da presente revelação, a máscara 508 pode incluir estrutura óptica, térmica, mecânica e/ou máscaras químicas para bloquear o calor relevante, laser, o produto químico (por exemplo, jato de microesferas), etc. sendo aplicado. Entende-se que as porções expostas podem ser removidas ou desnaturadas, dependendo do processo utilizado.
[00173] A FIG. 6 mostra uma lâmina de exemplo 600 com regiões “X” indesejadas 602 marcadas e uma região de interesse (ROI) 604 (por exemplo, uma região “S") entre as regiões “X” 602. Por exemplo, as regiões “X” 602 e a ROI 604 pode ser determinada pelos processos descritos acima.
[00174] A FIG. 7 ilustra um processo em que as regiões “X” indesejadas 712 e 714 são removidas de uma lâmina 720 sobrepondo uma máscara 700 sobre a lâmina 720. Por exemplo, uma lâmina de máscara 710 pode ser preparada tendo regiões “X” indesejáveis 702, 704 e região “S” 706 desejável delineada. Por exemplo, as regiões “X” 702, 704 e a região “S” 706 podem ser determinadas pelos processos descritos acima. Sobrepor a máscara 700 sobre a lâmina 720 permite a remoção das regiões “X” indesejáveis 712 e 714 da lâmina 720 de acordo com as porções delineadas. A lâmina resultante 720 inclui apenas a porção desejada 716. Entende-se que as regiões “X” 712 e 714 podem ser removidas ou desnaturadas, dependendo do processo utilizado.
[00175] Uma modalidade de exemplo do sistema de dissecção automatizada de tecido (ATD) utiliza um sistema de fresagem miniaturizado (FIG. 12) com uma ferramenta de fresagem de projeto personalizado descartável, como mostrado na FIG. 10 e na FIG. 11 que representa a porção de corte distal da ferramenta de fresagem que faz interface com a lâmina de tecido. Na face frontal dessa porção, pode haver uma ou várias arestas de corte que dissecarão o tecido da lâmina durante as rotações da ferramenta de fresagem. Pode haver um ou mais de lúmens (isto é, canais) na ferramenta, de modo que o tecido dissecado possa ser forçado para o(s) lúmen(s) com sucção a vácuo. A porção de corte pode ter interface ao corpo principal da ferramenta. As funções desse corpo principal são alojar o tecido coletado, fazer a interface com o mandril da máquina, alojar o elemento de filtro e fazer a interface com a parte de corte. Ar pressurizado ou outros gases inertes podem ser usados para forçar o tecido dissecado em um tubo de coleta. Modalidades alternativas incluem a transferência de gravidade para um tubo de coleta com agitação, por tampão de enxágue ou colocar diretamente a ferramenta de fresagem com o tecido coletado no tubo de ensaio. Uma ferramenta de fresagem descartável pode ser usada para cada caso consistindo em uma ou mais de lâminas de tecido.
[00176] Para reduzir o tempo de processamento, essa ferramenta de fresagem personalizada é projetada para operar em altas velocidades de rotação com acionamento direto ou movido a ar. A velocidade de rotação pode atingir ou além de
100.000 rpm. Isso permite taxas de alimentação melhoradas; portanto, a ferramenta foi projetada para suportar tensões operacionais e temperaturas incorridas ao operar em altas velocidades de rotação.
[00177] A região de corte distal pode ter um lúmen interno usado para coletar ROI de tecido e tem uma ou uma pluralidade de arestas de corte dispostas radialmente na face frontal. O material pode ser aço ou qualquer material que seja mais duro do que tecido e propício para processamento de alto volume com baixo custo. Os plásticos de engenharia podem ser boas escolhas, pois podem ser moldados por injeção de forma econômica. Como a ROI pode ser de 750 mícrons ou menor para algum tipo de tecido, o diâmetro dessa face frontal pode ser muito pequeno. Pequenos lúmens podem aumentar severamente as pressões diferenciais na porção de corte e restringir o fluxo de ar. É preferível diminuir rapidamente e aumentar o tamanho do lúmen imediatamente próximo à interface de corte.
[00178] A extremidade distal da interface do corpo principal com a porção de corte. A porção de corte pode ser roscada, moldada por inserção, ligada, encaixada por pressão ou qualquer outra técnica de montagem adequada. O interior do corpo principal consiste em volume suficiente para alojar os tecidos coletados de todas as lâminas em uma caixa. A extremidade proximal é fornecida com recursos que fazem interface com o mandril padrão da máquina. O material pode ser aço ou qualquer material que mantenha a resistência para suportar as tensões operacionais e seja propício para processamento de alto volume a custos baixos. Os plásticos de engenharia podem ser boas escolhas, pois podem ser moldados por injeção de forma econômica. A extremidade proximal do corpo principal também possui recursos internos para fazer interface com um filtro. Ele também terá recursos adequados para fazer interface com o acessório de vácuo que pode ser em linha ou em uma configuração fora do eixo acionado por vácuo direto ou por meio de um dispositivo Venturi.
[00179] O elemento de filtro deve parar o tecido coletado, mas permite que o ar ou gases inertes passem. O tamanho das aberturas do filtro pode ser de 50 mícrons ou maior. Os tamanhos das aberturas e o tamanho total do filtro são projetados de forma que o tecido coletado não entupa totalmente o filtro no final do processo. O filtro precisa resistir às pressões e forças operacionais. Um recurso de alívio de pressão também pode ser incorporado para evitar entupimento. O filtro pode ser ligado ou mecanicamente afixado ao corpo principal. Uma peça de fixação alternativa também pode ser usada.
[00180] A porção de corte distal da ferramenta de fresagem é conectada ao corpo principal. A porção de corte distal pode conter uma ou mais pluralidade de arestas de corte que fazem interface com as lâminas de tecido. O desenho da porção de corte distal direciona o tecido dissecado em direção ao centro da porção de corte. Uma ou mais de arestas de corte na posição distal são orientadas radialmente. Cada aresta de corte pode ser reta ou curva. O ângulo de contato da aresta e da ROI durante a operação é de modo que uma força vetorial líquida será gerada para forçar o tecido em direção ao centro do elemento de processamento, permitindo assim que a ROI seja coletada. Por exemplo, a aresta de corte #1 pode ser definida para ser perpendicular, a aresta de corte #2 pode formar um ângulo agudo e a aresta de corte #3 pode ser definida em um ângulo obtuso, cada uma dessas posições são definidas para conduzir o tecido dissecado. A modalidade preferida é para configurar uma porção de corte distal composta por uma ou mais da pluralidade de arestas configuradas no mínimo como a aresta de corte #1 e a orientação preferida é configurada como a aresta de corte #2 com um ângulo agudo. A porção de corte distal pode ser projetada para melhorar o poder de corte, incluindo variações nas arestas serrilhadas e posições serrilhadas (incluindo comprimento, largura e profundidade).
[00181] As FIG. 10 e FIG. 11 ilustram um dispositivo de fresagem de amostra de exemplo, de acordo com várias modalidades. Como mostrado nesse documento, o dispositivo 1000 é compreendido de um primeiro 1014 e um segundo 1010 componentes. O primeiro componente 1014 tem aberturas em extremidades opostas e o segundo componente 1010 é preso a uma extremidade do primeiro componente 1014. O segundo componente 1010 compreende adicionalmente uma abertura de coleta de amostra 1018 voltada para longe de onde o segundo componente 1010 é preso ao primeiro componente 1014, a abertura de coleta de amostra 1018 tendo um ou mais de elementos de raspagem de amostra 1020 se projetando ao longo de um perímetro da abertura de coleta de amostra 1018. Um canal de vácuo 1012 se estende através do primeiro 1014 e do segundo 1010 componentes para conectar a abertura de coleta de amostra 1018 com uma abertura de conexão de vácuo 1022 na outra extremidade do primeiro componente 1014. Quando o dispositivo 1000 é operado para coletar amostra de um substrato, ele é girado de modo que os elementos de raspagem de amostra 1020 removam mecanicamente porções da amostra da superfície do substrato enquanto simultaneamente coleta as porções da amostra removida através da abertura de coleta de amostra 1018 e do canal de vácuo 1012 usando bomba de vácuo para aplicar vácuo à abertura de conexão de vácuo 1022 do primeiro componente 1014. Em várias modalidades, as porções de amostra removidas podem ser coletadas através de um elemento de filtro 1016 que está afixado à abertura de conexão de vácuo 1022. Em várias modalidades, as porções de amostra são coletadas em um recipiente que está em comunicação fluida com o canal de vácuo 1012.
[00182] Em várias modalidades, o primeiro 1014 e o segundo 1010 componentes são compostos de materiais diferentes. Em várias modalidades, o primeiro 1014 e o segundo 101 componentes são compostos dos mesmos materiais. Exemplos de materiais que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a: metais, polímeros, fibra de vidro, etc.
[00183] Em várias modalidades, o primeiro 1014 e o segundo 1010 componentes são fabricados como uma única parte integrada e não como duas partes individuais separadas.
[00184] Em várias modalidades, os elementos de raspagem de amostra 1020 estão igualmente espaçados ao longo do perímetro da abertura de coleta de amostra 1018. Em várias modalidades, os elementos de raspagem de amostra 1104 estão diferencialmente espaçados ao longo do perímetro da abertura de coleta de amostra 1018.
[00185] A FIG. 12 ilustra um sistema de coleta de amostra de exemplo, de acordo com várias modalidades. Como representado nesse documento, o sistema 1200 inclui um dispositivo de fresagem de amostra 1000 que está posicionado sobre um substrato (isto é, lâmina) 1202 segurando uma amostra 1204. O dispositivo de fresagem de amostra 1000 é compreendido de um primeiro 1014 e um segundo 1010 componentes. Quando o dispositivo de fresagem de amostra 1000 está sendo operado, ele é girado e posicionado (em um eixo X, Y e Z) de modo que a ponta do dispositivo 1000 contacte a amostra 1204 para remover mecanicamente porções da amostra 1204 da superfície do substrato 1202 enquanto coleta simultaneamente as porções removidas da amostra através do uso de uma bomba de vácuo 1206 que aplica um vácuo a uma abertura 1208 em uma extremidade do dispositivo de fresagem 1000.
[00186] Em várias modalidades, o dispositivo de fresagem de amostra 100 pode ser movido em uma direção dos eixos X, Y e Z de modo que só entre em contato com uma porção desejada da amostra 1204. Em várias modalidades, a lâmina 1202 segurando a amostra 1204 pode ser movida em uma direção dos eixos X, Y e Z tal como o dispositivo de moagem de amostra
1000.
[00187] Em várias modalidades, o primeiro 1014 e o segundo 1010 componentes são compostos de materiais diferentes. Em várias modalidades, o primeiro 1014 e o segundo 101 componentes são compreendidos dos mesmos materiais. Exemplos de materiais que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a: metais, polímeros, fibra de vidro, etc. Procedimentos de Análise de Amostra Subsequentes Exemplares
[00188] Tecido de ROI (ou tecido S) pode ser coletado de modo que possa ser analisado ou manipulado de várias maneiras. Por exemplo, em algumas modalidades, o tecido de ROI coletado é submetido à lise celular, como descrito acima, seguido por um ou mais outros processos. Em algumas modalidades, DNA e/ou RNA e/ou proteínas, cofatores, lipídeos de membrana e semelhantes podem ser extraídos do tecido de ROI diretamente ou após a lise celular ou podem ser avaliados in situ.
[00189] Em algumas modalidades, os sistemas e métodos nesse documento estão envolvidos na análise de DNA no tecido de ROI. Por exemplo, os sistemas e métodos nesse documento podem ser usados em conjunto com a análise de tecido de ROI para variações do número de cópias (CNVs), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações pontuais em genes específicos, detecção de eliminação ou mutações de inserção em genes, detecção de transposições, translocações, presença de DNA estranho, tal como DNA viral ou bacteriano, metilação de DNA e semelhantes. Em algumas modalidades, os sistemas e métodos descritos nesse documento podem ser usados em conjunto com a análise de espécies de RNA no tecido de ROI, tal como a determinação do nível de transcritos de RNA específicos de genes ou detecção de transcritos de RNA com splicing alternativo particular e seus níveis relativos ou presença de RNAs interferentes. A análise de RNA pode ser realizada, por exemplo, por métodos incluindo a reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR), tal como RT-PCR quantitativo, ou por métodos de sequenciamento do transcriptoma completo. Em algumas modalidades, a presença ou os níveis de proteínas específicas no tecido de ROI podem ser avaliados, tal como in situ ou após procedimentos de lise celular, por métodos, tais como, imunoprecipitação, ELISA, Western blotting, ácidos nucleicos e semelhantes. Em algumas modalidades, o tecido de ROI pode ser avaliado para detectar a presença ou níveis de outras moléculas, tais como, cofatores biológicos, lipídeos de membrana celular ou outros componentes e semelhantes.
[00190] Sistemas e métodos exemplificativos para analisar amostras biológicas, por exemplo, tecidos FFPE montados em lâminas de vidro, são mostrados na FIG. 8A e FIG. 8B.
[00191] A FIG. 8A mostra um método de exemplo para o processamento e/ou análise de amostras de pacientes, por exemplo, amostra de biópsia de tumor, de acordo com os métodos descritos acima. A amostra biológica é microjateada com um meio de contato contendo partículas e ar. Em algumas modalidades, o meio de contato pode conter partículas que são bem adequadas para uso no isolamento de analitos específicos de interesse que estão presentes na amostra do paciente.
Por exemplo, partículas de sílica ou partículas revestidas de sílica, tal como grânulos ferromagnéticos revestidos de sílica, são bem adequadas para isolar marcadores de ácido nucleico, tal como mRNA abrigando mutações de sentido errado ou mutações com perda de função.
O microjateador de partículas é carregado com tais partículas e o bocal do microjateador é direcionado para a área de tecido desejada.
Por exemplo, no caso de espécime de patologia, a área desejada pode ser uma área contendo ácidos nucleicos, por exemplo, núcleos de células que foram corados com corantes apropriados.
Alternativamente, nos casos em que o espécime do paciente contém diferentes tipos de tecido, a área desejada pode ser um tipo de tecido ou uma camada de tecido que contém células de interesse, por exemplo, células epiteliais que revestem o duto pancreático no caso de câncer pancreático.
O microjateamento da região de interesse com o meio de contato (contendo ar pressurizado e partículas) remove as células de interesse, que são então coletadas e combinadas com um tampão de lise de tecido para romper as células.
Isso produz uma solução de lisado celular, em que os analitos de interesse (por exemplo, no caso de câncer pancreático, ácidos nucleicos mutantes que codificam KRAS, TP53, CDKN2A, SMAD4, BRCA1 e/ou BRCA2; ver Cicenas et al., Canceres (Basel), 28, 9 (5), 2017) são adsorvidos nas partículas.
Para melhorar a taxa de adsorção, o pH da solução tampão pode ser ajustado em ou abaixo do pKa dos grupos de silanol de superfície nas partículas de sílica e o teor de sal do tampão é aumentado.
As partículas são então lavadas com uma solução que deixa os analitos adsorvidos em sua superfície enquanto lava outros componentes da solução de lisado, por exemplo, não analitos, tais como proteínas e lipídeos. Os analitos podem ser analisados diretamente usando técnicas analíticas a jusante, tal como PCR. Alternativamente, os ácidos nucleicos adsorvidos na superfície das partículas de sílica são eluídos com uma solução de eluente adequada antes da análise a jusante com técnicas de detecção de ácido nucleico, tal como PCR. A eluição é facilitada pelo uso de tampões de baixa força iônica e pH. Se desejado, antes do microjateamento, a amostra pode ser pré-processada usando técnicas de microdissecação, como microdissecação a laser, para adicionalmente refinar e/ou ter como alvo a região de interesse (ROI).
[00192] A FIG. 8B mostra um método de exemplo para o processamento e/ou análise de uma amostra biológica, por exemplo, amostra entomológica fixa para arquivo de museu ou uma lâmina de contato contendo microrganismos de solo, de acordo com os métodos descritos acima. A amostra biológica é microjateada com um meio de contato contendo partículas e ar. Em algumas modalidades, o meio de contato pode conter partículas que são bem adequadas para uso no isolamento de analitos específicos de interesse que estão presentes na amostra do paciente. Por exemplo, as partículas de alumínio que foram funcionalizadas com grupos amino, carboxila, sulfonato e fosfato podem ser úteis no isolamento de marcadores polipeptídicos específicos. O microjateador de partículas é carregado com tais partículas e o bocal do microjateador é direcionado para a área de tecido desejada. Por exemplo, no caso de espécime de inseto fixo, a área desejada pode ser uma área contendo marcadores de interesse, por exemplo, abdômen. O microjateamento da região de interesse com o meio de contato (contendo ar pressurizado e partículas) remove as células de interesse, que são então coletadas e combinadas com um tampão de lise de tecido para romper as células. Isso produz uma solução de lisado celular, em que os analitos de interesse são adsorvidos nas partículas (por exemplo, os peptídeos são adsorvidos nas partículas de alumínio funcionalizadas). Para melhorar a taxa de adsorção, dependendo das propriedades físico-químicas do alvo (por exemplo, hidrofilicidade no caso de proteínas solúveis; hidrofobicidade no caso de proteínas de membrana), as partículas podem ser derivadas. As partículas são então lavadas com uma solução que deixa os analitos adsorvidos em sua superfície enquanto lava outros componentes da solução de lisado, por exemplo, não analitos, tais como lipídeos. Os analitos podem ser analisados diretamente usando técnicas analíticas a jusante, tal como espectrometria de massa. Em alternativa, os polipeptídeos adsorvidos na superfície das partículas de alumínio são eluídos com uma solução de eluente adequada antes da análise a jusante com técnicas de detecção de peptídeos, tal como imunoblotting ou espectrometria de massa. Se desejado, antes do microjateamento, a amostra pode ser pré-processada usando técnicas de microdissecação, como microdissecação a laser, para refinar e/ou ter como alvo a ROI. Sistemas Implementados por Computador
[00193] A FIG. 9 é um diagrama de blocos que ilustra um sistema de computador 400, no qual modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implementadas. Em várias modalidades dos presentes ensinamentos, o sistema de computador 400 pode incluir um barramento 402 ou outro mecanismo de comunicação para comunicar informações e um processador 404 acoplado ao barramento 402 para processar informações. Em várias modalidades, o sistema de computador 400 também pode incluir uma memória, que pode ser uma memória de acesso aleatório (RAM) 406 ou outro dispositivo de armazenamento dinâmico, acoplado ao barramento 402 para determinar as instruções a serem executadas pelo processador 404. A memória também pode ser usada para armazenar variáveis temporárias ou outras informações intermediárias durante a execução de instruções a serem executadas pelo processador 404. Em várias modalidades, o sistema de computador 400 pode incluir adicionalmente uma memória somente leitura (ROM) 408 ou outro dispositivo de armazenamento estático acoplado ao barramento 402 para armazenar informações estáticas e instruções para o processador 404. Um dispositivo de armazenamento 410, tal como um disco magnético ou disco óptico, pode ser fornecido e acoplado ao barramento 402 para armazenar informações e instruções.
[00194] Em várias modalidades, o sistema de computador 400 pode ser acoplado via barramento 402 a um visor 412, como um tubo de raios catódicos (CRT) ou visor de cristal líquido (LCD), para exibir informações para um usuário de computador. Um dispositivo de entrada 414, incluindo teclas alfanuméricas e outras, pode ser acoplado ao barramento 402 para comunicar informações e seleções de comando para o processador 404. Outro tipo de dispositivo de entrada do usuário é um controle de cursor 416, tal como um mouse, uma esfera rolante ou teclas de direção do cursor para comunicar informações de direção e seleções de comando para o processador 404 e para controlar o movimento do cursor no visor 412. Esse dispositivo de entrada 414 tipicamente tem dois graus de liberdade em dois eixos, um primeiro eixo (ou seja, x) e um segundo eixo (ou seja, y, que permite ao dispositivo especificar posições em um plano. No entanto, deve ser entendido que os dispositivos de entrada 414 permitindo o movimento do cursor tridimensional (x, y e z) também são contemplados nesse documento.
[00195] Consistente com certas implementações dos presentes ensinamentos, os resultados podem ser fornecidos pelo sistema de computador 400 em resposta ao processador 404 executando uma ou mais de sequências de uma ou mais de instruções contidas na memória 406. Tais instruções podem ser lidas na memória 406 a partir de outro meio legível por computador ou meio de armazenamento legível por computador, como o dispositivo de armazenamento 410. A execução das sequências de instruções contidas na memória 406 pode fazer com que o processador 404 execute os processos nesse documento descritos. Alternativamente, circuitos com fio podem ser usados no lugar de ou em combinação com instruções de software para implementar os presentes ensinamentos. Assim, as implementações dos presentes ensinamentos não estão limitadas a qualquer combinação específica de circuitos de hardware e software.
[00196] O termo “meio legível por computador” (por exemplo, armazenamento de dados, armazenamento de dados, etc.) ou “meio de armazenamento legível por computador", como usado nesse documento, refere-se a qualquer meio que participa no fornecimento de instruções ao processador 404 para execução. Tal meio pode assumir muitas formas, incluindo, mas não se limitando a, meio não volátil, meio volátil e meio de transmissão. Exemplos de meios não voláteis podem incluir, mas não estão limitados a, discos ópticos, em estado sólido, magnéticos, tal como o dispositivo de armazenamento 410. Exemplos de meios voláteis podem incluir, mas não estão limitados a, memória dinâmica, tal como a memória 406. Exemplos de meios de transmissão podem incluir, mas não estão limitados a, cabos coaxiais, fio de cobre e fibra óptica, incluindo os fios que compreendem o barramento
402.
[00197] Formas comuns de meios legível por computador incluem, por exemplo, um disquete, um disco flexível, disco rígido, fita magnética ou qualquer outro meio magnético, um CD-ROM, qualquer outro meio óptico, cartões perfurados, fita de papel, qualquer outro meio físico com padrões de orifícios, um RAM, PROM e EPROM, um FLASH-EPROM, qualquer outro chip de memória ou cartucho ou qualquer outro meio tangível do qual um computador pode ler.
[00198] Além do meio legível por computador, instruções ou dados podem ser fornecidos como sinais em meios de transmissão incluídos em um aparelho ou sistema de comunicação para fornecer sequências de uma ou mais instruções para o processador 404 do sistema de computador 400 para execução. Por exemplo, um aparelho de comunicação pode incluir um transceptor tendo sinais indicativos de instruções e dados. As instruções e dados são configurados para fazer com que um ou mais de processadores implementem as funções descritas na revelação nesse documento. Exemplos representativos de conexões de transmissão de comunicações de dados podem incluir, mas não estão limitados a, conexões de modem de telefone, redes de área ampla (WAN), redes de área local (LAN), conexões de dados infravermelhos, conexões NFC, etc.
[00199] Deve ser apreciado que as metodologias descritas nesse documento, fluxogramas, diagramas e revelação acompanhante podem ser implementadas usando o sistema de computador 400 como um dispositivo autônomo ou em uma rede distribuída de recursos de processamento de computador compartilhados, tal como uma rede de computação em nuvem.
[00200] As metodologias descritas nesse documento podem ser implementadas por vários meios, dependendo da aplicação. Por exemplo, essas metodologias podem ser implementadas em hardware, firmware, software ou qualquer combinação dos mesmos. Para uma implementação de hardware, a unidade de processamento pode ser implementada dentro de um ou mais de circuitos integrados específicos de aplicação (ASICs), processadores de sinais digitais (DSPs), dispositivos de processamento de sinais digitais (DSPDs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs), processadores, controladores, microcontroladores, microprocessadores, dispositivos eletrônicos, outras unidades eletrônicas projetadas para realizar as funções descritas nesse documento, ou uma combinação dos mesmos.
[00201] Em várias modalidades, os métodos dos presentes ensinamentos podem ser implementados como programa de firmware e/ou software e aplicativos escritos em linguagens de programação convencionais, tais como C, C++, Python, etc. Se implementados como firmware e/ou software, as modalidades descritas nesse documento podem ser implementadas em um meio legível por computador não transitório no qual um programa é armazenado para fazer com que um computador execute os métodos descritos acima. Deve ser entendido que os vários dispositivos descritos nesse documento podem ser fornecidos em um sistema de computador, tal como o sistema de computador 400 da FIG. 9, por meio do qual o processador 404 executaria as análises e determinações fornecidas por esses dispositivos, submetidas às instruções fornecidas por qualquer um ou uma combinação de componentes de memória 406/408/410 e entrada do usuário fornecida através do dispositivo de entrada 414.
[00202] Embora os presentes ensinamentos sejam descritos em conjunto com várias modalidades, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a tais modalidades. Pelo contrário, os presentes ensinamentos abrangem várias alternativas, modificações e equivalentes, como será apreciado por aqueles técnicos no assunto.
[00203] Além disso, ao descrever várias modalidades, o relatório descritivo pode ter apresentado um método e/ou processo como uma sequência particular de etapas. No entanto, na medida em que o método ou processo não depende da ordem particular de etapas estabelecidas nesse documento, o método ou processo não deve ser limitado à sequência particular de etapas descritas. Como um técnico no assunto apreciaria, outras sequências de etapas podem ser possíveis. Portanto, a ordem particular das etapas estabelecidas no relatório descritivo não deve ser interpretada como uma limitação das reivindicações. Além disso, as reivindicações direcionadas ao método e/ou processo não devem ser limitadas ao desempenho de suas etapas na ordem escrita, e um técnico no assunto pode prontamente apreciar que as sequências podem ser variadas e ainda permanecer dentro do espírito e do escopo das várias modalidades.
[00204] As modalidades descritas nesse documento podem ser praticadas com outras configurações de sistema de computador, incluindo dispositivos portáteis, sistemas de microprocessador, componentes eletrônicos de consumo baseados em microprocessador ou programáveis, minicomputadores, computadores mainframe e semelhantes. As modalidades também podem ser praticadas na distribuição de ambientes de computação onde as tarefas são realizadas por dispositivos de processamento remoto que estão ligados por meio de uma rede.
[00205] Também deve ser entendido que as modalidades descritas nesse documento podem empregar várias operações implementadas por computador envolvendo dados armazenados em sistemas de computador. Essas operações são aquelas que requerem manipulação física de quantidades físicas. Usualmente, embora não necessariamente, essas quantidades assumem a forma de sinais elétricos ou magnéticos capazes de ser armazenados, transferidos, combinados, comparados e de outra forma manipulados. Além disso, as manipulações realizadas são frequentemente referidas em termos, tais como produção, identificação, determinação ou comparação.
[00206] Qualquer uma das operações que fazem parte das modalidades descritas nesse documento são operações de máquina úteis. As modalidades, descritas nesse documento, também se referem a um dispositivo ou aparelho para realizar essas operações. Os sistemas e métodos descritos nesse documento podem ser especialmente construídos para as finalidades exigidas ou podem ser um computador de finalidade geral seletivamente ativado ou configurado por um programa de computador armazenado no computador. Em particular, várias máquinas de finalidade geral podem ser usadas com programas de computador escritos de acordo com os ensinamentos nesse documento, ou pode ser mais conveniente construir um aparelho mais especializado para realizar as operações necessárias.
[00207] Certas modalidades também podem ser incorporadas como código legível por computador em um meio legível por computador. O meio legível por computador é qualquer dispositivo de armazenamento de dados que pode armazenar dados, que podem depois ser lidos por um sistema de computador. Exemplos de meios legível por computador incluem discos rígidos, armazenamento afixado à rede (NAS), memória somente para leitura, memória de acesso aleatório, CD-ROMs, CD-Rs, CD-RWs, fitas magnéticas e outros dispositivos de armazenamento de dados ópticos, com memória FLASH e não óticos. O meio legível por computador também pode ser distribuído por sistemas de computador acoplados a uma rede, de modo que o código legível por computador seja armazenado e executado de forma distribuída.
EXEMPLOS
[00208] A(o)s estruturas, materiais, composições e métodos descrita(o)s nesse documento se destinam a ser exemplos representativos da revelação e será entendido que o escopo da revelação não é limitado pelo escopo dos exemplos. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão que a revelação pode ser praticada com variações na(o)s estruturas, materiais, composições e métodos revelada(o)s, e tais variações são consideradas como dentro do âmbito da revelação. Exemplo 1: Processamento de amostras biológicas para obter analitos de ácido nucleico
[00209] Uma amostra de histologia contendo ácidos nucleicos de interesse é processada de acordo com os métodos descritos acima. Aqui, o meio de contato contém partículas que são adequadas para uso no isolamento de ácido nucleico. Esses incluem partículas de sílica ou partículas revestidas de sílica, tais como grânulos ferromagnéticos revestidos de sílica. O microjateador de partículas é carregado com partículas de sílica para fornecer uma maneira eficiente de isolar ácidos nucléicos de espécimes de tecido. Primeiro, a área de tecido desejada é removida das lâminas por microjateamento com partículas de sílica que são então coletadas e combinadas com um tampão de lise de tecido para romper as células. Isso produz uma solução de lisado celular, em que os ácidos nucleicos são adsorvidos nas partículas de sílica. As partículas de sílica são então lavadas com uma solução que deixa os ácidos nucléicos adsorvidos em sua superfície enquanto lava outros componentes da solução de lisado, tais como proteínas e lipídeos. Os ácidos nucleicos podem ser analisados diretamente usando técnicas analíticas a jusante, tal como PCR. Alternativamente, os ácidos nucleicos adsorvidos na superfície das partículas de sílica são eluídos com uma solução de eluente adequada antes da análise a jusante com técnicas de detecção de ácido nucleico, tal como PCR. Se desejado, a amostra pode ser pré-processada usando técnicas de microdissecção, tal como microdissecção a laser. Exemplo 2: Processamento de amostras biológicas para obter analitos de ácido nucleico e peptídeo
[00210] Alternativamente, as partículas usadas para microjateamento no Exemplo 1 acima são coletadas em um recipiente e combinadas com outras partículas que são otimamente adequadas para a ligação seletiva de uma variedade de analitos potenciais (por exemplo, ácidos nucleicos ou proteínas), e a mistura de partículas resultante é usada para isolar os analitos de interesse. Como no Exemplo 1, nessa configuração alternativa, partículas de microjateamento que se ligam ao analito de interesse (por exemplo, com base na carga ou hidrofobicidade ou afinidade) são selecionadas primeiro. A mistura de tecido e partículas que são geradas após microjateamento são combinadas com um tampão de lise para romper as células, com a solução de lisado resultante sendo então combinada com partículas que têm oligonucleotídeos ou anticorpos ligados à sua superfície, aos quais os oligonucleotídeos ou anticorpos se ligam especificidade para os analitos de interesse. Os pares de partículas são então submetidos a análise direta (por exemplo, cromatografia ou espectrometria). Alternativamente, os pares de partículas são submetidos a uma série de etapas de ligação, lavagem e eluição para eluir o analito de interesse, que é então analisado usando técnicas convencionais. Por último, em que o analito de interesse é uma proteína, a solução de lisado também pode ser submetida a outras etapas analíticas, tais como, ensaios de enzimas, ensaios de ligação, ensaios funcionais, etc.
[00211] Os métodos acima descritos podem ser combinados com quaisquer etapas de isolamento e/ou purificação, cujas etapas podem ser implementadas em qualquer estágio do fluxo de trabalho, de preferência antes da etapa analítica final, por exemplo, PCR (no caso de analitos de ácido nucleico) ou ELISA (no caso de analitos de proteínas). Por exemplo, os ácidos nucleicos de interesse são frequentemente isolados do tecido por uma série de etapas que compreendem (a) a lise do tecido, na qual as células do tecido são rompidas por vários métodos para quebrar as células e liberar seu conteúdo na solução; (b) adsorção dos ácidos nucleicos na superfície de uma fase sólida; (c) lavagem dessa fase sólida com uma solução que deixa os ácidos nucleicos adsorvidos à fase sólida, mas remove outras biomoléculas: e (d) lavagem da fase sólida com uma solução que elui os ácidos nucleicos da fase sólida, de modo que o eluato coletado contém os ácidos nucléicos isolados. Membranas de sílica e partículas de sílica são comumente usadas como fase sólida nesse tipo de processo. Outros tipos de partículas também são comumente usados, incluindo grânulos ferromagnéticos revestidos com sílica ou polímero.
[00212] A partir da descrição anterior, um técnico no assunto pode facilmente determinar as características essenciais dos métodos e, sem se afastar do espírito e do escopo dos mesmos, pode fazer várias alterações e modificações para adaptá-los a vários usos e condições.
[00213] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto à qual essa revelação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos nesse documento possam ser usados na prática ou teste da presente revelação, métodos e materiais adequados são descritos nos parágrafos anteriores. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá.
[00214] Todas as patentes dos Estados Unidos e pedidos de patentes dos Estados Unidos publicados ou não publicados nesse documento citados são incorporados por referência. Todas as patentes estrangeiras publicadas e pedidos de patentes citados nesse documento são incorporados por meio desse documento por referência. Todas a(o)s referências, documentos, manuscritos e literatura científica publicada(o)s citada(o)s nesse documento são incorporada(o)s por meio desse por referência. Todos os identificadores e números de acesso pertencentes às bases de dados científicas referenciadas nesse documento (por exemplo, PUBMED, NCBI) são incorporados nesse documento por referência. Recitação de modalidades selecionadas
[00215] Modalidade 1. Um sistema para processar amostras afixadas a um substrato, compreendendo uma unidade de suporte para prender um substrato; uma câmera posicionada próxima à unidade de suporte; um elemento de processamento configurado para remover uma porção de uma amostra afixada no substrato; e um dispositivo de computação conectado comunicativamente à unidade de suporte, à câmera e ao elemento de processamento, compreendendo um dispositivo de captura de imagem configurado para obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada e uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada usando a câmera, um dispositivo de marcador digital configurado para permitir que um usuário gere uma imagem de marcador que contém a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada, um dispositivo de sobreposição de imagem configurado para sobrepor a imagem de marcador na segunda imagem de modo que os gráficos de imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados e um dispositivo de remoção de amostra configurado para controlar o posicionamento da unidade de suporte e o elemento de processamento de modo que apenas uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do contorno digital da primeira amostra afixada é removido.
[00216] Modalidade 2. O sistema da modalidade 1, em que o elemento de processamento é configurado para remover a porção da amostra utilizando uma ferramenta mecânica.
[00217] Modalidade 3. O sistema da Modalidade 2, em que a ferramenta mecânica compreende pelo menos um de jateamento de areia, uma lâmina de raspagem, uma ferramenta de fresagem, uma cureta, um furador, uma colher, um aspirador.
[00218] Modalidade 4. O sistema de qualquer uma das Modalidades 1 a 3, em que a ferramenta de processamento é configurada para remover a porção da amostra utilizando uma ferramenta não mecânica.
[00219] Modalidade 5. O sistema da Modalidade 4, em que a ferramenta não mecânica compreende pelo menos um de um laser ou um jato de água.
[00220] Modalidade 6. Um método para processar amostras afixadas a um substrato, compreendendo a obtenção de uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada; obter uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada; gerar uma imagem de marcador contendo a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada; sobrepor a imagem do marcador na segunda imagem de modo que os gráficos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados; e remover apenas uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira afixada usando um elemento de processamento.
[00221] Modalidade 7. O método da Modalidade 6, em que a remoção compreende a remoção da porção da segunda amostra fixada com uma ferramenta mecânica.
[00222] Modalidade 8. O método da Modalidade 6 ou Modalidade 7, compreendendo adicionalmente a remoção da porção da segunda amostra afixada com pelo menos um de jato de areia, uma lâmina de raspagem, uma cureta, um furador, uma colher, um aspirador, ou uma combinação de acima.
[00223] Modalidade 9. O método da Modalidade 6, em que a remoção compreende a remoção da porção da segunda amostra afixada com uma ferramenta não mecânica.
[00224] Modalidade 10. O método da Modalidade 6 ou Modalidade 9, que compreende adicionalmente a remoção da porção da segunda amostra afixada com pelo menos um de um laser ou jato de água.
[00225] Modalidade 11. Um sistema para processar amostras afixadas a um substrato, compreendendo uma unidade de suporte para prender um substrato; uma câmera posicionada próxima à unidade de suporte; um elemento de processamento configurado para fornecer um agente desnaturante de ácido nucleico para desnaturar o ácido nucleico em uma porção de uma amostra fixada no substrato; e um dispositivo de computação conectado comunicativamente à unidade de suporte, à câmera e ao elemento de processamento, compreendendo um dispositivo de captura de imagem configurado para obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada e uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada usando a câmera, um dispositivo de marcador digital configurado para permitir que um usuário gere uma imagem de marcador que contém a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada, um dispositivo de sobreposição de imagem configurado para sobrepor a imagem de marcador na segunda imagem de modo que gráficos de imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados, e um dispositivo de desnaturação de ácido nucleico configurado para controlar o posicionamento da unidade de suporte e o elemento de processamento de modo que apenas o ácido nucleico em uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada é desnaturado, o dispositivo de desnaturação de ácido nucleico compreendendo um analisador químico para realizar análise química, um espectrômetro de massa e/ou um analisador de células para realizar a análise de células.
[00226] Modalidade 12. Sistema da modalidade 11, em que o agente desnaturante de ácido nucleico compreende um produto químico.
[00227] Modalidade 13. Sistema da modalidade 12, em que o produto químico compreende pelo menos um de um alvejante, um ácido, um álcali ou uma enzima.
[00228] Modalidade 14. O sistema de qualquer uma das Modalidades 11 a 13, em que o elemento de processamento é configurado para remover a porção da amostra utilizando uma ferramenta não química.
[00229] Modalidade 15. Sistema da modalidade 14, em que a ferramenta não química compreende pelo menos um de um laser, um aquecedor térmico, ondas de radiofrequência (RF), ultrassom, criogenia ou plasma.
[00230] Modalidade 16. Método para processar amostras afixadas a um substrato, que compreende obter uma primeira imagem de um primeiro substrato com uma primeira amostra afixada; obter uma segunda imagem de um segundo substrato com uma segunda amostra afixada; gerar uma imagem de marcador contendo a primeira imagem e um gráfico digital de uma porção da primeira amostra afixada; sobrepor a imagem do marcador na segunda imagem de modo que os contornos da imagem da primeira amostra afixada e da segunda amostra afixada sejam alinhados; e ácido nucleico desnaturante em apenas uma porção da segunda amostra afixada que está dentro do gráfico digital da primeira amostra afixada usando um elemento de processamento.
[00231] Modalidade 17. Método da modalidade 16, em que a desnaturação compreende expor a porção da segunda amostra afixada com um produto químico.
[00232] Modalidade 18. O método da Modalidade 16 ou Modalidade 17, compreendendo adicionalmente expor a porção da segunda amostra afixada a pelo menos um de um alvejante, um ácido, um álcali ou uma enzima.
[00233] Modalidade 19. Método da modalidade 16, em que a desnaturação compreende expor a porção da segunda amostra fixada com uma ferramenta não química.
[00234] Modalidade 20. Método da Modalidade 16 ou Modalidade 19, compreendendo adicionalmente expor a porção da segunda amostra afixada a pelo menos um de um laser, um aquecedor térmico, ondas de radiofrequência (RF), ultrassom, criogenia ou plasma.
[00235] Modalidade 21. Um dispositivo de processamento de amostra, compreendendo um primeiro componente tendo aberturas em extremidades opostas; um segundo componente que é preso a uma extremidade do primeiro componente, em que o segundo componente compreende adicionalmente uma abertura de coleta de amostra voltada ao contrário de onde o segundo componente é preso ao primeiro componente, a abertura de coleta de amostra tendo um ou mais de elementos de raspagem de amostra que se projeta(m) ao longo de um perímetro da abertura de coleta de amostra; e um canal de vácuo que se estende através do primeiro e do segundo componentes para conectar a abertura de coleta de amostra com uma abertura de conexão de vácuo na outra extremidade do primeiro componente.
[00236] Modalidade 22. O dispositivo de processamento de amostra da Modalidade 21, em que o primeiro e o segundo componentes são compostos de materiais diferentes.
[00237] Modalidade 23. O dispositivo de processamento de amostra da Modalidade 22, em que o primeiro e o segundo componentes são compostos do mesmo material.
[00238] Modalidade 24. O dispositivo de processamento de amostra de qualquer uma das Modalidades 21 a 23, em que os elementos de raspagem de amostra estão igualmente espaçados ao longo do perímetro da abertura de coleta de amostra.
[00239] Modalidade 25. O dispositivo de processamento de amostra de qualquer uma das Modalidades 21 a 23, em que os elementos de raspagem de amostra são diferencialmente espaçados ao longo do perímetro da abertura de coleta de amostra.
[00240] Modalidade 26. O dispositivo de processamento de amostra de qualquer uma das Modalidades 21 a 25, incluindo adicionalmente um filtro que é afixado a uma abertura em uma extremidade do primeiro componente.
[00241] Modalidade 27. O dispositivo de processamento de amostra da modalidade 21, em que o primeiro e o segundo componentes são produzidos como um único dispositivo integrado.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de processamento de uma amostra biológica para um ensaio biológico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) contactar a amostra biológica com um meio de contato que compreende uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos a transferência parcial de um componente na amostra biológica para o meio de contato; e (b) remover o meio de contato da amostra biológica.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é processada para análise de um ou mais de analitos de interesse diagnóstico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende espécimes de biópsia por punção, espécimes de biópsia de agulha, tecidos frescos, culturas de tecidos, espécimes de tecidos congelados, tecidos tratados com formalina neutra, órgãos, organelas, tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (FFPE), tecidos embebidos em parafina e fixados em etanol (EFPE), tecidos corados com hematoxilina e eosina (H&E) ou tecidos fixados em glutaraldeído.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma região de interesse (ROI), uma região sem interesse (RONI), ou todas as regiões na amostra biológica com o meio de contato; de preferência contactando uma região de interesse (ROI) com o meio de contato.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende pelo menos um analito de interesse diagnóstico selecionado de DNA genômico (gDNA), DNA metilado, DNA metilado específico, RNA mensageiro (mRNA), DNA fragmentado, RNA fragmentado, mRNA fragmentado, DNA mitocondrial (mtDNA), DNA de cloroplasto (ctDNA), RNA viral ou DNA viral, microRNA, RNA ribossomal, produto de PCR in situ, mRNA poliA, híbrido de RNA/DNA, lipídeo, carboidrato, proteína, glicoproteína, lipoproteína, fosfoproteína, variante de uma proteína acetilada ou fosforilada específica, ou proteínas do revestimento viral; de preferência ácidos nucleicos selecionados de mRNA, gDNA, DNA viral ou RNA viral.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância particulada no meio de explosão compreende óxido de alumínio; dióxido de silício; partículas de base metálica; partículas magnéticas ou ferromagnéticas ou uma combinação das mesmas.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a substância particulada é capaz de se ligar a um analito ou não analito na amostra biológica; de preferência, a substância particulada é capaz de se ligar ao analito por meio de uma interação selecionada de interação iônica, interação polar-apolar, interação hidrofóbica, interação de van der waal, acoplamento químico, interação dielétrica ou zwitterion ou uma combinação dos mesmos.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de contato compreende ar pressurizado selecionado de hélio pressurizado, argônio, xenônio, nitrogênio, dióxido de carbono ou uma combinação dos mesmos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é montada em um substrato, por exemplo, um substrato é selecionado de vidro,
silício, material revestido com poli-L-lisina, nitrocelulose, poliestireno, copolímeros de olefina cíclica (COCs), polímeros de olefina cíclica (COPs), polipropileno, polietileno e/ou policarbonato.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende um analito de ácido nucleico e o meio de contato compreende uma substância particulada que compreende sílica.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente microdissecação, por exemplo, microdissecação a laser.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de contato é removido da amostra biológica por meio de vácuo, diferencial ou gradiente de pressão, gravidade, um meio de transporte (por exemplo, líquido ou aerossol ou gás) ou um meio de transferência selecionado do campo magnético ou campo elétrico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) contactar seletivamente uma região sem interesse (RONI) na amostra biológica com o meio de contato, em que o contato seletivo compreende de preferência deixar uma região de interesse (ROI) na amostra biológica intocada; (b) contactar seletivamente uma região de interesse (ROI) na amostra biológica com o meio de contato, em que o contato seletivo compreende de preferência deixar uma região sem interesse (RONI) na amostra biológica intocada; ou (c) contactar ROI e RONI na amostra biológica com o meio de contato.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13,
caracterizado pelo fato de que compreende coletar a substância particulada no meio de contato; (c) preparar opcionalmente a substância particulada para análise; e (d) opcionalmente analisar adicionalmente a substância particulada.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a preparação da substância particulada para análise compreende tratar a substância particulada com um tampão (por exemplo, tampão de lise) e lavar a substância particulada para remover não analitos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a análise da substância particulada compreende reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo (qPCR), PCR de transcriptase reversa (RT- PCR), amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação por círculo rolante (RCA), imunoensaio, imunoPCR (iPCR), ensaio de atividade enzimática, coloração, formação de imagem, amplificação do genoma completo (WGA), PCR in situ, WGA in situ, formação de polony, sequenciamento, sequenciamento de uma única molécula, análise de nanopore, sequenciamento de nanopore, formação de imagem de uma única molécula, formação de esferas de DNA, eletroforese, eletroforese de sistemas microeletromecânicos (MEMS), espectrometria de massa, cromatografia (por exemplo, HPLC), ensaio de ligação de proximidade, detecção eletroquímica, ressonância de plasmon (SPR), ensaio de hibridização (por exemplo, ensaio de hibridização in situ, como hibridização in situ por fluorescência (FISH)) FRET, classificação de células (por exemplo, FACS), ELISA eletroquimioluminescência e ELISA quimioluminescência.
17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente misturar o meio de contato com um meio enriquecedor.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio de enriquecimento compreende uma substância que se liga especificamente a um analito de interesse na amostra biológica, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de proteína de interesse ou um ácido nucleico que se hibridiza especificamente com um ácido nucleico de interesse.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende um tecido bidimensional (por exemplo, seção de tecido ou fatia) ou um tecido tridimensional (por exemplo, bloco de tecido) que compreende uma localização espacial bem definida de uma região de interesse (ROI) e/ou uma região sem interesse (RONI); de preferência ROI e RONI.
20. Método de ensaio para um analito em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende o processamento da amostra biológica por (a) contactar a amostra biológica com um meio de contato compreendendo uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos a transferência parcial de um componente em a amostra biológica para o meio de contato; e (b) remover o meio de contato da amostra biológica para obter uma amostra biológica processada; e ensaio do analito na amostra biológica processada ou no meio de contato removido.
21. Sistema bioanalítico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um primeiro componente para contatar uma amostra biológica ou uma região na mesma com um meio de contato que compreende uma substância particulada e ar pressurizado sob condições suficientes para efetuar pelo menos uma transferência parcial de um componente na amostra biológica para o meio de contato; (b) um segundo componente para remover o meio de contato da amostra biológica; e (c) opcionalmente, um terceiro componente para analisar o componente no meio de contato ou na amostra biológica processada ou no meio de contato e na amostra biológica processada.
22. Sistema bioanalítico, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente compreende um microjateador de partículas pressurizadas (PMB) contendo o meio de contato.
23. Sistema bioanalítico, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o segundo componente compreende um vácuo, diferencial ou gradiente de pressão, um meio para transportar a substância particulada (por exemplo, líquido ou aerossol) ou um meio de transferência selecionado de campo magnético ou campo elétrico.
24. Sistema bioanalítico, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o terceiro componente opcional compreende um instrumento selecionado de reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo (qPCR), PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação por círculo rolante (RCA), imunoensaio, imunoPCR (iPCR), ensaio de atividade enzimática, coloração, formação de imagem,
amplificação do genoma completo (WGA), PCR in situ, WGA in situ, formação de polony, sequenciamento, sequenciamento de uma única molécula, análise de nanopore, sequenciamento de nanopore, formação de imagem de uma única molécula, formação de esferas de DNA, eletroforese, eletroforese de sistemas microeletromecânicos (MEMS), espectrometria de massa, cromatografia (por exemplo, HPLC), ensaio de ligação de proximidade, detecção eletroquímica, ressonância de plasmon (SPR), ensaio de hibridização (por exemplo, ensaio de hibridização in situ, tal como hibridização in situ por fluorescência (FISH)) FRET, classificação de células (por exemplo, FACS), ELISA eletroquimioluminescência e ELISA quimiluminescência.
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