ES2613515T3 - Análisis de RT-qPCR de material microdiseccionado a partir de la sección teñida de FFPET - Google Patents
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Abstract
Método para la tinción inmunohistoquímica de una sección de tejido fijada en formalina, embebida en parafina, que comprende las etapas de: a) proporcionar un soporte sólido, b) montar la sección de tejido embebida en parafina y fijada en formalina sobre el soporte sólido, c) retirar la parafina de la sección de tejido embebida en parafina y fijada con formalina, d) calentar entre 50 y 70 °C durante 12 a 24 h. la sección de tejido montada sobre el soporte sólido para recuperar los epítopos, y e) teñir la sección de tejido montada sobre el soporte sólido, en el que al menos la etapa e) se lleva a cabo en presencia de cloruro de sodio de 0,5 a 3,0 M.
Description
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se realiza durante 1,5 a 2,5 h. En una realización, la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido con el anticuerpo secundario se realiza en presencia de cloruro de sodio de 0,5 a 3,0 M. En una realización específica, la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido con el anticuerpo secundario se realiza a aproximadamente 20 ºC. En otra realización específica, la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido con el anticuerpo secundario se realiza durante aproximadamente 2 h. En aún otra realización específica, la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido con el anticuerpo secundario se realiza en presencia de cloruro sódico aproximadamente 2,0 M. En una realización más específica, la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido con el anticuerpo secundario se realiza a aproximadamente 20 ºC durante aproximadamente 2 h, donde el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 2 M.
En una realización, la tinción de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido comprende además una reacción enzima-sustrato catalizada por una enzima unida covalentemente al anticuerpo secundario. Por lo tanto, en una realización específica, la tinción comprende el uso de un anticuerpo marcado. La enzima puede seleccionarse del grupo que consiste en peroxidasas y fosfatasas alcalinas. Las peroxidasas, tales como HRP, son capaces de transformar sustratos seleccionados del grupo que consiste en 3,3'-diaminobenzidina (DAB), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 4-cloro-1-naftol (CN) y p-fenilendiamina. Las fosfatasas alcalinas son capaces de transformar sustratos seleccionados del grupo que consiste en naftol as-mx-fosfato, cloruro de triamino-trilolil-metano hexazotizado, naftol AS-BI-fosfato, naftol AS-TR-fosfato, 5-bromo-4-cloro-3-indoxilfosfato (BCIP), nitroazul-tetrazolio (NBT), violeta de yodonitrotetrazolio (INT), Fast Red TR, Fast Red LB, Fast Blue BB y Fast Garnet GBC.
En una realización específica, la enzima capaz de transformar el sustrato es HRP. En una realización específica, el sustrato transformado por HRP es DAB. En una realización, la tinción con DAB se realiza en presencia de cloruro de sodio de 0,5 a 3,0 M. En una realización específica, el cloruro sódico está presente en una concentración de aproximadamente 2 M. En una realización, la tinción con DAB se realizó durante 5-20 minutos a temperatura ambiente. En una realización específica, la tinción con DAB se realizó durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente.
En una realización, el soporte sólido es un portaobjetos de membrana. En una realización específica, el soporte sólido es un portaobjetos de membrana adecuada para LCM. En una realización específica, el portaobjetos de membrana es una lámina de membrana de naftalato de polietileno. Se ha demostrado que los portaobjetos de membrana comercialmente disponibles, tales como portaobjetos de membrana de naftalato de polietileno, no son adecuados para el método de acuerdo con la presente descripción. Los portaobjetos de membrana comercialmente disponibles no proporcionan suficiente adherencia a las secciones de FFPET durante la etapa de calentar las secciones de tejido montadas en los portaobjetos de membrana recubiertos para recuperar los epítopos. Con el fin de mejorar la adhesión entre los portaobjetos de membrana y las secciones FFPET durante la etapa de calentamiento, los portaobjetos de membrana se recubrieron con poli-L-lisina que aumentó la adhesión entre los portaobjetos de membrana y las secciones FFPET de forma que las secciones FFPET estaban unidas de forma estable a los portaobjetos de membrana.
En una realización, la etapa de diseccionar área de interés desde la sección de tejido teñida montada sobre el soporte sólido comprende microdiseccionar o macrodiseccionar un área de interés. En una realización específica, la etapa de microdisección comprende el proceso de cortar y separar una o más células específicas o un área de interés de una muestra de tejido. Por ejemplo, la microdisección puede realizarse usando microdisección por captura láser (LCM) cortando el área relevante con un láser. En una realización específica, la etapa de macrodisección comprende el proceso de rascar un área de interés desde una sección de tejido montada sobre un soporte sólido, tal como un portaobjetos de microscopio, utilizando una herramienta tal como un bisturí o una espátula.
En el método según la descripción, se utilizó LCM en la sección FFPET teñida unida al portaobjetos de membrana para cortar un área de interés de la sección de tejido. El área de interés se utilizó posteriormente para el aislamiento de RNA. En una realización, el área de interés tiene un tamaño de 0,5 -5 mm2. En una realización específica, el área de interés tiene un tamaño de 1-2 mm2. Se aisló RNA del área de interés usando métodos bien conocidos en la técnica, tal como utilizando el equipo de aislamiento de RNA FFPET de High Pure (Roche Diagnostics GmbH). El RNA aislado fue posteriormente transcrito inversamente con el fin de obtener cDNA. Debido a la cantidad limitada de cDNA y para proporcionar suficiente ácido nucleico para un experimento qPCR, puede realizarse una etapa de preamplificación en el cDNA antes de la amplificación por qPCR. Por lo tanto, en una realización, el método de acuerdo con la descripción comprende además las etapas de f) microdisección de un área de interés de la sección de tejido teñido montada sobre el portaobjetos de membrana recubierta, g) aislamiento del RNA del área de interés, h) transcripción inversa del RNA aislado en cDNA, i) preamplificar el cDNA, y j) amplificar y cuantificar el cDNA preamplificado. En una realización específica, la etapa de amplificación y cuantificación del cDNA preamplificado se realiza mediante PCR en tiempo real.
En una realización específica, la presente descripción se refiere a un método para tinción inmunohistoquímica de una sección de tejido embebida en parafina, fijada en formalina, que comprende las etapas de a) proporcionar un portaobjetos de membrana cubierto con poli-L-lisina, b) montar la sección de tejido embebida en parafina fijada en formalina sobre un portaobjetos de membrana, c) retirar la parafina de la sección de tejido embebida en parafina
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fijada con formalina mediante la incubación de la sección de tejido montada sobre el soporte sólido en xilol, d) calentar la sección de tejido montada en el portaobjetos de membrana para recuperar epítopos a aproximadamente 60 ºC durante aproximadamente 16 h, y e) tinción de la sección de tejido montada sobre el portaobjetos de membrana mediante el uso de un anticuerpo marcado, f) microdiseccionar un área de interés de la sección de tejido teñida montada en el portaobjetos de membrana que tiene un tamaño de 1-2 mm2, g) aislar el RNA del área de interés, h) transcribir de forma inversa el RNA aislado en cDNA, i) amplificar y cuantificar el cDNA, en donde al menos la etapa e) se realiza en presencia de cloruro de sodio aproximadamente 2 M y en el que la etapa de amplificación y cuantificación del cDNA se realiza mediante PCR en tiempo real.
La presente descripción se refiere además a un equipo para llevar a cabo el método como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, la presente descripción se refiere además a un equipo para realizar un método para tinción inmunohistoquímica de una sección de tejido fijada en formalina, embebida en parafina que comprende las etapas de a) proporcionar un soporte sólido, b) montar la parafina fijada en formalina, c) retirar la parafina de la sección de tejido fijada con formalina, embebida en parafina, d) calentar entre 50 y 70 °C durante 12 a 24 h. la sección de tejido montada sobre el soporte sólido para recuperar los epítopos, y e) teñir la sección de tejido montada sobre el soporte sólido, en donde al menos la etapa e) se lleva a cabo en presencia de cloruro de sodio de 0,5 a 3,0
M. En una realización, el cloruro de sodio está presente en una concentración de 1,5 a 2,5 M. En una realización más específica, el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 1,8 a 2,2 M. En una realización aún más específica, el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 2 M.
En una realización, el método realizado con el equipo comprende además las etapas de f) diseccionar un área de interés a partir de la sección de tejido teñido montado sobre el soporte sólido, g) aislar el RNA del área de interés, h) transcribir de manera inversa el RNA aislado en cDNA, i) amplificar y cuantificar el cDNA. En una realización, las etapas h) e i) se realizan como PCR de una sola etapa. En otra realización, las etapas h) e i) se realizan como PCR de dos etapas. En una realización específica, la etapa de amplificación y cuantificación del cDNA se realiza mediante PCR en tiempo real.
En una realización, el equipo para realizar el método de acuerdo con la descripción comprende a) un soporte sólido, b) una solución para la recuperación de epítopo, y c) una solución para tinción inmunohistoquímica que comprende cloruro de sodio en una concentración de 0,5 A 3,0 M. En otra realización, el equipo para realizar el método de acuerdo con la descripción comprende a) un portaobjetos de membrana revestido con poli-lisina, b) una solución para la recuperación de epítopo, y c) una solución para tinción inmunohistoquímica que comprende cloruro de sodio en una concentración de 0,5 a 3,0 M. En una realización específica, el equipo comprende además todos los reactivos necesarios para realizar la transcripción inversa a partir de RNA en cDNA, y la amplificación y cuantificación del cDNA. En otra realización específica, el equipo comprende todos los reactivos necesarios para realizar la transcripción inversa a partir de RNA en cDNA, preamplificar el cDNA, y amplificar y cuantificar el cDNA preamplificado.
Los siguientes ejemplos 1-3 se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo alcance real se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.
Ejemplo 1
Revestimiento de los portaobjetos de membrana con poli-L-lisina
Los portaobjetos de membrana PEN (MicroDissect GmbH) se cubrieron con aproximadamente 1 ml de solución de poli-L-lisina (0,1% p/v, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) y se incubaron durante 30 min. en una cámara de humedad a temperatura ambiente. La solución de poli-L-lisina se eliminó mediante una potente agitación. Posteriormente, las láminas de membrana PEN se secaron durante la noche bajo luz ultravioleta.
Resultados Observados (no mostrados):
El revestimiento de los portaobjetos de membrana PEN con poli-L-lisina conduce a un aumento de la unión de la sección de tejido al portaobjetos de membrana cuando se aplica a la recuperación de epítopo inducida por calor a baja temperatura (LT-HIER, 60 ºC, 16 h, pH 8). Portaobjetos de membrana revestidos con poli-L-lisina: 0 de 3 secciones de tejido separadas del portaobjetos. Portaobjetos de membrana sin poli-L-lisina: 3 de 3 secciones de tejido separadas del portaobjetos.
Ejemplo 2
Tinción con CD31 sin/con cloruro sódico 2 M
Se usaron secciones FFPET de muestras tumorales para tinción basada en anticuerpos y posterior aislamiento de RNA. La siguiente descripción se refiere solamente al procedimiento realizado para teñir las secciones de FFPET en presencia de cloruro de sodio 2 M. Para experimentos sin cloruro de sodio, se realizó exactamente el mismo
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